CN112891528A

CN112891528A - 一种鸡传染性支气管炎疫苗株

Info

Publication number: CN112891528A
Application number: CN202110146285.XA
Authority: CN
Inventors: 朱艳梅; 孟靖; 刘秋云; 丁欣; 申茂欣; 时宏超; 韩建文; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112891528B

Abstract

本发明提供一种鸡传染性支气管炎疫苗株，是将插入有鸡传染性支气管炎病毒QX型病毒株S1基因片段的疫苗株H52的核酸片段连接入载体，制成重组质粒；然后将重组质粒与辅助质粒共转染宿主细胞后拯救出重组病毒株作为疫苗株；所述的S1基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的疫苗株以疫苗株H52为骨架，插入鸡传染性支气管炎病毒QX型流行株的S1基因，从而制备出针对流行株的弱毒活疫苗株。本发明的疫苗株的构建方法相比传统的使用鸡胚传代至少80代以上方法制备QX型疫苗株更省时，制备出的疫苗株生长特性与骨架毒株生长特性更接近。

Description

一种鸡传染性支气管炎疫苗株

技术领域

本发明属于禽类疫苗技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎疫苗株。

背景技术

传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是一种由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis Virus，IBV)引起鸡的急性、高度传染性并具有重大经济意义的病毒病，常引起育成鸡呼吸道症状，一些毒株感染也会导致肾脏、生殖系统损伤，造成产蛋下降甚至死亡。研究发现造成鸡群多种症状的原因是由于IBV存在多个血清型，目前以肾型即QX型为主。

IBV属于γ-冠状病毒，是有囊膜不分节段单股正链RNA病毒，其基因组长约28kb，主要编码四中结构蛋白S、M、N、E及多种非结构蛋白，S蛋白即纤突蛋白作为主要的结构蛋白，含有IBV主要的保护性抗原表位，可刺激机体产生中和抗体，该蛋白存在碱性氨基酸裂解位点，可以被宿主细胞的福林蛋白酶切割成S1和S2亚基，S1亚基位于胞外的球状头部，带有IBV受体结构域，是中和抗体的主要诱导蛋白。

由于冠状病毒基因组是RNA病毒中最大的，没有合适的载体容纳长达28kb 的全长DNA分子，同时冠状病毒的基因组中含有毒性序列，在细菌中不稳定，常发生一些片段的丢失和突变，给冠状病毒的反向遗传操作带来很大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡传染性支气管炎疫苗株及其构建方法，从而克服现有技术中构建的传染性支气管炎重组病毒不稳定的问题。

本发明首先提供一种鸡传染性支气管炎疫苗株，是将插入有鸡传染性支气管炎病毒QX型病毒株S1基因片段的疫苗株H52的核酸片段连接入载体，制成重组质粒；然后将重组质粒与辅助质粒共转染宿主细胞后拯救出重组病毒株作为疫苗株；

所述的插入有S1基因片段的疫苗株H52的核酸片段，其是通过酵母同源重组的方式连接入载体中；

所述的S1基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其一种编码基因的序列为 SEQ IDNO:2；

S1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MLVKSLFLVTILCALCSANLFDSDNNYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSTNYTSNAGSASAC TVGIIKDVYNQSAASIAMTAPSQGMAWSKSQFCSAHCNFSEITVFVTHCYSSGTGSCPITGMIARDHIRISA MKNGSLFYNLTVSVSKYSRFKSFQCVNNLTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSVMKEF KVLAYFVNGTAQDVILCDKSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNTTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFT NVSNAQPNSGGVNTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDFMYGSYHPRCSFRPETINNGLWFNSL SVSLTYGPLQGGCKQSVFSGKATCCYAYSYNGPRACKGVYSGELSKTFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPL VLMQHNYNNITLDKCVNYNIYGRVGQGFITNVTDSAANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVAQGSYGPNY YKVNPCEDVNQQFVVSGGNIVGILTSRNETGSEQVENQ

