CN102174476A - 预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法。本发明提供了鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，CGMCC No.4457。本发明提供的毒株为具有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株。将该毒株接种到敏感细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的鸭病毒性肝炎灭活疫苗(细胞苗)，有利于鸭病毒性肝炎的防控。本发明可以有针对性的防治鸭病毒性肝炎的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗(细胞苗)及其制备方法。
背景技术
养鸭业是我国水禽养殖业的重要组成部分，在我国的农业经济中占有着非常重要的地位，然而鸭病的肆虐不但制约着我国养殖业向规模化、集约化方向的迈进，而且影响着我国禽类产品的进出口等国际化多边贸易的发展，同时会给国家和地区带来巨大的社会、经济和人类生命财产损失。鸭病毒性肝炎是鸭群的常见疾病，对雏鸭有着较大的危害。鸭病毒性肝炎的防控直接影响着我国养鸭业的发展，一直以来都是我国畜牧业生产所关注的重中之重。
鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis，DVH)简称鸭肝炎，是由鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV，又称鸭肝炎病毒)引起雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性烈性传染病。本病的潜伏期为2-5d，人工感染时的潜伏期为1d。雏鸭发病时表现精神萎靡、缩头、眼半闭呈瞌睡状、不随群走动、孤立于群外或行动呆滞、常蹲卧、共济失调等，常在出现神经症状后数小时或数天死亡。有些急性病例雏鸭没有任何症状，突然倒地死亡。少数病愈雏鸭生长缓慢，达不到正常的生长体重。
鸭病毒性肝炎为小RNA病毒科Avihepatovirus病毒属，无囊膜不分节段的正链RNA病毒，无血凝性，对酸、热有较强抵抗力。该病毒RNA全长7729～7799，只有一个开放阅读框，翻译产生一个含2254个氨基酸残基的多聚蛋白。因抗原性差异，DHAV可分为三个基因型，分别为DHAV-1，DHAV-2(Taiwan)和DHAV-3(Korea)，三个亚型之间无血清学交叉反应。
目前鸭病毒性肝炎在世界多数养鸭国家均有发生和流行，我国许多养鸭的省市均有该病的流行。对鸭病毒性肝炎的防控中，目前采用康复鸭血清、高免鸭血清及免疫种鸭的卵黄抗体治疗本病可较好地控制本病流行。另外，疫苗已研制成三种：氢氧化铝DHV鸡胚化弱毒苗(组织苗)、氢氧化铝DHV鸡胚化弱毒灭活苗(组织苗)及氢氧化铝DHV鸡胚化强毒灭活苗(组织苗)。从病原入手，进一步研究分子致病机理和病毒变异机理，开发相应疫苗是防控该病的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法。
本发明提供了鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，是2010年10月，刘文军、周远成在北京市房山区某鸭场的发病鸭体内分离获得的一株鸭病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，已于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4457。鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No.4457简称鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株。
鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株是2009年4月，刘文军、周远成在山东省潍坊市鸭场的发病鸭体内分离获得的一株鸭病毒性肝炎I型病毒(DHAV-1)，已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3746。鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746简称鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株。
本发明还保护鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)中的应用。
本发明还保护鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株和鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
本发明还保护将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)。
本发明还保护将鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No.4457和鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)。
本发明还保护一种制备鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步骤：将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，得到的上清即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-1细胞。
所述将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液的方法可包括如下步骤：
①将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为生产用种毒；②将生产用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为制苗用种毒；③将制苗用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收集上清液。
所述步骤①、步骤②和步骤③中：接种所述宿主细胞时MOI均可为0.001，培养时间均可为48-72小时；所述步骤①、步骤②和步骤③中：培养时间优选为48小时；所述步骤③中，可通过5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#3332)离心30-40min收集上清液。
所述宿主细胞为BHK21细胞时，在所述接种前可先进行如下扩增培养：
(1)将冻存的BHK21细胞37℃水浴融化，800rpm离心5min，取沉淀；用细胞培养液悬浮沉淀，得到2×105细胞/ml的细胞悬液，37℃、5％CO2静置培养至每毫升含有1×106细胞；(2)在步骤(1)的基础上消化细胞，然后重悬于细胞培养液中，使每毫升含有2×105细胞，然后在如下条件下培养至每毫升含有1×106细胞：pH7.4，溶解氧饱和度为50％、37℃，100转/min(Wheaton公司磁力搅拌器，搅拌器货号：356907；搅拌杆货号356886)。
所述细胞培养液具体可为：95体积份的DMEM和5体积份的胎牛血清混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。
