CN112294953A

CN112294953A - 一种pcv2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及制备方法

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Publication number: CN112294953A
Application number: CN202011629263.0A
Authority: CN
Inventors: 于萍萍; 车艳杰; 刘奇; 汤波; 聂思静; 刘飞; 刘运平; 张渊魁; 王敏
Original assignee: Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-02-02

Abstract

本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗，并进一步公开其制备方法和应用。本发明所述三联灭活疫苗，含有灭活的猪圆环病毒2型杆状病毒表达的Cap蛋白、灭活的猪肺炎支原体和灭活的副猪嗜血杆菌13型疫苗的佐剂，三种抗原之间无干扰，可实现一针免疫三种保护，一次免疫即可预防三种疫病；同时，从攻毒保护和血清抗体水平看，其免疫效果达到或超过各商品单苗的水平，免疫剂量为2.0ml/头，即可达到各单苗的2次免疫效果，免疫持续期长，效力持久，具备了安全性好、制备方法简单、免疫方便、降低免疫成本等优点。

Description

一种PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及制备方法

技术领域

本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及一种PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，并进一步公开其制备方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒又称为猪的“艾滋病”，感染猪的免疫系统会被完全破坏，丧失对其他疫苗的免疫应答能力，导致免疫失败，同时导致其他病原体的继发感染。其中，据统计，临床上由猪圆环病毒引起的继发感染通常超过50%，死亡率达到40%以上。其中，猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）能引起仔猪断奶多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、猪皮肤和肾病综合征（PDNS）、母猪繁殖障碍等，给全世界养猪业造成极大的经济损失。国内猪场流行以PCV2a亚型为主，同时有部分PCV2b亚型毒株，两者之间有一定的交叉保护，但是不能完全保护。PCV2基因组全长1767/1768bp，共有11个开放阅读框（Openreading frames，ORFs），其中ORF2编码病毒唯一的结构蛋白核衣壳蛋白（CAP），该蛋白有234个氨基酸组成，分子量为28KD，可自我装配成病毒样粒子，是主要的免疫原性蛋白并能诱导特异性PCV2中和抗体（Pogranichnyy et al，2000），因此，ORF2基因是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，又称猪喘气病，具有高发病率和低病死率的特点，属国家二类动物疫病，在世界范围内广泛流行，一旦在猪场感染便难以控制，每年给我国的养猪业造成巨大的经济损失，是造成现代养猪业经济损失的重要疾病之一。猪支原体肺炎主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。猪肺炎支原体不仅是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一，单纯感染时常引起温和型慢性肺炎，当与其他病原混合感染时，呼吸道疾病加重，引起猪只呼吸道疾病综合征（Porcine respiratorydisease complex，PRDC）。大量研究已表明猪肺炎支原体与其他病原体具有协同感染的作用，大多数情况下，协同猪肺炎支原体感染的病原体能增加相关疾病的严重性和潜在的持久性。

副猪嗜血杆菌病（Haemophi Iusparasusi，Hps）又称猪革拉斯氏病，是由副猪嗜血杆菌引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的细菌性传染病，在我国猪群中普遍存在，已成为全球范围内影响养猪业的一大重要细菌性疾病。其主要临床症状表现为发热、精神沉郁、食欲下降或厌食、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等；剖检病变主要表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。该病发病没有明显的季节性，多呈地方流行性，主要危害2周龄至4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5-8周龄猪的猪，严重时病死率高达50%，育肥前期的猪发病率为20%，母猪发病可诱发流产或死亡，可造成严重的经济损失。副猪嗜血杆菌存在大量的异源基因，血清学比较复杂，目前按琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20%以上血清型不可确定，其中1、5、10、12、13和14型毒力最强毒，2、4和15型为中等毒力，3、6、7、8、9和11型无毒力。根据美国、德国、加拿大、日本和西班牙等国家的血清流行病学调查，以4型、5型、13型最为流行。HPS各种血清型之间的致病力差异较大，不同血清型或不同菌株之间的免疫交叉保护力较低。因此研制具有高效交叉保护力的疫苗时预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求。

目前，防控猪圆环病毒2型（PCV2）病毒病、猪肺炎支原体以及副猪嗜血杆菌病的主要方法是接种疫苗，而国内市场上使用的疫苗主要是PCV2单苗、猪肺炎支原体单苗和副猪嗜血杆菌单苗。其中，猪圆环病毒2型疫苗主要是PCV2全病毒灭活疫苗、PCV1-PCV2嵌和病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达PCV2基因工程疫苗或者大肠杆菌表达PCV2基因工程苗。其中，全病毒灭活疫苗对机体刺激时间比较短，需2次接种，而且PCV2在细胞上增殖滴度低，制备费用高；基因工程亚单位疫苗相对于其他疫苗，疫苗抗体产生的更早，抗体水平稳定，能够有效阻止病毒的复制，保护力强。尤其是杆状病毒表达的CAP蛋白的亚单位疫苗是国内研究的热点，因其表达的蛋白修饰完整，接近病毒天然蛋白，免疫原性好，所以该系统成为研制基因工程亚单位疫苗的首选。但是，基因工程亚单位疫苗对抗原及佐剂的要求较高，因此，寻求一种有效持续，副作用小佐剂极为关键。现有技术佐剂材料中，水佐剂疫苗在市场上备受青睐，但水佐剂控缓释效果不如油佐剂，因此，配合一种长效控缓释的免疫增强剂十分必要。

目前，国内并没有针对于猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌的联苗商品，本发明填补了国内自主研发猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗的空白。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高免疫原性、无安全隐患、免疫成本低廉的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗，所述灭活疫苗可用于同时预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎及副猪嗜血杆菌病；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，所述疫苗含有灭活的PCV2型CAP蛋白抗原、灭活的猪肺炎支原体抗原、灭活的副猪嗜血杆菌抗原，以及，疫苗佐剂；其中，

所述的PCV2型CAP蛋白抗原为参照PCV2a和PCV2b分离株，在保持氨基酸不变的前提下，经人工合成密码子优化，将密码子改造为昆虫细胞杆状病毒表达系统偏嗜密码子的PCV2ORF2序列，并在序列两端引入EcoRI和XhoI酶切位点，通过双酶切插入pF astBac1转移载体中，经克隆、转染分别获得重组杆状病毒后，经感染SF9或 highfive细胞高效表达的CAP蛋白抗原。

优选的，所述PCV2a型CAP蛋白和PCV2b型CAP蛋白的浓度比为1：1。

具体的，所述PCV2型CAP蛋白抗原包括PCV2a型CAP蛋白和PCV2b型CAP蛋白；

所述PCV2a型CAP蛋白的编码基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述PCV2a型CAP蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

所述PCV2b型CAP蛋白的编码基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述PCV2b型CAP蛋白具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

