CN110201153B

CN110201153B - 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN110201153B
Application number: CN201910540974.1A
Authority: CN
Inventors: 陈辉; 张小军; 宋晓飞; 葛平萍; 秦绪伟; 张娣; 李金波; 贾爱琴; 王蕾; 徐龙涛
Original assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Current assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: CN110201153A

Abstract

本发明涉及一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括兔病毒性出血症病毒VP60蛋白抗原、灭活的多杀性巴氏杆菌QLT‑1株和支气管败血波氏杆菌JN01株抗原，该三联灭活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护率高，对兔病毒性出血症病毒AV‑34株、多杀性巴氏杆菌QLT‑1株、支气管败血波氏杆菌JN01株的攻毒保护率均达到80％以上。结果说明本发明的疫苗安全可靠，可用于预防兔病毒性出血症(兔瘟)、兔多杀性巴氏杆菌病(A型)、兔支气管败血波氏杆菌病的发生。

Description

一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

兔病毒性出血症（viral haemorrhagic disease of rabbits）是由兔出血症病毒（rabbit haemorrhagic disease virus, RHDV）感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病，又称兔出血性肺炎和兔出血症病毒，俗称兔瘟，全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征的传染病。兔病毒性出血症呈世界流行性分布，发病率和病死率很高，高达100%，是兔常见多发病之一，1989 年，该病被世界动物卫生组织（OIE）正式列为 B 类传染病，我国则将其列为二类传染病。

目前主要使用兔瘟组织灭活疫苗来预防该病。组织灭活疫苗长期以来一直具有良好的免疫效果，但对变异株无法起到完全保护效果；生产该类疫苗需要捕杀大量非免疫兔使得生产组织灭活疫苗的成本高，同时也不符合动物福利要求，并且如果病毒灭活不彻底就存在散毒的危险；组织灭活疫苗只产生体液免疫，而且产生的抗体维持时间短；该类疫苗容易结块不易运输保存。因此有必要研制更安全、更高效的新型疫苗。亚单位疫苗具有生产成本低廉、安全性好等优势。

兔巴氏杆菌病(Rabbit Pasteurellosis)，又称兔出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的一种多型性传染病。根据感染部位的不同而呈现不同的临床症状，主要临床表现有：败血症、传染性鼻炎、地方流行性肺炎、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎等。此病是引起9周龄~6月龄兔死亡的一种最主要的传染病。本病一年四季均可发生，以冬春最为多见，呈散发或地方性流行。兔巴氏杆菌病的急性暴发若不及时采取措施，会造成兔群的大批死亡，慢性感染也会因内源性感染造成病情反复或出现混合感染，以最终死亡的结果告终。一般情况下，夏季会有20%左右兔发病，在 9月到10月发病率最高达到50%~60%，然后再呈下降趋势，直到第二年7～8月为全年发病最低水平。

兔支气管败血波氏杆菌是引起家兔波氏杆菌病的主要呼吸道致病菌之一，在家兔中，发病兔临床表现以发生鼻炎和支气管炎，呼吸困难，鼻腔有浆液和粘液性分泌物为主要特征。近年来，随着中国大型养兔业的发展，波氏杆菌病的发病率明显增加，并常与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、葡萄球菌（Staphylococcus）等细菌或病毒混合感染，已成为引起兔业养殖中发病率和死亡率增加的重要原因之一，给养殖户造成了巨大的经济损失。兔波氏杆菌病的疫苗研究目前主要集中在全菌灭活苗上，目前在市场上没有兔波氏杆菌灭活苗可售，但在兔养殖过程中，波氏杆菌病的发生率仍然较高，因此要加强波氏杆菌疫苗研发。

目前国内尚未有关于同时防控兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、支气管败血波氏杆菌病三种疾病相关疫苗。

发明内容

本发明的目的在于利用本申请人自已制备的rBac-HBM-HS4-VP60株重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒、自行分离到的QLT-1株多杀性巴氏杆菌和JN01株支气管败血波氏杆菌制备成兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，该疫苗含有经灭活处理的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白抗原、QLT-1株多杀性巴氏杆菌灭活抗原、JN01株支气管败血波氏杆菌灭活抗原和；该三联灭活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护率高，对兔病毒性出血症病毒AV-34株、多杀性巴氏杆菌QLT-1株、支气管败血波氏杆菌JN01株的攻毒保护率均达到80％以上。

本发明的技术方案：

1. 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白，多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌的灭活抗原；

所述疫苗用于同时预防兔病毒性出血症（兔瘟）、兔多杀性巴氏杆菌病（A型）、兔支气管败血波氏杆菌病。

2. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述疫苗由重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌灭活后制备获得，抗原按每毫升疫苗中含重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株细胞培养物血凝效价应不低于1:512，含多杀性巴氏杆菌菌数应不低于3.0×10⁹CFU，含支气管败血波氏杆菌菌数应不低于6.0×10⁹CFU标准进行配苗。

3. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述疫苗的三种抗原的生产菌毒株分别为保藏编号为CGMCC No.8052的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，保藏编号为CGMCC No.17688的多杀性巴氏杆菌QLT-1株，和保藏编号为CGMCC No.17689的支气管败血波氏杆菌JN01株，以上菌毒种已于2013年08月02日和2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

4. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述疫苗含有氢氧化铝胶佐剂，抗原与氢氧化铝胶配苗比例为9:1。

5. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗的的制备方法，包括以下步骤：

（1）重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株半成品制备：将重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株基础毒种接种Sf9细胞进行培养，对收获的细胞培养物采用BEI灭活剂进行灭活，灭活结束后需进行灭活检验，灭活检验方法为MTT相对效力法；

（2）多杀性巴氏杆菌QLT-1株半成品制备：将多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌种接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基进行培养，对收获的菌液采用甲醛灭活剂进行灭活，灭活结束后，取样接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板进行灭活检验，应无菌生长；

（3）支气管败血波氏杆菌JN01株半成品制备：将支气管败血波氏杆菌JN01株菌种接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基进行培养，对收获的菌液采用甲醛灭活剂进行灭活，灭活结束后，取样接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板进行灭活检验，应无菌生长；

（4）疫苗配制：抗原含量按每毫升疫苗中含重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株细胞培养物血凝效价应≥1:512，含多杀性巴氏杆菌菌数应≥3.0×10⁹CFU，含支气管败血波氏杆菌菌数应≥6.0×10⁹CFU的标准进行配苗，加入佐剂和硫柳汞并充分混匀。

6. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗制备方法步骤（1）中接种细胞为Sf9细胞，接种密度为1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml，27℃培养，待细胞密度高于3.0×10⁶个细胞/ml时，补加细胞培养液继续培养，待细胞密度达到1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml时，按MOI=0.5～2.0接种重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。

7. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗的制备方法步骤（1）获得的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株细胞培养物，灭活检验合格后需进行兔病毒性出血症病毒血凝（HA）试验方法进行测定，对1%人O型红细胞血凝效价应不低于1:8192。

8. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗的制备方法步骤（2）中，对多杀性巴氏杆菌QLT-1株进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将多杀性巴氏杆菌QLT-1株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养18～24h，作为一级种子；将多杀性巴氏杆菌QLT-1株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子；按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min，待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%,然后按培养基总量的2%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养8～12h。

9. 本发明所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于所述疫苗的制备方法步骤（3）中，对支气管败血波氏杆菌JN01株进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将支气管败血波氏杆菌JN01株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养48～72h，作为一级种子；将支气管败血波氏杆菌JN01株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子；按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min,待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%，然后按培养基总量的1%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养16～18h。

本发明有益效果

本发明涉及一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白抗原，灭活的多杀性巴氏杆菌QLT-1株和支气管败血波氏杆菌JN01株抗原，该三联灭活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护率高，对兔病毒性出血症病毒AV-34株、多杀性巴氏杆菌QLT-1株、支气管败血波氏杆菌JN01株的攻毒保护率均达到80％以上。结果说明本发明的疫苗安全可靠，可用于预防兔病毒性出血症（兔瘟）、兔多杀性巴氏杆菌病（A型）、兔支气管败血波氏杆菌病的发生。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，（本发明简称：重组杆状病毒VP60株）已于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.8052；兔病毒性出血症病毒AV-34株（强毒株，购自北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心）；多杀性巴氏杆菌QLT-1株、支气管败血波氏杆菌JN01株，以上株已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为： CGMCC No.17688、CGMCC No. 17689。

附图说明

图1 HBM基因扩增图中 1:HBM PCR产物；2: DL2000 marker。

图2 HS4基因扩增图中1：阴性对照；2：HS4 PCR产物；M：DL5000 Marker。

图3 菌落PCR鉴定（HS4基因连接到pVL-HBM载体）图中1-11：菌落PCR产物；M：DL2000 Marker。

图4 观察蚀斑（菌落PCR验证VP60基因连接到pVL-HBM-HS4载体）图中1-7：菌落PCR产物；M：DL2000 Marker。

图5 重组杆状病毒蚀斑纯化图。

本发明具体实施方式

1. 疫苗株的选育

本发明人利用购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心的兔病毒性出血症病毒AV-34株，采用昆虫杆状病毒表达系统，利用分子生物学方法构建表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株（简称：重组杆状病毒VP60株），将重组杆状病毒VP60株接种Sf9细胞，收获细胞培养物进行免疫原性试验，结果免疫兔全部健活，对照组兔全部死亡，表明构建的重组杆状病毒VP60株，其表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白具有良好的免疫原性，可以作为疫苗株。动物回归试验攻毒兔出现兔多杀性巴氏杆菌病典型临床症状及死亡兔剖检典型病理变化，并进行免疫原性研究，结果证明多杀性巴氏杆菌QLT-1株具有良好的免疫原性，可以作为疫苗株；从疑似兔波氏杆菌的发病兔鼻腔、肺脏中成功分离出10株支气管败血波氏杆菌，对临床分离的支气管败血波氏杆菌进行毒力比较试验，结果支气管败血波氏杆菌JN01株毒力最强，并进行了免疫原性研究，结果证明支气管败血波氏杆菌JN01株具有良好的免疫原性，可以作为疫苗株。

（1）重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株（重组杆状病毒VP60株）选育

采用昆虫杆状病毒表达系统，使用分子生物学方法构建表达兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株（简称：重组杆状病毒VP60株）。将重组杆状病毒VP60株细胞培养物加入BEI灭活完全后，分别按一定的比例进行稀释，与氢氧化铝胶按9:1比例制备不同抗原含量的疫苗（每毫升疫苗中细胞培养物血凝效价分别为1:64、1:256、1:1024）。

