CN103263666B - 猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ‑166株，保藏号为CGMCC No.4545。本发明提供的猪用二联灭活疫苗在预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎方面表现出显著的技术效果。安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复、超剂量接种试验动物后安全，体温、精神状态正常，无任何临床症状；效力试验显示，本发明疫苗对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的强毒攻击有良好的保护作用，可有效的预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS）又称猪地方流行性肺炎或猪喘气病，由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhyo）引起的猪接触性慢性呼吸道疾病，呈全世界广泛流行，是严重危害养猪业健康发展的主要猪病之一。猪支原体肺炎死亡率虽然不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，可使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。
目前用于猪支原体肺炎免疫的疫苗有两种，即灭活疫苗和弱毒疫苗。国外厂家生产的多为灭活疫苗，以佐剂克服灭活疫苗的不足，因为肌肉接种，使用方便，但是价格昂贵，且免疫效果方面与国内存在差异。国内生产的弱毒疫苗可以产生较强的局部粘膜免疫力和细胞免疫力，免疫期较长，但需要胸腔内注射，使用不方便，有一定的接种副反应，并且要求疫苗免疫后一周内避免使用抗菌素。因此如何获得一种符合国内猪支原体肺炎流行状况且免疫原性好、保护效果好的灭活疫苗是当务之急。
另外，猪支原体肺炎感染后可引起猪体的免疫抑制，导致猪体的免疫功能下降，对猪的巨噬细胞、T细胞和B细胞的功能均有抑制。因此，猪群一旦发生猪支原体肺炎感染，就很容易与其它病毒和细菌发生混合感染，以猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type2，PCV2）最为常见。而现阶段，国内还没有猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎的二联灭活疫苗上市，因此一种能防治猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型混合感染的疫苗也是必不可少的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法和应用。
首先，本发明提供一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）抗原以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，保藏号为CGMCC No.4545。
其中，所述的油佐剂为Montanide ISA50V2佐剂。
其中，所述的灭活的猪肺炎支原体DJ-166株抗原含量不低于109CCU/ml。
其中，所述的灭活的猪圆环病毒2型抗原的含量不低于106.5TCID50/ml。
本发明提供的二联灭活疫苗，其含有的两种抗原之间基本上无干扰现象。
“基本上无干扰现象”是指，所述的二联灭活疫苗在免疫猪以后，两种抗原之间不会显著削弱对方的免疫效果。
本发明还提供所述的二联灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
1）分别增殖浓缩猪圆环病毒2型毒液和猪肺炎支原体菌液；
2）分别灭活猪圆环病毒2型浓缩毒液和猪肺炎支原体浓缩菌液；
3）制备油相：将Montanide ISA50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟；
4）制备水相：用步骤2）的灭活PCV2浓缩毒液稀释步骤2）的灭活Mhyo浓缩菌液，使水相中PCV2抗原含量至少为106.3TCID50/ml、Mhyo抗原含量为300～350μg/ml；
（5）乳化：将水相成分与油相成分按1:1配比乳化，先将油相加入剪切机内，2000r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以5000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
其中，所述的猪圆环病毒2型的繁殖方法包括如下步骤：
1）将猪圆环病毒2型用生长液作1:3稀释，然后按5%（V/V）的比例接种已长满80%-100%单层PK-15A细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液37℃培养72小时；
2）猪圆环病毒2型的浓缩及纯化：倒掉细胞维持液，加入1/10细胞维持液体积的0.01mo1/L PBS，置-15℃/室温反复冻融后收获，3000r/min离心20分钟，取上清。猪圆环病毒2型（DNB-SX07株）毒种每1ml病毒含量应不低于106.2TCID50；
所述生长液为含有8%新生牛血清的MEM营养液，所述维持液为含有2%新生牛血清的MEM营养液。
其中，所述的猪肺炎支原体增殖方法包括如下步骤：
1）猪肺炎支原体的繁殖：将猪肺炎支原体按10%（V/V）的比例接种猪肺炎支原体液体培养基，37℃培养9日，培养基颜色变黄，pH降至6.8时收获菌液；