具体的，所述猪肺炎支原体抗原为保藏编号为CGMCC NO.4545的猪肺炎支原体DJ-166病毒株，经改良CH培养基增殖、浓缩、纯化并灭活得到的猪肺炎支原体抗原。

具体的，所述副猪嗜血杆菌抗原血清为HN01株经增殖、浓缩、纯化并灭活得到的副猪嗜血杆菌抗原。优选的，所述副猪嗜血杆菌抗原血清包括4型、5型和13型。

具体的，所述的三联灭活疫苗：

所述PCV2型CAP蛋白抗原的含量≥4μg/头份，优选所述PCV2型CAP蛋白抗原的含量为35-100µg/头份，更优选为35µg/头份；

所述猪肺炎支原体抗原的含量≥100μg/头份，优选猪肺炎支原体含量100-300µg/头份，更优选为100µg/头份；

所述副猪嗜血杆菌抗原血清的含量≥1.0×10⁸CFU/头份，优选所述副猪嗜血杆菌含量1.0×10⁸-1.0×10¹⁰CFU/头份，更优选为1.0×10⁸ CFU/头份，更优选所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型和13型含量均≥1.0×10⁸CFU/头份。

具体的，所述的疫苗佐剂包括铝盐佐剂、矿物油佐剂、化学物质佐剂或水溶性佐剂。

具体的，所述的水溶性佐剂包括ISA251C佐剂组合物、ISA1313佐剂、壳聚糖佐剂、NP40佐剂。

具体的，所述的水溶性佐剂组合物包括ISA251C、硫代硫酸钠1%-3.5%和苏氨酸0.2%-2%，优选包括ISA251C、硫代硫酸钠3.5%和苏氨酸0.5%。

具体的，所述PCV2型CAP蛋白抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗灭活剂包括β-丙内酯、硫柳汞和甲醛溶液。优选的，所述PCV2型杆状病毒表达的Cap蛋白灭活剂为BEI（二乙烯亚胺），所述猪肺炎支原体灭活剂为硫柳汞，所述副猪嗜血杆菌灭活剂为甲醛溶液。

具体的，所述的三联灭活疫苗含有：PCV2型Cap蛋白含量至少4µg/头份，猪肺炎支原体蛋白含量至少为100µg/头份，副猪嗜血杆菌含量至少为1.0×10⁸CFU/头份。

具体的，所述的三联灭活疫苗含有：PCV2型Cap蛋白含量至少8µg/头份，猪肺炎支原体蛋白含量至少为150µg/头份，副猪嗜血杆菌含量至少为2.0×10⁸CFU/头份。

具体的，所述的三联灭活疫苗含有：PCV2型杆状病毒表达的Cap蛋白4µg/头份，猪肺炎支原体150µg/头份，副猪嗜血杆菌2.0×10⁸ CFU/头份，ISA251C、3.5%硫代硫酸钠和0.5%苏氨酸，使其占疫苗总量的20%（V/V）。

本发明还公开了一种制备所述三联灭活疫苗的方法，包括将所述PCV2型CAP蛋白抗原、所述猪肺炎支原体抗原和所述副猪嗜血杆菌抗原血清分别进行灭活浓缩的步骤，并按照选定的配比与所述疫苗佐剂进行混合的步骤。

具体的，所述三联灭活疫苗的制备方法，还包括获得所述PCV2型CAP蛋白抗原的步骤，具体包括：

（1）参照已知的PCV2a和PCV2b亚型分离毒株的CAP蛋白序列，在保持氨基酸不变的前提下，将密码子改造为昆虫细胞杆状病毒表达系统偏嗜密码子，并在序列两端引入EcoRI和XhoI酶切位点，通过双酶切插入pF astBac1转移载体中，分别获得重组杆状病毒转移载体pFastBac1-ORF2a和pFastBac1-ORF2b；

（2）将获得重组杆状病毒转移载体转化DH10Bac™ E. Coli,同源重组，获得重组杆状病毒DNA；

（3）分别将重组杆状病毒DNA转染SF9细胞、包装，产生表达PCV2 CAP蛋白的重组杆状病毒DBN01a和DBN01b株；

（4）将所得重组杆状病毒DBN01a和DBN01b株感染SF9或者 high five细胞，获得重组的PCV2 CAP蛋白病毒样粒子，经检测PCV2 CAP蛋白浓度，表达水平不低于200μg/ml时，灭活病毒；

（5）分离纯化重组的PCV2型CAP蛋白，即得。

具体的，所述步骤（4）中，即利用生物反应器无血清培养基悬浮培养SF9细胞或者high five，细胞密度2.0×10⁶-2.5×10⁶/ml，按照感染复数（MOI）为0.5-5.0的接种量接种步骤（3）所述的重组杆状病毒，培养5-7天后收获。

优选的，控制生物反应器的培养参数设定为pH6.2-7.2，温度27℃，溶氧20%-60%，搅拌速度90-160rpm。

具体的，所述的生物反应器包括5L、10L、50L、500L培养方式采用批式培养方法，分批补料培养方法或者二者的组和进行培养。

具体的，所述步骤（4）中，所述PCV2 CAP蛋白浓度测定，将收获的细胞培养物与标准蛋白（BSA）进行SDS-PAGE检测，参照标准蛋白浓度，通过灰度分析确定Cap蛋白浓度。

具体的，所述步骤（5）中，采用50-100kD超滤膜包对澄清的细胞培养物进行3-5倍浓缩纯化。

具体的，所述灭活步骤使用BEI，浓度为0.1%-5%，灭活温度为30-37℃，灭活时间为24h-48h，灭活结束后用硫代硫酸钠中和过量的BEI。优选为，所述的BEI灭活浓度为0.1%，37℃，灭活24h。

具体的，所述三联灭活疫苗的制备方法，还包括获得所述猪肺炎支原体抗原的步骤，具体包括：将所述猪肺炎支原体病毒株接种至改良CH液体培养基中，于37℃发酵罐20%通氧量条件下培养3-4日的步骤，经收获并测定活菌滴度测定不低于10¹¹CCU/ml，纯化，即得。

具体的，所述CH液体培养基具体成分包括：

A液：脑心浸出液2.0g、PPLO肉汤5.0g、去离子水300ml以上成分混合，搅拌，使之完全溶解，116℃高压灭菌20分钟，冷却后备用；

B液：10×Hank’s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠0.8g、蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.1g、0.1%酚红、青霉素400U/ml、去离子水545ml；以上各成分混合、搅拌，使之完全，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用；