S1蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：

ATGTTGGTGAAGTCACTGTTTTTAGTGACCATTTTGTGTGCACTATGTAGTGCAAATTTGTTTGATTCTGATAATAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGGCCTCCAAATGGATGGCATTTGCAAGGGG GTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTACTAATTATACTAGTAATGCCGGTTCTGCAAGTGCGTGCACTGTTG GTATTATTAAGGACGTCTATAATCAAAGTGCGGCTTCCATAGCTATGACAGCACCTTCTCAGGGTATGG CTTGGTCTAAGTCACAATTTTGTAGTGCACACTGTAACTTTTCTGAAATTACAGTTTTCGTCACACATT GTTATAGTAGCGGTACAGGGTCTTGCCCTATAACAGGCATGATTGCACGTGATCATATTCGTATTTCTGC AATGAAAAATGGTTCTTTATTTTATAACTTAACAGTTAGCGTATCTAAATACTCTAGGTTTAAGTCTTTT CAATGTGTTAACAACCTCACATCTGTTTATCTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTTCCAACAAAACTACTG ATGTTACGTCAGCAGGTGTGTATTTTAAAGCAGGTGGACCTGTAAATTATAGTGTTATGAAAGAATTTA AGGTTCTTGCTTATTTTGTTAATGGTACAGCACAAGATGTAATTTTGTGTGACAAGTCCCCTAAGGGTT TGCTAGCTTGTCAATATAATACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTACTAATACTACTTTAGTT AGGGAAAAGTTCATCGTATATCGTGAAAGTAGTGTTAATACTACTCTGGCGTTAACTAATTTCACTTTT ACTAATGTAAGTAATGCACAGCCTAATAGTGGTGGTGTTAATACTTTTCATTTATATCAAACACAAACA GCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAATTTGTCATTTCTGAGTCAGTTTGTGTATAAGGCAAGTGATTTTA TGTATGGGTCTTATCATCCTAGGTGTTCTTTTAGACCAGAAACCATTAATAATGGTTTGTGGTTTAATTC ATTGTCAGTTTCTCTTACGTATGGACCCCTACAGGGAGGGTGTAAGCAATCTGTTTTTAGTGGTAAGGC AACGTGTTGTTATGCCTACTCTTATAATGGCCCTAGAGCATGTAAAGGTGTTTATTCAGGTGAATTAAG CAAGACTTTTGAATGTGGATTGCTGGTTTATGTTACTAAGAGTGATGGCTCTCGTATACAAACTAGAAC GGAGCCCTTAGTATTAATGCAACACAATTATAATAATATTACTTTAGATAAGTGTGTTAACTATAATATAT ATGGCAGAGTGGGCCAAGGTTTTATTACTAATGTGACTGATTCTGCTGCTAATTTTAGTTATTTAGCAGA TGGTGGGTTAGCTATTTTAGACACTTCGGGTGCCATAGATGTTTTTGTTGCACAGGGCAGCTATGGTCC TAATTATTACAAGGTCAATCCTTGTGAAGATGTTAACCAACAGTTTGTAGTGTCTGGTGGCAATATAGT TGGCATTCTTACTTCTAGAAATGAAACAGGTTCTGAACAGGTTGAGAACCAG；

所述的载体，优选为酵母人工染色体载体；作为实施例的一种具体记载，为pYES1L载体；

所述的辅助质粒，是表达H52株的N基因的重组质粒；

所述的宿主细胞，作为实施例的一种具体记载为BHK细胞。

本发明所提供的鸡传染性支气管炎疫苗Q3株用于制备疫苗；

本发明再一个方面还提供一种供鸡传染性支气管疫苗，其中抗原使用上述的疫苗株。

本发明所提供的疫苗株以疫苗株H52为骨架，插入鸡传染性支气管炎病毒 QX型流行株的S1基因，从而制备出针对流行株的弱毒活疫苗株。本发明的疫苗株的构建方法相比传统的使用鸡胚传代至少80代以上方法制备QX型疫苗株更省时，制备出的疫苗株生长特性与骨架毒株生长特性更接近。