本发明还保护一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，是将以上任一所述方法制备的所述病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
所述灭活的方法具体如下：在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下：将3体积份油相、1体积份水相和1％(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01％(质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下：将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下：将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混匀。
本发明还保护另一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，包括如下步骤：
(1)将上述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分甲；
(2)将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分乙；
(3)将活性成分甲和活性成分乙混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
所述灭活的方法具体如下：在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下：将3体积份油相、1体积份水相和1％(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01％(质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下：将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下：将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混匀。
本发明还保护另一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，包括如下步骤：将上述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液混合后作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
所述鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液可通过如下方法制备：将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-1细胞。
所述将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液的方法可包括如下步骤：
①将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为生产用种毒；
②将生产用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为制苗用种毒；
③将制苗用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收集上清液。
所述步骤①、步骤②和步骤③中：接种所述宿主细胞时MOI均可为0.001，培养时间均可为48-72小时；所述步骤①、步骤②和步骤③中：培养时间优选为48小时；所述步骤③中，可通过5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#3332)离心30-40min收集上清液。
所述宿主细胞为BHK21细胞时，在所述接种前可先进行如下扩增培养：
(1)将冻存的BHK21细胞37℃水浴融化，800rpm离心5min，取沉淀；用细胞培养液悬浮沉淀，得到2×105细胞/ml的细胞悬液，37℃、5％CO2静置培养至每毫升含有1×106细胞；(2)在步骤(1)的基础上消化细胞，然后重悬于细胞培养液中，使每毫升含有2×105细胞，然后在如下条件下培养至每毫升含有1×106细胞：pH7.4，溶解氧饱和度为50％、37℃，100转/min(Wheaton公司
磁力搅拌器，搅拌器货号：356907；搅拌杆货号3568860。
所述细胞培养液具体可为：95体积份的DMEM和5体积份的胎牛血清混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。
所述灭活的方法具体如下：在混合后的所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下：将3体积份油相、1体积份水相和1％(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01％(质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下：将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下：将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混匀。
本发明提供的疫苗免疫雏鸭时，采用单次免疫的方式，推荐免疫剂量为0.2ml。本发明提供的疫苗免疫种鸭时，采用单次免疫的方式，推荐免疫剂量为1ml。
本发明提供了一株有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株。将该毒株接种到敏感细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的鸭病毒性肝炎灭活疫苗(细胞苗)，有利于鸭病毒性肝炎的防控。本发明可以有针对性的防治鸭病毒性肝炎的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
附图说明
图1为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株PCR检测结果；泳道1为阳性对照，2为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，3为Marker5000，4为阴性对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1、鸭肝炎病毒DHAV-FS毒株的发现和鉴定
一、DHAV-FS株的发现
本发明的发明人从野外某鸭场(2010年10月，在北京市房山区的鸭场，由刘文军、周远成发现)的发病鸭体内分离获得了一株鸭病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，将其命名为DHAV-FS株，已于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.4457。
二、DHAV-FS株的鉴定
1、病毒形态
DHAV-FS株的病毒粒子呈二十面体对称，直径约40nm。
2、分子生物学鉴定
提取DHAV-FS的RNA，经反转录后，根据GENBANK发表的DHAV全基因序列(GU250782)设计的一对特异性引物(P1和P2)，进行RT-PCR扩增，扩增产物为250bp的目的条带。PCR产物的电泳图见图1。测序结果如序列表的序列1所示。PCR扩增产物的序列与现有DHAV具有很高的同源性，但也有序列差异。结果表明DHAV-FS毒株为DHAV阳性。