C液：健康马血清140ml；

将上述A液、B液和C液充分混合均匀，以1mol/L氢氧化钠pH至7.6，即得所需猪肺炎支原体改良CH液体培养基。

优选的，所述猪肺炎支原体接种比例为8%-10%。

具体的，所述猪肺炎支原体抗原的纯化步骤包括：

（1）收集发酵液，以50KD膜包浓缩至原体积的1/10，再以10000r/min 4℃离心60分钟，沉淀菌体用pH7.2-7.4的Tris-NaCl缓冲液悬浮，离心洗涤3次，制成原培养物体积1/100菌悬液；

（2）将浓缩纯化菌悬液加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，混合均匀，置2-8℃灭活12小时；

（3）用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，1/100浓缩菌液蛋白浓度应≥4mg/ml，即可。

具体的，所述三联灭活疫苗的制备方法，还包括获得所述副猪嗜血杆菌抗原的步骤，具体包括：将所述副猪嗜血杆菌HN01株接种至TBS液体培养基中，于37℃发酵罐150rpm条件下培养12-15h的步骤，经收获并测定活菌数量不低于50亿时，收获菌液，纯化，即得。

优选地，本发明所述的三联灭活疫苗的制备方法中，所述的PCV2型Cap蛋白含量至少为4µg/头份，猪肺炎支原体蛋白含量至少为100µg/头份，副猪嗜血杆菌含量至少为1.0×10⁸CFU/头份。

优选地，本发明所述的三联灭活疫苗的制备方法中，所述的猪圆环病毒杆状病毒表达的Cap蛋白浓缩至含量为50µg/头份，猪肺炎支原体浓缩至含量为150µg/头份，副猪嗜血杆菌浓缩至含量为1.0×10⁹CFU/头份。

本发明所述PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，含有灭活的PCV2型杆状病毒表达的Cap蛋白、灭活的猪肺炎支原体和灭活的副猪嗜血杆菌13型疫苗的佐剂；其中，所述的PCV2型杆状病毒载体是PCV2型分离株，包含PCV2a型和PCV2b型两种亚型毒株，且CAP蛋白密码子经过昆虫细胞杆状病毒密码子优化，人工合成的密码子优化的PCV2 ORF2序列，克隆、转染SF9细胞获得重组杆状病毒，然后感染SF9或者 high five细胞高效表达CAP蛋白病毒样粒子（VLPs），提高了蛋白的免疫原性；从蛋白表达水平上不低于200μg/ml，蛋白表达量高，每头份最低用量4μg，每毫升可以制备50头份从而降低生产成本；所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，活菌滴度不低于10¹⁰CCU/ml，免疫原性好，猪肺炎支原体含量不低于100μg/头份；所述副猪嗜血杆菌含量至少为1.0×10⁸CFU/头份。本发明的三联灭活疫苗三种抗原之间无干扰，可实现一针免疫三种保护，一次免疫即可预防四种疫病，节省了人力、物力和财力，有效减少动物的应激反应，避免了因频繁免疫造成的免疫麻痹和免疫失败；同时，从攻毒保护和血清抗体水平看，其免疫效果达到或超过各商品单苗的水平，免疫剂量为2.0ml/头，即可达到各单苗的2次免疫效果，免疫持续期长，效力持久，具备了安全性好、制备方法简单、免疫方便、降低免疫成本等优点。

本发明所述预防PCV2型、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌（13型）感染的三联灭活疫苗，在佐剂中加入硫代硫酸钠和苏氨酸后，可显著提高抗体水平，且产生保护性抗体的时间早，对预防PCV2型、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌的感染起到良好的效果，能同时预防PCV2型、猪喘气病和副猪嗜血杆菌血清13型感染，免疫成本低廉，实用性强。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明的重组杆状病毒转移载体pFastBac1-ORF2鉴定图；

图2所述重组bacmid PCR鉴定图；

图3感染重组杆状病毒后SF9的病变图和健康SF9细胞图；

图4本发明表达的CAP蛋白形成病毒样粒子（VLPs）电镜图；

图5为PCV2b型CAP 蛋白SDS-PAGE灰度分析定量图及特异性检测图；

图6为本发明的三联灭活疫苗制备方法流程图；

图7为本发明经过基因修饰和基因密码子修饰的PCV2型蛋白与常规未经基因修饰和基因密码子修饰的PCV2型蛋白的差异。

具体实施方式

实施例1PCV2型重组杆状病毒的构建

目的基因的优化与合成

参照PCV2b亚型DBN-SX07株设计PCV2型ORF2b基因核苷酸序列，得到PCV2b亚型株ORF2b基因的原始核苷酸序列如SEQ ID No.5所示（702bp），PCV2b亚型株Cap蛋白的原始氨基酸序列如SEQ ID No.6所示（233aa）。

本实施例中以PCV2b亚型株ORF2b基因的优化为例，详细阐述其密码子优化过程，相应PCV2a亚型株ORF2a基因的优化参照该过程进行。

在保持PCV2b亚型株ORF2b氨基酸不变的前提下，将密码子改造为昆虫细胞杆状病毒表达系统偏嗜密码子，序列两端引入EcoRI和XhoI酶切位点，通过双酶切插入pFastBac转移载体中，获得重组杆状病毒转移载体，命名为pFastBac1-ORF2b。

重组杆状病毒转移载体的扩增与鉴定

将获得的重组杆状病毒转移载体pFastBac1-ORF2b转化DH5α大肠杆菌扩增，采取常规提取质粒方法提取重组杆状病毒转移载体；通过EcoRI和XhoI双酶切鉴定重组杆状病毒转移载体，如图1所示，电泳可见737bp的目的条带大小和4775bp的pFastBac1两个条带。

重组杆状病毒的DNA的获得

将pFastBac1-ORF2b转化DH10Bac™ E. Coli,同源重组，涂布于LB三抗选择培养平板（含：50μg/ml卡那霉素kanamycin，7μg/ml 庆大霉素gentamicin，10μg/ml四环霉素tetracycline，100μg/ml Bluo-gal和40μg/ml IPTG），37℃培养48h后挑选白色菌落，采用如下通用引物M13PCR鉴定，阳性菌落核酸电泳应出现3000bp左右的条带。

M13 Forward (-40)：5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′ ；

M13 Reverse：5′CAGGAAACAGCTATGAC3′。

挑选鉴定阳性的菌落划线再次纯化，经PCR鉴定阳性的菌落，冻-20℃备用。鉴定结果如图2所示。

采用的50ulPCR体系（可微调）包括：

10X Taq Buffer（appropriate for enzyme） 5ul；

dNTP Mix 4ul；

M13 Forward(-40)（10nm） 2ul；

M13 Reverse（10nm） 2ul；

Taq polymerase（5units/μl） 1ul；

Sterile Water 35ul；

菌液或提出的重组bacmid DNA（100ng） 1ul。

PCR程序设定（步骤2-4循环25-35次）如下：93℃ 3min，94℃ 45s，55℃ 45s，72℃5min，72℃ 7min。

重组杆状病毒的获得

采用异丙醇沉淀法提取重组杆状病毒DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，浓度较高（500ng/ul或以上），参照说明书使用Cellfection转染试剂（购自Iinvitrogen）转染sf9细胞，27℃培养，72h-96h出现明显的细胞病变。可明显看出细胞变大，出现颗粒样物质，细胞囊泡化，收获重组杆状病毒DBN01株，感染重组杆状病毒后SF9的病变图和健康SF9细胞图如图3所示。

