CN115261335B - 一种口服免疫的禽流感灭活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种口服免疫的禽流感灭活疫苗，其中抗原为灭活的禽流感病毒H9N2亚型WL‑19株，保藏编号为CCTCC No：V202163。所述疫苗的安全性良好，接种雏鸡后，未出现因口服疫苗引起的任何局部和全身不良反应。所述疫苗采用口服免疫，其作用于鸡的鼻咽黏膜，能有效阻断禽流感病毒的感染，相较于现有的通过皮下注射的禽流感灭活苗仅仅能保护鸡群不感染，无法阻断病毒传播的现状，本疫苗可以起到净化鸡场的作用，直接阻断禽流感病毒的传播，其生物安全意义重大。

Description

一种口服免疫的禽流感灭活疫苗
技术领域
本发明属于生物疫苗制品技术领域，具体涉及一种口服免疫的禽流感灭活疫苗。
技术背景
禽流感是目前危害世界养禽业发展的重要疾病，我国自1994年报道鸡群中发生H9亚型禽流感以来，该病在我国大多数省份流行。
H9亚型禽流感病毒感染家禽后会出现产蛋下降、生长迟缓等临床症状，与其他疾病混合感染时常出现死亡现象，从而给家禽养殖业造成比较严重的经济损失，是危害我国养殖业的重要疾病之一。H9亚型禽流感病毒的致死率虽不如高致病性禽流感，但造成的经济损失并不亚于高致病性禽流感病毒，其疫病的防控具有重大的经济意义。
H9亚型禽流感一年四季均可发生，但在冬春季和气温骤冷骤热的季节多发。病毒在禽类的呼吸道和肠道内繁殖，可从呼吸道、结膜和粪便中排出。被感染禽群的粪便、饲料、水、设备、笼具、衣物、运输车辆和哺乳动物、昆虫等，都可传播疾病。
现有的禽流感疫苗均为灭活苗，仅能预防鸡的禽流感体内感染，对于鸡禽流感的呼吸道、肠道感染没有抑制作用，而消化道和呼吸道是诸多病原微生物感染的主要途径。目前临床上很难观察到禽群H9亚型禽流感的单纯感染，在临床见到更多的是与其他病原体的混合或继发感染，如与大肠杆菌、鸡毒支原体、传染性支气管炎等的混合感染，从而造成较高的死亡率。通过饮水免疫直接切断病原微生物的入侵和向外释放的途径，将有助于预防禽流感等传染性疾病。
同时，国内外禽流感及其多联多价疫苗大部分为鸡胚源灭活疫苗，其免疫方式均为注射免疫。鸡胚源疫苗在鸡胚尿囊液的收获方面存在困难，存在产品批次间不稳定、劳动需求大、污染风险高等问题。而注射免疫劳动强度大，操作时间长，动物应激反应大，对于大规模养殖局限性较大。
禽流感病毒属甲型流感病毒，流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科。病毒表面糖蛋白具有持续进化的特性，使得导致该疫病的病原每年的出现都有所差异。禽流感的这种抗原变异性是在自身的复制机制基础上使自身适应其宿主，从而获得大流行的潜力。而且，病毒变异率快，导致已有病毒株制备的疫苗免疫效果下降较快。因此，需要通过不断筛选新毒株来保证疫苗的免疫效力。
发明内容
本发明的目的是提供一种口服免疫的禽流感灭活疫苗，用于增强鸡对禽流感疾病的免疫力。
本发明首先提供一株禽流感病毒，命名为禽流感病毒H9N2亚型WL-19株，于2021年8月5日保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V202163。
本发明所提供的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株用于制备灭活疫苗。
本发明再一个方面提供一种口服免疫的禽流感灭活疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株；
所述的疫苗佐剂包含有水相和油相，其中水相包含有质量百分比分别为1％～2％的壳聚糖，0.002％～0.005％的黄芪多糖，0.09～0.1％的葡萄糖；油相中包含有体积百分比分别为80～90％的角鲨烯，5～10％的聚氧乙烯蓖麻油，5～10％的聚醚；
作为实施例的具体记载，所述的水相和油相的体积比为9:1。
所述的灭活，作为实施例的一种具体记载，是使用β-丙内酯(BPL)作为灭活剂进行灭活。
本发明通过所筛选的病毒株来制备疫苗，所制备的疫苗的安全性良好，接种雏鸡后，未出现因口服疫苗引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定进行评价，结果显示本发明中制备的疫苗免疫后21天抗体≥1：64，说明本发明制备的疫苗对鸡群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。
本发明所制备疫苗采用流行毒株，可以解决旧有疫苗对鸡禽流感疾病保护效果下降的问题，对于鸡群有更好的保护作用，可以保护鸡群不受流行毒株感染。本发明疫苗采用口服免疫，其作用于鸡的鼻咽黏膜，能有效阻断禽流感病毒的感染，相较于现有的通过皮下注射的禽流感灭活苗仅仅能保护鸡群不感染，无法阻断病毒传播的现状，本疫苗可以起到净化鸡场的作用，直接阻断禽流感病毒的传播，其生物安全意义重大。
附图说明
图1为H亚型鉴定PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为Marker DL2000，泳道1为阳性对照，泳道2为WL-19株，泳道3为SPF鸡胚液；
图2为WL-19株HA基因同源性分析图；
图3为WL-19株HA基因遗传进化分析图；
图4为N亚型鉴定PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；M为Marker DL5000，泳道1为WL-19株，泳道2为阳性对照，泳道3为SPF鸡胚液；
图5为WL-19株NA基因同源性分析图；
图6为WL-19株NA基因遗传进化分析图。