2）猪肺炎支原体的浓缩及纯化：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使猪肺炎支原体菌液浓度达到1011～1012CCU/ml；将浓缩后的菌液低速离心弃沉淀；将上清高速离心，弃上清，沉淀用pH值7.2Tris-NaCl缓冲液悬浮，反复3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl缓冲液重悬至原体积1%。
其中，所述的猪圆环病毒2型灭活方法包括如下步骤：将浓缩的病毒液按1:4000（V/V）的比例加入β-丙内酯，在2～8℃下持续24小时，期间每4小时振摇1次，再经37℃水解2小时，灭活终止。
其中，所述猪肺炎支原体灭活方法包括如下步骤：给已浓缩的菌液加入浓度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的浓度达到0.01%，在2～8℃下持续灭活12小时，期间振摇2次，再经超声裂解4分钟，灭活终止。
本发明还提供所述的二联灭活疫苗在制备治疗猪圆环病毒2型和/或猪支原体肺炎引起的疾病的药物中的应用。
本发明提供的用猪肺炎支原体DJ-166株制备的猪支原体肺炎二联灭活疫苗对不同地区流行的强毒株均有很好的保护效果，且与进口疫苗相比在安全性、免疫效力和免疫产生期上无明显差别，达到进口疫苗的质量标准。
本发明的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，以江苏省地方标准（DB32/T1461-2009）猪肺炎支原体检测PCR法，设计引物扩增出特异性猪肺炎支原体P36基因片段，经过基因测序后，初步确定为猪肺炎支原体。然后又经多重PCR（猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体）、培养特性、生化特性和血清学特性鉴定，证明为猪肺炎支原体，纯净。菌株在人工合成培养基传8代稳定后，经过3次克隆纯化后制备得到该株猪肺炎支原体。本发明的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.4545。
本发明提供的猪用二联灭活疫苗在预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎方面表现出显著的技术效果。安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复、超剂量接种试验动物后安全，体温、精神状态正常，无任何临床症状；效力试验显示，本发明疫苗对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的强毒攻击有良好的保护作用，可有效的预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎；免疫持续期试验显示，免疫持续期为6个月，可确保免疫期内对猪提供有效保护。应用本发明制品免疫接种动物可一针防两病，减轻免疫接种工作量，减少免疫次数，减少对猪群的应激，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败。
附图说明
图1所示为制备二联灭活疫苗中的不同佐剂对比试验中不同佐剂疫苗免疫猪血清PCV2抗体效价曲线图。
图2所示为制备二联灭活疫苗中的不同佐剂对比试验中不同佐剂疫苗免疫猪Mhyo血清抗体S/P值曲线图。
图3所示为二联苗中两种抗原的相容性研究中免疫猪PCV2血清抗体效价曲线图。
图4所示为二联灭活疫苗的效力试验中免疫后35日攻毒猪PCV2血清抗体效价曲线图。
图5所示为二联灭活疫苗的效力试验中免疫后35日攻毒猪Mhyo血清抗体S/P值曲线图。
图6所示为二联灭活疫苗的免疫持续期试验中免疫后6个月攻毒猪PCV2血清抗体效价曲线图。
图7所示为二联灭活疫苗的免疫持续期试验中免疫后6个月攻毒猪Mhyo血清抗体S/P值曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1猪支原体肺炎灭活疫苗的制备
（1）增殖猪肺炎支原体的程序
①猪肺炎支原体的繁殖：将猪肺炎支原体按10%（V/V）的比例接种猪肺炎支原体液体培养基（配方参见CN201110001231.0），37℃培养9日，培养基颜色变黄，pH降至6.8时收获菌液，收获菌液量为50000ml。猪肺炎支原体（DJ-166株）活菌滴度为109CCU/ml。
②猪肺炎支原体的浓缩及纯化：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使猪肺炎支原体菌液浓度达到1011～1012CCU/ml，浓缩后的菌液量为7600ml。将上述菌液低速离心弃沉淀；将上清高速离心，弃上清，沉淀用pH值7.2Tris-NaCl缓冲液悬浮，反复3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl缓冲液重悬至原体积1%，获得浓缩后的菌液500ml。
③制苗菌液的检验：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，应无细菌、霉菌污染。
（2）猪肺炎支原体灭活的程序
①灭活：给已浓缩的菌液加入浓度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的浓度达到0.01%，在2～8℃下持续灭活12小时，期间振摇2次，再经超声裂解4分钟（输出功率300W，超声5秒，间歇5秒），灭活终止，进行灭活检验。