表达产物的鉴定

将毒种以病毒感染指数即MOI（附注4）=0.5-5.0接种于生长良好、细胞密度为2.0×10⁶-2.5×10⁶/ml、活力≥95%的SF9细胞，27℃培养96-120小时，收获细胞培养物，进行Western Blot鉴定，应出现分子量为28KD特异性条带。所得PCV2型CAP蛋白具有如SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

实施例2昆虫细胞生物反应器无血清悬浮培养表达CAP蛋白

生产用毒种制备

将基础毒种按MOI=0.01-5.0接种生长良好、细胞密度为2.0×10⁶-2.5×10⁶/ml的Sf9细胞，27℃培养72-96小时，收获病毒液，定量分装，注明名称、收获日期、毒种代次等，进行病毒含量检测，特异性检测，纯净性检测后，病毒含量在≥1.0×10⁸PFU/ml，2-8℃保存备用。

生物反应器无血清悬浮培养SF9细胞及CAP蛋白表达定量

用悬浮细胞培养方法。取2000ml摇瓶培养SF9细胞800ml，细胞活率95%，细胞密度达到2.0×10⁶-2.5×10⁶个细胞/ml时，按照0.5×10⁶个细胞/ml转移到5L生物反应器，继续培养3-4天，待细胞密度达到2.0×10⁶-2.5×10⁶个细胞/ml时，细胞活率95%以上时，按照0.5×10⁶个细胞/ml转移到50L生物反应器，继续培养。

其中，摇瓶培养条件为27℃，120prm/min，生物反应器参数设置为：pH6.2-7.2，温度27℃，溶氧20%-60%，搅拌速度90-160rpm。待细胞密度达到2.5×10⁶个细胞/ml，按照MOI=2接种重组杆状病毒DBN01b株，27℃培养96-120小时，收获细胞培养物，注明名称、收获日期、批号等，置2-8℃保存。本发明表达的CAP蛋白形成病毒样粒子（VLPs）电镜图如附图4所示。

蛋白的定量

将收获的细胞培养物与标准蛋白（BSA）进行SDS-PAGE检测，参照标准蛋白浓度，通过灰度分析确定Cap蛋白浓度，应不低于200mg/ml，Western-blot检测应出现28KD左右的条带，结果如图5所示。

蛋白的灭活

对收获的细胞培养物用孔径为10-15µm超滤系统过滤去除细胞碎片，随后向细胞培养物中加入4%BEI溶液，使其终浓度为0.1%，37℃灭活24小时，灭活结束后，向细胞培养物中加入50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2%，搅拌1小时终止灭活，2-8℃保存。

蛋白纯化

灭活后用50-80kD超滤膜包对澄清的细胞培养物进行3-5倍浓缩纯化，2-8℃保存，不超过35日。

蛋白的检测鉴定

取灭活后的细胞培养物，接种Sf9细胞，进行MTT灭活检验。同时设接种未灭活重组杆状病毒DBN01株的Sf9细胞作为阳性对照，正常Sf9细胞作为阴性对照。当阳性对照组检测孔读数均低于比对标准值时，阴性对照和灭活样品检测孔读数均不低于比对标准值，则判为灭活完全。结果灭活样品检测孔读数低于比对标准值。

将灭活的Cap蛋白培养物用Tris-Nacl缓冲液稀释为20µg/ml，配苗，备用。

实施例3

本实施例中，参照PCV2a亚型毒株设计PCV2型ORF2a基因核苷酸序列，得到PCV2a亚型株ORF2a基因的原始核苷酸序列如SEQ ID No.7所示（702bp），PCV2a亚型株Cap蛋白的原始氨基酸序列如SEQ ID No.8所示（233aa）。

同样的，上述PCV2a亚型株ORF2a基因的优化过程参照上述实施例1-2方法进行，所得PCV2b型CAP蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

实施例4猪肺炎支原体DJ-166株的菌液增殖制备

本实施例中，所述猪肺炎支原体DJ-166株是从山西发病猪肺脏分离，经过2次亚克隆而来，菌种免疫原性好，制备疫苗后免疫猪保护率80%以上，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCCNo.4545。

本实施例中，所述CH液体培养基具体成分包括：

B液：10×Hank’s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠0.8g、蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.1g、0.1%酚红、青霉素400U/ml、去离子水545ml；以上各成分混合、搅拌，使之完全，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用：

C液：健康马血清140ml；

一级种子繁殖：将冻干菌种按5%-10%比例接种改良CH液体培养基，置37℃培养3-4日，当培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.8-7.0左右时收获菌液，作为一级种子。

二级种子繁殖：取一级种子按5%-10%接种改良CH液体培养基，置37℃培养3-4日，当培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.8-7.0左右时收获菌液，经纯粹检验合格后作为二级种子。

用发酵培养法培养。将二级种子按5%-10%接种于改良CH液体培养基，置37℃、20%通氧量发酵罐中培养4-5日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.5-6.8时收获菌液。置2-8℃保存，应不超过15日。

取12只无菌试管，每管装4.5ml CH液体培养基，在第1管加入0.5ml培养物，混合均匀后取0.5ml加入第2管，如此连续10倍系列稀释至10^-11，同时设未加菌液改良CH液体培养基为阴性对照。置37±1℃培养14日，在培养基pH值下降0.5以下的最末1管作为菌液的CCU。经检测鉴定，菌液应纯粹无杂菌，且活菌计数CCU应10¹¹ml。

实施例5猪肺炎支原体DJ-166株抗原的浓缩纯化灭活及蛋白定量

浓缩纯化

将收获的菌液取样按2010版《中国兽药典》附录进行纯粹检验，并取样进行活菌滴度测定。将收获的菌液经30KD-50KD膜包浓缩至原体积的1/10，再以10000r/min 4℃离心60分钟，沉淀菌体用Tris-NaCl（pH值7.2-7.4）缓冲液悬浮，离心洗涤3次，制成原培养物体积1/100菌悬液，置-40℃保存。

灭活

将浓缩纯化菌在冰水浴中超声4分钟，输出功率250-300W，再加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，混合均匀，置2-8℃灭活12小时（期间振摇2次），2-8℃保存，应不超过35日。

