CN102851257A - 一种鸡传染性支气管炎病毒减毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本方法涉及一种鸡传染性支气管炎病毒减毒疫苗株及其应用。本发明人对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)进行传代致弱，成功地获得了一种IBV减毒株CCTCC.V201232及其衍生病毒株。本发明的减毒株及衍生病毒株可用于制备预防传染性支气管炎的疫苗组合物。实验表明，本发明的减毒株和疫苗组合物接种于幼龄禽类后，可有效激活禽类体内的免疫系统并对鸡传染性支气管炎有良好的预防作用。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒减毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和免疫领域，具体地，为一种鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)的减毒株、减毒株的衍生毒株以及其在IBV防治接种、疫苗组合物制备中的应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是IBV(InfectiousBronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性传染病。IBV自然感染主要发生于鸡，各种年龄的鸡都易感。传染性支气管炎病毒主要侵害鸡的呼吸道，肾脏和输卵管。临床症状多见于六周龄以内的鸡，感染率高，但死亡率低。肉鸡感染之后，主要降低食物转换率、增重缓慢、同时可能出现继发感染，造成屠宰合格率低。10日龄以内的雌性雏鸡感染后，往往导致永久性输卵管破坏；但也危害育成鸡和产蛋鸡群，使之抵抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。

目前世界上流行着许多血清型/基因型的IBV。过去IBV的分型是按血清中和反应来确定血清型的。各血清型之间无交叉保护作用或交叉保护作用很低。随着分子生物学技术的发展，目前常常用S1蛋白的基因的核苷酸和氨基酸序列的比较来确定其基因型。在所有已知血清型中，马萨诸塞血清型(Massachusetts，以下简称Mass或M41)分布和流行最广，几乎世界各地有IBV的国家均有该血清型的流行。

根据国内外的研究报道，IBV不同血清型/基因型的分布具有明显的地域特征。Pan J.Y.等从青岛地区分离并鉴定出了一种腺胃型IBV毒株，命名为QX株(1999，Genebank access No.:AF193424)。后来在2004年，刘胜旺等报道在我国免疫鸡群和非免疫鸡群中也分离到QX基因型毒株，但病鸡多以肾炎为主。最近几年除呼吸道症状和肾脏变化外，雌性雏鸡感染后输卵管出现囊肿也非常常见。我国大陆当前同时流行多个血清型/基因型的IBV毒株，其中类QX型毒株(简称QX-like，亦称LX4-type)是最主要的优势流行株，比例超过50%，部分地区甚至高达75%。从2003年以来，类QX基因型IBV已在许多国家广泛流行，如荷兰、比利时、法国、德国、意大利、俄罗斯、韩国等，除呼吸道症状和肾脏变化外，雌性雏鸡感染后输卵管常出现囊肿。

美国常用的IBV疫苗株：1)Mass-type血清型如H120或Ma5；2)Delaware血清型如DE072；3)Georgia血清型如GA98；4)Connecticut血清型；5)Arkansas血清型等。欧洲常用的IBV疫苗株：1)Mass-type血清型如H120或Ma5或H52；2)4/91或793B血清型；3)D274血清型；4)D1466血清型；5)类QX基因型等。

我国广泛使用的疫苗均属于Mass-type血清型的毒株，包括H120、H52、Ma5和W93。当前国内流行毒株除Mass-type血清型外，还有相当一部分在遗传进化关系上与Mass-type疫苗毒株存在较大差异，因此我国已有疫苗不能有效地预防IB流行毒株的攻击。研究开发具有较好保护力的新血清型或基因型的疫苗，同时还能与Mass-type血清型IB减毒疫苗联合应用显得尤为重要，本发明研究开发了一种新的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株，解决了以上所述问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于保护禽类宿主以抵抗传染性支气管炎的减毒病毒株及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis virus，IBV)的减毒株，所述减毒株是鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05，保藏号为CCTCC.V201232。

在本发明的第二方面，提供了衍生自第一方面所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株的衍生病毒株。