具体实施方式
本发明从山东省临沂市某肉鸡场发病鸡群中分离得到一株禽流感病毒株，与近年的H9亚型分离株同源性高、亲缘关系近，为流行性毒株。使用该分离的病毒株制备得到一种可通过口服免疫的灭活疫苗，可应用于鸡禽流感的黏膜免疫，阻断鸡禽流感病毒感染鸡呼吸道和消化道，防治鸡禽流感病毒。相比较于现有的禽流感疫苗，本发明所提供的口服灭活疫苗对于现在流行的病毒株的交叉免疫保护效果更好，对于鸡禽流感疾病的防治更有效。
本发明实施例中使用的材料及来源信息如下：
SPF鸡胚：购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；
SPF鸡：自行孵化SPF鸡胚至所需日龄使用；
NDV阳性血清、EDSV阳性血清及SPF鸡血清：均购自中国兽医药品监察所；
H9亚型AIV阳性血清、H5亚型AIV阳性血清：购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；
H9N2亚型禽流感病毒HN106株：青岛蔚蓝生物制品有限公司自行分离鉴定的毒株。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1病毒株的分离与鉴定
从山东省临沂市某肉鸡场发病鸡群中分离到有血凝活性的分离物，该分离物的血凝活性能被H9亚型AIV阳性血清所抑制，而不能被H5亚型AIV阳性血清、NDV阳性血清及EDSV阳性血清所抑制；用H亚型和N亚型禽流感鉴定引物进行RT-PCR扩增和序列分析，结果表明该分离物为H9N2亚型禽流感病毒。HA和NA基因的全序列分析结果表明所分离的毒株与近年的H9亚型分离株同源性高、亲缘关系近，为当前流行毒株。
该分离毒株对42日龄SPF鸡的IVPI为0，属于低致病力禽流感病毒；动物回归试验结果显示，接种42日龄SPF鸡，10/10病毒分离阳性。
综上所述，该分离毒株可作为禽流感灭活疫苗的生产毒株，并将该毒株命名为禽流感病毒H9N2亚型WL-19株。
下面对病毒的分离和鉴定进行详细的描述。
1.1病毒分离
1、病料：
采自山东省临沂市某发病肉鸡场发病鸡的肺和气管。
2、病毒分离：
将病料剪碎，加入适量灭菌生理盐水后研磨，冻融三次，以8000r/min离心15分钟取上清，经0.22μm滤膜无菌过滤，滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/胚，37℃继续孵育，同时设空白对照鸡胚2枚。24小时死亡鸡胚弃去，观察至96小时，无论死胚、活胚逐胚收获鸡胚液，标记后冻存。
接种的5枚SPF鸡胚观察至96小时有4枚死亡，逐胚收获鸡胚液，标记。
按现行《中国兽药典》附录所述红细胞凝集(HA)试验方法，分别测定各鸡胚液对1％鸡红细胞的凝集效价，具体结果见表1。
表1：病毒分离接胚表
从表1结果可知，1、2、3号鸡胚液具有血凝性，可以进行病毒分离。
将1、2、3号鸡胚液用灭菌生理盐水稀释成4HA单位的抗原液，分别与H9亚型AIV阳性血清、NDV阳性血清、EDSV阳性血清、H5亚型AIV阳性血清和SPF鸡血清作血凝抑制试(HI)试验。具体结果见表2。
表2：HI试验表
注：“-”表示反应阴性。
从表2的结果可知，3枚鸡胚液的血凝活性均能被H9亚型禽流感阳性血清抑制，而不能被H5亚型AIV阳性血清、NDV阳性血清及EDSV阳性血清所抑制。其中1号鸡胚液的HI效价最高，达1:256。因此，申请人选择1号鸡胚液进行后续病毒鉴定，并将该分离的病毒株命名为WL-19株。
1.2病毒鉴定
1、分子生物学鉴定
(1)H亚型的鉴定
禽流感病毒H亚型鉴定引物(NY/T772-2013)由华大科技有限公司合成。
参照TRIzol试剂说明提取WL-19株病毒液的RNA，进行反转录和PCR扩增，同时设H9N2亚型禽流感病毒HN106株病毒液为阳性对照，SPF鸡胚液为阴性对照。将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。回收目的片段送华大科技有限公司测序。
测序结果显示：WL-19株为H亚型禽流感病毒。
(2)HA基因的序列分析
通过PCR扩增获得WL-19株HA基因，全长1686bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
将HA基因序列在NCBI数据库中进行比对分析，结果如图2所示，WL-19株与近年来流行的H9N2亚型禽流感4.2.5分支的毒株同源性最高，在95.7％以上。
进一步将WL-19株HA基因序列与表3中的H9N2型毒株进行遗传进化分析。结果如图3所示，WL-19株处于H9N2亚型禽流感4.2.5分支。遗传进化分析结果与同源性结果一致。
表3：HA基因序列分析参考毒株信息表
(3)N亚型的鉴定
禽流感病毒N亚型鉴定引物(NY/T772-2013)由华大科技有限公司合成。
参照TRIzol试剂说明提取WL-19株病毒液的RNA，进行反转录和PCR扩增，同时设H9N2亚型禽流感病毒HN106株病毒液为阳性对照，SPF鸡胚液为阴性对照。将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图4所示。回收目的片段送华大科技有限公司测序。
测序结果显示WL-19株为N亚型禽流感病毒。
(4)NA基因的序列分析
通过PCR扩增获得WL-19株NA基因，全长1401bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
将NA基因序列在NCBI数据库中进行比对分析。结果如图5所示，WL-19株与近期的禽流感流行毒株H9亚型的同源性均在97.7％以上，同源性最高，亲缘关系最近。