灭活检验

取5.0ml灭活菌液接种45ml 改良CH液体培养基，置37℃培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，改良CH液体培养基为阴性对照。并取出0.2ml接种固体培养基，置5% CO₂环境，37℃培养10日，观察有无支原体菌落生长。当阳性对照出现明显颜色变化（pH值下降0.5以下），阴性对照应无颜色变化，灭活菌液无颜色变化，固体培养基未见到猪肺炎支原体典型菌落，判为灭活完全。若液体培养基中出现恒定的pH变化、固体培养基上出现典型的猪肺炎支原体菌落，判为灭活不完全。

支原体抗原浓度测定量

通过BCA蛋白定量试剂盒定量，将灭活的猪肺炎支原体用Tris-Nacl缓冲液稀释为750µg/ml，准备配苗。

实施例6副猪嗜血杆菌（13型）的菌液制备

一级种子繁殖：将副猪嗜血杆菌13型HN01株冻干菌种划线接种于含0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和5%新生牛血清的胰蛋白大豆琼脂（TSA）平板，37℃培养18-24小时，挑选5个单个典型菌落，接种含0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和5%新生牛血清的胰蛋白大豆琼脂（TSA）斜面，37℃培养18-24小时，纯粹检验合格后，作为一级种子。

二级种子繁殖：将一级种子挑选的单个菌落，接入含0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和5%新生牛血清的胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基中，37℃摇床培养200rpm振荡培养12小时，取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无杂菌生长，作为二级种子。

用发酵培养法培养。将鉴定合格副猪嗜血杆菌13型HN01株分别按1%比例（V/V）接种TBS液体培养基，37℃、150rpm搅拌培养12-15小时，当活菌数量达到50亿时收获菌液。

取收获的菌液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7共计2个稀释度分别接种于TSA固体培养基各3个，每个平板接种0.1ml，摇动平板，使菌液表面散布均匀，置37℃放置60分钟后，平板倒置培养24小时，计算每个稀释度的平均菌落数，乘以稀释倍数，既是菌液的活菌数。

副猪嗜血杆菌（13型HN01株）菌液处理：将培养的副猪嗜血杆菌（13型HN01株）以连续流10000rpm离心，再以Tris-Nacl缓冲液（pH值7.2-7.4）恢复至原体积。

副猪嗜血杆菌（13型HN01株）的灭活

将上述制得菌液，加入终浓度为0.3%（V/V）甲醛溶液，37℃灭活24小时，期间每2小时振摇1次，灭活后将菌液置2-8℃保存，不超过3个月。

猪肺炎支原体灭活检验

将灭活的菌液取0.2ml接种2个TSA固体培养基平皿中，用接种环进行划线后，37℃培养24-48小时观察菌落生长情况，同时设TSA同批的固体培养基平皿2个不接种菌液作为对照。结果4个平皿中均应无细菌生长，灭活完全。

将灭活的副猪嗜血杆菌菌液用Tris-Nacl缓冲液稀释为灭活前3.3×10⁹CFU/ml，备用，配苗。

实施例7配苗

如图6所示的工艺流程图，按照前述实施例1-6中方案分别得到所需PCV2a型CAP蛋白抗原、PCV2b型CAP蛋白抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原，备用。

佐剂配制

将ISA251C佐剂灭菌后，加入50%的硫代硫酸钠，使其终浓度为3.5%，并加入30%的苏氨酸溶液，使其终浓度为0.5%，于120rpm搅拌10分钟混合均匀备用。

将以上各成分按下表所示比例进行混合，将含量合格的PCV2型Cap蛋白抗原（控制CAP蛋白两种亚型之间的加入比例为1：1）、猪肺炎支原体抗原13型HN01株抗原与所述佐剂混合，室温搅拌30分钟，生产三联灭活疫苗。

本实施例中PCV2型Cap蛋白含量为8µg/头份；猪肺炎支原体抗原含量为150µg/头份；副猪嗜血杆菌抗原（4型JS01株、5型FJ04株和13型HN01株）灭活前含量各为1.0×10⁹CFU/头份。本实施例所述三联灭活疫苗的成分如下表1。

表1三联灭活疫苗的成分及配比

无菌条件下以500ml/瓶、250ml/瓶、100ml/瓶或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，压上铝塑盖，获得三联灭活疫苗。PCV2型Cap蛋白含量为8µg/头份；猪肺炎支原体抗原含量为150µg/头份；副猪嗜血杆菌抗原13型HN01株灭活前含量各为1.0×10⁹CFU/头份。

实施例8

本实施例将实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗与251C佐剂中未加入硫代硫酸钠和苏氨酸的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗和商品疫苗的比对试验。

分别制备实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗，记为A组；

未加入硫代硫酸钠和苏氨酸的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗，记为B组；

商品PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗（批号309-909A）为C组；

商品猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）（批号273-339）为D组。

动物试验设计

免疫：选用3-4周龄的健康易感猪65头，随机分为5组（试验分组见下表2），第1组25头，每头颈部肌肉注射A组疫苗2.0ml；第2组25头，每头颈部肌肉注射B组疫苗2.0ml；第3组每头颈部肌肉注射C组疫苗2.0ml；第4组5头，每头颈部肌肉注射D组疫苗2.0ml；第5组5头为空白对照组，不接种任何疫苗，各组猪同条件下隔离饲养。

表2疫苗试验分组

抗体效价测定：各组疫苗接种后，分别在接种前、接种后7日、14日、28日、2个月、3个月、4个月和5个月采血，检测PCV2、Mhy和Hps血清4型、5型、13型抗体效价。

血清抗体效价判定

PCV2血清抗体判定：S/P值≥0.4判为阳性；S/P值＜0.3判为阴性；0.3≤S/P值＜0.4判为可疑；

Mhy血清抗体判定：S/P值≥0.4判为阳性；0.3≤S/P值≤0.4判为可疑；S/P值＜0.3判为阴性；

Hps血清抗体判定：IHA＞1:4判为阳性；IHA≤1:4判为阴性。

血清抗体效价测定结果见表3-4，表3显示疫苗免疫后不同时间PCV2和Mhy血清抗体效价，表4结果为疫苗免疫后不同时间Hps血清抗体效价。

PCV2血清抗体效价测定：PCV2采用PCV2型ELISA抗体检测试剂盒（韩国金诺公司）进行检测。A组疫苗免疫前PCV2血清抗体均为阴性，免疫后2周，血清抗体全部转为阳性，免疫后2-3个月血清抗体达到高峰，血清抗体S/P值为1.635、1.736，之后逐渐降低，至免疫后5个月血清抗体S/P值为1.023；B组疫苗免疫前PCV2血清抗体均为阴性，免疫后2周，血清抗体部分转为阳性，免疫后2个月血清抗体达到高峰，血清抗体S/P值为1.326，之后逐渐降低，免疫后5个月血清抗体S/P值为0.549；D组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后3周，血清抗体部分转为阳性，免疫后2个月血清抗体达到高峰，血清抗体S/P值为1.362，之后抗体水平缓慢下降，免疫后5个月，血清抗体S/P值为0.536；对照组PCV2血清抗体一直保持阴性。可见，本发明实施例7制备的251C佐剂组合物的三联灭活疫苗PCV 2抗体水平优于251C佐剂的三联灭活疫苗和市场商品的PCV2单苗抗体水平。