在另一优选例中，所述衍生病毒株具有以下一个或多个特性：

(a)低毒力：毒力与CCTCC.V201232的毒力相近或相同；

(b)所述的衍生病毒株中S1基因的第1-1643位的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(c)所述衍生病毒株表达的S1蛋白的第54位氨基酸为异亮氨酸(Ile)；

(d)所述衍生病毒株表达的S1蛋白的第1-547位如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的减毒株和所述衍生病毒株安全性好：可用于肉鸡、蛋鸡和种鸡的免疫接种；可用于一日龄或一日龄以上(如2-9日龄)鸡的免疫接种；和/或可用于蛋鸡和种鸡在产蛋期间的免疫接种。

在本发明的第三方面，提供了一种疫苗组合物，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株。

在另一优选例中，所述的载体是兽药学上可接受的载体或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为二价疫苗或多价疫苗。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有一种或多种针对选自下组的血清型的IBV疫苗株：

(a)M41血清型,如H120或Ma5或W93或H52；

(b)4/91或793B血清型。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物是含保藏号为CCTCC.V201232的减毒株和M41血清型(如H120疫苗株)的二价疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物每剂量中含有10^3.0～10^5.5鸡胚半数感染量EID₅₀的减毒株。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括：滴鼻剂、点眼剂型。

在本发明的第四方面，提供了一种制备鸡传染性支气管炎病毒的减毒株的方法，包括步骤：在家禽胚卵中，对保藏号为CCTCC.V201232的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05进行传代，从而制得减毒株。

在另一优选例中，所述的传代次数为1-1000次，较佳地2-200次。

在本发明的第五方面，提供了本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株的用途，即用于制备疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物用于保护禽类宿主以抵抗传染性支气管炎。

在另一优选例中，所述的禽类宿主包括：鸡。

在本发明的第六方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：

(a)对保藏号为CCTCC.V201232的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(b)将步骤(a)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

在本发明的第七方面，提供了一种鸡传染性支气管炎(IBV)的双价疫苗，所述双价疫苗是包含(i)本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株和(ii)M41血清型(如IBV-H120疫苗株)的联合疫苗。

在本发明的第八方面，提供了一种对家禽进行接种的方法，包括步骤：给需要的家禽接种本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株，或接种本发明第三方面中所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述家禽包括：鸡、鸽子、雉鸡。

在另一优选例中，所述的家禽包括：1日龄及1日龄以上的鸡。

在另一优选例中，所述的接种方式包括：滴鼻接种、点眼接种、饮水接种、气雾接种。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了IBV-KL05与其他基因型IBV毒株S1基因的核苷酸序列比对结果。

图2显示了IBV-KL05与其他基因型IBV毒株S1蛋白的氨基酸序列的比对结果。

图1和图2中，1-6分别表示以下序列：1.AY842862.1W93.seq；2.M21970.1strainH120.seq；3.AF352315.1H52.seq；4.AY189157.1_LX4.seq；5.AF193423.1_QX.seq；6.IBV-KL05.seq。结果表明，IBV-KL05与IBV-LX4及IBV-QX同一性很高(大于95%)，属于同一基因型。

图3显示了本发明减毒株IBV-KL05与其他多种IBV毒株的S1蛋白氨基酸第1-100位的比对结果。其中，IBV-KL05.seq为本发明减毒株的序列。结果显示，本发明减毒株的区别于其它IBV的显著特征是：S1蛋白的第54位氨基酸为异亮氨酸(Ile)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而具体的研究，对IBV强毒株进行连续传代致弱，首次意外地获得了一种减毒株IBV-KL05，该减毒株能够非常有效地对抗IBV类QX、IBV-QX，因此可开发为预防传染性支气管炎的疫苗。此外，该减毒株还可与其他血清型的减毒株(例如M41血清型)形成良好的双价或多价疫苗，以对抗IBV类QX、IBV-QX以及IBV-M41等不同的病毒株。在此基础上完成了本发明。

术语

本发明中，所述的“鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)”、“IBV”、“鸡染性支气管炎病毒”、“鸡传染性支气管炎病毒IBV”可以互换使用，均指鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。