进一步将WL-19株NA基因序列与表4中所述H9亚型分离毒株进行遗传进化分析。结果如图6所示，WL-19株处于H9N2亚型禽流感4.2.5分支。遗传进化分析结果与同源性结果一致。
表4：NA基因序列分析参考序列表
综上，分子生物学鉴定结果表明，本发明分离得到的WL-19株为禽流感病毒H9N2亚型，且与现有公布的禽流感病毒H9N2亚型分离株在抗原蛋白上存在差异，不同于现有的流行毒株。因此，WL-19株是一种新的禽流感病毒H9N2亚型流行株。
申请人将该分离毒株WL-19株命名为禽流感病毒H9N2亚型WL-19株，于2021年8月5日保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V202163。
2、病毒含量测定
将禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1m1，置37℃继续孵育。24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，观察至120小时，无论死胚、活胚逐胚收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者判为感染，计算EID50，禽流感病毒H9N2亚型WL-19株在鸡胚上的病毒含量为107.32EID50/0.1ml。
3、鸡胚中和试验
将禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液用灭菌生理盐水稀释至约含104.0EID50/0.1ml，与等量H9亚型AIV阳性血清混合，室温中和1小时，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2m1；同时设病毒对照(等量病毒液和灭菌生理盐水混合)10枚，每胚0.2m1。置37℃继续孵育，观察至120小时。
结果显示，与H9亚型AIV阳性血清混合接种组的鸡胚10/10健活，进行HA试验，10/10阴性；而病毒对照组的10/10死亡，进行HA试验，均不低于1:128。
4、静脉致病指数(IVPI)测定
将禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液用灭菌生理盐水作10倍稀释，翅静脉接种42日龄SPF鸡10只，每只0.2ml。接种后每24小时观察一次，共观察10日，每次观察时对接种鸡打分，正常记为0，发病(鸡只蜷缩在一起不愿运动、采食或饮水，但无明显的翅、腿麻痹表现)记为1，麻痹(翅、腿明显不协调，翅膀下垂)记为2，死亡记为3，计算静脉致病指数。
结果显示，所有接种鸡均正常，未发现任何异常反应，IVPI为0。
5、动物回归实验
将禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液用灭菌生理盐水作10倍稀释，翅静脉接种42日龄SPF鸡10只，每只0.2ml。接种后每日观察，于接种后第5日采集每只鸡的喉拭子及泄殖腔拭子，处理后尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离，测定红细胞凝集价，与H9亚型AIV阳性血清进行HI试验鉴定，结果见表5。
表5：动物回归试验病毒分离表
从表5的试验结果可知，本发明分离得到的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株适合作为疫苗毒株，其效力符合要求。
1.3毒种的纯化与检验
采用终点稀释法和中和试验法对禽流感病毒H9N2亚型WL-19株进行传代纯化，对纯化后毒种进行扩繁，冻干保存E0代毒种100瓶，病毒含量为107.63EID50/0.1ml，HA效价为1:512；经检验，该毒种纯净，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，血凝活性能被H9亚型AIV阳性血清特异性抑制，在鸡胚上的增殖活性能被H9亚型AIV阳性血清特异性中和；该毒种翅静脉接种42日龄SPF鸡，观察10日，所有接种鸡均未见明显异常反应，接种后5日病毒分离率为9/10；用该毒种制备疫苗进行免疫原性试验，结果免疫组血清HI效价的几何平均值为1:588.1，攻毒10/10病毒分离阴性；对照组血清HI效价均不高于1:4，攻毒5/5病毒分离阳性，表明该毒种免疫原性良好。将扩增的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株E0代毒定为原始种子。
1.4致病性研究
1、对42日龄SPF鸡的毒剂量试验
结果表明：禽流感病毒H9N2亚型WL-19株攻毒后第5日为排毒高峰期，10-3稀释时(104.63EID50/0.1ml)攻毒，可满足试验鸡9/10发病，结合生产实际，将攻毒方式定为：每只鸡翅静脉注射约含106.0EID50的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液，于攻毒后5日，采集每只鸡的喉拭子及泄殖腔拭子接种SPF鸡胚分离病毒，攻毒鸡应9/10以上病毒分离阳性。
2、对不同日龄SPF鸡的致病力试验
结果表明：28、42、56日龄SPF鸡每只翅静脉注射约含106.0EID50的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒液，攻毒后第5日采集喉拭子和泄殖腔拭子用鸡胚分离病毒，结果9/10～10/10病毒分离阳性，符合攻毒发病要求。
综上，禽流感病毒H9N2亚型WL-19株对雏鸡的毒力为：28～56日龄SPF鸡每只翅静脉注射约含106.0EID50的WL-19株病毒液，观察10日，应无明显异常反应；攻毒后5日，进行病毒分离，至少9只鸡病毒分离阳性。