Mhy血清抗体效价测定：Mhy采用猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒（IDEXX公司）进行检测。A组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周，Mhy血清抗体均转为阳性，血清抗体S/P值为1.186，免疫后2个月血清抗体达到高峰，Mhy血清抗体S/P值为2.765，之后逐渐降低，免疫后5个月血清抗体S/P值为1.438；B组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周，Mhy血清抗体均转为阳性，血清抗体S/P值为0.865，免疫后2个月血清抗体达到高峰，Mhy血清抗体S/P值为1.968，之后逐渐降低，免疫后5个月血清抗体S/P值为0.853；C组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周，Mhy血清抗体均转为阳性，血清抗体S/P值为0.851，免疫后2个月血清抗体达到高峰，Mhy血清抗体S/P值为1.756，之后逐渐降低，免疫后5个月血清抗体S/P值为0.987；对照组Mhy血清抗体一直保持阴性。可见，本发明实施例7制备的251C佐剂组合物的三联灭活疫苗M hy抗体水平优于251C佐剂的三联灭活疫苗和市场商品的Mhy单苗抗体水平。

表3疫苗免疫后不同时间PCV2、Mhy血清抗体检测结果（ELISA检测）

副猪嗜血杆菌血清抗体效价测定：采用间接血凝试验方法进行检测。A组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周， 13型血清抗体效价为1:10.0，免疫后3周，13型血清抗体效价为1:16.0，免疫后2个月血清抗体达到高峰，13型血清抗体效价为1:57.6，之后抗体水平呈缓慢下降趋势，免疫后5个月，13型血清抗体效价为1:19.2；B组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周，13型血清抗体效价为1:4.0，免疫后3周，13型血清抗体效价为1:7.2，免疫后2个月血清抗体达到高峰，13型血清抗体效价为1:38.4，之后抗体水平呈缓慢下降趋势，免疫后5个月，13型血清抗体效价为1:4.0；E组疫苗免疫前血清抗体均为阴性，免疫后2周，Hps血清4型抗体效价为1:5.6，5型血清抗体效价为1:4.0；免疫后3周，Hps血清4型抗体效价为1:10.0，5型血清抗体效价为1:8.0；免疫后2个月血清抗体达到高峰，Hps血清4型抗体效价为间接血凝效价为1:38.4，5型血清抗体效价为1:51.2，之后抗体水平呈缓慢下降趋势，免疫后5个月，Hps4型血清抗体效价为1:4.0，5型血清抗体效价均为1:2.0，已为阴性。A组疫苗抗体效价显著高于B组和E组疫苗，且A组疫苗免疫后2周血清抗体均转为阳性，其他2组疫苗在免疫后3周血清抗体效价转为阳性。可见，本发明实施例7用佐剂复合物制备的三联灭活疫苗中Hps血清抗体效价显著高于佐剂中不加入复合物的三联灭活疫苗。

表4疫苗免疫后不同时间Hps血清抗体检测结果（间接血凝试验）

实施例9安全性评价

本实施例将实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗与三种灭活单苗（PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）和猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗进行安全性评价。

取实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗；PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗（批号309-909A）；猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）（批号273-339）；猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型、5型）（批号150914），备用。

动物试验设计

将实施例7中制备的三联灭活疫苗颈部肌肉注射3周龄猪5头，每头4.0ml，同时设健康对照猪5头，同条件下饲养。连续观察14日，记录试验猪的临床健康状况。

选用3-4周龄的健康易感猪45头，随机分为6组（试验分组见下表5），第1组25头，每头颈部肌肉注射PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗2.0ml；第2组5头，每头颈部肌肉注射猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）单苗2.0ml；第3组5头，每头颈部肌肉注射PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗单苗2.0ml；第4组为攻毒对照组15头不接种疫苗；第5组为空白对照5头，不接种疫苗，不攻毒，各组猪同条件下隔离饲养。免疫后28日，对相应的猪分别进行攻毒试验，如表5所示。

表5疫苗试验分组

上述安全性评价结果见下表6，可见，实施例7中制备的疫苗超剂量接种3周龄健康易感猪，在14日观察期内，试验疫苗猪和健康对照猪均5/5健活，从精神状态、体温、体重以及采食和饮水情况看与健康对照组无差异，注射局部及全身无异常反应，剖检实质性脏器和空腔脏器均未见异常。

表6安全性检验结果

实施例10免疫效力评价实验

本实施例将实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗与三种灭活单苗（PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）和猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗进行免疫效力评价。

本实施例中，将实施例7中制备的三联灭活疫苗，经过无菌检验等合格后用于试验，动物的实验设计方案同实施例9，即如上表5中方案所示。

上述免疫效力评价结果见下表7-9所示。

从下表7中PCV2免疫攻毒保护结果可见，在疫苗免疫后28日PCV2攻毒，病毒血症检测，实施例7制备的三联灭活疫苗血清经PCR检测5/5阴性，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组4/5阴性，攻毒对照组5/5阳性；相对日增重，三联灭活疫苗免疫组和商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组相对日增重与空白对照组比较，差异不显著（P=0.397、0.284＞0.05），攻毒对照组与空白对照组比较差异极显著（P=0.003＜0.01）；免疫组化检测，三联灭活疫苗组5/5阴性，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组4/5阴性，攻毒对照组5/5阳性。综合以上检测结果，三联灭活疫苗PCV2免疫组保护率100%，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗免疫组保护率100%，攻毒对照组发病率100%，空白对照组均正常。

表7 PCV2免疫攻毒保护结果

从下表8中Mhy免疫攻毒保护结果可知，疫苗免疫后28日Mhy攻毒，实施例7制备的三联灭活疫苗免疫组肺炎病变减少87.6%，商品的猪肺炎支原体灭活疫苗单苗免疫组肺炎病变减少70.5%。

表8 Mhy免疫攻毒保护结果

注：“/”表示未进行此项。

如下表9所示的Hps免疫攻毒保护结果，疫苗免疫后28日Hps攻毒，实施例1制备的三联灭活疫苗血清13型攻毒，三联灭活疫苗免疫组保护率100%，攻毒对照组发病率100%。

表9 Hps免疫攻毒保护结果

注：“/”表示无此项内容；分母为检测猪总数量，分子为出现发病猪的数量

实施例11免疫持续期试验

本实施例对实施例7中制备的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗免疫持续期试验

材料：取实施例7中制得PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌（13型）三联灭活疫苗、PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗（批号309-909A）；猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）（批号273-339），备用。