②灭活检验：取5ml灭活菌液接种于45ml猪肺炎支原体液体培养基（配方参见CN201110001231.0），置37℃培养，连续观察14日；培养到5～7日时，取0.2ml接种固体培养基，37℃培养10日；液体培养基无明显颜色变化且固体培养基上无支原体菌落生长。
③蛋白浓度测定：用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算蛋白浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260，浓缩后菌液蛋白浓度为5.85mg/ml。
（3）疫苗配制程序
①油相制备：将Montanide ISA50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟。
②水相制备：将浓缩、纯化灭活菌液用pH7.2的Tris-NaCl缓冲液稀释将蛋白浓度稀释为300μg/ml。
③乳化方法：将水相成分与油相成分按1:1配比乳化。先将油相加入剪切机内，1500r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以4000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
（4）疫苗的检验
①物理性状检验：该疫苗为油包水型，外观应为乳白色乳剂。取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应≤0.5ml。黏度测定按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，黏度为6.3s/0.4ml。
②无菌检验：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，无细菌、霉菌污染。
③硫柳汞残留量测定：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检测，平均硫柳汞残留量为0.0058%。
④安全性检验：用体重18～22g小白鼠8只，每只皮下注射疫苗0.5ml，连续观察14日，小白鼠均健活，无局部和全身不良反应。
实施例2猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）免疫猪后不同强毒攻毒保护性试验
为评价猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）的免疫效果，用该疫苗免疫猪，采用不同来源强毒株进行攻毒，以便考察该疫苗对不同地方流行强毒的攻毒保护效果。
用14～20日龄猪肺炎支原体血清抗体阴性的福建黑猪15头，每头肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）2.0ml，同时设攻毒对照15头，每头肌肉注射生理盐水2.0ml，同条件下隔离饲养。免疫后28日，将免疫组和攻毒对照组均随机分成3组，每组5头。第1组连同攻毒对照组各猪气管注射HB株（分离自河北某猪场）10ml（含0.2g病肺组织）；第2组连同攻毒对照组各猪气管注射SX株（分离自山西某猪场）10ml（含0.5g病肺组织）；第3组连同攻毒对照组各猪气管注射FJ株（分离自福建某猪场）10ml（含0.5g病肺组织）。攻毒后28日进行剖杀，按28分计分法记录各猪肺炎病变得分，计算肺炎病变减少率。
结果：
猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）免疫猪后28日采用不同强毒进行攻击，攻毒保护试验结果如表1。
表1不同强毒攻毒后保护性试验结果
从试验结果可以看出，应用DJ-166株研制的猪支原体肺炎灭活疫苗对不同地区的流行株具有良好的保护效果。
实施例3猪支原体肺炎灭活疫苗与同类制品的免疫效力对比研究试验
按实施例1制备猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）与美国辉瑞公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗（批号A063229）在免疫效力和免疫产生期进行了对比试验。
疫苗效力检验：用14～20日龄猪肺炎支原体血清抗体阴性的福建黑猪15头，分成3组，第1组每头肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）2.0ml，第2组每头肌肉注射美国辉瑞公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗2.0ml，第3组为攻毒对照组。同条件下隔离饲养。注射后28日，各组每头猪气管注射猪肺炎支原体强毒HB株10ml（含0.2g病肺组织），并于攻毒后28日进行剖杀，按28分计分法记录各猪肺炎病变得分，计算肺炎病变减少率。
免疫产生期试验：以上各组试验猪在接种疫苗后7、14、21和28日分别采血，用ELISA方法检测血清抗体滴度。结果判定：S/P值=（待检样本OD-阴性标准血清OD）/(阳性标准血清OD-阴性标准血清OD)，S/P<0.3，判为血清肺炎支原体（Mhyo）抗体阴性。S/P于0.3至0.4，判为血清肺炎支原体（Mhyo）抗体可疑。S/P>0.4，判为血清肺炎支原体（Mhyo）抗体阳性。
结果：
疫苗效力检验结果，如表2。
表2猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）与同类制品免疫猪肺炎病变评分结果
免疫产生期试验结果，如表3。