1.5种子继代与种子批建立
将禽流感病毒H9N2亚型WL-19株E0代毒在SPF鸡胚上连传15代，病毒含量、对雏鸡毒力、免疫原性(鸡胚培养物和悬浮的MDCK-sc细胞培养物)及特异性等均稳定，且各代毒种均纯净，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，均符合生产用毒种要求。
禽流感病毒H9N2亚型WL-19株毒种在15代内稳定，建立了基础种子批，记为AIV-WL-19-JC01、AIV-WL-19-JC02、AIV-WL-19-JC03，各冻干100瓶。经鉴定，建立的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株基础种子批合格。结合生产实际，基础种子代次范围定为E1～E5，生产种子继代不超过3代，最高使用代次不超过E15代；效检用毒种代次范围为E1～E3。
实施例2禽流感病毒H9N2亚型灭活疫苗的制备
MDCK-sc全悬浮禽流感病毒H9N2亚型WL-19株适应性细胞来源于北京鼎持生物技术有限公司，由北京鼎持生物技术有限公司筛选克隆，其细胞生产培养基为MDCK303，来源于壹生科(深圳)有限公司，接毒培养基为MDCK302，来源于壹生科(深圳)有限公司。
1、MDCK-sc细胞扩增
使用MDCK304培养基复苏MDCK-sc细胞，按照常规方式进行培养，其工艺参数为：培养温度37℃，pH7.0，溶氧40。细胞生长48～72h后，按起始密度0.5×106cells/ml进行传代。经过48～72h培养，细胞密度接近10×106cells/ml。对细胞进行传代，细胞扩增到1000ml左右，继续培养48～72h，准备接毒。
2、禽流感病毒H9N2亚型WL-19株抗原制备
在细胞密度达到107cells/ml时，以适合的感染复数0.0001～0.001接种禽流感病毒H9N2亚型WL-19株病毒。接种病毒后，同步添加一倍剂量的病毒增殖培养基，按照培养温度37℃，pH为7.2，溶氧40进行细胞培养，待培养中细胞活率低于80％，收获病毒液，其中病毒含量达到109.5EID50/mL。对收获的病毒液进行两次冻融，冻融后离心去除细胞沉渣，由此收获病毒液上清。按照1:4000接入β-丙内酯(Sigma)作为灭活剂，在2～8℃灭活48h。灭活后置于37℃水解两小时。灭活后的病毒液通过100～300KD超滤进行浓缩，浓缩倍数为35倍。
3、半成品检验
(1)无菌检验
取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
(2)灭活检验
取灭活后的病毒液，分别尿囊腔接种9～11日龄的SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24h内死亡鸡胚，观察5日，非特异性死亡不超过2个，收获所有鸡胚液，逐个测定鸡胚液的血凝价，全部是阴性，将收获的鸡胚液混合，盲传一代并测定鸡胚液的血凝价，全部是阴性。
4、水相制备
将上述制备得到的禽流感病毒H9N2亚型WL-19株灭活抗原用PBS缓冲液稀释35倍。
将质量百分比分别为1～2％的壳聚糖，0.002～0.005％的黄芪多糖，0.09～0.1％的葡萄糖和98％稀释后的灭活抗原充分混合，得到水相，2～8℃保存。
5、油相制备
将体积百分比分别为80～90％的角鲨烯，5～10％的聚氧乙烯蓖麻油，5～10％的聚醚充分混匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，得到油相，2～8℃保存。
6、疫苗制备
按照9:1的体积比将水相和油相进行混合，4℃搅拌0.5h，经过微射流均值乳化机制成乳液，即制备成疫苗。
7、分装
定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
8、动物试验
(1)安全检验
用21日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只，设为A、空白对照两组，按照下表6进行免疫，观察14日。
表6：安全检验免疫表
分组 疫苗 一免 二免
A 实验疫苗 1日龄口服0.4ml 7日龄口服0.4ml
空白对照 不免疫 不免疫 不免疫
结果显示，SPF鸡未出现因口服疫苗引起的局部和全身不良反应，从而证明本发明制备得到的口服灭活疫苗应用于靶动物是安全的。
(2)效力检验
选用21日龄SPF鸡50只，分为A、B、C、D和空白对照共5组，每组10只，按照表7所述方法进行免疫，免疫后21日分别分离鸡血清，检测HI值，结果见表8。
表7：效力检验免疫表
表8：免疫结果表
从表8的动物实验结果可知，免疫后21天，口服灭活WL-19株病毒液和市售H9N2亚型禽流感疫苗进行免疫的B组和D组SPF鸡均未产生抗体；而口服本发明制备得到的灭活疫苗进行免疫的A组SPF鸡血清中抗体HI均值达到6.1，与C组皮下注射市售H9N2亚型禽流感疫苗的免疫效果相当。从而说明，本发明制备得到的禽流感H9N2亚型灭活疫苗可通过口服进行免疫，且免疫效果良好，取得了意料不到的技术效果。
(3)攻毒实验
分别对上述效力检验中的A组、C组、空白对照组的SPF鸡进行攻毒。口服活病毒剂量为106.0EID50/0.2ml，攻毒5天后采咽拭子，泄殖腔拭子，加入装有1mL PBS的EP管中，同一只鸡的混到一起，在-80℃冰箱冻融一次，10000r/min离心两次取上清，每只鸡的拭子上清液接9～10日龄鸡胚五枚，培养五天后取尿囊液检测HA。若有任意一枚鸡胚HA≥24，即记为分离阳性。具体结果见表9。
