CN112779193B - 一株滑液囊支原体强毒株及其应用 - Google Patents

一株滑液囊支原体强毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株滑液囊支原体强毒株及其应用，通过对福建省某滑液囊感染的鸡群进行MS分离、纯化和鉴定后命名为MS FZ株，用其纯培养物感染10~11周龄的SPF鸡具有较高的致病力，至少有80%的SPF鸡出现了气囊炎；将MS FZ株通过甲醛灭活后与油佐剂乳化制备成灭活疫苗对SPF鸡进行两次免疫后以MS FZ株新鲜培养物进行攻毒验证疫苗保护力，结果表明至少有80%的SPF鸡获得免疫保护；因此本发明分离的MS FZ强毒菌株可用作不同药物或预防治疗方法有效性评价的检验用强毒株，并且可以作为疫苗候选毒株制备MS灭活疫苗。

Description

一株滑液囊支原体强毒株及其应用
技术领域
本发明属于生物制品领域，具体涉及一株滑液囊支原体强毒株及其应用。
背景技术
滑液囊支原体（MS）感染主要引起鸡或火鸡的渗出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或黏液囊炎，但近年来在鸡群中最常发生的是亚临床型的上呼吸道感染，各日龄的鸡均可感染，但以28~120 天的鸡最易感染，不同的MS菌株在感染过程中，对于不同的组织具有不同的嗜性，呼吸型菌株主要造成亚临床的呼吸道疾病，主要为气囊炎。虽然滑液支原体的感染极少直接造成禽类的死亡，但其导致的生长迟滞，蛋壳畸形，死淘率上升、肉鸡胴体废弃率增加以及防控所需的大量投入，均可造成严重的经济损失。
近年来国内鸡群滑液囊支原体感染情况呈现普遍性，马爽等人对2010年3月~2015年12月来自华北、华中、华南、东北、西北、华东地区11个省份的不同养鸡场进行了流行病学调查，结果显示该病在我国6个地区11个省均有发生，血清学检测结果显示，血清阳性率为30.23%~54.67%。对临床病料进行病原菌的分离鉴定，共分离到鸡滑液囊支原体39株，分离率为37.1%。Xue et al （2017） 对来自2010-2015年的中国21省的44395只非免疫鸡通过ELISA对MS血清学调查发现，MS能够感染任何年龄的鸡，总体流行率为41.19%，血清阳性率在不同年份从24.7%到57.20%不等，最高的血清阳性率出现在2010年，而最低的出现在2013年；在不同省份，血清阳性率从5.10%到100%不等；对463个商品鸡群检测，80.99%的血清样品为MS阳性。发明人对福建省2018-2019年采集的鸡血清进行了MS抗体检测，结果发现MS抗体阳性率达到82.5%（873份/1058份），并且对部分鸡的喉头拭子或气管拭子进行了检测，发现发生呼吸道症状的鸡群MS感染率最高，达到89%，而疑似健康或亚健康的鸡群MS感染率在30-40%之间。
因此MS感染在中国已经非常普遍，成功建立MS人工动物感染模型以及制备MS疫苗对于进一步的研究有效的控制和预防策略是十分必要的，尤其在目前抗生素减量化行动中，更应加强对新的、有针对性的动物感染模型，用于评价药物或防制技术的有效性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株滑液囊支原体强毒株及其应用，具体涉及滑液囊支原体强毒株MS灭活疫苗的制备或MS疫苗效力及其他预防治疗方法的检验用强毒株。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株滑液囊支原体，所述滑液囊支原体为滑液囊支原体FZ株，已在2020年7月26日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：V202048，地址为武汉大学。
所述的一株滑液囊支原体在制备灭活疫苗中的应用。
所述灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
（1）MS FZ株菌液的培养与灭活：采用静置培养的方式，使用MS FZ株P1代培养物以体积比1：100~1:1000的比例接种新鲜无菌的支原体培养基，在37℃培养约1~5天，待培养基颜色变为橙黄色时，略有混浊时，收获P2代的新鲜培养物，取出部分菌液测定活菌数CCU，经测定其CCU在108~109/ml；在上述培养好的MS FZ株P2代菌液中加入10%甲醛溶液，使甲醛终体积浓度为0.1%，摇匀后全部转移到一个新的无菌三角瓶中，在2~8℃条件下灭活8小时，灭活过程中振荡4~5次，使灭活完全；灭活结束后，取灭活后菌液，以体积比1：10和1:100分别接种5 mL 支原体培养基5管，置37℃培养14日，培养基不变色，灭活完全；
（2）油相制备：添加Span到600 mL白油中，在60℃条件下充分搅匀；0.2微米的PTFE滤膜过滤或115℃高压灭菌15min；