上游引物DHV-PGR1：5’-GGAGGTGGTGCTGAAA-3’；
下游引物DHV-PCR2：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’。
3、血凝性
DHAV-FS株对鸡、兔、猪、豚鼠红细胞均不凝集。
4、对细胞的半数感染量(TCID50)
DHAV-FS株第16代的细胞毒为107.2TCID50/ml、27代的细胞毒为107.04TCID50/ml。
5、对鸡胚的半数感染量(EID50)
DHAV-FS株第13代的滴度为107.18EID50/0.2ml。
6、对雏鸭的致病力测定
DHAV-FS株3代对雏鸭的致病力测定，滴度为104.25ID50/ml，103.80LD50/ml。ID50为半数感染量，LD50为半数致死量。
7、稳定性
将DHAV-FS株在细胞传32代，每0.1ml病毒含量均为107TCID50以上，DHAV-FS毒株在32代以内是稳定的，可以作为疫苗生产用种毒。
8、免疫原性
DHAV-FS株F1～F32均具有良好的免疫原性，利于疫苗的研究。
9、特异性
将DHAV-FS株稀释至104TCID50/ml，与等量抗鸭肝炎病毒特异性血清混合，室温放置1小时后，接种SPF鸡胚10个，观察120小时。在24～120小时内不引起特异性死亡，且至少存活8个。
实施例2、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
一、鸡胚成纤维细胞系DF-1的培养
鸡胚成纤维细胞系DF-1：购自北京中原公司(ATCC细胞系编号为：CRL-12203)。
细胞培养液：9体积份的DMEM和1体积份的FBS混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。
1、细胞复苏
将DF-1细胞冻存管从液氮中取出，迅速在37℃水浴锅中加温，使细胞液融化。将冻存管在台式离心机中800rpm离心5min，弃上清。将细胞沉淀在3ml培养基中吹打均匀(6em直径培养皿中)，放入CO2恒温培养箱中，37℃、5％CO2静置培养。
2、细胞传代
使用电动吸引器，沿培养皿壁吸去废液。PBS清洗1-2次，吸去废液。沿培养皿壁加入胰酶，37℃消化。待到细胞形态变圆，吸去胰酶，用DMEM培养基吹打细胞，使细胞均匀悬浮于培养基中，得到细胞悬液。将细胞悬液均匀分为几份，加入到新的培养皿中，加入新的DMEM培养基，置于37℃培养。
3、细胞冻存
将细胞培养液置于离心管中，800rpm离心5min。小心弃上清，用细胞冻存液重悬细胞。将重悬好的细胞分装，每只冻存管不超过1.5ml。冻存管先置于4℃、30min，然后-20℃、2h，然后-80℃过夜，然后放入液氮罐中保存。
二、病毒液的制备和TCID50的测定
1、病毒液的制备
鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接种DF-1细胞；细胞病变达80％以上时(约48小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(病毒液)。
2、病毒液的TCID50测定
(1)准备细胞
取生长良好的DF-1细胞，消化后用10％FBS DMEM制备细胞悬液；调整细胞浓度为5×105个/ml，然后加入96孔细胞培养板，0.1ml/孔。37℃、5％CO2培养使其铺满单层。
(2)准备病毒
将步骤1制备的病毒液进行10倍梯度稀释。
(3)病毒液的TCID50测定
96孔板中细胞长满单层后，将培养液吸出，加入病毒稀释液，每个梯度8-16孔，每孔0.1ml，37℃、5％CO2培养96小时后观察病变孔数并记录。各个稀释度的CPE结果见表1。
表1各个稀释度的CPE结果
| 病毒稀释度 | 出现CPE的孔数 |
| 103 | 16/16 |
| 104 | 16/16 |
| 105 | 16/16 |
| 106 | 13/16 |
| 107 | 7/16 |
| 108 | 1/16 |
| 109 | 0/16 |
| 1010 | 0/16 |
(4)根据Reed-Muench氏法计算
按Reed-Muench氏法计算TCID50，中间数据见表2。
表2按Reed-Muench氏法计算TCID50的中间数据
注：A、B和C项为原始数据；D项为B项减去C项之值(即无CPE孔＝细胞孔数-CPE孔数)；E项为C项从下向上加的值(原因是108有CPE的这一细胞孔如果接种病毒量更大的107也一定会有CPE，依次类推)；F项为D项从上往下加的值(原因106是无CPE的这三个细胞孔如果接种病毒量更小的107也一定无CPE，依次类推)；G项为E项和F项之和(即各组累积细胞孔数总数等于该组的累积CPE孔数与累积无CPE孔数之和)；H项为E项和G项之和(即累积CPE百分率等于累积CPE孔数与累积细胞孔数总数之比)。从表2可见，半数细胞出现CPE的稀释度(即TCID50)介于10-6与10-7之间。
距离比＝(高于50％的百分数-50)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)＝(87.5-50)/(87.5-40)＝0.73。
TCID50＝高于50％的病毒稀释度的负对数+距离比＝6+0.73＝6.73。
固能使50％细胞发生病变的稀释度为10-6.73，当病毒液进行106.73倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，每毫升病毒液中的病毒含量为107.73TCID50。
三、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
1、生产用种毒的制备
鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接种DF-1细胞，MOI为0.001(MOI为用于感染的病毒量与细胞数目的比值；病毒量的单位为TCID50，细胞数目的单位为个)；接种后观察至80％以上细胞出现病变时(接种后48小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(抽样检测TCID50，病毒含量≥106.5TCID50/0.1ml的作为生产用种毒)。上清置于2～8℃保存。
生产用种毒的纯净性检验：
(1)无菌检验
T.G、G.P小管和G.A斜面培养基均未观察到菌落。
(2)支原体检验
在观察期内，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。
(3)外源病毒检验
两组鸡胚7日内全部存活，剖检胎儿发育正常，绒毛尿囊膜无病变，鸡胚液无血凝性。病毒中未见细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，证明其是纯净的。
2、制苗用毒液的制备
取生产用种毒接种细胞，MOI为0.001；接种后细胞病变达80％以上时(接种后48小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(抽样检测TCID50，病毒含量≥106.5TCID50/0.1ml的作为制苗用种毒)。上清置于2～8℃保存。
3、疫苗的制备
(1)病毒液的制备和灭活
将制苗用种毒接种DF-1细胞，MOI为0.001，每隔12小时观察一次；细胞病变(CPE)达80％以上时(接种后48小时)，收取细胞液，反复冻融3次，5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#3332)离心30min，收取上清(抽样检测应无菌生长)，上清(病毒液)置于2～8℃保存。
在上清中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)，期间振摇3～4次，灭活后2～8℃保存(灭活病毒液)。