制备的疫苗分别免疫45日龄和95日龄健康易感兔，免疫后14日，进行兔病毒性出血症病毒HI抗体效价测定，同时进行攻毒。结果45日龄和95日龄健康易感兔攻毒保护结果无明显区别。当每毫升疫苗中细胞培养物血凝效价为1:64时，免疫后14日，兔病毒性出血症病毒HI抗体效价为1:8～1:32，45日龄和95日龄兔攻毒保护率均为60%；当每毫升疫苗中细胞培养物血凝效价不低于1:256时，免疫后14日，HI抗体效价均不低于1:32，攻毒保护率均为100%。表明重组杆状病毒VP60株表达的VP60蛋白具有良好的免疫原性，重组杆状病毒VP60株可作为疫苗研制的候选毒株。

（2）多杀性巴氏杆菌QLT-1株选育

将第0代多杀性巴氏杆菌QLT-1株接种含0.1%裂解血球全血的改良马丁肉汤培养基，37℃培养10h，取样进行活菌计数，同时按菌液总量的0.3%加入甲醛溶液，37℃灭活48h。将灭活完全的菌液分别用无菌生理盐水进行适当调整，和灭菌氢氧化铝胶按9:1比例进行配苗，再加入1%的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌，制备3批不同抗原含量的疫苗（最终每毫升疫苗抗原含量分别为1.5×10⁹CFU、3.0×10⁹CFU、6.0×10⁹CFU）。

取45日龄健康易感兔15只，随机分为3组，5只/组。3组兔分别免疫3批疫苗，颈部皮下注射，1.0ml/只，另取相同条件下的5只兔不免疫作为对照。免疫后21日，免疫兔与对照兔分别颈部皮下注射多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌液1.0ml（含活菌数约为5～10 CFU），攻毒后连续观察10日。结果配苗前抗原含量≥3.0×10⁹CFU/ml的疫苗免疫兔，免疫后21日攻毒保护率为80%（4/5）以上，对照兔100%（5/5）死亡，表明多杀性巴氏杆菌QLT-1株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

（3）支气管败血波氏杆菌JN01株选育

将第0代支气管败血波氏杆菌JN01株接种含0.1%裂解血球全血的改良马丁肉汤培养基，37℃培养16h，取样进行活菌计数，同时按菌液总量的0.4%加入甲醛溶液，37℃灭活24h。将灭活完全的菌液分别用无菌生理盐水进行适当调整，和灭菌氢氧化铝胶按9:1比例进行配苗，再加入1%的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌，制备3批不同抗原含量的疫苗（最终每毫升疫苗抗原含量分别为3.0×10⁹CFU、6.0×10⁹CFU、12.0×10⁹CFU）。

取45日龄健康易感兔15只，随机分为3组，5只/组。3组兔分别免疫3批疫苗，颈部皮下注射，1.0ml/只，另取相同条件下的5只兔不免疫作为对照。免疫后21日，免疫兔与对照兔分别静脉注射支气管败血波氏杆菌JN01株菌液1.0ml（含活菌数约为8.0×10⁹CFU），攻毒后连续观察7日。结果配苗前抗原含量≥6.0×10⁹CFU/ml的疫苗免疫兔，免疫后21日攻毒保护率为80%（4/5）以上，对照兔100%（5/5）发病，表明支气管败血波氏杆菌JN01株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

2. 菌、毒种特性

（1）重组杆状病毒VP60株

1）病毒含量按MTT相对效力法（黄仕和,余模松.测定杆状病毒滴度方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2007(02):79-83.）进行测定，每毫升病毒含量应≥1.0×10⁸PFU。

2）表达蛋白血凝效价测定将毒种按MOI=0.5～2.0接种生长良好、细胞密度为1.4×10⁶～1.6×10⁶个细胞/ml的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，用血凝（HA）试验方法进行血凝效价测定，对1%人“O”型红细胞血凝效价应不低于1:4096。

3）表达蛋白Western Blot鉴定将毒种按MOI=0.5～2.0接种生长良好、细胞密度为1.4×10⁶～1.6×10⁶个细胞/ml的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，进行Western Blot鉴定，66kDa附近应出现特异性条带。

4）表达蛋白免疫原性将毒种按MOI=0.5～2.0接种生长良好、细胞密度为1.4×10⁶～1.6×10⁶个细胞/ml的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，用血凝（HA）试验方法进行血凝效价测定。将细胞培养物稀释至血凝效价为1:256，经二乙烯亚胺（BEI）灭活完全后，按本规程制备疫苗。用45～95日龄健康易感兔5只，各颈部皮下注射疫苗0.5ml，同时设条件相同的不接种对照兔5只。免疫14日后，分别颈部皮下注射兔病毒性出血症病毒AV34株1.0ml（含1.0×10⁴个最小致死量），攻毒后连续观察7日，对照兔应至少死亡4只，免疫兔应全部健活。