如本文所用，术语“IBV-KL05”指保藏号为CCTCC.V201232的减毒株(或减毒疫苗株)。该减毒株也称为“IBV-KL05 MVS”。

如本文所用，术语，“IBV-KL05 MVS+3”是衍生自CCTCC.V201232的、经过3次传代的衍生减毒株。

如本文所用，术语“减毒株”和“减毒疫苗株”可互换使用，都指减毒的、可作为疫苗活性成分使用的病毒株。

毒株来源及分离

本发明的毒株来源为2010年山东省某肉鸡场疑似的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染，肉鸡出现腹泻及呼吸道症状，剖检发现，病鸡肾脏肿大。采集气管、肺及肾脏组织，制成10%组织悬液，接种到9～11日龄的SPF鸡胚尿囊腔，接种后18～48小时收获尿囊液(进行连续传代，收集每一代尿囊液)。大部分鸡胚在接种1～7天后死亡，并表现出典型的IBV病变。

将收集的尿囊液提取RNA，根据IBV病毒S1基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增得到目的片段，并直接用PCR产物进行测序。将测序结果与已知序列进行比对后，证明本公司分离的病毒为IBV，并在核苷酸和氨基酸水平上与IBV-LX4type或类IBV-QX基因型相似(同源率达95%以上)。将该分离株命名为IBV-QD01，可在9～11日龄SPF鸡胚上进行传代。

减毒方法和减毒株

在本发明中，通过对鸡传染性支气管炎病毒强毒株(IBV-QD01)进行连续传代，从而获得了一种效果优异的减毒株。

在一优选例中，传代减毒方法包括：使用9～11日龄SPF鸡胚对IBV-QD01病毒株进行连续传代培养，每代接种2～3枚鸡胚的尿囊腔，每胚接种100～200μl，置于37～38℃，湿度为45%～60%培养18～48小时后，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代，连续传代70代以上并进行克隆，进行病毒滴度测定并进行致弱性评价后，获得了6株理想的克隆株。

一株优选的克隆株是鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05，并于2012年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.V201232。

研究表明，IBV病毒的S蛋白N-末端在跨越内基质网内膜时可被蛋白酶切除10个疏水氨基酸构成的信号肽，并被裂解切割为S1(90kDa)和S2(84kDa)亚单位多肽，S1蛋白分子量约为90kDa，由520～538个氨基酸组成，S2约为84kDa，由625个氨基酸组成。

通常，可以通过S1基因的核苷酸序列来表征不同的病毒株。几种病毒株的S1基因的核苷酸序列比对结果示于图1，S1蛋白的氨基酸序列比对结果示于图2。

本发明CCTCC.V201232的S1基因的部分序列(对应于编码S1蛋白第1～547位的基因)示于SEQ ID NO.:1，其编码的S1蛋白第1-547位的氨基酸序列示于SEQ ID NO.:2。

应理解，对于本发明减毒株IBV-KL05的各基因序列(包括S1基因序列)而言，应以保藏号CCTCC.V201232的减毒株的序列为准。

本发明人研究表明，本发明病毒株区别于其它IBV的一个显著特征是：所表达的S1蛋白的第54位氨基酸为异亮氨酸(Ile)(见图3)。

疫苗组合物

本发明还提供一种防治IBV的组合物，所述组合物是指将本发明的减毒株和免疫(学)上可接受的载体混合后获得的可用于防治IBV的组合物，尤其是疫苗组合物。

在本发明中，免疫(学)上可接受的载体指适合用于疫苗的载体，包括兽药学可接受的载体和药学上可接受的载体。

“兽药学可接受的载体”或“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(如减毒株或灭活的成分)给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

