CN107881154A - 貉细小病毒弱毒疫苗株及其在制备貉细小病毒弱毒疫苗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了貉细小病毒弱毒疫苗株及其在制备貉细小病毒弱毒疫苗中的用途。所述貉细小病毒弱毒疫苗株，命名为HB‑F69，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.14339。试验表明该疫苗株作为疫苗使用时，安全、有效，可有效预防貉细小病毒性肠炎的发生，且经过连续5代动物接种实验，证明该疫苗株无毒力返强。因此，本发明所述的貉细小病毒弱毒疫苗株在防治貉细小病毒性肠炎领域将具有广阔的应用前景。

Description

貉细小病毒弱毒疫苗株及其在制备貉细小病毒弱毒疫苗中的 用途

技术领域

本发明涉及貉细小病毒弱毒疫苗株及其应用，本发明属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

貉细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属貉细小病毒引起的急性、高度接触性传染病，同貉犬瘟热、貉传染性肝炎一起被称为貉养殖业三大疫病。1984年貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次发生。1988夏咸柱等从不同地区肠炎病貉分离出3株细小病毒，从而首次证实了貉细小病毒在我国的存在。目前貉细小病毒性肠炎广泛存在于世界各个国家。不同年龄和品种的貉均有易感性，但尤以50～60日龄的仔貉和幼貉最为易感，幼貉的发病率为70％以上，死亡率高达90％；成年貉的发病率为30％左右，死亡率在30％以下。患病貉和耐过貉是该病的主要传染源，病毒通过粪、尿、唾液等排出体外，经消化道和呼吸道传染给易感的健康貉。该病全年都可发生，常呈地方性流行。一旦传入貉场，如兽医防疫卫生措施不完善，常常导致长期存在和周期性发生流行，给养殖户带来巨大的经济损失。

我国毛皮动物养殖业从上世纪50年代起步，90年代获得蓬勃发展，现已成为畜牧业养殖的重要组成部分。目前，我国毛皮动物存栏数可达1亿只，其中貉占25％，主要集中在河北、山东、辽宁、吉林、黑龙江等省份地区。对推动当地经济发展，增加农民就业和收入起到了重要的作用。貉细小病毒性肠炎是危害貉养殖业的最重要传染病之一，由于缺乏特效的治疗方法，目前仍以疫苗接种为主要防控手段。因此，研制出安全、有效的貉细小病毒性肠炎的疫苗是控制貉细小病毒性肠炎的有效方法。

目前国内市场上还未有专用于貉的细小病毒性肠炎疫苗，一直在使用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗进行免疫预防，其缺点在于：一方面灭活疫苗在生产过程中往往存在灭活不彻底或灭活剂(多数为甲醛)使用量超标的现象，给疫苗的下一步使用带来了极大的隐患。同时甲醛具有较大毒性，因此使用甲醛作为灭活剂对貉具有一定毒性，往往在接种部位造成局部炎症反应，甚至是化脓、溃疡，影响貉皮张质量，造成经济损失。同时，灭活疫苗只能调动起机体的体液免疫，无法刺激机体细胞免疫应答的产生。另一方面，由于貉与水貂为不同种属的动物，使用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗对貉进行免疫预防，往往达不到令人满意的效果。

因此，开发安全、有效、能够同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应的貉细小病毒弱毒疫苗是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种貉细小病毒弱毒疫苗株以及由该疫苗株制备得到的貉细小病毒弱毒疫苗。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明采用连续传代的方法，将分离得到的貉细小病毒株HB在猫肾细胞CRFK上连续传代，并且每10～20代进行一次噬斑克隆纯化。经过69次传代，最终获得了一株对貉安全、免疫原性良好的貉细小病毒弱毒株，命名为HB-F69，将貉细小病毒弱毒株HB-F69连续5代灌胃接种抗体阴性貉，每代连续观察14天。结果显示每代接种貉体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种貉肠道无病变，说明该疫苗株HB-F69无毒力返强现象。将该疫苗株HB-F69制备成弱毒疫苗分别进行单剂量(10^5.5/头份)、单剂量重复和超剂量(10倍)接种抗体阴性貉，试验结果表明，疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，貉各项生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种貉肠道无病变。说明貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗对貉安全。将该疫苗株HB-F69制备成弱毒疫苗接种抗体阴性貉(10^5.5/头份)，接种3周、3个月、6个月和9个月后，使用细小病毒检验用强毒对貉进行攻击，结果表明，接种后3周、3个月貉对细小病毒的保护率为100％，接种貉各项生理指标均正常，无任何临床症状出现；接种后6个月貉对细小病毒的保护率为95％；接种后9个月貉对细小病毒的保护率为85％。说明该疫苗具有良好的免疫保护效力。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一株貉细小病毒弱毒疫苗株，命名为HB-F69，分类命名为犬细小病毒(Canine Parvovirus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.14339，保藏时间为：2017年8月23日。