（3）水相制备：将Tween-80缓慢加入到160 mL灭活后的MS FZ菌液中，搅拌，使Tween-80充分溶解并混匀；
（4）乳化：将368 mL的油相烧杯转移到乳化机下，调整乳化机转速11000 rpm，混合油相15 s，渐渐的将上述水相加入到油相中，乳化机在＜25℃下，11000 rpm乳化7 min后停止，进行QC检查；经检查制备好的乳化液外观为乳白色的乳剂，取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散；取3~5 mL乳化后样品在20℃下，1570 g离心15 min无明显分层；在37℃条件下放置21日不破乳；则制备获得疫苗。
所述一株滑液囊支原体强毒株在滑液囊支原体疫苗效力检验中的应用。所述滑液囊支原体强毒株的活菌数为108~109/mL。
本发明的优点在于：
本发明专利分离的MS FZ株具有较高的致病力，感染10~11周龄SPF鸡可以导致严重的气囊炎，发病率可达80%，可用作MS疫苗效力检验或其他方法有效性检验用强毒株；将MS FZ株制成油佐剂灭活疫苗，经免疫后攻毒，其免疫保护效果可达80%以上，因此MS FZ株具有较高的致病力和免疫原性，可用作MS灭活疫苗制备用种毒或效力检验用强毒株。
附图说明
图1. MS分离株在支原体培养基中的生长情况，左为培养基阴性对照呈玫瑰红色，右为MS分离株培养3d后的培养基呈橘黄色。
图2. MS分离株克隆纯化时在支原体固体培养基上的菌落形态（50×）。
图3. 对挑取的单克隆培养物进行MS特异性引物PCR后结果，其PCR产物检测条带为207bp，其中，1-5分别为不同克隆培养物PCR结果，6为阴性对照，7为MS阳性对照。
具体实施方式
实施例1
使用支原体培养基对感染MS的鸡群进行MS病原分离、纯化和鉴定，并对建立10~11周龄SPF鸡人工感染模型和灭活疫苗制备以及免疫效力评价方法，具体如下：
1、菌株的分离及纯化、鉴定
取临床疑似MS感染鸡群的病鸡，处死后，无菌采集气管拭子、喉头拭子和气囊拭子，将采样后的拭子直接放置于无菌支原体培养基中，及时送到实验室，37℃培养18~20小时，提取DNA，用MS特异性引物（MS-F：GAGAAGCAAAATAGTGATATCA / MS-R：CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA）进行PCR扩增，对扩增阳性培养物以体积比1:10转移接种新鲜培养基，37℃继续培养，逐日观察培养基颜色变化，颜色由玫瑰红变为橘红色或黄色时（图1），将培养物-70℃冻存保存。
待支原体分离株稳定传代至4代后，开始在固体培养基上进行单克隆化。培养好的支原体培养物按10-1、10-2、10-3、10-4稀释度涂布于支原体固体培养基上，至长出单菌落（图2）后挑取到支原体液体培养基上，长好后经上述PCR鉴定（图3）后，将鉴定正确的MS培养物再稀释涂布于支原体固体培养基上，如此连续克隆3次后，将纯化的MS命名为FZ株，在支原体液体培养基中进行扩大培养，将其培养物记为P1代。从-70℃取出保存的菌种储存液，融化平衡至室温后，分别取0.5 mL加入对应的4.5 mL 支原体培养基中，依次10倍倍比稀释到10-9，每个稀释度的菌液分别装入4支2 mL培养管中（1 mL /支），另取新鲜培养基分别装入4支2 mL培养管中（1 mL /支）作为阴性对照，放入37℃培养箱中，5~10天观察结果。以培养基颜色能发生变化的最高稀释度为该菌株的CCU50/mL，经反复测定菌落数为108~109 CCU50/mL。
、MS FZ株的培养特性
经过测定，MS FZ株生长需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、猪血清等营养成分，最适生长温度为37℃。在不同批次支原体培养基上均生长良好，37℃培养2~5天，培养物pH由7.6~7.8下降到6.8~7.0，当大量培养时，可呈现轻度浑浊。培养物中的活菌数均大于108 CCU50/mL，最高时可达109 CCU50/mL。FZ株接种支原体固体培养基后，在37℃培养2~5天后，可见“肚脐状”或 “煎蛋样”的菌落。
、MS FZ株对10~11周龄SPF鸡人工感染模型建立
用MS FZ株成功建立了对10~11周龄SPF鸡的人工感染模型。将P1代培养物以体积比1:100~1:1000比例接种新鲜培养基后在37℃培养1~3天后，待培养基颜色由玫瑰红色变为橘黄色时，收获培养物，记为P2代，准备攻毒，同时进行CCU50测定。将50羽10~11周龄的SPF鸡分为5组，其中2组（第1组和第3组）用无菌培养基将P2代新鲜培养物稀释10倍后进行气管注射攻毒，0.2 mL/羽；另外2组（第2组和第4组）用P2代新鲜培养物原液进行气管注射攻毒，0.2 mL/羽；第5组不攻毒，作为阴性对照组。从攻毒后第4天开始至试验结束，将第1组和第2组的环境温度提高到28～32℃，而将第3组和第4组的环境温度控制在23～26℃。攻毒后每日观察鸡临床症状，主要观察呼吸道症状，记录发病情况，并且所有鸡在攻毒后第10天剖杀，观察气囊炎等临床病理变化，并对每只鸡是否发病进行判定。