5）安全性选择35～65日龄健康易感兔，接种前观察3日，每日定时测体温1次（以每只兔3日体温平均值作为基础体温），挑选精神、饮食、粪便、体温均正常，无其它异常临床症状的兔5只，分别颈部皮下注射毒种4.0ml，接种后，每日定时观察并测体温1次（与接种前测温时间一致），连续观察14日。接种兔应全部健活，精神、饮食、粪便、体温与接种前相比无明显变化，无其它异常临床症状；或体温升高超过1℃，但稽留应不超过2日。

6）纯净性按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

7）特异性

①毒种PCR检测用PCR方法进行检测，应出现大小约1.7kb的目的条带。

②表达蛋白特异性将重组杆状病毒VP60株细胞培养物用生理盐水稀释为4个血凝单位的悬液，与等量的兔源兔病毒性出血症病毒特异性抗血清充分混匀，作为阳性血清中和组；与等量的兔源兔病毒性出血症病毒阴性血清充分混匀，作为阴性血清中和组；与等量生理盐水混匀作为病毒对照组；另设一组不加抗原的红细胞对照组。37℃中和30min，期间振摇2～3次。中和完毕后，将以上4组各加入一排试管，每排试管至少5支，每管0.5ml，然后每管再加入0.5ml 1%人O型红细胞，充分振摇，37℃作用30min，观察结果。病毒对照组出现凝集，红细胞对照组不出现凝集判为试验成立；阳性血清中和组应不出现凝集，阴性血清中和组应全部出现凝集。

（2）多杀性巴氏杆菌QLT-1株

1）形态和生化特性为革兰氏阴性、两端钝圆的球杆状或短杆状菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。

2）培养特性在麦康凯平板上不生长；在含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板上生长良好，菌落边缘整齐、表面光滑；在绵羊鲜血琼脂平板上，生长良好，为水滴样菌落，无溶血现象。

3）血清学特性荚膜基因多重PCR分群法鉴定，应为A群。

4）毒力用60～120日龄健康易感兔5只，分别颈部皮下注射多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌液1.0ml（含活菌数约为5～10 CFU），攻毒后连续观察10日，应全部死亡。

5）免疫原性用本菌制备疫苗（每毫升疫苗含多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌数为3.0×10⁹ CFU）。用45～95日龄健康易感兔5只，分别颈部皮下注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照兔5只，分别颈部皮下注射多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌液1.0ml（含活菌数约为5～10 CFU），攻毒后连续观察10日，对照兔应全部死亡，免疫兔应至少4只健活。

（3）支气管败血波氏杆菌JN01株

1）形态和生化特性为革兰氏阴性，常呈两极着色，细小球杆状菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。

2）培养特性在各种普通培养基中均易生长，但极易发生菌相变异。在麦康凯琼脂上生长良好、菌落呈微红色，直径约1～1.5mm；在含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板上生长良好，菌落边缘整齐、表面光滑；在 B-G 基础培养基上，典型菌落（Ⅰ相菌落）呈珍珠状或半圆状、直径约0.5～0.8mm、乳白色、光滑致密、周边有不明显β溶血环；在培养条件不适或多次传代后出现Ⅱ相或Ⅲ相菌落，Ⅲ相菌落灰白、扁平、光滑、大于Ⅰ相菌落、质地稀软、不溶血。在蛋白胨琼脂上可形成灰白、透明、光滑、边缘整齐、微隆起的菌落。在普通肉汤或蛋白胨水中呈轻度均匀浑浊生长，不形成菌膜；在含4%～6%NaCl的肉汤中呈均匀浑浊生长。

3）毒力用60～120日龄健康易感兔5只，分别静脉注射支气管败血波氏杆菌JN01株菌液1.0ml（含活菌数约为8.0×10⁹CFU），攻毒后连续观察7日，应全部发病。

4）免疫原性用本菌制备疫苗（每毫升疫苗含支气管败血波氏杆菌JN01株菌数为6.0×10⁹CFU）。用45～95日龄健康易感兔5只，分别颈部皮下注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照兔5只，分别静脉注射支气管败血波氏杆菌JN01株菌液1.0ml（含活菌数约为8.0×10⁹CFU），攻毒后连续观察7日，对照兔应全部发病，免疫兔应至少4只保护。

3. 三联灭活疫苗的制备

（1）将重组杆状病毒VP60株基础毒种接种生长良好的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获病毒液，连传2代，收获第4代病毒液，作为生产用毒种。选择生长旺盛的Sf9细胞，接种细胞培养罐，27℃培养。待细胞密度达到1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml时，接种重组杆状病毒VP60株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。向细胞培养物中加入2%的BEI溶液，使其终浓度为0.1%，37℃灭活48h；灭活结束后，向细胞培养物中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2%，搅拌1h终止灭活。将灭活检验合格的细胞培养物按兔病毒性出血症病毒血凝（HA）试验方法进行测定，对1%人“O”型红细胞血凝效价应不低于1:8192。

（2）将多杀性巴氏杆菌QLT-1株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养18～24h，作为一级种子。将多杀性巴氏杆菌QLT-1株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子。按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min，待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%。然后按培养基总量的1%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养12h。进行纯粹检验和活菌计数，按菌液总量的0.3%加入甲醛溶液，充分混匀，37℃灭活48h。最终每毫升菌悬液含菌数应不少于1.0×10¹⁰CFU。

