CN103059131A - 防治ⅰ型和ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，本发明制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境；同时本发明采用辛酸沉淀法提取Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。

Description

防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及禽类用生物制品技术领域，尤其是一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法。 

背景技术

鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（DHV）引起的一种雏鸭高度致死性、急性传染病。鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)包含嗜肝病毒科、星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起Ⅱ型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道;小核糖核酸病毒科主要引起Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎。 

Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎在临床症状和病理变化上类似，但中和试验和荧光抗体试验证实二者无共同抗原成分，且Ⅲ型鸭肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鸭肝炎病毒。 

Ⅰ型鸭肝炎病毒致死性最强，该病毒呈球形或类球形，直径在20-40nm，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。由DHV-Ⅰ引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1-3周龄雏鸭，发病严重，传播迅速，病程短，临床表现为发病急、死亡快，剖解病变特征主要为肝脏有明显的出血点、出血斑，雏鸭通常在出现症状后1h内死亡，10日龄内的雏鸭感染后死亡率可达90%以上。该病呈世界性分布，首次报道于1945年美国长岛，1954年在英国病鸭中分离到该病毒，德国、意大利、印度、法国、苏联等相继有本病的发生。我国1963年最早报道了该病在上海地区出现，20世纪 80年代初期起本病在我国再次流行，之后北京、福建、浙江等多个地区爆发本病，流行区域广，给我国养鸭业造成了严重损失。 

DHV-III属于小RNA病毒，直径约30nm，但与Ⅰ型鸭肝炎病毒无关，由中和抗体试验和荧光抗体实验证实它们没有共同抗原成分。Toth于1969年在美国长岛首次报道了DHV-Ⅲ引起的鸭病毒性肝炎，我国在1998年由刘兆宇等报道了Ⅲ型DHV感染的发生。该疾病不如Ⅰ型鸭肝炎病毒感染严重，雏鸭的死亡率很少超过30%，但大体病变与Ⅰ型鸭肝炎病毒引起的相似。 

近年来我国不断从病鸭中同时分离到DHV-Ⅰ和DHV-III，证明相当多地区的鸭病毒性肝炎为DHV-Ⅰ和DHV-III的混合感染，且混合感染的病死率高于任何一种的单一感染，而治愈率低于任何一种的单一感染；而现有的鸭病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黄抗体绝大多数是针对Ⅰ型鸭肝炎病毒研制的，因此对于DHV-III单一感染及DHV-Ⅰ和DHV-III混合感染的治疗效果均不理想，给鸭病毒性肝炎的防治带来了新的挑战。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染的二价蛋黄抗体的制备方法。 

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 

1.制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋 

（1）选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染； 

（2）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒二价灭活苗 

A.制水相 

用冷冻保存的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相； 

B.制油相 

取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相； 

C.制备油乳剂灭活苗 

将上述步骤1-（2）-A所制得的水相和步骤1-（2）-B所制得的油相进行混匀即得； 

（3）免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋 

将步骤1-（2）所制备的二价灭活苗免疫步骤1-（1）处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋； 

2.利用步骤1制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体 

（1）分离高免鸡蛋蛋黄 

将步骤1制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； 

（2）提取卵黄抗体 

将步骤2-（1）所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0.2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该 上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V），对其进行过滤操作后，取滤液4℃保存备用； 

（3）配制、保存 

将步骤2-（2）所得滤液进行Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320；然后加入终浓度为0.01%（V/V）的吐温-80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。 

上述步骤1-（2）-A中的灭活处理是对病毒液用0.1%的甲醛37℃密封灭活48h。 

上述步骤1-（2）-A中病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4（V/V）。 

上述步骤1-（2）-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:6:2（V/V/W）。 

上述步骤1-（2）-C中水相和油相的混合比例为1:2（V/V）。 

上述步骤1-（3）中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次，剂量分别为0.5ml/只，1.0ml/只，1.5ml/只，第1次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价均达到要求。 

上述步骤2-（1）中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。 

上述步骤2-（2）中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用0.22μm的微孔滤膜过滤。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

（1）本发明制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境。 

（2）同时本发明采用辛酸沉淀法提取Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

实施例： 

本发明所涉防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其步骤为： 

1.制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋 

（1）选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染； 

（2）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒二价灭活苗 

A.制水相 

用冷冻保存的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相，病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4（V/V）； 

所述灭活处理是对病毒液用0.1%的甲醛37℃密封灭活48h。 

B.制油相 

取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，三者的混合比例为94:6:2（V/V/W），搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相； 

C.制备油乳剂灭活苗 

将上述步骤1-（2）-A所制得的水相和步骤1-（2）-B所制得的油相进行混匀即得，水相和油相的混合比例为1:2（V/V）； 

（3）免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋 

将步骤1-（2）所制备的二价灭活苗免疫步骤1-（1）处理过的高产蛋鸡，对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次，剂量分别为0.5ml/只，1.0ml/只，1.5ml/只，第1次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价均达到要求，收集鸡蛋，即为Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋； 

2.利用步骤1制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体 

（1）分离高免鸡蛋蛋黄 

将步骤1制备的高免鸡蛋进行消毒程序，消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干；然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； 