表9：攻毒结果表
从表9的攻毒结果可知，通过传统的皮下注射方法进行免疫的市售疫苗，只可以保护鸡只不发病，而本发明所述禽流感H9N2亚型灭活疫苗通过口服进行黏膜免疫，不仅可以保护鸡只不发病，更可以有效阻断禽流感在鸡群内的传播，攻毒阳性率远低于市售疫苗，取得了意料不到的技术效果。
9、疫苗保存期试验
将本发明制备得到的禽流感H9N2亚型灭活疫苗保存在2～8℃至12个月，在第3、6、9、12个月分别随机选取一瓶进行安全效力检验，检验结果见表10、表11。
表10：疫苗安全检验表
表11：疫苗效力检验表
由表10、表11的结果可知，本发明制备得到的禽流感H9N2亚型灭活疫苗在2～8℃条件下储存12个月，其对于试验靶动物依然是安全有效的。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物制品有限公司 青岛蔚蓝生物股份有限公司
<120> 一种口服免疫的禽流感灭活疫苗
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagacag tatcactaat aactatacta ctagtagcaa cagtaagcaa tgcagataag 60
atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgt caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgca ccattgaagg actaatctat 240
ggcaatcctt cttgtgatct attgttggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300
ccatcagctg ttaacggatt gtgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg 360
tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa aggatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga 480
tggttgactc aaaagaacaa cgcttaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gagaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatac tacgcagaca 600
aatctgtaca caagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660
ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720
tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa gatctgatgg gaatctaata 780
gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat 840
ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggatt aaacacaaca 900
ttgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata cattggcata 960
aaggagtctc aaacttgcag tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020
ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggtcggtcag gactagttgc tggttggtat 1080
ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260
aagatcgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320
gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgac gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg 1380
aagagggcgt tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac 1440
aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag aaggaagtat 1500
caagaggagt caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat cttcttgtgg attgcaaatg 1620
gggtttgctg cctttttgtt ctgggctatg tccaatgggt cttgcagatg caacatttgt 1680
atataa 1686
<210> 2