表3猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）与同类制品Mhyo血清抗体S/P值检测结果
结果表明猪支原体肺炎灭活疫苗（DJ-166株）在安全性、免疫效力和免疫产生期上均达到甚至超过进口同类制品水平。
实施例4猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗的制备
（1）增殖猪圆环病毒2型的程序
①猪圆环病毒2型的繁殖：将猪圆环病毒2型按5%（V/V）的比例接种已长满80%-100%单层PK-15A细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液37℃培养72小时。
②猪圆环病毒2型的浓缩及纯化：倒掉细胞维持液，加入1/10细胞维持液体积的0.01mo1/L PBS，置-15℃/室温反复冻融后收获，3000r/min离心20分钟，取上清，收获量3200ml。猪圆环病毒2型（DNB-SX07株，保藏号为CGMCC No.3064，公布于CN200910084906.5，在本申请中不提供保藏证明和存活证明，下同）毒种每1ml病毒含量为106.4TCID50。
③制苗毒液的检验：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
（2）猪圆环病毒2型灭活的程序
①灭活：将浓缩的病毒液按1:4000（V/V）的比例加入β-丙内酯，在2～8℃下持续24小时，期间每4小时振摇1次，再经37℃水解2小时，灭活终止，进行灭活检验。
②灭活检验：采用IFA法进行灭活检验，荧光显微镜下观察，灭活后的病毒液接种孔无荧光物质着染。
③β-丙内酯残留检测：采用高效液相色谱仪检测β-丙内酯残留，无检出。
（3）增殖猪肺炎支原体的程序
①猪肺炎支原体的繁殖：将猪肺炎支原体按10%（V/V）的比例接种猪肺炎支原体液体培养基（配方参见CN201110001231.0），37℃培养9日，培养基颜色变黄，pH降至6.8时收获菌液，收获菌液量为80000ml。猪肺炎支原体（DJ-166株）活菌滴度为109CCU/ml。
②猪肺炎支原体的浓缩及纯化：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使猪肺炎支原体菌液浓度达到1011～1012CCU/ml，浓缩后的菌液量为7600ml。将上述菌液低速离心弃沉淀；将上清高速离心，弃上清，沉淀用pH值7.2Tris-NaCl缓冲液悬浮，反复3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl缓冲液重悬至原体积1%，获得浓缩后的菌液750ml。
③制苗菌液的检验：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，应无细菌、霉菌污染。
（4）猪肺炎支原体灭活的程序
①灭活：给已浓缩的菌液加入浓度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的浓度达到0.01%，在2～8℃下持续灭活12小时，期间振摇2次，再经超声裂解4分钟（输出功率300W，超声5秒，间歇5秒），灭活终止，进行灭活检验。
②灭活检验：取5ml灭活菌液接种于45ml猪肺炎支原体液体培养基（配方参见CN201110001231.0），置37℃培养，连续观察14日；培养到5～7日时，取0.2ml接种固体培养基，37℃培养10日；液体培养基无明显颜色变化且固体培养基上无支原体菌落生长。
③蛋白浓度测定：用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算蛋白浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260，浓缩后菌液蛋白浓度为5.86mg/ml。
（5）疫苗配制程序
①油相制备：将Montanide ISA50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟。
②水相制备：用PCV2浓缩灭活毒液稀释Mhyo浓缩灭活菌液，使水相中PCV2抗原含量至少为106.3TCID50/ml、Mhyo抗原含量为300～350μg/ml。
③乳化方法：将水相成分与油相成分按1:1配比乳化。先将油相加入剪切机内，2000r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以5000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
（6）疫苗的检验
①物理性状检验：该疫苗为油包水型，外观应为乳白色乳剂。取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应≤0.5ml。黏度测定按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，黏度为6.6s/0.4ml。
②无菌检验：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检验，无细菌、霉菌污染。
③硫柳汞残留量测定：按2010版《中华人民共和国兽药典》第三部附录进行检测，平均硫柳汞残留量为0.0058%。
④安全性检验：用14～21日龄PCV2抗体及Mhyo抗体均为阴性仔猪5头，各颈部肌肉注射二联灭活疫苗4.0ml（分2点注射），观察14日，注苗局部无严重反应，无异常临床反应，且全部健活。
实施例5制备二联灭活疫苗中的不同佐剂对比试验