附图说明

图1：14个片段RT-PCR电泳结果图；

图2：辅助质粒pcD-N酶切鉴定结果图；

图3：全长质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图4：重组病毒Q3株S11片段和H12片段测序结果图；

图5：重组病毒Q3接种144h后鸡胚病变情况图。

图6：H52株的14个基因片段与QD19-3株的S1基因的连接方式。

具体实施方式

本发明以酵母基因重组为基础，以YAC(酵母人工染色体)为载体的反向遗传平台，能在半个月内时间里产生新重组病毒的技术，比传统的酶切连接方式构建感染性克隆更高效。

本发明将筛选获得的鸡传染性支气管炎病毒QX型QD19-3株的S1基因片段替换至疫苗株H52的相应位置，得到重组质粒，该重组质粒与辅助质粒共转染BHK细胞后成功拯救出重组病毒疫苗株株。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：鸡传染性支气管炎病毒QD19-3株的分离与鉴定

2019年采集山东青岛某鸡场免疫后发病鸡的肾脏、气管等组织，研磨后加入含有青链霉素的PBS，-70℃冻融两次，离心取上清过滤接种10.5日龄SPF鸡胚，孵化40h取尿囊液，连续在SPF胚上盲传3代。取F3代尿囊液，RT-PCR 扩增S1基因，经NCBI比对为QX亚型，将该毒株命名为QD19-3株。

将QD19-3株S1基因序列与目前市场QX亚型疫苗株进行同源性比对，结果显示QD19-3株与QX亚型疫苗株L1148同源性为93.3％，与QXL87株同源性为94％，说明流行株QD19-3株与疫苗株相比有基因突变。

实施例2：构建鸡传染性支气管炎疫苗株

1、用病毒DNA/RNA提取试剂盒(全式金，中国)分别从含有H52毒株 (CVCC AV1513)和QD19-3株(实验室分离毒)的尿囊液中提取病毒RNA，根据Genebank中H52株(EU817497)序列设计引物，用PrimeScript^TM One Step RT-PCR试剂盒(Takara)进行一步法RT-PCR反应，所用引物详见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1：引物序列及片段位置

注：加粗部分为Q3 S1序列，加斜部分为酶切位点序列，下划线为KozaK序列。

按照PrimeScrip II High Fidelity One Step RT-PCR Kit说明书配置50μl反应体系，反应程序条件为45℃10min；94℃2min；98℃10sec，55℃10sec，68℃30 sec，30个循环；68℃5min。取50μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察，切胶回收并测序验证扩增片段。其中H1F/H1R～H10F/H10R， H12F/H12R～H14F/H14R扩增H52株基因片段H1～H10和H12～H14基因片段； Q3S11F/Q3S11R扩增QD19-3株基因片段S11(图1)。

2、辅助表达质粒的构建

引物N-F和N-R扩增H52株的N基因的ORF全长，并克隆至表达载体 pcDNA3.1载体，构建辅助表达质粒pcD-N，提取质粒并测定浓度，该质粒用 Hind III和Kpn I酶切后，电泳后可以看出质粒被切成约5400bp和1320bp大小两个条带(图2)。

其中H52株的N基因的氨基酸序列如下：

MASGKATGKTDAPTPVIKLGGPKPPKVGSSGNVSWFQAIKAKKLNSPPPKFEGSGVPDNEN LKPSQQHGYWRRQARFKPGKGGRKPVPDAWYFYYTGTGPAANLNWGDSQDGIVWVAGK GADTKFRSNQGTRDSDKFDQYPLRFSDGGPDGNFRWDFIPLNRGRSGRSTAASSAASSRAP SRDGSRGRRSGAEDDLIARAAKIIQDQQKKGSRITKAKADEMAHRRYCKRTIPPGYKVDQV FGPRTKCKEGNFGDDKMNEEGIKDGRVTAMLNLVPSSHACLFGSRVTPKLQPDGLHLRFEF TTVVSRDDPQFDNYVKICDQCVDGVGTRPKDDEPRPKSRPNSRPATRTSSPAPRQQRQKKE KKSKKQDDEVDKALTSDEERNNAQLEFDDEPKVINWGESALGENEL(SEQ ID NO:3)