进一步的，本发明还提出了所述的貉细小病毒弱毒疫苗株在制备预防貉细小病毒性肠炎药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物为貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗。

一种貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗，其有效成分包括本发明所述的貉细小病毒弱毒疫苗株。优选的，疫苗成品中细小病毒滴度(TCID₅₀)≥10^5.5/头份。

所述的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗，是通过以下步骤制备得到：

将本发明所述的貉细小病毒弱毒疫苗株按培养体积的0.2％～2％同步接种于CRFK或F81细胞上，置37℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％时通过反复冻融的方法收获病毒液，进行病毒含量、纯净性检测，将检验合格的制苗用病毒液加入适量冻干保护剂，分装、冻干，保存于2～8℃，即为貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗。

其中，优选的，经检验合格的制苗用病毒液病毒滴度(TCID₅₀)≥10^7.0/ml。

相较于现有技术，本发明的有益效果体现在：

作为单苗使用时，安全、有效，接种疫苗后可保护貉免于细小病毒检验用强毒的攻击，一次免疫接种3周和3个月后，貉对细小病毒的保护率均为100％；一次免疫接种6个月和9个月后，貉对细小病毒的保护率分别为95％和85％。因此，该疫苗株可有效预防貉细小病毒性肠炎的发生。且经过连续5代动物接种实验，证明该疫苗株无毒力返强。因此，将该疫苗的免疫期定为6个月，在2～8℃的保存期定为15个月。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1貉细小病毒HB的传代致弱

1、貉细小病毒HB的传代致弱

(1)将貉细小病毒株HB以同步接毒的方法接种在猫肾细胞CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒，标记为HB-F1(第1代)。

(2)将第1代病毒HB-F1按照上面所述的方法接种、收获病毒，标记为HB-F2(第2代)。使用同样的方法，将病毒传代到69代，标记为HB-F69。

(3)当貉细小病毒HB-F1连续传代到第10代(HB-F10)时，对病毒进行克隆噬斑纯化。其方法为：将待纯化的病毒作10倍比稀释至10^-7，取10^-3～10^-7 5个稀释度病毒悬液0.1ml，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，并设未接毒细胞对照孔。置培养箱(37℃、5％CO₂)中培养，待细胞完全贴壁后，去掉培养液，用无血清MEM清洗2次，加入预热至37℃的低熔点营养琼脂3mL/孔，室温冷却凝固，置培养箱培养3～5d，每天观察噬斑。选择最高稀释度病毒接种孔，挑取相对独立的单个噬斑，标记为F+1代(即F11代)。挑出的带有病毒的低熔点琼脂噬斑用细胞培养液重悬，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，继续传代，标记为F+2代(即F12代)。从F+3代(即F13代)开始仍用细胞培养瓶进行传代，此后病毒每传10～20代进行一次噬斑克隆纯化。

2.貉细小病毒致弱株HB-F69毒力返强试验

(1)第1代毒力返强试验使用第69代病毒HB-F69灌胃接种抗体阴性貉(20ml/只，10⁷TCID₅₀/ml),同时设不接种阴性对照。

(2)将前1代接种动物第4～8天排泄物混合到一起，经PBS重悬、氯仿抽提后，取上清作为下一代毒力返强试验的接种物，灌胃接种量为20ml/只，连续接种5代。

(3)每次接种病毒后连续14天观察貉的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种貉肠道病变情况。