按佐剂生产厂家说明书推荐乳化方法，分别以MARCOL52白油佐剂、MontanideISA206佐剂、Montanide ISA50V2佐剂和杭州白油佐剂为佐剂，配制二联灭活疫苗，通过免疫猪血清抗体检测和免疫攻毒保护试验，确定最优佐剂。
按佐剂生产厂家说明书推荐比例配制疫苗A(MARCOL52白油佐剂)、疫苗B（Montanide ISA206佐剂）、疫苗C（Montanide ISA50V2佐剂）、疫苗D（杭州白油佐剂），并对以上疫苗进行性状检验。
安全检验：用14～21日龄健康易感仔猪20头，随机分成4组，每组5头，分别颈部肌肉注射四种疫苗4.0ml（分两点注射），观察14日。
效力检验PCV2部分：
用14～21日龄健康易感仔猪45头，随机分为9组，每组5头。第1、3、5和7组各颈部肌肉注射A疫苗、B疫苗、C疫苗和D疫苗，14日后用相同剂量加强免疫1次；第2、4、6、8组接种安慰剂（由PK-15A细胞PBS溶液和MARCOL52白油佐剂、Montanide ISA206佐剂、MontanideISA50V2佐剂、杭州白油佐剂乳化制成），作为攻毒对照组；第9组不免疫不攻毒，作为空白对照组。9组猪分别隔离饲养。二免后18日，第1～8组试验猪各在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。二免后56日，用DBN-SX07株病毒培养液（含105.0TCID50/ml）对第1～8组猪攻毒，每头滴鼻1.0ml，肌肉注射8.0ml，连续观察25日。攻毒后第4日，分别在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头；攻毒后第11、19日，试验猪腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免前、首免后14日、28日、42日和56日，对所有猪采血，分离血清，测定PCV2血清抗体效价。观察期结束时，将所有猪称重后扑杀，采集每头猪的腹股沟淋巴结，按免疫组化法检测PCV2抗原。根据体温、相对日增重、免疫组化和病毒血症进行判定，判定标准：a：体温，如果攻毒组试验猪体温≥40℃，且至少持续3日，则判为阳性；如果攻毒组试验猪体温<40℃，或体温≥40℃持续3日以下，则判为阴性。b：相对日增重，如果攻毒组试验猪相对日增重低于空白对照组，且差异显著（P<0.05），则判为阳性；如果攻毒组试验猪相对日增重低于空白对照组，且差异不显著（P>0.05），则判为阴性。c：免疫组化，用免疫组化法检测攻毒组试验猪腹股沟淋巴结组织，如果检测到PCV2抗原，则判为阳性；如果没有检测到PCV2抗原，则判为阴性。d：病毒血症，用国际标准试剂盒对全血进行检测，判定阴性或阳性。e：符合a、b、c和d项中的任何3项，即可判为发病。
效力检验猪支原体肺炎部分：
用14～21日龄健康易感仔猪40头，随机分为8组，每组5头。第1、3、5和7组各颈部肌肉注射A疫苗、B疫苗、C疫苗和D疫苗，14日后用相同剂量加强免疫1次；第2、4、6、8组接种安慰剂（由PK-15A细胞PBS溶液和MARCOL52白油佐剂、Montanide ISA206佐剂（法国SCIPPIC）、Montanide ISA50V2佐剂（法国SCIPPIC）、杭州白油佐剂乳化制成），作为攻毒对照组，隔离饲养。二免后56日，所有猪气管注射Mhyo（HB株）10ml（含0.4g病肺组织），连续观察25日。首免前、首免后14日、28日、42日和56日，对所有猪采血，分离血清，测定Mhyo血清抗体效价。观察期结束进行扑杀、剖检，计算肺炎病变减少率。
结果：
A疫苗、B疫苗、C疫苗和D疫苗经性状检验，外观均为乳白色乳剂，剂型均为O/W，3000r/min15分钟，管底未见水相析出，黏度分别为6.8、6.4、6.6、6.8秒/0.4ml。
安全性结果如表4。
表4不同佐剂制备疫苗接种仔猪临床反应
| 疫苗 | 佐剂 | 注射过敏反应 | 局部炎症反应 | 一过性热反应 |
| A疫苗 | MARCOL52白油佐剂 | 0/5 | 0/5 | 2/5 |
| B疫苗 | ISA206佐剂 | 0/5 | 0/5 | 2/5 |
| C疫苗 | ISA50V2佐剂 | 0/5 | 0/5 | 1/5 |
| D疫苗 | 杭州白油佐剂 | 0/5 | 0/5 | 2/5 |
不同佐剂疫苗免疫猪PCV2效力检测结果如表5和图1。
表5免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果
| 组别 | 佐剂 | 结果 |
| 第1组 | MARCOL52白油佐剂 | 5/5保护 |
| 第2组 | MARCOL52白油佐剂攻毒对照 | 4/5发病 |
| 第3组 | ISA206佐剂 | 5/5保护 |
| 第4组 | ISA206佐剂攻毒对照 | 5/5发病 |
| 第5组 | ISA50V2佐剂 | 5/5保护 |
| 第6组 | ISA50V2佐剂攻毒对照 | 4/5发病 |
| 第7组 | 杭州白油佐剂 | 5/5保护 |
| 第8组 | 杭州白油佐剂攻毒对照 | 5/5发病 |
| 第9组 | 空白对照 | 5/5正常 |
不同佐剂疫苗免疫猪猪支原体Mhyo攻毒保护试验结果如表6。
表6免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果
不同佐剂疫苗免疫猪Mhyo血清抗体S/P值检测结果如图2。
试验结果显示，Montanide ISA50V2佐剂配制的二联灭活疫苗免疫效果最好，MARCOL52白油佐剂和杭州白油佐剂次之，Montanide ISA206佐剂最差。