可接收的载体指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

此外，本发明的疫苗组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类：

无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；

有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；

合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；

油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。

施用方式和应用

本发明的主要应用为给需要的家禽接种所述的IBV的减毒株或其衍生病毒株，或接种由其制得的疫苗组合物，激活禽类体内免疫反应并保护禽类宿主以抵抗传染性支气管炎。

本发明中，所述的禽类包括(但并不限于)：鸡、鸽子、雉鸡，尤其是用于肉鸡，蛋鸡和种鸡的免疫接种。

本发明的减毒株或疫苗组合物，可用于一日龄或一日龄以上(如2～9日龄)鸡的免疫接种。此外，可在蛋鸡和种鸡在产蛋期间进行免疫接种。

在进行给药时，多种给药方式都是可用的。例如，所述的疫苗组合物可以通过滴鼻免疫、点眼免疫、注射免疫、饮水免疫和气雾免疫。

在进行给药时，活性成分(减毒株)通常在10^3.0～10^5.5EID₅₀每剂量以产生良好的免疫效果。接种次数通常为1次、2次或3次。

在本发明中，免疫接种一次后的免疫持续期，通常为至少6周。

本发明的主要有益效果包括：

1.免疫效果确切：本发明可对IBV-QX、类QX、LX4等产生良好的免疫效应，能够很好地防治禽类的IBV感染，免疫持续时间达6周及以上。

2.接种时间早，对幼龄禽类无致病性：本发明可接种于1日龄的幼鸡，不会诱发产生气管、肾脏及雌性的生殖系统的破坏。

3.与其他IBV疫苗免疫相容性良好：本发明能与M41血清型活疫苗共同制备成联合疫苗或与其他IBV强毒共同制备成联合灭活疫苗，不影响其免疫效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

1.病毒滴度测定

取待检病毒，进行10倍系列稀释；选稀释倍数为10^-3～10^-6或10^-5～10^-8的病毒悬液每个稀释度分别接种5枚9～11日龄的SPF鸡胚，每胚接种100μl，置于37.8℃，湿度为45%～60%的温箱内孵育7～10天(18～19日龄)，每天照胚，接种后24小时内死亡的鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，记录7～10天内鸡胚的感染数和存活数，按Reed-Muench或Spearman-Karber法计算EID₅₀。

2.气管环纤毛停滞试验

2.1 步骤

用过量麻醉剂处死雏鸡。

用剪刀剪开皮肤，用镊子分离皮肤，暴露气管。

将分离好的气管放入单独的容器中，加入足量的无血清细胞培养基，使液面没过气管。晃动容器，以保证培养基浸润气管。

将气管取出，放入平皿中，并编号，去除多余的脂肪和组织。

总共切下10个环，厚为2mm左右的气管环(会厌部下方取3环，气管中段4环，气管底部3环)。

将切下的气管环放入培养皿中或玻璃载玻片上，用无血清培养基保证气管切片湿润，置于低倍显微镜下观察。从鸡处死到观察气管纤毛活动情况应在2小时之内完成。

2.2 结果判定：

根据下列“气管纤毛停滞试验评分系统”进行评分。

低倍显微镜下观察气管切片，按判定标准，分别评为0-4分，如下：

0分：所有纤毛活动

1分：75%纤毛活动

2分：50%纤毛活动

3分：25%纤毛活动

4分：无纤毛活动

每个气管应有10个数据，总得分最大为40分。分值越大，证明病毒复制能力越强，相对致病性越强。

2.3 免疫效力试验的结果判定

由于IBV即使强毒接种后，在实验室条件下动物临床表现不明显，尤其是两周龄以上的鸡，因此无法准确、客观评价保护力。IBV进入动物体内首先感染气管粘膜，然后才在别的器官上皮细胞复制，如肾脏上皮细胞或输卵管上皮细胞，IBV在上皮细胞复制之后导致细胞变性，最终使被感染器官出现病理变化。临床症状的严重程度，取决于多种因素，比如病毒的毒力，被感染器官，是否有继发感染以及鸡只的健康状态，总的来说，IBV强毒感染鸡之后，一般都会引起气管纤毛活动停滞。若保护了气管纤毛活力，也就阻止了IBV进入别的器官。