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Ala Thr Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Val Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Arg Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Glx Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser
115 120 125
Asp Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Leu Ser Tyr
130 135 140
Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Asp Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Val Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Thr Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Glu
195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Leu Gln Thr Leu Arg Ile Arg His Asp
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Asp Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
305 310 315 320
Lys Glu Ser Gln Thr Cys Ser Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Arg
340 345 350
Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Met Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Asn Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Ser Cys Gly Leu Gln Met Gly Phe Ala Ala
530 535 540
Phe Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys
545 550 555 560
Ile
<210> 3
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaatccaa atcagaagat aatagcaatt ggctctgttt ctctaaccat tgcgataata 60
tgttttctca tgcagattgc catcttaaca acgaccatga cactacattt caggcagaat 120
gaatgcagca atccatcgaa taatcaagtg gtgccatgtg aacctatcat aatagagaag 180
aacacagtgc atttgaatag tactaccata gagaaggaaa tttgtcctaa agtggcagaa 240
tacaagaatt ggtcaaaacc acaatgtcaa attacagggt tcgctccttt ctcaaaggac 300
aactcaatta ggctttctgc aggtggagat atctgggtga caagagaacc ttatgtgtcg 360
tgcagtcttg gcaaatgtta tcaatttgca cttggtcagg gaaccactct gaaaaacaag 420
cactcaaatg gcactacaca tgatagaatt cctcacagaa ctctcttaat gaatgagtta 480
ggtgtcccat ttcatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc 540
catgatggga aagcatggtt acatatttgt gtgactgggg atgataaaaa tgctactgct 600
agtatcattt atgatgggat gctggctgac agtattggtt catggtccaa aaacatccta 660
agaacccagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtgcagtggt aatgactgat 720
ggaagtgcgt caggaaaggc tgacactaga atattattca taagagaggg gaaaattata 780
aatattagcc cattgtcagg aagtgctcag catgtggagg aatgttcctg ttacccccgg 840
tatcctgaag ttaggtgtgt ttgcagagac aactggaagg gctccaatag gcccgttcta 900
tatataaata tggcagatta tagtattgag tccagttatg tatgctcagg acttgttggc 960
gacacaccaa gagatgatga tagctccagc agcagtaact gtagagaccc taataacgaa 1020
agaggggccc caggggtgaa agggtgggcc tttgacgatg ggaatgacat ttggatggga 1080