实施例6二联苗中两种抗原的相容性研究
PCV2部分：
用14～21日龄健康易感仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和PCV2灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（由PK-15A细胞PBS溶液和Montanide ISA50V2佐剂乳化制成），作为攻毒对照组；第4组不免疫不攻毒，作为空白对照组。4组猪分别隔离饲养。二免后18日，第1～3组试验猪各在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。二免后21日，用DBN-SX07株病毒培养液（含105.0TCID50/ml）对第1～3组猪攻毒，每头滴鼻1.0ml，肌肉注射8.0ml，连续观察25日。攻毒后第4日，分别在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头；攻毒后第11、19日，试验猪腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免前、首免后7日、14日、21日、28日和35日，对所有猪采血，分离血清，测定PCV2血清抗体效价。观察期结束时，将所有猪称重后扑杀，采集每头猪的腹股沟淋巴结，按免疫组化法检测PCV2抗原。根据体温、相对日增重、免疫组化和病毒血症进行判定。
猪支原体肺炎部分：
用14～21日龄健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和MPS灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（Tris-NaCl缓冲液和Montanide ISA50V2佐剂乳化而成），作为攻毒对照组，隔离饲养。二免后21日，所有猪气管注射Mhyo（HB株）10ml（含0.4g病肺组织），连续观察25日。首免前、首免后7日、14日、21日、28日和35日，对所有猪采血，分离血清，测定Mhyo血清抗体效价。观察期结束进行扑杀、剖检，计算肺炎病变减少率。
结果：
免疫猪PCV2血清抗体效价检验结果图3；免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果如表7。
表7免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果
| 组别 | 剂量 | 结果 |
| 第1组 | 二联灭活疫苗 | 5/5保护 |
| 第2组 | PCV2灭活苗 | 5/5保护 |
| 第3组 | 攻毒对照 | 4/5发病 |
| 第4组 | 空白对照 | 5/5正常 |
Mhyo攻毒保护试验结果如表8。
表8免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果
综上所述，试验结果显示在PCV2效力检验中，二联灭活苗免疫效果和PCV2灭活苗免疫效果相比无明显差异；在猪支原体肺炎效力检验中，二联灭活苗免疫效果和MPS灭活苗免疫效果相比也无明显差异。证明本发明的两种抗原成分之间无干扰现象。
实施例7猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗的安全性试验
对3批实验室制品（批号分别为201011、201012、201013）进行了安全性试验。试验内容包括最小使用日龄猪1次单剂量接种安全性试验、单剂量重复接种安全性试验、1次超剂量接种安全性试验、对怀孕期和泌乳期猪的安全性试验、对不同品种猪安全性试验、对猪非使用日龄的安全性试验和对非靶动物安全性试验。
结果表明，单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种后各组试验动物体温正常，精神状态及食欲良好，注射部位及全身未见不良反应，对生产性能无影响，对怀孕期和泌乳期猪、不同品种猪、非使用日龄猪和对非靶动物接种均安全。
实施例8二联灭活疫苗的效力试验
对用实施例1的方法制备得到的3批二联灭活疫苗进行效力试验，在试验同时，对比进行两种单苗的效力试验，即，将PCV2灭活苗和MPS灭活苗分别作为对照试验组。
PCV2部分：
用14～21日龄健康易感仔猪40头，随机分为4组，每组10头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和PCV2灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（由PK-15A细胞PBS溶液和Montanide ISA50V2佐剂乳化制成），作为攻毒对照组；第4组不免疫不攻毒，作为空白对照组。4组猪分别隔离饲养。首免后32日，第1～3组试验猪各在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免后35日，用DBN-SX07株病毒培养液（含105.0TCID50/ml）对第1～3组猪攻毒，每头滴鼻1.0ml，肌肉注射8.0ml，连续观察25日。攻毒后第4日，分别在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头；攻毒后第11、19日，试验猪腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免前、首免后7日、14日、21日、28日和35日，对所有猪采血，分离血清，测定PCV2血清抗体效价。观察期结束时，将所有猪称重后扑杀，采集每头猪的腹股沟淋巴结，按免疫组化法检测PCV2抗原。根据体温、相对日增重、免疫组化和病毒血症进行判定。