因此，目前国外(比如欧洲兽药典)常常采用气管纤毛停滞试验，判定鸡传染性支气管炎疫苗的效力。攻毒后5至7天，处死鸡后，立即取出气管，将分离好的气管放入生理盐水或无血清细胞培养基中37℃保存备用。用时将气管取出，放入平皿中，并编号，去除多余的脂肪和组织。总共切下10个环，厚为2mm左右的气管环(会厌部下方取3环，气管中段4环，气管底部4环)。将切下的气管放入培养皿中，用生理盐水或无血清细胞培养基保证气管切片湿润，置于显微镜下观察。气管环纤毛活力大等于50%的气管环纤毛活动正常被认定为受到了保护，每只鸡10个气管环，至少有9个气管纤毛活力被认定为受到了保护，可判定该鸡得到了保护。气管环从鸡处死到观察气管纤毛活动情况应在2小时之内完成。

3.无菌检验和支原体检验

按现行《中华人民共和国兽药典(三部)》附录进行无菌检验和支原体检验。

4.外源病毒检验

分别将病毒株，按现行《中华人民共和国兽药典(三部)》附录进行外源病毒检验。取病毒样品(病毒效价约为10^7.0-7.6EID₅₀/1.0ml)，不稀释与抗IBV特异性抗血清混合，进行中和后作为待检样品。

4.1.用鸡胚进行外源病毒检验(病毒的特异性检验)

将9～11日龄SPF鸡胚24枚分成2组：

第1组10枚鸡胚，经尿囊腔内接种0.2ml经处理的样品；

第2组10枚鸡胚，经绒毛尿囊膜接种0.2ml经处理的样品；第3组4枚鸡胚作为不接种对照；所有鸡胚置于37.8℃，湿度为45%～60%的温箱中培养7日。对所有接种24小时后存活的鸡胚进行观察，检查有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常，并对尿囊液进行血凝抗原检测。

4.2.用细胞培养物进行外源病毒检测

对两个细胞培养瓶(每瓶25cm²)的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)单层，接种中和后的病毒液0.2ml，在37℃下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的CPE；用鸡红细胞进行红细胞吸附试验，弃去培养液，并洗涤单层细胞，加入0.1%红细胞悬液，在4℃吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞后，在显微镜下观察，是否出现CPE和红细胞吸附现象。

4.3.ELISA对禽白血病病毒检测

对两个细胞培养瓶(25cm²)的SPF CEF单层，各接种不中和不稀释的病毒样品，0.2ml每瓶，吸附60分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞作为对照。培养5～7日，按常规方法消化，收获细胞，将其中1/2作标记置-60℃检验用(P1)，其余细胞分在两个细胞瓶中。培养7日后，按同样方法收获细胞，留样(P2)，如此继续传第3代，收获细胞(P3)，所有对照同样处理。将P1、P2、P3和所有对照冻融3次。同时设立阳性对照按“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行ELISA试剂盒(购自中监所)对禽白血病病毒检测。

5.IBV的致病性试验

5.1 对气管的致病性

试验取7只1日龄SPF雏鸡，分为两组，第一组5只，滴鼻感染IBV病毒，每只10^4.5EID₅₀；第二组2只，为正常对照组，不接种。每天观察期临床症状。接种6天后，将所有鸡剖杀，观察气管和肾脏的病理变化，取其气管进行气管纤毛停滞试验，观察气管纤毛活动情况，根据评分系统判定其致病性。

IBV病毒(如IBV-QD01)感染鸡之后，一般都会引起气管纤毛活动停滞。在纤毛停滞试验中，每只鸡的总评分数超过25分，并且越接近于40分，被认为该病毒毒力越强。

5.2 对雌性鸡生殖系统安全性

试验取51只4日龄雌性SPF雏鸡，分为两组，第一组46只，为接种试验组，每只雏鸡点眼和滴鼻接种IBV病毒(如IBV-QD01)10^5.5EID₅₀；第二组5只，为正常对照组，不接种。接种11周后，将所有鸡剖杀，观察输卵管有无异常。