N基因的核苷酸序列如下：

ATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGAAAGACAGATGCCCCAACTCCAGTCATCAAACTAGGAGGACCA AAGCCACCTAAAGTTGGTTCTTCTGGAAATGTATCTTGGTTTCAAGCAATAAAAGCCAAGAAGTTAAA TTCACCTCCGCCTAAGTTTGAAGGTAGCGGTGTTCCTGATAATGAAAATCTAAAACCAAGTCAGCAGC ATGGATATTGGAGACGCCAAGCTAGGTTTAAGCCAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAGATGC TTGGTATTTTTACTATACTGGAACAGGACCAGCCGCTAACCTGAATTGGGGTGATAGCCAAGATGGTAT AGTGTGGGTTGCTGGTAAGGGTGCTGATACTAAATTTAGATCTAATCAGGGTACTCGTGACTCTGACA AGTTTGACCAATATCCGCTACGGTTTTCAGACGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGATTTCATTC CTCTGAATCGTGGTAGGAGTGGAAGATCAACAGCGGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCGTC GCGTGATGGCTCGCGTGGACGTAGAAGCGGAGCTGAAGATGATCTTATAGCTCGTGCAGCAAAGATC ATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTCGCATTACTAAAGCTAAGGCCGATGAAATGGCTCATCGCCG GTATTGTAAGCGTACTATCCCACCTGGTTATAAGGTTGATCAAGTATTTGGTCCCCGTACTAAATGTAAG GAGGGAAATTTTGGTGATGACAAGATGAATGAGGAGGGTATTAAGGATGGGCGCGTTACAGCAATGC TCAACCTAGTCCCTAGCAGCCATGCTTGTCTTTTTGGAAGTAGAGTGACGCCCAAACTTCAACCAGAT GGGCTGCACTTGAGATTTGAATTTACTACTGTGGTTTCACGTGATGATCCGCAGTTTGATAATTATGTG AAAATTTGTGATCAGTGTGTCGATGGTGTAGGGACGCGTCCAAAAGACGATGAACCGAGACCAAAGT CACGCCCAAATTCAAGACCTGCTACAAGAACAAGTTCTCCAGCGCCAAGACAACAGCGTCAAAAGA AGGAGAAGAAGTCAAAGAAGCAGGATGATGAAGTAGATAAGGCATTGACCTCAGATGAGGAGAGGA ACAATGCACAGCTGGAATTTGATGATGAACCCAAGGTGATTAACTGGGGGGAGTCAGCACTTGGAGA GAATGAGTTGTAA(SEQ ID NO:4)。

3、Q3-YAC重组质粒构建与鉴定

从pcDNA3.1载体扩增出CMV启动子序列和BGH序列，通过overlap PCR 的方式将CMV启动子与P1片段连接，BGH序列与P14片段进行连接(图6)。

按照

High-Order Genetic Assembly System说明书，利用酵母同源重组的方式将IBV的14个片段与CMV启动子，BGH作用元件连入pYES1L 载体中。取载体pYES1L100ng，14个片段各100ng，混匀1个EP管中，加入 100μl酵母感受态细胞MaV203，混匀，置于30℃水浴锅作用30min；片段和酵母感受态混合液中加入600μl PEG/LiAc，混匀，再置于30℃水浴锅作用30min；混合液中加入35.5μl DMSO，涡旋混匀5～8次，42℃水浴锅热休克20min。最后离心，去掉上清，用1ml灭菌生理盐水重旋菌泥，取100μl涂布于用CSM-Trp平皿上。放置30℃温箱中培养3天，挑取单菌落培养，提取酵母质粒并用上述引物鉴定全长，将鉴定正确的质粒，通过电转TOP10大肠杆菌中，按照Qiagen大提质粒试剂盒说明书提取全长质粒Q3-YAC，PCR鉴定并测序验证，测定质粒浓度(图3)。