动物试验设计

免疫：选用3-4周龄的健康易感猪45头，随机分为6组（试验分组见下表10），第1组15头，每头颈部肌肉注射PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗2.0ml；第2组5头，每头颈部肌肉注射猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）单苗2.0ml；第3组5头，每头颈部肌肉注射PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗单苗2.0ml；第4组为攻毒对照组25头不接种疫苗；第5组为空白对照5头，不接种疫苗，不攻毒，各组猪同条件下隔离饲养。

攻毒保护：免疫后5个月，各组试验猪分别用PCV2强毒DBN-SX07株、Mhy强毒HB株、Hps血清4型JS01株、血清5型FJ04株和血清13型HN01株进行攻毒，试验分组和攻毒剂量见表10。

表10免疫后5个月攻毒试验分组和攻毒剂量

注：A. 第1组为实施例1中制备的三联灭活疫苗；第2组猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）（批号273-339）；第3组为PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗（批号309-909A）；第4组为猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型、5型）（批号150914）。B. PCV2和Hps对日龄较大的猪不敏感，在5个月攻毒是，PCV2和Hps需要加大攻毒剂量，PCV2以8.0ml（含10^7.0TCID₅₀/ml）进行攻毒Hps血清13型以6.0ml(含活菌数6.0×10⁹CFU)、

上述免疫持续效力评价结果见下表11-13所示。

如表11所示的PCV2免疫攻毒保护结果，实施例7制备的三联灭活疫苗和商品PCV2单苗免疫后5个月PCV2攻毒，三联灭活疫苗血清经PCR检测5/5阴性，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组2/5阴性，攻毒对照组4/5阳性；相对日增重，三联灭活疫苗免疫组和商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组相对日增重与空白对照组比较，差异不显著（P＞0.05），攻毒对照组与空白对照组比较差异不显著（P＞0.05）；免疫组化检测，三联灭活疫苗组5/5阴性，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗组2/5阴性，攻毒对照组5/5阳性。综合以上检测结果，三联灭活疫苗PCV2免疫组保护率100%，商品的PCV2型杆状病毒载体灭活疫苗免疫组保护率40%，攻毒对照组发病率80%，空白对照组均正常。

表11 PCV2免疫5个月攻毒保护结果

如表12所示的Mhy免疫攻毒保护结果，实施例7制备的三联灭活疫苗和商品Mhy单苗免疫后5个月Mhy攻毒，三联灭活疫苗免疫组肺炎病变减少76.2%，商品的猪肺炎支原体灭活疫苗单苗免疫组肺炎病变减少69.0%。

表12Mhy免疫5个月攻毒保护结果

如表13所示的Hps免疫攻毒保护结果，实施例7制备的三联灭活疫苗免疫后5个月Hps攻毒血清13型攻毒，三联灭活疫苗免疫组保护率80%，攻毒对照组发病率80%。

表13Hps免疫5个月攻毒保护结果

上述试验结果表明，本发明制备的三联灭活疫苗从免疫后35日血清抗体和攻毒保护结果看，三联灭活疫苗与市场上的商品单苗相当，抗原间无干扰，且三联灭活疫苗中Hps每头份疫苗只用活菌数为1.0×10⁹CFU；从免疫持续期看，三联灭活疫苗为一次免疫，免疫期为5个月，市场商品PCV2单苗为一次免疫，免疫期为4个月，市场商品Mhy单苗为一次免疫，免疫期为5个月，不论从免疫期、攻毒保护和抗体水平看，三联灭活疫苗优于市场商品相应的单苗。

实施例12PCV2型蛋白选择差异

本申请方案中，形成所述三联灭活疫苗的PCV2型Cap蛋白包含两种亚型即PCV2b和PCV2a重组蛋白，对于PCV2型的病的保护更全面。在本发明方案中，PCV2型Cap蛋白经过基因基因修饰和基因密码子修饰，表达产量不低于200μg/ml。制备三联灭活疫苗时，PCV2型Cap蛋白4ug/头份，采用最佳的佐剂配比，能够100%保护。

本申请方案的三联灭活疫苗与现有的三联灭活疫苗的性能优势分析如下表14。所述传统三联灭活疫苗只含有一个亚型的Cap蛋白或全病毒灭活的蛋白。

表14本发明中的三联苗与目前现有的相关的三联苗的优势

实施例13PCV2型蛋白差异

分别对本发明上述实施例中经过基因修饰和基因密码子修饰的PCV2a蛋白与现有技术中传统未经基因修饰和基因密码子修饰的PCV2a蛋白，在PCV2a基因序列前添加蜂毒素信号肽序列并对基因的密码子做了真对昆虫杆状病毒表达系统密码子优化。对二者采用SDS-PAGE电泳检测，结果见附图7所示，其中，泳道1为250ug/ml BSA；泳道2为125ug/ml BSA；泳道3为62.5ug/ml BSA；泳道4为31.25ug/ml BSA，泳道5为Protein Marker（14KD-120KD）；泳道6本发明PCV2a蛋白上清样品电泳条带；泳道7为传统PCV2a蛋白上清样品电泳条带。

可见，本发明经过基因修饰和基因密码子修饰的PCV2型Cap蛋白表达量高达200ug/ml以上且蛋白为病毒样粒子（泳道6），而现有技术中传统未经修饰和优化的基因构建的PCV2型Cap蛋白表达量一般在50ug/ml（泳道7）。本发明所述疫苗具有更高的蛋白表达量，更低的用量就能起到同样的免疫效果，从生产成品上考虑，有效降低了生产成本。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 申请人：北京科牧丰生物制药有限公司、兆丰华生物科技（南京）有限公司、兆丰华生物科技（南京）有限公司北京生物医药科技中心、兆丰华生物科技（福州）有限公司

<120> 一种PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> PCV2a-CAP

<400> 1

atgacctatc cgcgtcgtcg ttatcgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc acatctgggc 60

caaatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtg catccgcgtc accgctaccg ttggcgtcgc 120

aaaaacggta tctttaattc acgcctgtcg cgtaccttcg gctatacggt taaagccacc 180

accgtcacca cgccgtcatg ggcagttgat atgctgcgct ttaacattga tgacttcctg 240

ccgccgggcg gtggcaccaa caaaatctca atcccgttcg aatactaccg cattcgtaaa 300

gtgaaagttg aattctggcc gtgctcgccg atcacccagg gtgatcgtgg tgtgggcagc 360

tctgcagtta ttctggatga caactttttc ccgaaaagca ccgctctgac gtatgacccg 420

tacgtcaatt atagttcccg ccataccatc ccgcagccgt ttagctacca ctctcgttat 480

ttcaccccga aaccggttct ggattctacg atcgactatt ttcaaccgaa caataaacgc 540

aaccagctgt ggatgcgtat tcaaaccagt aaaaatgtcg atcatgtggg tctgggcacg 600

gccttcgaaa actccaaata cgatcaagac tataatattc gtgtgacgat gtatgtccag 660

ttccgtgaat ttaacctgaa agacccgccg ctgaaaccgt aa 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> PCV2a-Cap