（3）将支气管败血波氏杆菌JN01株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养48～72h，作为一级种子。将支气管败血波氏杆菌JN01株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子。按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min，待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%。然后按培养基总量的1%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养18～24h。进行纯粹检验和活菌计数，按菌液总量的0.4%加入甲醛溶液，充分混匀，37℃灭活24h。最终每毫升菌悬液含菌数应不少于1.0×10¹⁰CFU。

（4）将灭活检验合格的重组杆状病毒VP60株细胞培养物、多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌液、支气管败血波氏杆菌JN01株菌液按适当的比例混合均匀，和灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗（最终每毫升疫苗中含重组杆状病毒VP60株细胞培养物血凝效价应不低于1:512，含多杀性巴氏杆菌菌数应不低于3.0×10⁹CFU，含支气管败血波氏杆菌菌数应不低于6.0×10⁹CFU），再加入1%的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌。

实施例

本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。

实施例1 ——重组杆状病毒VP60株构建

1. 转移载体pVL-HBM构建

（1）HBM基因扩增 HBM基因扩增以pMD19-HBM作为模板，HBM-F、HBM-R作为引物进行PCR扩增（图1）。

HBM-F（序列1）:5’-agcggatcca aaccatgaaa ttc-3’(BamHⅠ) 23

HBM-R（序列2）:5’-ataagatctg catgcggtac ccc-3’(PstⅠ) 23

（2）酶切将鉴定正确的PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，将pVL1393质粒和纯化的HBM基因PCR产物使用BamHⅠ/PstⅠ 37℃双酶切3h，将酶切产物凝胶电泳，使用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化回收。

（3）连接和转化将酶切产物进行凝胶电泳，使用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化回收。将酶切纯化后的pVL1393质粒和HBM基因PCR产物使用T4连接酶，16℃水浴连接过夜。将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90s，再冰浴2min，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1h。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基，37℃培养16h。

（4）菌落PCR及序列鉴定从含有Amp的LB固体培养基上挑取单菌落，接种含有Amp的LB液体培养基，37℃培养8h，以菌液作为模板，HBM-F和HBM-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳，验证目的基因的大小。将鉴定正确的菌液送公司测序。

2. 转移载体pVL-HBM-HS4构建

（1）HS4基因扩增以pMD19-HS4质粒作为模板，HS4-F（序列3），HS4-R（序列4）作为引物进行PCR扩增（图2）。

HS4-F5’-atatacgtag agctcacggg gacagccccc ccccaaag（SnaBⅠ）-3’38

HS4-R:5’-acatacgta aatattctca ctgactccgt cctggagtt(SnaBⅠ)-3’ 38

（2）pVL-HBM质粒提取根据质粒小量抽提试剂盒提取说明提取测序正确的重组质粒pVL-HBM。

（3）酶切凝胶回收纯化HS4基因PCR产物，将pVL-HBM质粒和HS4基因PCR产物分别使用SnaBⅠ酶切3h，将酶切产物凝胶电泳，使用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化回收。

（4）连接转化将酶切纯化过的pVL-HBM质粒和HS4基因PCR产物使用T4 连接酶连接过夜。取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴2min，加入900μl 不含Amp的LB培养基，37℃培养1h。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基，37℃培养16h。

（5）挑取平板上单菌落分别接种 LB液体培养基，37℃培养8～12h。以菌液作为模板，HS4-F和HS4-R作为引物进行菌落PCR扩增（图3），将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小。将鉴定正确的菌液送公司测序。

3. 转移载体pVL-HBM-HS4-VP60构建

（1）质粒提取根据质粒小量抽提试剂盒说明提取测序正确的pVL-HBM-HS4质粒和pMD19-VP60质粒。

（2）酶切将转移载体pVL-HBM-HS4和pMD19-VP60质粒分别用EcoRⅠ/KpnⅠ 37℃酶切3h。将酶切产物凝胶电泳，使用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化回收。

（3）连接和转化将酶切纯化后的pVL-HBM-HS4质粒和酶切纯化后的VP60片段使用T4连接酶16℃水浴连接过夜。将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2min，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1h。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基，37℃培养16h。

（4）菌落PCR鉴定和序列测定从平板上挑取单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养8～12h，以菌液为模板，VP60-F（序列5）和VP60-R（序列6）为引物进行菌落PCR鉴定（图4）。将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小。将鉴定正确的菌液送公司测序（序列7）。

VP60-F:5’-aatgaattcg gcaaagcccg tgcagcgccg caag(EcoRⅠ)-3’34

VP60-R:5’-atgggtacct cagacataag aaaagccatt ggctg(KpnⅠ)-3’35

目的基因（序列7）:

atggagggca aagcccgcac agcgccgcaa ggcgaagcag caggcactgc taccacagca 60

tcagttcccg gaaccacgac cgacggcatg gatccaggcg tggtggccgc aactagtgtg 120

gtcactgcag aaaattcatc cgcatcggtt gcaacggcgg ggattggagg cccaccccaa 180

caggtggacc aacaggaaac atggaggaca aacttttact acaatgacgt tttcacttgg 240

tccgtcgcgg atgcgcccgg cagcattctc tatactgtcc agcactctcc acagaacaac 300

ccattcacag ctgtgctgag ccagatgtac gctggttggg ctggtggcat gcagttccgc 360

ttcatagttg ctggatcagg tgtgtttggt gggcgactgg tcgcggctgt gataccaccg 420

ggcatcgaga ttggaccagg gttggaggtc aggcaattcc cccatgttgt tatcgacgcc 480

cgttcactcg aacctgttac tatcaccatg ccagacttac gtcccaacat gtaccaccca 540

actggtgacc ctggccttgt ccccacacta gtccttagtg tttacaacaa cctcatcaac 600

ccgtttggtg ggtccaccaa cgcaatccag gtaacagtgg aaacaaggcc aagtgatgac 660

tttgagttcg tgatgattag agccccctcc agtaagactg ttgactcaat ctcacccgca 720

ggcctcctca cgaccccagt tctcactggt gttggcaatg acaacaggtg gaacggccaa 780

atagtgggac tgcaaccagt acctgggggg ttttccacgt gcaacaggca ttggaacttg 840

aacggcagca catatggctg gtcaagccct cggtttgccg acattgacca tcgaagaggc 900

agtgcaagtt ttgctgggaa taactccacc aacgtgctcc agttttggta cgctaatgct 960

gggtctgcaa ttgacaaccc tatctcccag gttgcaccgg acggctttcc tgacatgtca1020

ttcgtgcctt ttaacagccc caacattccg accgcggggt gggttgggtt tggtggtatt1080

tggaacagca acaacggtgc ccccgctgct acgactgtgc aggcctatga gttaggtttt1140

gccactgggg caccaaacaa cctccagccc accaccaaca cttcaggtgc acagactgtc1200

gctaagtcca tttatgccgt ggtaaccggc acaaaccaaa acccaaccgg actgtttgtg1260

atggcctcgg gtgttatctc cactccaaac gccaacgccg tcacatacac gccccaacca1320

gacagaattg tgactacacc cggcactcct gccgccgcac ctgtgggtaa gaacacgccc1380

atcatgttcg cgtctgttgt caagcgcact ggtgacgtca acgccgcagc tgggtcaacc1440

aacgggaccc agtacggcac aggctcccaa ccactgccag taacaattgg actttcgctc1500

aacaactact cgtcagcact catgcccggg cagtttttcg tttggcagtt aacctttgca1560

tctggtttca tggagatcgg tttaagtgtg gacgggtatt tttatgcagg aacaggagcc1620

tcaaccacgc tcattgactt gactgaactc attgacgtac gccccgtggg gcccaggcca1680

tccaagagca cactcgtgtt taacctgggg ggcgcaacca atggcttttc ttatgtctga1740

4. 重组杆状病毒的转染与纯化

（1）转染昆虫细胞在细胞培养皿中接种2.0×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50%～70%。待细胞贴壁后，弃培养基，添加1.0ml转染缓冲液A。将0.5μg的BD BaculoGoldLinearized Baculovirus DNA和2μg pVL-HBM-HS4-VP60质粒在无菌EP管中混匀放置5min，添加1.0ml转染试剂B，混合均匀。吸取混合物滴加到细胞培养皿，27℃孵育4h，移除转染复合物，细胞培养基洗三次，添加3.0ml新鲜培养基，培养皿用封口膜封口，放置培养箱，27℃培养4～5日，收获上清。

（2）蚀斑纯化在细胞培养皿中接种2.0×10⁶～2.5×10⁶个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释上述共转染病毒上清，每个培养皿添加1.0ml不同稀释度的病毒液，室温放置1h，每15min适当震荡，使病毒充分感染。

无菌水配置2%琼脂糖，微波加热到60℃，充分融化。然后放置42℃恒温水浴，添加1体积的2×Grace培养基，混合均匀。弃细胞培养皿中培养液上清，在细胞表面覆盖4.0ml 1%琼脂糖，同时吸走所有气泡，10～15min后琼脂糖凝固。将培养皿放置于湿润环境中，27℃培养7日，观察蚀斑（图5）。在培养皿上标记蚀斑，挑取蚀斑，接种SF-SFM培养基中，2～8℃放置过夜，收获病毒悬液，接种Sf9细胞，27℃培养96～120h，收获细胞培养物，即为第0代病毒。

实施例2——疫苗制备

1. 重组杆状病毒VP60株半成品制备

（1）毒种繁殖将重组杆状病毒VP60株基础毒种接种生长良好的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获病毒液，连传2代，收获第4代病毒液，作为生产用毒种。

（2）生产用细胞制备

1）细胞复苏将冻存的Sf9细胞从液氮中取出，立即投入37℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解，将Sf9细胞悬液转移至离心管，620r/min离心5min，弃上清液，用SF-SFM培养基重悬细胞，置于合适容量的三角瓶，27℃摇床培养，转速为100～105r/min。

2）细胞扩大培养当Sf9细胞密度达到3.0×10⁶个细胞/ml以上时，进行传代，细胞传代至一定数量，接种细胞培养罐，27℃继续培养。

（3）细胞接种、接毒及收获选择生长旺盛的Sf9细胞，接种42L细胞培养罐，接种密度为1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml，27℃培养。待细胞密度达到1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml时，接种重组杆状病毒VP60株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。

（4）灭活向细胞培养物中加入2%的BEI溶液，使其终浓度为0.1%，37℃灭活48h；灭活结束后，向细胞培养物中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2%，搅拌1h终止灭活。

（5）半成品检验

1）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2）血凝效价测定按兔病毒性出血症病毒血凝（HA）试验方法进行测定。