(2)乳化
油相制备：由注射用白油94体积份，加司本-806体积份，混合后，然后加硬脂酸铝(每100毫升混合液加入1.75克硬脂酸铝)，逐渐搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相制备：取灭菌吐温-804体积份，加入灭活病毒液96体积份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
乳化：取油相3体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相1体积份，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞水溶液，使其终浓度为0.01％，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012001)。
(7)分装
定量分装，加盖密封，2～8℃保存(批号为201012001)。
实施例3、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
采用鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株制备疫苗，方法同实施例2，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012002)。
实施例4、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
采用鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株制备疫苗，方法同实施例2，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012003)。
实施例5、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
一、幼小仓鼠肾细胞BHK21的培养
幼小仓鼠肾细胞BHK21：购自中国兽医药品监察所(细胞系编号为CL6)。
细胞培养液：95体积份的DMEM和5体积份的胎牛血清混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。
1、细胞复苏
将BHK21细胞冻存管从液氮中取出，迅速在37℃水浴锅中加温，使细胞液融化。将冻存管在台式离心机中800rpm离心5min，弃上清。将细胞沉淀吹打均匀，细胞悬液按照2×105细胞/ml的浓度接种培养皿(含细胞培养液)，放入CO2恒温培养箱中，37℃，5％CO2静置培养。
2、细胞传代及悬浮培养
待细胞长满培养皿后，细胞浓度达1×106细胞/ml时，消化细胞，重悬于新鲜细胞培养液中，进行细胞计数，按照细胞浓度为1×105细胞/ml的量接种细胞培养反应器(含细胞培养液)进行悬浮培养，设置悬浮培养阶段主要参数为：pH7.4，溶解氧饱和度为30％[溶解氧饱和度＝(溶解氧实测含量/实测条件下溶解氧的饱和含量)×％]，温度37℃，转速100转/min(Wheaton公司
磁力搅拌器，搅拌器货号：356907；搅拌杆货号356886)。
3、细胞收获
每天取样进行细胞计数，待细胞浓度达1×106细胞/ml时进行传代或收获后冷冻保存。
二、病毒液的制备和TCID50的测定
用BHK21细胞代替DF-1细胞，其它同实施例2的步骤二。
即病毒液的半数感染量为107.73TCID50/ml。
三、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
用BHK21细胞代替DF-1细胞，其它同实施例2的步骤三。
得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012004)。
实施例6、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
采用鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株制备疫苗，方法同实施例5，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012005)。
实施例7、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
采用鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株制备疫苗，方法同实施例5，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012006)。
实施例8、鸭病毒性肝炎疫苗的质检
一、成品检验
用实施例2至实施例7制备的六个批号的疫苗进行如下检测：
(1)物理性状
外观：应为乳白色乳状液。
剂型：为油包水型(W/O)。取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状，不扩散。
粘度：用1ml吸管(出口内径为1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应不超过5秒。
稳定性：在37℃左右条件下放置21日或将疫苗5ml加入离心管，经3000r/min离心，15分钟，应不破乳。
不符合规定者判为不合格。
(2)无菌检验按《中国兽药典》规定进行，应为无菌生长。
(3)安全检验用3～7日龄的北京鸭10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。
(4)效力检验用1日龄左右的北京鸭10只，各皮下注射疫苗0.3ml，21日时，连同饲养条件相同的对照鸭10只，各胸部肌肉注射107TCID50强毒，观察7日，应全部健活。
(5)甲醛、硫柳汞含量测定按《中国兽药典》的规定方法进行测定，其甲醛溶液量(40％甲醛)不应超过0.1％，汞类防腐剂残留量应不超过0.01％。
二、安全性检验
用实施例2至实施例7制备的六个批号的疫苗进行如下检测：
(1)各种剂量对不同日龄北京鸭雏鸭的安全性试验
将疫苗颈部皮下接种1日龄、3日龄、5日龄北京鸭雏鸭，每组10只，0.2ml/只。接种后观察14天，所有雏鸭接种部位未见肿胀、坏死，未见全身不良反应。
(2)单剂量重复使用的安全性试验
将疫苗颈部皮下注射接种10只3日龄雏鸭，每周一次，每次0.2ml/只，重复3次；颈部皮下接种30周龄种鸭10只，每周1次，每次0.5ml/只，重复3次。接种后观察14天，鸭接种部位未见肿胀、坏死，未见全身不良反应。
(3)一次超剂量接种的安全性试验
将疫苗颈部皮下接种3日龄雏鸭10只，1ml/只。超剂量接种的10只雏鸭，接种后观察14天，所有雏鸭接种部位未见肿胀、坏死，未见全身不良反应。
(4)疫苗对产蛋鸭生产性能的影响试验
取疫苗免疫28周龄产蛋高峰期的产蛋鸭20只，分为2组，每组10只，分别皮下注射疫苗，免疫剂量为0.5ml和1ml，同时设立阴性对照，每只皮下注射0.5ml生理盐水，同时同条件饲养14天，观察结果，200912001批次疫苗的结果见表3。
表3疫苗对产蛋鸭的影响
综上所述，安全性验证结果表明，6个不同批号的疫苗均是安全的，没有引起任何不良反应。
实施例9、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
一、疫苗组分I的制备
鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株是2009年4月，刘文军、周远成在山东省潍坊市鸭场的发病鸭体内分离获得的一株鸭病毒性肝炎I型病毒(DHAV-1)，已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3746。鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746简称鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株。
1、生产用种毒的制备
鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株接种DF-1细胞，MOI为0.001(MOI为用于感染的病毒量与细胞数目的比值；病毒量的单位为TCID50，细胞数目的单位为个)；接种后观察至80％以上细胞出现病变时(接种后48小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(抽样检测TCID50，病毒含量≥106.5TCID50/0.1ml的作为生产用种毒)。上清置于2～8℃保存。
2、制苗用毒液的制备
取生产用种毒接种细胞，MOI为0.001；接种后细胞病变达80％以上时(接种后48小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(抽样检测TCID50，病毒含量≥106.5TCID50/0.1ml的作为制苗用种毒)。上清置于2～8℃保存。
3、疫苗的制备
(1)病毒液的制备和灭活
将制苗用种毒接种DF-1细胞，MOI为0.001，每隔12小时观察一次；细胞病变(CPE)达80％以上时(接种后48小时)，收取细胞液，反复冻融3次，5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#3332)离心30min，收取上清(抽样检测应无菌生长)，上清(病毒液)置于2～8℃保存。
在上清中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)，期间振摇3～4次，灭活后2～8℃保存(灭活病毒液)。
(2)乳化
油相制备：由注射用白油94体积份，加司本-80 6体积份，混合后，然后加硬脂酸铝(每100毫升混合液加入1.75克硬脂酸铝)，逐渐搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相制备：取灭菌吐温-80 4体积份，加入灭活病毒液96体积份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
乳化：取油相3体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相1体积份，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞水溶液，使其终浓度为0.01％，得到疫苗组分I。
(7)分装
定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
二、疫苗组分II的制备
用BHK21细胞代替DF-1细胞，其它同步骤一，得到疫苗组分II。
三、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备
将实施例2制备的鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012001)与疫苗组分I等体积混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012007)。
将实施例5制备的鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012004)与疫苗组分II等体积混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗(批号为201012008)。
实施例10、鸭病毒性肝炎疫苗的效力检验
用实施例2至实施例7和实施例9制备的八个批号的疫苗分别进行检测。
一、对雏鸭免疫的效力
将雏鸭(品种为北京鸭，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物实验基地)分为25组，每组20只，分别进行如下处理：
第一组：注射201012001批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第二组：注射201012001批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第三组：注射201012001批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第四组：注射201012002批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第五组：注射201012002批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第六组：注射201012002批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第七组：注射201012003批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第八组：注射201012003批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第九组：注射201012003批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第十组：注射201012004批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第十一组：注射201012004批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第十二组：注射201012004批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第十三组：注射201012005批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第十四组：注射201012005批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第十五组：注射201012005批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第十六组：注射201012006批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第十七组：注射201012006批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第十八组：注射201012006批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第十九组(空白对照组)：注射生理盐水，每次每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第二十组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第二十一组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第二十二组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml；