(4)结果表明，连续5代动物回归试验中接种貉体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种貉肠道无病变，说明疫苗株HB-F69未发生毒力返强，可用于疫苗研究。

所述的貉细小病毒弱毒疫苗株HB-F69保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.14339，保藏时间为：2017年8月23日。

实施例2貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗的制备

(1)将疫苗株HB-F69按培养体积的0.2％～2％同步接种于CRFK或F81细胞上，置37℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒液。按照上述方法制备5批疫苗，进行病毒含量、纯净性检测。结果表明，5批疫苗的病毒滴度(TCID₅₀)≥10^7.0/ml，说明疫苗株HB-F69生产性能良好，适合工业大规模生产。

(2)制备冻干保护剂

将明胶、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照质量百分比计，使明胶的终浓度为2～7％，水解乳蛋白的终浓度为10-25％，蔗糖终浓度为15～30％，于116℃、30min高压灭菌后得到。

(3)将收获的病毒液与冻干保护剂按照体积比为4:1混合，定量分装于无菌的安瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥。

(4)疫苗成品进行病毒滴度、纯粹性检验，貉细小病毒滴度≥10^5.5/头份。

实施例3貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗安全性试验

取检验合格的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种抗体阴性貉，分别进行单剂量(10^5.5/头份)、单剂量重复和超剂量(10倍)接种，同时设不接种疫苗貉作为对照。疫苗接种后，连续14天观察貉的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种貉肠道病变情况。试验结果表明，疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，貉各项生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种貉肠道无病变。说明貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗对貉安全。

实施例4貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗效力及免疫期试验

(1)取检验合格的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种(10^5.5/头份)抗体阴性貉，同时设接种F81细胞培养液对照组，免疫后每月采血、分离血清，用于血凝抑制试验。

(2)试验动物接种3周、3个月、6个月和9个月后，使用细小病毒检验用强毒对貉进行攻击，剂量为20ml，含100个半数致死量(LD₅₀)，灌胃接种。每天观察攻毒貉体温、食欲、精神状态等生理指标。

(3)结果表明，接种后3周、3个月貉对细小病毒的保护率为100％，接种貉各项生理指标均正常，无任何临床症状出现；接种后6个月貉对细小病毒的保护率为95％；接种后9个月貉对细小病毒的保护率为85％。因此，将该疫苗的免疫期定为6个月。对照组貉均表现出体温升高，剧烈腹泻，排出混有肠粘膜的水样稀便或管型便。

以上结果表明本发明的疫苗株及其疫苗对于强毒的攻击可产生较好的保护作用，可有效预防貉细小病毒性肠炎的发生，是貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗的良好候选毒株。

实施例5貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗的保存期测定

取检验合格的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗3批(实施例2方法制备)保存于2～8℃，分别于保存的第3、6、9、12、15、18和24个月取样，进行性状、真空度、剩余水分、病毒滴度检测。结果表明，3批疫苗在2～8℃保存15个月性状为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范围内，细小病毒的病毒滴度(TCID50)分别为：10^5.80/ml、10^5.71/ml和10^5.67/ml，高于疫苗的免疫要求(细小病毒滴度≥105.5/头份)，因此将该疫苗在2～8℃的保存期定为15个月。

Claims (7)

1.貉细小病毒弱毒疫苗株，命名为HB-F69，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.14339。

2.权利要求1所述的貉细小病毒弱毒疫苗株在制备预防貉细小病毒性肠炎药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗。

4.一种貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗，其特征在于其有效成分包括权利要求1所述的貉细小病毒弱毒疫苗株。

5.如权利要求4所述的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗，其特征在于疫苗成品中貉细小病毒滴度TCID₅₀≥10^5.5/头份。

6.一种制备权利要求4所述的貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

将权利要求1所述的貉细小病毒弱毒疫苗株按培养体积的0.2％～2％同步接种于CRFK或F81细胞上，置37℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％时通过反复冻融的方法收获病毒液，进行病毒含量、纯净性检测，将检验合格的制苗用病毒液加入冻干保护剂，分装、冻干，保存于2～8℃，即为貉细小病毒性肠炎弱毒疫苗。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于经检验合格的制苗用病毒液病毒滴度TCID₅₀≥10^7.0/ml。