3）表达VP60蛋白含量测定用双抗体夹心ELISA法进行VP60蛋白含量测定。

4）灭活检验取灭活后细胞培养物按MTT相对效力法进行灭活检验。

2. 多杀性巴氏杆菌QLT-1株半成品制备及检验

（1）一级种子的繁殖与鉴定将多杀性巴氏杆菌QLT-1株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养18～24h，作为一级种子。取样，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。

（2）二级种子的繁殖与鉴定将多杀性巴氏杆菌QLT-1株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子。取样按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。

（3）多杀性巴氏杆菌QLT-1株菌液制备按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min。待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%。然后按培养基总量的2%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养8～12h。

（4）菌液检验按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数。

（5）菌液灭活按菌液总量的0.3%加入甲醛溶液，充分混匀，待温度升至37℃开始计时，灭活48h。

（6）灭活检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

3. 支气管败血波氏杆菌JN01株半成品制备及检验

（1）一级种子的繁殖与鉴定将支气管败血波氏杆菌JN01株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养48～72h，作为一级种子。取样，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。

（2）二级种子的繁殖与鉴定将支气管败血波氏杆菌JN01株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子。取样按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。

（3）支气管败血波氏杆菌JN01株菌液制备按发酵罐容量装入80%左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min。待培养基温度冷却至37℃左右时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%。然后按培养基总量的1%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养18～24h。

（5）菌液灭活按菌液总量的0.4%加入甲醛溶液，充分混匀，待温度升至37℃开始计时，灭活24h。

（6）灭活检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

3. 疫苗制备将灭活检验合格的细胞培养物、多杀性巴氏杆菌菌液、支气管败血波氏杆菌菌液按适当的比例混合均匀，和灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1%的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌。

4. 分装定量分装，加盖密封。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。

按上述方法连续生产3批疫苗，批号分别为1804001、1804002、1804003。

实施例3 ——疫苗的检验

1. 性状静置后，上层为澄清液体，下层有少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2. 装量检查、无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均符合规定。

3. 安全检验 3批实验室制品分别颈部皮下免疫45日龄左右健康易感兔，2.0ml/只，连续观察10日，结果所有试验兔均健活，精神、饮食、粪便、体温均正常；接种部位均无肿胀、坏死现象，均未出现其它异常临床症状。具体结果见表1。

表1 3批实验室制品安全性试验检验结果

5. 效力检验

（1）兔病毒性出血症部分

1）血清学方法 3批疫苗分别免疫45日龄左右健康易感兔，免疫后14日，连同条件相同的对照兔分别采血，分离血清，测定兔病毒性出血症病毒HI抗体效价，结果免疫兔兔病毒性出血症病毒HI抗体效价均不低于1:32，对照兔兔病毒性出血症病毒HI抗体效价均不高于1:4。具体结果见表2。

表2 兔血清学方法效力检验结果

2）免疫攻毒法 3批疫苗免疫45日龄左右健康易感兔，免疫后14日，连同条件相同的对照兔进行攻毒，连续观察7日，结果免疫兔均100%（5/5）保护，对照兔100%（5/5）死亡。具体结果见表3。

表3 兔病毒性出血症部分效力检验结果

（2）多杀性巴氏杆菌病部分 3批疫苗免疫45日龄左右健康易感兔，免疫后21日，连同条件相同的对照兔进行攻毒，连续观察10日，结果免疫兔均80%（4/5）以上保护，对照兔100%（5/5）死亡。具体结果见表4。

表4 多杀性巴氏杆菌病部分效力检验结果

（3）支气管败血波氏杆菌病部分 3批疫苗免疫45日龄左右健康易感兔，免疫后21日，连同条件相同的对照兔进行攻毒，连续观察7日，结果免疫兔均80%（4/5）以上保护，对照兔100%（5/5）死亡。具体结果见表5。

表5 支气管败血波氏杆菌病部分效力检验结果

6. 甲醛和汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均符合规定。

序列表

<110> 齐鲁动物保健品有限公司

<120> 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(HBM-F)

<400> 1

agcggatcca aaccatgaaa ttc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(HBM-R)

<400> 2

ataagatctg catgcggtac ccc 23

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(HS4-F)

<400> 3

atatacgtag agctcacggg gacagccccc ccccaaag 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(HS4-R)

<400> 4

acatacgtaa atattctcac tgactccgtc ctggagtt 38

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(VP60-F)

<400> 5

aatgaattcg gcaaagcccg tgcagcgccg caag 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(VP60-R)

<400> 6

atgggtacct cagacataag aaaagccatt ggctg 35

<210> 7

<211> 1740

<212> DNA

<213> VP60基因保守区域片段(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

atggagggca aagcccgcac agcgccgcaa ggcgaagcag caggcactgc taccacagca 60

tcagttcccg gaaccacgac cgacggcatg gatccaggcg tggtggccgc aactagtgtg 120

gtcactgcag aaaattcatc cgcatcggtt gcaacggcgg ggattggagg cccaccccaa 180

caggtggacc aacaggaaac atggaggaca aacttttact acaatgacgt tttcacttgg 240

tccgtcgcgg atgcgcccgg cagcattctc tatactgtcc agcactctcc acagaacaac 300

ccattcacag ctgtgctgag ccagatgtac gctggttggg ctggtggcat gcagttccgc 360

ttcatagttg ctggatcagg tgtgtttggt gggcgactgg tcgcggctgt gataccaccg 420

ggcatcgaga ttggaccagg gttggaggtc aggcaattcc cccatgttgt tatcgacgcc 480

cgttcactcg aacctgttac tatcaccatg ccagacttac gtcccaacat gtaccaccca 540

actggtgacc ctggccttgt ccccacacta gtccttagtg tttacaacaa cctcatcaac 600

ccgtttggtg ggtccaccaa cgcaatccag gtaacagtgg aaacaaggcc aagtgatgac 660

tttgagttcg tgatgattag agccccctcc agtaagactg ttgactcaat ctcacccgca 720

ggcctcctca cgaccccagt tctcactggt gttggcaatg acaacaggtg gaacggccaa 780

atagtgggac tgcaaccagt acctgggggg ttttccacgt gcaacaggca ttggaacttg 840

aacggcagca catatggctg gtcaagccct cggtttgccg acattgacca tcgaagaggc 900

agtgcaagtt ttgctgggaa taactccacc aacgtgctcc agttttggta cgctaatgct 960

gggtctgcaa ttgacaaccc tatctcccag gttgcaccgg acggctttcc tgacatgtca 1020

ttcgtgcctt ttaacagccc caacattccg accgcggggt gggttgggtt tggtggtatt 1080

tggaacagca acaacggtgc ccccgctgct acgactgtgc aggcctatga gttaggtttt 1140

gccactgggg caccaaacaa cctccagccc accaccaaca cttcaggtgc acagactgtc 1200

gctaagtcca tttatgccgt ggtaaccggc acaaaccaaa acccaaccgg actgtttgtg 1260

atggcctcgg gtgttatctc cactccaaac gccaacgccg tcacatacac gccccaacca 1320

gacagaattg tgactacacc cggcactcct gccgccgcac ctgtgggtaa gaacacgccc 1380

atcatgttcg cgtctgttgt caagcgcact ggtgacgtca acgccgcagc tgggtcaacc 1440

aacgggaccc agtacggcac aggctcccaa ccactgccag taacaattgg actttcgctc 1500

aacaactact cgtcagcact catgcccggg cagtttttcg tttggcagtt aacctttgca 1560

tctggtttca tggagatcgg tttaagtgtg gacgggtatt tttatgcagg aacaggagcc 1620

tcaaccacgc tcattgactt gactgaactc attgacgtac gccccgtggg gcccaggcca 1680

tccaagagca cactcgtgtt taacctgggg ggcgcaacca atggcttttc ttatgtctga 1740

Claims

1.一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，该灭活疫苗的有效成分为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株表达的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌的灭活抗原；

所述疫苗用于同时预防兔病毒性出血症、兔多杀性巴氏杆菌病A型、兔支气管败血波氏杆菌病；

所述疫苗的生产菌毒株分别为保藏编号为CGMCC No.8052的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，保藏编号为CGMCC No.17688的多杀性巴氏杆菌QLT-1株和保藏编号为CGMCC No.17689的支气管败血波氏杆菌JN01株，以上菌毒种已于2013年08月02日和2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；

所述疫苗的制备方法包括以下步骤：

疫苗配制：抗原含量按每毫升疫苗中含重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株细胞培养物血凝效价应≥1:512，含多杀性巴氏杆菌菌数应≥3.0×10⁹CFU，含支气管败血波氏杆菌菌数应≥6.0×10⁹CFU的标准进行配苗，加入佐剂和硫柳汞并充分混匀，所述疫苗含有氢氧化铝胶佐剂，抗原与氢氧化铝胶配苗比例为9:1。

2.根据权利要求1所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，所述该疫苗制备方法步骤（1）中接种细胞为Sf9细胞，接种密度为1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml，27℃培养，待细胞密度高于3.0×10⁶个细胞/ml时，补加细胞培养液继续培养，待细胞密度达到1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml时，按MOI=0.5～2.0接种重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。

3.根据权利要求1所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，所述该疫苗的制备方法步骤（1）获得的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株细胞培养物，灭活检验合格后需进行兔病毒性出血症病毒血凝试验方法进行测定，对1%人O型红细胞血凝效价应不低于1:8192。

4.根据权利要求1所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，所述该疫苗的制备方法步骤（2）中，对多杀性巴氏杆菌QLT-1株进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将多杀性巴氏杆菌QLT-1株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养18～24h，作为一级种子；将多杀性巴氏杆菌QLT-1株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子；按发酵罐容量装入80%的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min，待培养基温度冷却至37℃时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%,然后按培养基总量的2%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养8～12h。

5.根据权利要求1所述一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法步骤（3）中，对支气管败血波氏杆菌JN01株进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将支气管败血波氏杆菌JN01株基础菌种划线接种含0.1%裂解血球全血及4%小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板，37℃培养48～72h，作为一级种子；将支气管败血波氏杆菌JN01株一级种子接种含0.1%裂解血球全血及0.1%小牛血清改良马丁肉汤培养基，37℃培养18～24h，作为二级种子；按发酵罐容量装入80%的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min,待培养基温度冷却至37℃时，加入裂解血球全血，使其终浓度为0.1%，然后按培养基总量的1%接种二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法培养，37℃培养16～18h。