猪支原体肺炎部分：
用14～21日龄健康易感仔猪30头，随机分为3组，每组10头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和MPS灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（Tris-NaCl缓冲液和Montanide ISA50V2佐剂乳化而成），作为攻毒对照组，隔离饲养。首免后35日，所有猪气管注射Mhyo（HB株）10ml（含0.4g病肺组织），连续观察25日。首免前、首免后7日、14日、21日、28日和35日，对所有猪采血，分离血清，测定Mhyo血清抗体效价。观察期结束进行扑杀、剖检，计算肺炎病变减少率。
结果：
免疫猪PCV2效力检验结果如图4；免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果如表9。
表9免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果
免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果如表10；Mhyo血清抗体效价检测结果如图5。
表10免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果
综上所述，试验结果表明，二联灭活苗与相应单苗在免疫效力上，无明显差异。
实施例9二联灭活疫苗的免疫持续期试验
PCV2部分：
用14～21日龄健康易感仔猪40头，随机分为4组，每组10头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和PCV2灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（由PK-15A细胞PBS溶液和Montanide ISA50V2佐剂乳化制成），作为攻毒对照组；第4组不免疫不攻毒，作为空白对照组。4组猪分别隔离饲养。首免后6个月前3日，第1～4组试验猪各在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免后6个月，用DBN-SX07株病毒培养液（含105.0TCID50/ml）对第5～7组猪攻毒，每头滴鼻1.0ml，肌肉注射8.0ml，连续观察25日。攻毒后第4日，分别在猪的两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），4.0m1/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头；攻毒后第11、19日，试验猪腹腔注射巯基乙酸培养基，10m1/头。首免前、首免后35日、3个月、4个月、5个月和6个月，对所有猪采血，分离血清，测定PCV2血清抗体效价。观察期结束时，将所有猪称重后扑杀，采集每头猪的腹股沟淋巴结，按免疫组化法检测PCV2抗原。根据体温、相对日增重、免疫组化和病毒血症进行判定。
猪支原体肺炎部分：
用14～21日龄健康易感仔猪30头，随机分为3组，每组10头。第1、2组各颈部肌肉注射二联灭活苗和MPS灭活苗2.0ml，14日后用相同剂量加强免疫1次；第3组接种安慰剂（Tris-NaCl缓冲液和Montanide ISA50V2佐剂乳化而成），作为攻毒对照组，隔离饲养。首免后6个月，所有猪气管注射Mhyo（HB株）10ml（含0.4g病肺组织），连续观察25日。首免前、首免后35日、3个月、4个月、5个月和6个月，对所有猪采血，分离血清，测定Mhyo血清抗体效价。观察期结束进行扑杀、剖检，计算肺炎病变减少率。
结果：
免疫猪PCV2效力检验结果如图6；免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果如表11。
表11免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果
免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果如表12；Mhyo血清抗体效价检测结果如图7。
表12免疫猪Mhyo攻毒保护试验结果
综上所述，试验结果表明，二联灭活苗与相应单苗在免疫持续期上，无明显差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）抗原以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，保藏号为CGMCC No.4545，所述的油佐剂为Montanide ISA 50V2佐剂。
2.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活的猪肺炎支原体DJ-166株抗原含量不低于109CCU/ml。
3.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活的猪圆环病毒2型抗原的含量不低于106.5TCID50/ml。
4.如权利要求1~3任一项所述的二联灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
1）分别增殖浓缩猪圆环病毒2型毒液和猪肺炎支原体菌液；
2）分别灭活猪圆环病毒2型浓缩毒液和猪肺炎支原体浓缩菌液；