对于减毒毒株，方法同上，不同点在于采用1日龄雌性SPF雏鸡。

6.IBV鸡胚传代毒株的致弱评价试验

在传代致弱过程中，取鸡胚传50代(EP50)和鸡胚传70代(EP70)进行致弱评价。每个试验取12只1日龄SPF雏鸡，分为两组，第一组10只，滴鼻感染相应的IBV鸡胚毒，每只10^4.5EID₅₀；第二组2只，为正常对照组，不接种。每天观察期临床症状。接种6天后，将所有雏鸡剖杀，观察气管和肾脏的病理变化，取其气管进行气管纤毛停滞试验，观察气管纤毛活动情况，根据评分系统判定其致病力。

实施例1

减毒株的制备

使用9～11日龄SPF鸡胚对IBV-QD01病毒株(可购自上海启盛生物科技有限公司)进行连续传代培养，每代接种2～3枚鸡胚的尿囊腔，每胚接种100～200μl，置于37.8℃，湿度为45%～60%培养18～48小时后，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代，连续传代70代以上并进行克隆，进行病毒滴度测定并进行致弱性评价后，获得了6株理想的克隆。

收毒后再接种鸡胚，再进一步扩增一代，无菌收集尿囊液作为下一步动物试验的病毒材料。

一株优选的克隆株是鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05(InfectiousBronchitis Virus，IBV)，于2012年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.V201232。

将基于CCTCC.V201232用于后续试验的减毒原始株称为IBV-KL05 MVS(原始种毒)，减毒原始株在鸡胚中额外传代3代的衍生减毒株称为IBV-KL05MVS+3。

实施例2

减毒株免疫保护作用

在本实施例中，测试了IBV-KL05株对不同血清型强毒的免疫攻毒保护试验。方法如下：

试验取80只1日龄SPF雏鸡，分为五组。

1～2组：每组20只，点眼接种IBV-KL05MVS+3，每只10^3.5EID₅₀；

3组：20只，点眼接种IBV-H120疫苗，每只10^3.5EID₅₀；

4～5组为正常对照组，每组10只，不接种。

接种后三周，进行攻毒，第1、3和4组攻毒用强毒为IBV-QD01，第2组和第5组攻毒用强毒为IBV-M41，点眼和滴鼻，攻毒剂量均为每只10^4.5EID₅₀。

每天观察期临床症状。攻毒后6天做气管环纤毛停滞试验，观察气管纤毛活动情况，来判定其免疫效力。

结果：IBV-KL05对IBV-QD01(基因型)强毒攻毒的保护力很好，高达95%，对IBV-M41(血清型)强毒攻毒有一定的保护力，为45%。IBV-H120疫苗对IBV-QD01强毒攻毒的保护力较弱，为40%。由此可认为，本发明的减毒株可有效地引发针对IBV的免疫保护，具体如表1：