cgaacaatca aaagtggttc acgctcaggt tatgagactt ttagggtcgt taatggttgg 1140
accacggcta attccaagtc acaggtaaat aggcaagtca tagttgacag tgacagctgg 1200
tctgggtatt ctggtatctt ctctgttgaa ggcaagaatt gcatcaacag gtgcttttat 1260
gtggagttga taagagggag accacaggaa accagagtgt ggtggacttc aaacagcatc 1320
attgtattct gtggaacctc aggtacatat ggaacaggct catggcctga tggagcgaat 1380
atcgacttta tgcctatata a 1401
<210> 4
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ile Ile Cys Phe Leu Met Asp Ile Ala Ile Leu Thr Thr Thr
20 25 30
Met Thr Leu His Phe Arg Gln Asp Glu Cys Ser Asn Pro Ser Asn Asn
35 40 45
Asp Val Val Pro Cys Glu Pro Ile Ile Ile Glu Lys Asn Thr Val His
50 55 60
Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys Val Ala Glu
65 70 75 80
Tyr Lys Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe Ala Pro
85 90 95
Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp Ile Trp
100 105 110
Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Leu Gly Lys Cys Tyr Asx
115 120 125
Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Met Asp Lys His Ser Asn Gly
130 135 140
Thr Thr His Asp Arg Ile Pro His Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu
145 150 155 160
Gly Val Pro Phe His Leu Gly Asp Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser
165 170 175
Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Ile Cys Val Thr
180 185 190
Gly Asp Asp Asp Asn Ala Thr Ala Ser Ile Asp Tyr Asp Phe Cys Val
195 200 205
Met Leu Ala Asp Ser Asp Gly Ser Trp Ser Lys Asn Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Ala Val Val Met
225 230 235 240
Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Asp Ile Leu Phe Ile
245 250 255
Arg Glu Gly Lys Ile Ile Asn Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln
260 265 270
His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Glu Val Arg Asp
275 280 285
Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Leu Tyr Ile
290 295 300
Asn Met Ala Asp Tyr Ser Ile Glu Ser Ser Asp Val Cys Ser Gly Leu
305 310 315 320
Val Gly Asp Thr Pro Arg Asp Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys
325 330 335
Arg Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Trp Asp
340 345 350
Phe Asp Asp Gly Asn Asp Ile Trp Met Gly Arg Thr Ile Lys Ser Gly
355 360 365
Ser Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Asp Val Asn Gly Trp Thr Thr
370 375 380
Ala Asn Ser Lys Ser Gln Asp Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Ser Asp