3）制备油相：将Montanide ISA 50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟；
4）制备水相：用步骤2）的灭活PCV2浓缩毒液稀释步骤2）的灭活Mhyo浓缩菌液，使水相中PCV2抗原含量至少为106.3TCID50/ml、Mhyo抗原含量为300~350µg/ml；
5）乳化：将水相成分与油相成分按 1:1 配比乳化，先将油相加入剪切机内，2000r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以5000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型的增殖方法包括如下步骤：
1）将猪圆环病毒2型用生长液作1:3稀释，然后按5%（V/V）的比例接种已长满80%-100%单层PK-15A细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液37℃培养72小时；
2）猪圆环病毒2型的浓缩及纯化：倒掉细胞维持液，加入1/10细胞维持液体积的0.01mo1/L PBS，置-15℃/室温反复冻融后收获，3000r/min离心20分钟，取上清，猪圆环病毒2型DNB-SX07株毒种每1ml病毒含量应不低于106.2 TCID50；
所述生长液为含有8%新生牛血清的MEM营养液，所述维持液为含有2%新生牛血清的MEM营养液。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的猪肺炎支原体增殖浓缩方法包括如下步骤：
1）猪肺炎支原体的增殖：将猪肺炎支原体按10%（V/V）的比例接种猪肺炎支原体液体培养基，37℃培养9日，培养基颜色变黄，pH降至6.8时收获菌液；
2）猪肺炎支原体的浓缩及纯化：用超滤膜系统将猪肺炎支原体菌液进行浓缩，使猪肺炎支原体菌液浓度达到1011~1012CCU/ml；将浓缩后的菌液低速离心弃沉淀；将上清高速离心，弃上清，沉淀用pH值7.2 Tris-NaCl缓冲液悬浮，反复3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl缓冲液重悬至原体积1%。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型灭活方法包括如下步骤：将浓缩的病毒液按1:4000（V/V）的比例加入β-丙内酯，在2~8℃下持续24小时，期间每4小时振摇1次，再经37℃水解2小时，灭活终止。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体灭活方法包括如下步骤：在浓缩的菌液中加入浓度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的浓度达到0.01%，在2~8℃下持续灭活12小时，期间振摇2次，再经超声裂解4分钟，灭活终止。
9.权利要求1~3任一项所述的二联灭活疫苗在制备治疗猪圆环病毒2型和/或猪肺炎支原体引起的疾病的药物中的应用。
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| CN108697782A (zh) * | 2016-03-23 | 2018-10-23 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对pcv2病毒和猪肺炎支原体感染的组合疫苗 |
| CN106729768A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种猪支原体肺炎疫苗效力检验方法 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090017064A1 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
| CN101948536A (zh) * | 2010-05-10 | 2011-01-19 | 洛阳普莱柯生物工程有限公司 | 猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法 |
| CN101980720A (zh) * | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
| CN102154167A (zh) * | 2011-01-05 | 2011-08-17 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090017064A1 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
| CN101980720A (zh) * | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
| CN101948536A (zh) * | 2010-05-10 | 2011-01-19 | 洛阳普莱柯生物工程有限公司 | 猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法 |
| CN102154167A (zh) * | 2011-01-05 | 2011-08-17 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法 |
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