<400> 2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Ser Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Lys Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Phe Pro Lys Ser Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Ile Gln Thr Ser Lys Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Asp Pro Leu Lys Pro

225 230

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> PCV2b-CAP

<400> 3

atgacctacc cccgtcgtcg ctatcgtcgc cgtcgtcacc gtcctcgcag ccatctgggc 60

cagatcctcc gtcgtcgccc ttggctggtg catcctcgcc atcgctaccg ttggcgccgc 120

aagaacggta tcttcaacac ccgcctgtcc cgcacctttg gctacaccat caagcgcacc 180

accgtcaaga ctccctcctg ggccgtggat atgatgcgct tcaacatcaa cgactttctg 240

ccccctggcg gtggtagcaa tccccgttcc gtgccctttg agtactaccg catccgcaag 300

gtgaaggtcg agttctggcc ctgctcccct atcacccagg gtgaccgtgg tgtgggtagc 360

tccgccgtga tcctcgacga caacttcgtg accaaggcca ccgccctgac ttacgacccc 420

tacgtgaact actcctcccg tcacaccatc acccagccct tctcctacca cagccgttac 480

tttaccccca agcccgtgct cgacagcact atcgactact tccagcccaa caacaagcgc 540

aaccagctgt ggctgcgcct gcaaactgcc ggtaacgtgg accatgtggg cctgggcacc 600

gccttcgaga actccatcta tgaccaggag tacaacatcc gcgtgaccat gtacgtgcag 660

ttccgcgagt ttaacctcaa ggaccccccc ctcaaccctt aa 702

<210> 4

<211> 233

<212> PRT

<213> PCV2b-CAP

<400> 4

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 5

<211> 702

<212> DNA

<213> ORF2b

<400> 5

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180

acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480

tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540

aatcagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccctt aa 702

<210> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> ORF2b

<400> 6

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 7

<211> 702

<212> DNA

<213> ORF2a

<400> 7

atgacctatc cgcgtcgtcg ttatcgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc acatctgggc 60

caaatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtg catccgcgtc accgctaccg ttggcgtcgc 120

aaaaacggta tctttaattc acgcctgtcg cgtaccttcg gctatacggt taaagccacc 180

accgtcacca cgccgtcatg ggcagttgat atgctgcgct ttaacattga tgacttcctg 240

ccgccgggcg gtggcaccaa caaaatctca atcccgttcg aatactaccg cattcgtaaa 300

gtgaaagttg aattctggcc gtgctcgccg atcacccagg gtgatcgtgg tgtgggcagc 360

tctgcagtta ttctggatga caactttttc ccgaaaagca ccgctctgac gtatgacccg 420

tacgtcaatt atagttcccg ccataccatc ccgcagccgt ttagctacca ctctcgttat 480

ttcaccccga aaccggttct ggattctacg atcgactatt ttcaaccgaa caataaacgc 540

aaccagctgt ggatgcgtat tcaaaccagt aaaaatgtcg atcatgtggg tctgggcacg 600

gccttcgaaa actccaaata cgatcaagac tataatattc gtgtgacgat gtatgtccag 660

ttccgtgaat ttaacctgaa agacccgccg ctgaaaccgt aa 702

<210> 8

<211> 233

<212> PRT

<213> ORF2a

<400> 8

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Ser Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Lys Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Phe Pro Lys Ser Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Ile Gln Thr Ser Lys Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Asp Pro Leu Lys Pro

225 230

Claims

1.一种PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有灭活的PCV2型CAP蛋白抗原、灭活的猪肺炎支原体抗原、灭活的副猪嗜血杆菌抗原，以及，疫苗佐剂；其中，

所述的PCV2型CAP蛋白抗原为参照PCV2a和PCV2b分离株，在保持氨基酸不变的前提下，经人工合成密码子优化，将密码子改造为昆虫细胞杆状病毒表达系统偏嗜密码子的PCV2ORF2序列，并在序列两端引入EcoRI和XhoI酶切位点，通过双酶切插入pF astBac1转移载体中，经克隆、转染分别获得重组杆状病毒后，经感染SF9或High Five细胞高效表达的CAP蛋白抗原。

2.根据权利要求1所述的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述PCV2型CAP蛋白抗原包括PCV2a型CAP蛋白和PCV2b型CAP蛋白；

所述PCV2a型CAP蛋白的编码基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述PCV2型CAP蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求2所述的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原为保藏编号为CGMCC NO.4545的猪肺炎支原体DJ-166病毒株，经改良CH培养基增殖、浓缩、纯化并灭活得到的猪肺炎支原体抗原。

4.根据权利要求3所述的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌抗原血清为HN01株经增殖、浓缩、纯化并灭活得到的副猪嗜血杆菌抗原。

5.根据权利要求1-4任一项所述的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：

所述PCV2型CAP蛋白抗原的含量≥4μg/头份；

所述猪肺炎支原体抗原的含量≥100μg/头份；

所述副猪嗜血杆菌抗原血清的含量≥1.0×10⁸CFU/头份。

6.根据权利要求5所述的PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂包括铝盐佐剂、矿物油佐剂、化学物质佐剂或水溶性佐剂。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述PCV2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括将所述PCV2型CAP蛋白抗原、所述猪肺炎支原体抗原和所述副猪嗜血杆菌抗原血清分别进行灭活浓缩的步骤，并按照选定的配比与所述疫苗佐剂进行混合的步骤。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括获得所述PCV2型CAP蛋白抗原的步骤，具体包括：

（4）将所得重组杆状病毒DBN01a和DBN01b株感染SF9或highfive细胞，获得重组的PCV2CAP蛋白病毒样粒子，经检测PCV2 CAP蛋白浓度，表达水平不低于200μg/ml时，灭活病毒；

（5）分离纯化重组的PCV2型CAP蛋白，即得。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，还包括获得所述猪肺炎支原体抗原的步骤，具体包括：将所述猪肺炎支原体病毒株接种至改良CH液体培养基中，于37℃发酵罐20%通氧量条件下培养3-4日的步骤，经收获并测定活菌滴度测定不低于10¹¹CCU/ml，纯化，即得。

10.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，还包括获得所述副猪嗜血杆菌抗原的步骤，具体包括：将所述副猪嗜血杆菌HN01株接种至TBS液体培养基中，于37℃发酵罐150rpm条件下培养12-15h的步骤，经收获并测定活菌数量不低于50亿时，收获菌液，纯化，即得。