385 390 395 400
Ser Trp Asp Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Asn Cys
405 410 415
Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln Glu
420 425 430
Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Phe Cys Gly Thr
435 440 445
Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asp
450 455 460
Phe Met
465

Claims (3)

1.一种口服免疫的禽流感灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的保藏编号为CCTCC No：V202163的禽流感H9N2亚型病毒；所述的疫苗佐剂包含有水相和油相，其中水相包含有质量百分比分别为1%～2%的壳聚糖，0.002%～0.005%的黄芪多糖，0.09～0.1%葡萄糖；油相中包含有体积百分比分别为80～90%的角鲨烯，5～10%的聚氧乙烯蓖麻油，5～10%的聚醚。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的水相和油相的体积比为9:1。
3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活，是使用β-丙内酯作为灭活剂进行灭活。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102370977A (zh) * 2010-08-06 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种新型疫苗佐剂及应用
CN102816740A (zh) * 2012-09-03 2012-12-12 江苏省农业科学院 一种禽流感病毒、灭活疫苗及其制备方法
KR20120135015A (ko) * 2011-05-30 2012-12-12 건국대학교 산학협력단 공기전파가 가능한 신규한 ｈ９ｎ２형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 균주 및 그로부터 유래된 백신
CN104147599A (zh) * 2014-06-24 2014-11-19 华中科技大学 一种疫苗佐剂、其制备方法及应用
CN111057682A (zh) * 2019-12-05 2020-04-24 北京华夏兴洋生物科技有限公司 一株禽源h9n2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用
CN111494617A (zh) * 2020-04-08 2020-08-07 扬州优邦生物药品有限公司 一种四联灭活疫苗及其制备方法
CN113736749A (zh) * 2021-08-25 2021-12-03 福建圣维生物科技有限公司 一株禽流感病毒毒株及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102370977A (zh) * 2010-08-06 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种新型疫苗佐剂及应用
KR20120135015A (ko) * 2011-05-30 2012-12-12 건국대학교 산학협력단 공기전파가 가능한 신규한 ｈ９ｎ２형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 균주 및 그로부터 유래된 백신
CN102816740A (zh) * 2012-09-03 2012-12-12 江苏省农业科学院 一种禽流感病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN104147599A (zh) * 2014-06-24 2014-11-19 华中科技大学 一种疫苗佐剂、其制备方法及应用
CN111057682A (zh) * 2019-12-05 2020-04-24 北京华夏兴洋生物科技有限公司 一株禽源h9n2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用
CN111494617A (zh) * 2020-04-08 2020-08-07 扬州优邦生物药品有限公司 一种四联灭活疫苗及其制备方法
CN113736749A (zh) * 2021-08-25 2021-12-03 福建圣维生物科技有限公司 一株禽流感病毒毒株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选";万晓朋 等;《中国预防兽医学报》;第32卷(第4期);第276-280页 *
"H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选";胡晓苗 等;《中国兽医杂质》;第53卷(第11期);第36-38和41页 *
"Ｈ9亚型禽流感病毒HF株的分离 鉴定和免疫原性评价";程艺 等;《中国畜牧兽医》;第47 卷(第9期);第2945-2952页 *

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