第二十三组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.1ml；
第二十四组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.2ml；
第二十五组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.4ml。
试验中采用单次免疫。免疫后第14天，各组雏鸭取10只均肌肉注射鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，每只鸭攻毒剂量均为107TCID50，之后再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数，结果见表4。免疫后第14天，各组雏鸭取另10只均肌肉注射鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株和鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，每只鸭每种病毒的攻毒剂量均为107TCID50，之后再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数(即未死亡的只数)，结果见表4。
表4雏鸭病毒性肝炎灭活疫苗的效力试验结果
DHAV-FS株攻毒后：批号200912001-200912008的疫苗，以0.1ml剂量组免疫雏鸭，攻毒保护率在80％以上，以0.2ml剂量组和0.4ml剂量组进行免疫，攻毒保护率在100％；空白对照组的鸭均全部死亡，保护率为0％。
DHAV-SD株和DHAV-FS株联合攻毒后：第一组至第十九组(空白对照组、批号200912001-200912006的疫苗)的鸭均全部死亡，保护率为0％；批号200912007和200912008的疫苗，以0.1ml剂量组免疫雏鸭，攻毒保护率在80％以上，以0.2ml剂量组和0.4ml剂量组进行免疫，攻毒保护率在100％。
二、对种鸭免疫的效力
将产蛋种鸭(品种为北京鸭，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物实验基地)分为25组，每组10只，分别进行如下处理：
第一组：注射201012001批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第二组：注射201012001批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第三组：注射201012001批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第四组：注射201012002批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第五组：注射201012002批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第六组：注射201012002批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第七组：注射201012003批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第八组：注射201012003批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第九组：注射201012003批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第十组：注射201012004批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第十一组：注射201012004批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第十二组：注射201012004批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第十三组：注射201012005批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第十四组：注射201012005批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第十五组：注射201012005批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第十六组：注射201012006批号的疫苗，每只鸭皮下注射0.5ml；
第十七组：注射201012006批号的疫苗，每只鸭皮下注射1ml；
第十八组：注射201012006批号的疫苗，每只鸭皮下注射1.5ml；
第十九组(空白对照组)：注射生理盐水，每只雏鸭皮下注射1ml；
第二十组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.5ml；
第二十一组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射1ml；
第二十二组：注射201012007批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射1.5ml；
第二十三组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射0.5ml；
第二十四组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射1ml；
第二十五组：注射201012008批号的疫苗，每只雏鸭皮下注射1.5ml。
试验中采用单次免疫。免疫后第30至35天收集各组产蛋鸭所产鸭蛋(每组随机选取40个)，进行孵育。雏鸭出壳后7天，各组取20只均肌肉注射鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，每只攻毒剂量均为107TCID50，再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数，结果见表5。雏鸭出壳后7天，各组取另20只均肌肉注射鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株和鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，每只鸭每种病毒的攻毒剂量均为107TCID50，再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数，结果见表5。
表5种鸭病毒性肝炎灭活疫苗的效力试验结果
DHAV-FS株攻毒后：批号200912001-200912008的疫苗，以0.5ml剂量组免疫种鸭，7日龄雏鸭攻毒保护率在80％以上，以1ml剂量组和1.5ml剂量组进行免疫，攻毒保护率在100％；空白对照组的鸭均全部发病或死亡，保护率为0％。
DHAV-SD株和DHAV-FS株联合攻毒后：第一组至第十九组(空白对照组、批号200912001-200912006的疫苗)的鸭均全部死亡，保护率为0％；批号200912007和200912008的疫苗，以0.5ml剂量组免疫种鸭，7日龄雏鸭攻毒保护率在80％以上，以1ml剂量组和1.5ml剂量组进行免疫，攻毒保护率在100％。
Claims (10)
1.鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，其保藏号为CGMCC No.4457。