表1

*IBV-QD01(EP4)表示在鸡胚中传代4次的IBV-QD01病毒株。

此外，经无菌检验和支原体检验，各减毒株(IBV-KL05 MVS，IBV-KL05 MVS+3)均未发现有细菌、霉菌和支原体污染。

经外源病毒检验，各减毒株(IBV-KL05 MVS，IBV-KL05 MVS+3)均未发现有外源病毒污染。

实施例3

减毒株对雌性生殖系统的安全性试验

试验取51只1日龄雌性SPF雏鸡，分为两组：

第一组46只，每只点眼接种10^5.5EID₅₀ IBV-KL05 MVS；

另一组5只，为正常对照组，不接种。鸡每天至少观察一次。

11周龄时剖杀所有鸡，观察输卵管有无异常如囊肿，变形，发育不全等。

结果：第一组有4只雏鸡在免疫接种后20天死亡，由于卵黄囊细菌感染或啄咬致死。

第二组有1只雏鸡在免疫接种后第8天由于发育不良被剔除该组。试验存活的42只试验组鸡和4只对照组鸡在接种后11周，进行解剖，输卵管均未发现异常。

上述结果表明，本发明的IBV-KL05作为疫苗候选株，对一日龄及以上的鸡的生殖系统是非常安全的(表2)。

表2

实施例4

4.1 减毒株的免疫持续期试验

试验取30只1日龄SPF雏鸡，分为两组：

第1组为试验组，每组20只，点眼接种IBV-KL05 MVS+3，每只10^3.5EID₅₀；

第2组为正常对照组，每组10只，不接种。接种后六周，进行攻毒试验，攻毒用强毒为IBV-QD01，点眼和滴鼻，攻毒剂量均为每只10^4.5EID₅₀。

每天观察期临床症状。攻毒后6天做气管环纤毛停滞试验，观察气管纤毛活动情况，来判定其免疫效力。

结果：表明IBV-KL05株的在免疫接种后六周，保护率可达95%(如表3)。

表3

4.2 鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05对相同基因型异源毒株的攻毒保护试验

试验取30只1日龄SPF雏鸡，分为两组：

第1组为试验组，每组20只，点眼接种IBV-KL05 MVS+3，每只10^3.5EID₅₀；

第2组为正常对照组，每组10只，不接种。

接种后三周，进行攻毒试验，攻毒用强毒为IBV-FS(可购自扬州大学)，点眼和滴鼻，攻毒剂量均为每只10^4.5EID₅₀。结果，减毒疫苗株IBV-KL05对相同基因型异源毒株(IBV-FS株)的保护率为95%。

实施例5

IBV-KL05株和IBV-H120疫苗免疫相容性试验

试验取100只1日龄SPF雏鸡，分为六组。

1～4组：每组20只。

1组每只雏鸡点眼接种IBV-KL05 MVS+3 10^3.5EID₅₀；

2组和3组：每只雏鸡点眼接种IBV-KL05 MVS+3 10^3.5EID₅₀和IBV-H120 10^3.5EID₅₀；

4组:每只雏鸡点眼接种IBV-H120疫苗10^3.5EID₅₀；

5～6组：每组10只，为正常对照组，不接种。

接种后六周，进行攻毒，1、2和5组攻毒用强毒为IBV-QD01(EP4)，3、4和6组攻毒用强毒为IBV-M41(可购自中国兽药品监察所)，点眼和滴鼻，攻毒剂量均为每只10^4.5EID₅₀。

每天观察其临床症状。攻毒后6天做气管环纤毛停滞试验，观察气管纤毛活动情况，来判定其免疫效力。

结果表明：IBV-KL05减毒疫苗株和IBV-H120株免疫相容性很好，可以作为双价疫苗使用(如表4)。此外，该结果提示，本发明的IBV-KL05减毒疫苗株也可用于制备多价疫苗组合物。

表4

注：a,本组试验动物有1只在接种后一周内，由于卵黄囊细菌感染死亡；b,本组试验动物有2只在接种后一周内，由于卵黄囊细菌感染死亡。

实施例6

IBV-QD01的致病性

采用通用方法5所述的各致病性试验，对IBV-QD01的致病性进行评价。

6.1.IBV-QD01对鸡气管的致病性：

结果:所有接种的SPF雏鸡没有死亡，只有1只肾脏发生肿大，颜色稍苍白。气管纤毛停滞试验结果见下表，该病毒可引气管纤毛全部停滞,如表5：

表5

6.2.对雌性鸡生殖系统的影响试验

结果：第一组有3只雏鸡和第二组有1只雏鸡在接种后1周内由于卵黄囊细菌感染而死亡。第一组剩余的43只雌性雏鸡，有10只(23%)输卵管出现囊肿；对照组剩余的4只输卵管均未发现异常。

实施例6的结果表明IBV-QD01为强毒株，致病性强，可用作后续该基因型攻毒用强毒株。

实施例7.