经测定，攻毒时MS FZ株P2代新鲜培养物的活菌数为108.77CCU50/mL。攻毒后10天的临床观察期内，未观察到明显的呼吸道症状，包括咳嗽、气喘等，也未发现脚垫及腿部关节处等有肿胀发生；极少有胸骨囊肿出现，G1、G2、G3、G4、G5组分别有2、0、1、1、0羽出现轻度的胸骨囊肿。解剖后的临床观察中，除气囊炎外，其他组织器官未观察到可见的临床病理变化。
用FZ株P2代新鲜培养物的原液和稀释10倍的菌液经气管内注射途径攻毒后，在较高温度和正常温度下均可以导致11周龄SPF鸡出现不同程度的气囊炎，极少量鸡出现胸骨囊肿，其中G1、G2、G3、G4组的气囊炎发生率分别为8/9*、10/10、9/10、9/10，各组均可以达到80%的鸡出现气囊炎，且严重气囊炎发生率分别为6/9、8/10、8/10、5/10，阴性对照鸡的气囊均正常。发病的判定标准为：气囊出现气囊炎，表现为气囊上出现大量泡沫、或气囊增厚、或气囊上出现黄色干酪样物质，胸气囊或腹气囊一处或多处呈现气囊炎均为发病。*攻毒前，因啄羽死亡淘汰1羽。
、MS FZ株灭活疫苗的制备及其免疫效力
MS FZ株菌液的培养与灭活：
采用静置培养的方式，使用MS FZ株P1代培养物以体积比1：100~1:1000的比例接种新鲜无菌的支原体培养基，在37℃培养1~5天，待培养基颜色变为橙黄色时，略有混浊时，收获P2代的新鲜培养物，取出部分菌液测定活菌数CCU，经测定其CCU在108~109/mL。在上述培养好的MS FZ株P2代菌液中加入10%的甲醛溶液，使甲醛终浓度为0.1%，摇匀后全部转移到一个新的无菌三角瓶中，在2~8℃条件下灭活8小时，灭活过程中振荡4~5次，使灭活完全。灭活结束后，取灭活后菌液，以体积比1:10和1:100分别接种5 mL 支原体培养基5管，置37℃培养14日，培养基不变色，证明其灭活完全。
株灭活疫苗的制备：
油相制备：添加60 mL Span到600 mL白油中，在60℃条件下充分搅匀；0.2 μm的PTFE滤膜过滤或115℃高压灭菌15min。
水相制备：将5 mL Tween-80缓慢加入到160 mL灭活后的MS FZ菌液中，搅拌，使Tween-80充分溶解并混匀。
乳化：将368 mL的油相烧杯转移到乳化机下，调整乳化机转速11000 rpm，混合油相15 s，渐渐的将上述水相抗原加入到油相中，乳化机在＜25℃下，11000 rpm乳化7 min后停止，进行QC检查。经检查制备好的乳化液外观为乳白色的乳剂，取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散；取3~5 mL乳化后样品在20℃下，1570g离心15min无明显分层。在37℃左右条件下放置21日不破乳。制备的疫苗符合规定，可以用于免疫动物。
株灭活疫苗的效力试验：
将2~3周龄的SPF鸡33羽，分为3组，每组11羽，其中第1组以颈部皮下注射的方式免疫制备好的MS FZ株灭活疫苗0.3 mL/羽，免疫4周后，再以同样的疫苗在颈部皮下注射0.5mL/羽进行加强免疫，第2组和第3组不免疫。加强免疫4周后，第1组和第2组所有鸡用MS FZ株P2代的新鲜培养物进行气管注射攻毒，攻毒剂量为0.2 mL/羽，第3组不攻毒。攻毒后每日观察鸡临床症状，主要观察呼吸道症状，记录发病情况，并且所有鸡在攻毒后第10天剖杀，观察气囊炎等临床病理变化，并对每只鸡是否发病进行判定。
经测定攻毒用的MS FZ株P2代菌液活菌数为108.29 CCU50/mL。攻毒后观察10天，未发现有明显的临床症状。解剖后进行临床病理变化观察，第1组（免疫组）的气囊炎发病率为18.2%（2/11），免疫保护率为81.8%（9/11），第2组（阳性攻毒组）的气囊炎发病率为90.9%（10/11），第3组（空白对照组）的气囊炎发病率为0%（0/11）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagaagcaaa atagtgatat ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagtcgtctc cgaagttaac aa 22

Claims (2)

1.一株滑液囊支原体强毒株，其特征在于：所述滑液囊支原体强毒株为滑液囊支原体FZ株，已在2020年7月26日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：V202048。
2.如权利要求1所述的一株滑液囊支原体强毒株在制备灭活疫苗中的应用，所述灭活疫苗至少可保护80%的灭活疫苗免疫鸡不发生气囊炎。
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