（2）提取卵黄抗体 

将步骤2-（1）所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0.2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V），对其进行过滤操作后，取滤液4℃保存备用；过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用0.22μm的微孔滤膜过滤。 

（3）配制、保存 

将步骤2-（2）所得滤液进行Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320；然后加入终浓度为0.01%（V/V） 的吐温-80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。 

上述效价检测需同时满足以下两个条件： 

（1）中和抗体效价测定：按现行《中国兽药典》2010版附录中和试验法固定病毒稀释血清法，使用检验用种毒与系列稀释的抗体中和后，分别尿囊腔接种12日龄鸭胚，连续观察5天，进行测定。中和抗体效价应不低于1:320。 

（2）免疫攻毒法：用3日龄易感雏鸭（鸭病毒性肝炎中和抗体效价不高于1:4）30只，随机分为3组。第1组为空白对照组，每只腿部肌肉注射生理盐水0.5ml，隔离饲养；第2组为预防组，每只腿部肌肉注射本品0.5ml；第3组为攻毒对照组，每只腿部肌肉注射生理盐水0.5ml。24小时后，第1组每只腿部肌肉注射生理盐水0.5ml；第2组和第3组每只腿部肌肉注射检验用种毒0.5ml（约200LD₅₀）。连续观察10天后，第1组应全部健活；第2组应至少健活8只；第3组应至少死亡8只。 

临床应用例： 

静海县某养殖户，购买一批雏鸭的2天内生长良好，饮水、采食等正常，3日龄（2010年08月16日）开始发病，并出现死亡，4日龄发病及死亡增加。 

现场可见发病雏鸭精神不振、缩颈垂翅、行动迟缓、流泪、腹泻、干脚，死前表现角弓反张。现场初诊为鸭病毒性肝炎，随后进行临床试验，并采集病料进行确诊。剖检可见主要表现肝脏肿大，表面散布大量出血点及出血斑，色黄、质脆，胆囊肿胀、质脆，脾肿大，其它器官无明显病变。 

为确诊，取病死雏鸭数只，送实验室进一步检验。实验室无菌接种肝、脾、心于巧克力平板及麦康凯平板37℃培养24小时，均无细菌生长，继续培养至48小时，仍无细菌生长。肝、脾组织处理后的样品液，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，7/10死亡；样品液与DHV-Ⅰ高免血清中和后，接种12日龄鸭胚， 连续观察10日，3/10死亡；样品液与DHV-III高免血清中和后，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，5/10死亡；将DHV-Ⅰ和DHV-III高免血清1:1（v/v）混合后，与样品液中和，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，无死亡胚。以样品液在12日龄鸭胚盲传3代后的尿囊液为样品，进行RT-PCR检测，可见DHV-Ⅰ和DHV-III相应条带。因此，该病例确诊为DHV-Ⅰ和DHV-III的混合感染。 

对该鸭群进行临床试验，将雏鸭分为两组： 

(1）试验组：共1227只，以2倍量腿部肌肉注射，进行紧急预防； 

(2）对照组：共200只，不做处理。 

连续观察1个月。 

实验结果如下： 

（1）试验组：注射后死亡下降，2天后停止死亡，未出现新的发病，恢复良好，无复发。试验期间死亡共78只，死亡率为6.36%。 

（2）对照组：死亡继续增加，5天后停止死亡。雏鸭恢复缓慢，后期有少量复发死亡。试验期间死亡共107只，死亡率为53.5%。 

临床应用例证明，本产品紧急预防效果良好，能迅速控制疫病的传染，无复发现象。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (8)

1.一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 

1）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋； 

（1）选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染； 

（2）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒二价灭活苗； 

A.制水相； 

用冷冻保存的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相； 

B.制油相； 

取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相； 

C.制备油乳剂灭活苗； 

将上述步骤1-（2）-A所制得的水相和步骤1-（2）-B所制得的油相进行混匀即得； 

（3）免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋； 

将步骤1-（2）所制备的二价灭活苗免疫步骤1-（1）处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋； 

2）利用步骤1制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体； 

（1）分离高免鸡蛋蛋黄； 

将步骤1制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； 

（2）提取卵黄抗体； 

将步骤2-（1）所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0.2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V），对其进行过滤操作后，取滤液4℃保存备用； 

（3）配制、保存； 

将步骤2-（2）所得滤液进行Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320；然后加入终浓度为0.01%（V/V）的吐温-80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。 

2.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤1-（2）-A中的灭活处理是对病毒液用0.1%的甲醛37℃密封灭活48h。 

3.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤1-（2）-A中病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4（V/V）。 

4.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤1-（2）-B中白油、司本-80和硬脂酸铝的混合比例为94:6:2（V/V/W）。 

5.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤1-（2）-C中水相和油相的混合比例为1:2（V/V）。 

6.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤1-（3）中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次，剂量分别为0.5ml/只，1.0ml/只，1.5ml/只，第1次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价均达到要求。 

7.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤2-（1）中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用0.05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。 

8.根据权利要求1所述的防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤2-（2）中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用0.22μm的微孔滤膜过滤。