分子标记的研究

在本实施例中，对野生型毒株(IBV-QD01)和本发明的减毒株IBV-KL05(CCTCC.V201232)的基因(包括S1基因)进行测序，并与已知其他IBV的S1核苷酸及氨基酸序列进行对比。

7.1 引物设计

合成以下引物：

IBV-F:5’-GCGAAAACTGAACAAAAGAC-3’(SEQ ID NO.:3)

IBV-R:5’-GGCCATAACTAACATAAGGG-3’(SEQ ID NO.:4)

7.2 病毒的增殖与RNA提取

按病毒RNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)说明方法提取病毒基因组RNA。

7.3 S1基因的扩增

按RT-PCR Kit(AMV)Ver.3.0(购自宝生物工程有限公司)说明方法扩增IBVS1基因。

RT-PCR反应条件：30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min后，进入PCR，PCR反应程序为94℃2min；94℃30s、55℃30s、72℃90s，进行32个循环后，72℃10min。

反应结束后，取5μl PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳40分钟，进行初步电泳鉴定，于紫外分光仪下观察并切下目的条带。

7.4 PCR产物的回收和序列测定

应用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)说明方法进行PCR产物的纯化回收。为进一步进行鉴定，将经过鉴定阳性的PCR回收纯化产物，送往上海生物工程有限公司测序。

扩增产物的条带大小为约1620bp，测定的减毒株IBV-KL05的S1基因序列如SEQ ID NO.:1，S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2。

7.5 核苷酸和氨基酸序列比较

减毒株IBV-KL05与其他IBV(包括Mass-type的W93、H120和H52及类QX-type的LX4和QX等)的S1蛋白碱基序列和氨基酸序列比较结果如下：

IBV-KL05与LX4、QX同源性均大于95%，属于同一基因型，即QX-type，与Mass-type同源性低。见图1-2：

将IBV-KL05与Genebank上已公布的32株IBV比对后(见图3)，发现IBV-KL05的第54个氨基酸为异亮氨酸(Ile)，而其他32株IBV毒株第54个氨基酸均为Thr或Ser,因此可认为这个氨基酸位点是IBV-KL05的标志性位点之一。

结论：

从实施例1-7可以看出，本发明的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05，对于预防IBV有良好、确切的效果，持续时间为6周以上，且可以用于幼龄禽类(如1日龄的鸡)进行接种，无副作用，安全可靠。另一方面，本发明与其他血清型IBV疫苗免疫相容性良好，可以用于制备二价或多价联合疫苗。

菌种保藏

本发明的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05(Infectious BronchitisVirus，IBV)，于2012年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.V201232。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)的减毒株，其特征在于，所述减毒株是鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05，保藏号为CCTCC.V201232。

2.一种权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株的衍生病毒株；

优选地，所述衍生病毒株具有以下一个或多个特性：

(a)低毒力：毒力与CCTCC.V201232的毒力相近或相同；

(b)所述的衍生病毒株中S1基因的第1-1643位的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(c)所述衍生病毒株表达的S1蛋白的第54位氨基酸为异亮氨酸(Ile)；

(d)所述衍生病毒株表达的S1蛋白的第1-547位如SEQ ID NO.:2所示。

3.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株。

4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为二价疫苗或多价疫苗。

5.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还含有一种或多种针对选自下组的血清型的IBV疫苗株：

(a)M41血清型,如H120或Ma5或W93或H52；

(b)4/91或793B血清型。

6.一种制备鸡传染性支气管炎病毒的减毒株的方法，其特征在于，包括步骤：在家禽胚卵中，对保藏号为CCTCC.V201232的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05进行传代，从而制得减毒株。

7.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株的用途，其特征在于，用于制备疫苗组合物；

更佳地，所述的疫苗组合物用于保护禽类宿主以抵抗传染性支气管炎。

8.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)对保藏号为CCTCC.V201232的鸡传染性支气管炎减毒疫苗株IBV-KL05进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(b)将步骤(a)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

9.一种鸡传染性支气管炎(IBV)的双价疫苗，其特征为，所述双价疫苗是包含(i)权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株和(ii)M41血清型(如IBV-H120疫苗株)的联合疫苗。

10.一种对家禽进行接种的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的家禽接种权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒株，或接种权利要求3所述的疫苗组合物。

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