2.鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No.4457在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
3.鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No.4457和鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
4.将鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCCNo.4457灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗。
5.将鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCCNo.4457和鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCCNo.3746灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗。
6.制备鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步骤：将鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No.4457在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-1细胞。
7.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，是将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
8.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分甲；
(2)将鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCCNo.3746的病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分乙；
(3)将活性成分甲和活性成分乙混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
9.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis Avirus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746的病毒液混合后作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCC No.3746的病毒液是通过如下方法制备的：将鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株CGMCCNo.3746在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-1细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: MICROBIOLOGY INST., CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20120509 Owner name: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: MICROBIOLOGY INST., CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20120509 |
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| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhao Yarong Inventor after: Liu Wenjun Inventor after: Wang Guihua Inventor after: Li Jing Inventor after: Mou Wei Inventor before: Liu Wenjun Inventor before: Zhou Yuancheng Inventor before: Li Jing Inventor before: Bi Yuhai Inventor before: Sun Lei |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100101 CHAOYANG, BEIJING TO: 100097 HAIDIAN, BEIJING Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LIU WENJUN ZHOU YUANCHENG LI JING BI YUHAI SUN LEI TO: ZHAO YARONG LIU WENJUN WANG GUIHUA LI JING MOU WEI |
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Effective date of registration: 20120509 Address after: 100097, No. 9 Shuguang Road, Haidian District, Beijing Applicant after: Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. Co-applicant after: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences Address before: 100101 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 1, West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, A315, Applicant before: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences |
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Effective date of registration: 20200714 Address after: 211102, 999 Ting Dong Road, Jiangning economic and Technological Development Zone, Nanjing, Jiangsu Co-patentee after: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co., Ltd Address before: 100097, No. 9 Shuguang Road, Haidian District, Beijing Co-patentee before: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Patentee before: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |