CN103709247A - 一种ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用。本发明的一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，包括收集高免蛋、高免蛋消毒、海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀、抗体的超滤膜浓缩和纯化以及灭活除菌等步骤。研究结果表明，本发明采用海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀提取得到的Ⅰ型和新型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，抗体纯度高、效价高、副反应小、治疗效果明显，能够安全方便的用于Ⅰ型以及新型鸭肝炎病毒的同时防治。

Description

一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法，特别涉及一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用。本发明属于水禽用生物制品技术领域。

背景技术

鸭甲型肝炎（Duck Hepatitis A,DHA）是由鸭甲型肝炎病毒（Duck Hepatitis AVirus,DHAV）引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。该病主要侵害1～3周龄的雏鸭，传播迅速，发病严重，临床症状主要表现为痉挛、抽搐和角弓反张，以肝脏肿胀和出血为主要病理变化。病鸭多在出现症状后的1小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率可达90%以上，该病已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。

鸭肝炎病毒包含嗜肝病毒科、星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起Ⅱ型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道；目前我国流行的是由小核糖核酸病毒科引起的Ⅰ型和新型鸭甲型肝炎。对于血清I型病毒，我国已经采用了多年的卵黄抗体进行预防和治疗，并取得了一定的效果，但今年来不断从病鸭中同时分离到I型和新型鸭肝炎病毒，证明我国多地出现血清I型和新型鸭肝炎混合感染的情况。血清中和试验表明，I型和新型之间缺乏交叉保护作用，I型卵黄抗体很难对流行的新型鸭肝炎病毒进行预防，I型和新型二价卵黄抗体是预防和控制鸭病毒性肝炎的必然要求，因此探讨I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的提取方法对有效防治该病具有是十分重要的意义。

卵黄抗体（egg yolk antibodies，IgY）是指产蛋鸡受特定抗原免疫后产生并转移和贮存在卵黄中的特异性抗体，从蛋黄中将IgY提取并应用在动物疾病的防治中已得到广泛认可。但IgY被广泛应用的前提是如何将卵黄中将大量的IgY提取、纯化出来。近年来，国内外学者报道了许多卵黄抗体的制备方法，但由于提取方法的不当，缺少抗体纯化过程，导致提取过程中，抗体大量损失，效价大幅降低，大量杂蛋白及脂肪等物质未被除去，同时存在提取药品的残留。其结果是一方面，造成抗体提取成本的提高；其另一方面，造成抗体注射困难、难以吸收、注射局部肿胀、过敏反应严重，直接导致抗体治疗效果不佳，严重影响抗体的使用效果，极大的限制了卵黄抗体在疾病防治上的应用。

目前常采用的方法包括酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法以及辛酸法等，其中酸化水提取法除脂效果不佳，卵黄抗体中含有大量杂蛋白；聚乙二醇法中使用聚乙二醇易溶于水，目前尚没有办法去除，对畜禽有一定的危害，IgY含有一定杂蛋白，抗体纯度不高；氯仿法中使用氯仿有残留和毒性，对卵黄抗体的品质有较大影响，易引起注射部位肿胀，及动物全身不良反应；辛酸法中辛酸在水中溶解度极低（0.062g/L），因此在水溶性物质中辛酸残留量极微。在医学工业中辛酸已被广泛应用，对生物不具毒副作用。但单纯使用辛酸萃提，蛋白纯度低，效价低，治疗效果不明显。

发明内容

针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明所要解决的技术问题之一，是提供一种卵黄抗体的提取方法，以解决目前存在的由于提取方法的不当，缺少抗体纯化过程，导致提取过程中，抗体大量损失，效价大幅降低，大量杂蛋白及脂肪等物质未被除去，同时存在提取药品的残留的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种卵黄抗体（egg yolk antibodies，IgY）的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）收集高免蛋；

（2）将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

（3）除脂

量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5-2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至pH5.0-5.2，置2～8℃保存过夜；

其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1-0.15％（w/w）的海藻酸钠以及0.02-0.08％（w/w）的NaC1，其余为纯化水；

（4）盐析

次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%（w/w），再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；

（5）抗体的纯化

沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存；

（6）抗体的灭活除菌

获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释后经甲醛溶液灭活，然后经滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

在本发明中，优选的，步骤（2）中是将高免蛋浸入1‰（v/v）新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，然后用甲醛熏蒸鸡蛋30分钟。

在本发明中，优选的，步骤（3）中按所量取的卵黄体积的2倍加入海藻酸钠溶液，其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.12％的海藻酸钠以及0.05％的NaC1，其余为纯化水。

在本发明中，优选的，步骤（4）或（5）中所述的PBS缓冲液为0.15mol/L的PBS缓冲液，pH7.2。

在本发明中，优选的，步骤（6）中将获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释至病毒抗体中和效价≥1:512，经终浓度为0.04%（v/v）的甲醛溶液37℃灭活24h；再用0.45μm滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

通过与目前普遍使用的卵黄抗体的提取方法，例如酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法相比，结果发现分别用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法和海藻酸钠硫酸铵法提取的IgY经SDS-PAGE电泳后，纯度存在明显差异，5种方法提取的IgY均在67kD和22kD左右，出现IgY的重链和轻链电泳条带，而用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法提取的IgY，还在34kD～55kD之间出现非目的蛋白的电泳条带。说明以上四种方法提取的IgY，含有杂蛋白，蛋白纯度较低，结果如图1所示。

本发明所要解决的技术问题之二，是提供一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，以解决方法现有卵黄抗体提取方法中存在的抗体效价低，抗体纯度不高，治疗效果不佳的问题，同时提供一种能够同时对Ⅰ型、新型鸭肝炎起到防治作用的二价卵黄抗体。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清Ⅰ型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的抗体；

其中，所述的血清Ⅰ型鸭肝炎病毒为鸭甲型肝炎病毒SD株，命名为DHAV-SD，分类命名为鸭甲型肝炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年12月9日，微生物保藏编号为：CGMCC No.8560；

所述的新型鸭肝炎病毒为鸭甲肝病毒JS株，命名为DHAV-JS，分类名是：鸭甲肝病毒，微生物保藏编号是：CGMCC No.6852。保藏时间是：2012年11月13日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该病毒株已记载在申请号为201210562151.7，发明名称为一种鸭甲肝病毒JS株及其在鸭病毒性肝炎防治中的应用的中国专利申请中；

（2）将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

（3）除脂

量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5-2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至pH5.0-5.2，置2～8℃保存过夜；

其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1-0.15％（w/w）的海藻酸钠以及0.02-0.08％（w/w）的NaC1，其余为纯化水；

（4）盐析

次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%（w/w），再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；

（5）抗体的纯化

沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再在进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存；

（6）抗体的灭活除菌

将获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释至鸭肝炎病毒血清Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒的抗体中和效价≥1:512，经终浓度为0.04%（v/v）的甲醛溶液37℃灭活24h；再用0.45μm滤膜过滤得到最终的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体提取液。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的高免蛋，经中和试验检测，鸭肝炎病毒血清Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒的抗体效价均≥1：1024。

在本发明中，优选的，步骤（2）中是将高免蛋浸入1‰（v/v）新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，然后用甲醛熏蒸鸡蛋30分钟。

在本发明中，优选的，步骤（3）中按所量取的卵黄体积的2倍加入海藻酸钠溶液，其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.12％（w/w）的海藻酸钠以及0.05％（w/w）的NaC1，其余为纯化水。

本发明所要解决的技术问题之三是提供一种由以上任一项所述的制备方法制备得到的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体。

本发明所要解决的技术问题之四是提供所述的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体在制备预防或治疗Ⅰ型及/或新型鸭肝炎药物中的应用。

研究结果表明，本发明采用海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀提取得到的Ⅰ型和新型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，抗体纯度高、效价高、副反应小、治疗效果明显，能够安全方便的同时用于Ⅰ型以及新型鸭肝炎的防治。

附图说明

图1为采用不同方法提取得到的IgY的SDS-PAGE电泳图。

1、蛋白Marker；2、酸化水法提取的IgY；3、聚乙二醇法提取的IgY；4、氯仿法提取的IgY；5、辛酸法提取的IgY；6、本发明的海藻酸钠-硫酸铵法提取的IgY。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备

1、生产用毒株

制苗免疫原用血清Ⅰ型鸭肝炎病毒SD株和新型鸭肝炎病毒JS株，均由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。

血清Ⅰ型鸭肝炎病毒SD株（DHAV-SD），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.8560。

新型鸭肝炎病毒JS株（DHAV-JS），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中，微生物保藏编号是：CGMCC No.6852。

2、疫苗（免疫原）的制备

2.1血清Ⅰ型鸭肝炎病毒SD株原液的制备

取血清Ⅰ型鸭肝炎病毒SD株，用灭菌生理盐水稀释1000倍，经尿囊腔接种11日龄鸭胚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育。鸭胚接种后，将24小时前死亡的鸭胚弃去。在24～96小时内死亡的鸭胚随时取出，气室向上直立于2～8℃冷却12小时后，无菌收取绒毛尿囊、胎儿、胚液及羊水，匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2.2新型鸭肝炎病毒JS株原液的制备

取新型鸭肝炎病毒JS株，用灭菌生理盐水稀释1000倍，经尿囊腔接种11日龄鸭胚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育。鸭胚接种后，将24小时前死亡的鸭胚弃去。在24～96小时内死亡的鸭胚随时取出，气室向上直立于2～8℃冷却12小时后，无菌收取绒毛尿囊、胎儿、胚液及羊水，匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2.3抗原的浓缩

将鸭肝炎病毒SD株鸭胚液和JS株鸭胚液分别倒入透析袋，扎紧透析袋两端，放入400g/L的PEG20000中进行浓缩，当浓缩到原体积的1/20时取出，加适量pH7.2PBS冲洗袋壁，使最终体积为原液的1/10，并按现行《中国兽药典》规定进行无菌检验，无菌生长，并测定毒价。每0.2ml病毒含量均不低于10^5.0ELD₅₀。

2.4灭活

浓缩后的抗原加入终浓度为0.2%（v/v）的甲醛溶液，密封置37℃作用48小时（期间6～8小时振摇1次）。

2.5灭活检验

将灭活后的SD株和JS株病毒抗原分别经尿囊腔接种11日龄鸭胚10枚，每胚0.2ml置37℃培养观察168小时。鸭胚全部健活且无病变。

2.6油乳剂灭活疫苗的制备

2.6.1水相制备

取浓缩并检验合格的SD株和JS株病毒鸭胚液，分别按每96ml鸭胚液加入4ml吐温-80，各自于灭菌容器内充分振摇使吐温-80完全溶解为止。

2.6.2油相制备

按注射用白油94份，司本-806份，硬脂酸铝1.5份的比例配制油相，混合加热完全熔解后，在115℃灭菌40分钟，冷至室温备用。

2.6.3乳化

按水相和油相1：1.5的比例，将油相分别注入预混罐中，低温搅拌的同时，各自缓慢加入两种水相，再注入乳化罐乳化5分钟。即成为接种蛋鸡鸭肝炎病毒JS株和SD株灭活疫苗。

2.7灭活疫苗检验

2.7.1性状

外观：乳白色乳剂

剂型：油包水型。取一清洁吸管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相≤0.5ml。

黏度：用1ml吸管（下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm）吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，结果：在8秒以内。

2.7.2无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果：无菌生长。

2.7.3安全检验

取健康雏鸭20只，其中10只肌肉多点注射鸭肝炎病毒JS株灭活疫苗2ml，另10只肌肉多点注射鸭肝炎病毒SD株灭活疫苗2ml。同时用条件相同的对照雏鸭10只与免疫雏鸭同条件饲养，观察10日，注射组和对照组雏鸭均健活。

3高免蛋的制备

3.1高免蛋鸡的选择

产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能，产蛋率维持在80%以上。按0.5%抽样ELISA检测禽白血病、禽传染性贫血、禽网状内皮组织增殖病，全部为阴性；监测鸡白痢和鸡支原体，二者的阳性率不超过0.1%。

3.2产蛋鸡的免疫

3.2.1基础免疫接种

将产蛋鸡肌肉多点注射鸭肝炎病毒SD株和JS株灭活疫苗各1.0ml。

3.2.2加强免疫接种

在基础免疫后10日进行第2次接种，产蛋鸡肌肉多点注射鸭肝炎病毒SD株和JS株灭活疫苗各2.0ml。

3.2.3强化免疫接种

在加强免疫后10日进行第3次接种，产蛋鸡肌肉多点注射鸭肝炎病毒SD株和JS株灭活疫苗各3.0ml。

3.2.4维持免疫接种

在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，产蛋鸡肌肉多点注射鸭肝炎病毒SD株和JS株灭活疫苗各3.0ml。

4.Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备

4.1高免蛋的采集

产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鸡蛋黄中的鸭肝炎病毒抗体效价。经中和试验检测，血清Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体效价均≥1：1024时收集鸡蛋，置2～8℃贮存。

4.2蛋壳消毒与分离卵黄

将采集的高免蛋浸入1‰（v/v）新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。然后用甲醛熏蒸鸡蛋30分钟。打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

4.3除脂

量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其2倍体积量加0.12％海藻酸钠溶液(按重量百分比计，含0.12％（w/w）海藻酸钠以及0.05％（w/w）NaC1，其余为纯化水）混合并调至pH5.2，置2～8℃保存过夜。

4.4盐析

次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%（w/w），再搅拌均匀。以4000r/min离心20分钟，弃掉上清。沉淀用适量的PBS（0.15mol/L，pH7.2）溶解沉淀。

4.5抗体纯化

溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS（0.15mol/L，pH7.2）恢复至原体积再在进行浓缩，反复3次，脱去硫酸铵，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存。

4.6抗体的灭活除菌

提取的卵黄抗体用灭菌生理盐水稀释至血清Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体中和效价均≥1:512，经终浓度为0.04%（v/v）的甲醛溶液37℃灭活24h；再用0.45μm滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

5成品检验

5.1性状检验

本品为略带白色澄明液体，久置有少量沉淀。

5.2无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

5.3支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。

5.4外源病毒检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。

5.5安全检验

用3日龄易感雏鸭10只，各颈部皮下注射抗体2.0ml/只，观察10日，全部健活。用体重18～22g小白鼠5只，各皮下注射抗体0.5ml/只，观察10日，小白鼠全部健活。

5.6铵盐残留量测定

按现行《中国药品检验标准操作规范》铵盐检查法进行测定，符合规定。

按照上述方法，分别制备了三批Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体，批号为201301，201302，201303。

实施例2Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体对Ⅰ型、新型鸭肝炎的预防和治疗效果

1、中和试验

按现行《中国兽药典》2010版附录中和试验法固定病毒稀释血清法，使用检验用种毒与系列稀释的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体（实施例1制备）中和后，分别尿囊腔接种11日龄鸭胚，连续观察7天，进行测定。结果：Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体中和效价均≥1:512。

2、攻毒保护试验

3个批次抗体各选取3日龄易感雏鸭200只，随机分为1、2组，每组100只，同时选取同批次雏鸭40只，设置为对照组3、4组，每组20只。1、2组每只颈部皮下注射Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体（实施例1制备）0.5ml，3、4组每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。24小时后，1、3组每只分别颈部皮下注射鸭肝炎病毒SD株强毒，每只0.5ml（含1000个LD₅₀）；2、4组每只分别颈部皮下注射鸭肝炎病毒JS株强毒，每只0.5ml（含1000个LD₅₀）观察10日。3个批次的抗体攻毒保护试验，结果见表1，卵黄抗体对Ⅰ型和新型鸭肝炎强毒的攻毒保护率均达98%以上，对照组雏鸭80%以上死亡。结果表明提取的卵黄抗体对Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒有较好的攻毒保护效果。

表1Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的攻毒保护效果

3、卵黄抗体的治疗效果

3个批次抗体各选取3日龄易感雏鸭200只，随机分为1、2组，每组100只，同时选取同批次雏鸭60只，设置为对照组3、4组，每组30只。1、3组注射鸭肝炎强毒JS株，每只0.5ml（含1000个LD₅₀）；2、4组注射鸭肝炎强毒SD株，每只0.5ml（含1000个LD₅₀),，攻毒1日后，1、2组雏鸭每只分别注射1.0mlⅠ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体（实施例1制备）进行治疗，结果见表2，卵黄抗体对感染Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒的雏鸭治愈率均达到97%以上，表明提取的卵黄抗体对Ⅰ型和新型鸭肝炎有较好的治疗效果。

表2Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的治疗效果

试验例1使用不同方法提取的IgY除脂率、理化性状、抗体效价及蛋白纯度的比较

为了进一步说明本发明的效果，本发明进行了以下对比实验：

1、除脂率的比较

分别采用本发明的方法以及现有技术中使用的酸化水法进行除脂，并比较二者的除脂率。

其中本发明的方法（海藻酸钠法）为：量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其2倍体积量加0.12％海藻酸钠溶液（按重量百分比计，含0.12％海藻酸钠以及0.05％NaC1，其余为纯化水）混合并调至pH5.2，置2～8℃保存过夜，IgY抗体即存在于上清液中。

酸化水法的提取方法为：量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其2倍体积量加入纯化水，搅拌均匀；用盐酸调pH值为5.2，静置6h弃掉沉淀，收集上清液，IgY抗体即存在于上清液中。

采用常规方法对获得的上清液中的脂类物质含量进行测定，结果如下表3所示：

表3本发明的方法以及酸化水法的除脂率比较

结果表明使用本发明的方法，脂类物质含量大大降低，除脂效果好，酸化水提取法除脂效果不佳，卵黄抗体中含有大量杂蛋白。

2、使用不同方法提取的IgY理化性状、抗体效价及蛋白纯度的比较

酸化水提取法：量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其2倍体积量入纯化水，搅拌均匀；用盐酸调pH值为5.2，静置6h弃掉沉淀，收集上清液,IgY抗体即存在于上清液中。

聚乙二醇法：将分离的卵黄搅成液体状，加入3倍体积的浓度为3.5%乙二醇(PEG)磷酸缓冲液（PBS,pH值为7.2,0.01mol/L）,静置4h，10000r/min离心20min,将沉淀物溶于适量PBS中，即得IgY粗提物。

氯仿提取法：将卵黄、生理盐水、氯仿按1：2：2的比例混匀后室温放置30min,3000r/min离心20min，溶液分成3层，下层为有机溶剂，中间层为变性脂蛋白，上层为提取的IgY溶液。

辛酸萃提法：向用酸化水法提取的IgY溶液中缓慢加入终浓度为1%的正辛酸,搅拌10min，放入冰箱中冷冻10min，抽滤得IgY溶液。

本发明方法（海藻酸钠-硫酸铵法）按照实施例1的方法进行。

使用常规方法分别对提取得到的IgY理化性状、抗体效价及蛋白纯度进行观察、测定，其结果如图1和下表4所示：

表4不同方法提取IgY的的理化性状和抗体效价

图1为采用不同方法提取得到的IgY的SDS-PAGE电泳图，从图1可以看出分别用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法和海藻酸钠硫酸铵法提取的IgY经SDS-PAGE电泳后，纯度存在明显差异，5种方法提取的IgY均在67kD和22kD左右，出现IgY的重链和轻链电泳条带，而用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法提取的IgY，还在34kD～55kD之间出现非目的蛋白的电泳条带。说明，以上四种方法提取的IgY，含有杂蛋白，蛋白纯度较低。

Claims (10)

1.一种卵黄抗体（egg yolk antibodies，IgY）的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）收集高免蛋；

（2）将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

（3）除脂

量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5-2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至pH5.0-5.2，置2～8℃保存过夜；

其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1-0.15％的海藻酸钠以及0.02-0.08％的NaC1，其余为纯化水；

（4）盐析

次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%，再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；

（5）抗体的纯化

沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存；

（6）抗体的灭活除菌

获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释后经甲醛溶液灭活，然后经滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤（2）中是将高免蛋浸入1‰新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，然后用甲醛熏蒸30分钟。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤（3）中按所量取的卵黄体积的2倍加入海藻酸钠溶液，其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.12％的海藻酸钠以及0.05％的NaC1，其余为纯化水。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤（6）中将获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释至病毒抗体中和效价≥1:512，经终浓度为0.04%的甲醛溶液37℃灭活24h；再用0.45μm滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

5.一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清Ⅰ型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的抗体，所述的血清Ⅰ型鸭肝炎病毒为鸭甲型肝炎病毒SD株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年12月9日，微生物保藏编号为：CGMCC No.8560；所述的新型鸭肝炎病毒为鸭甲肝病毒JS株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年11月13日，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852；

（2）将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

（3）除脂

量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5-2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至pH5.0-5.2，置2～8℃保存过夜；

其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1-0.15％的海藻酸钠以及0.02-0.08％的NaC1，其余为纯化水；

（4）盐析

次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%，再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；

（5）抗体的纯化

沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再在进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存；

（6）抗体的灭活除菌

将获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释至血清Ⅰ型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的抗体中和效价≥1:512，经终浓度为0.04%的甲醛溶液37℃灭活24h；再用0.45μm滤膜过滤得到最终的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体提取液。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的高免蛋，经中和试验检测，血清Ⅰ型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的抗体效价均≥1：1024。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中是将高免蛋浸入1‰新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，然后用甲醛熏蒸30分钟。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中按所量取的卵黄体积的2倍加入海藻酸钠溶液，其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.12％的海藻酸钠以及0.05％的NaC1，其余为纯化水。

9.由权利要求5-8所述的制备方法制备得到的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体。

10.权利要求9所述的Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体在制备预防或治疗Ⅰ型及/或新型鸭肝炎药物中的应用。

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