4、重组质粒转染

使用BHK细胞进行病毒的拯救工作。将BHK细胞用含10％胎牛血清的 DMEM培养基，均匀铺于12孔板中，每孔1ml，然后于含有5％CO₂细胞培养箱中37℃过夜培养，待BHK细胞生长至70％～90％时开始进行转染。

提前将Opti-MEM培养基于37℃水浴锅中加热待用。按照Lipofectamine

LTX&PLUS^TM试剂盒说明书进行操作。取两个1.5ml离心管A、B，均加入30ul Opti-MEM培养基，A管中加入1.5ug的全长质粒Q3-YAC、1ug的辅助质粒pcD-N、1ul plus溶液，B管中加入5ul LTX溶液。将B管中的溶液加入到A管中混匀，室温静置10min。反应期间，取出12孔板，将细胞上清培养基吸弃，并用提前预热好的Opti-MEM培养基清洗2-3遍后，加入600ul Opti-MEM培养基。A管反应结束后，将溶液均匀的滴在细胞培养板孔中，摇匀，然后于含有 5％CO₂细胞培养箱中37℃继续培养3天。

待细胞培养完毕，于-40℃冰箱中冷冻数小时后，在37℃温箱中复融。轻轻吹打细胞孔，确保细胞完全脱落。然后用注射器吸取细胞培养基，接种于10.5 日龄的SPF鸡胚中，鸡胚于37℃培养箱中生长。

5、拯救病毒鉴定

拯救后的细胞病毒接种10.5日龄SPF鸡胚2枚，37℃培养48h，收获尿囊液，标记为F1代；将F1代尿囊液接种10.5日龄鸡胚7枚，标记为F2代，48h 收获F2代2枚，提取尿囊液RNA，用14对引物扩增拯救病毒分段基因片段，将扩增产物经1％琼脂凝胶电泳鉴定，并将S11片段和H12片段切胶回收后送上海生工生物工程有限公司进行测序。结果S11片段测序结果与QD19-3序列一致， P12片段测序结果与QX株一致，详见图4。无菌收获分装F2代尿囊液，即为本发明所制备的疫苗株病毒，标记为Q3株。

剩余的5枚F2代鸡胚生长144h后，将鸡胚剖出，观察鸡胚形态。接种病毒的鸡胚生长缓慢或阻滞，鸡胚呈球形，羊膜增厚。

随着传代次数的增加，胚胎死亡率逐步增加，病变更加明显(图5)。

实施例3：构建的疫苗株的效果检测

1、重组病毒气管环实验

取24只SPF鸡，将H52株、QD19-3株与重组病毒Q3株正常收获的尿囊液进行10倍稀释，分别滴鼻6只1日龄SPF鸡，另6只作为空白对照，分别在攻毒后5天、10天、14天分别取2只鸡进行气管环评分实验。结果，H52株和Q3株攻毒后14天内鸡只采食饮水较好，而野毒QD19-3株在攻毒后7天、11 天均死亡一只。从气管环评分结果来看，野毒株QD19-3株导致气管环损伤较大，毒力较强。而将QD19-3株的S1替换至H52株疫苗株的相应位置重组出来的 Q3株，毒力变弱，与疫苗株H52相似，可以作为一株理想的疫苗候选株。

2冻干活疫苗制备

将Q3疫苗株尿囊液稀释100倍，无菌接种10.5日龄SPF胚，0.1ml/枚，37℃温箱孵育，弃去36h内死胚，在36h后将活胚放置2～8℃冰箱冷藏6～12h。

无菌收获冷藏的鸡胚尿囊液于无菌的玻璃瓶中，取少量尿囊液进行EID50 检测，接种后鸡胚在24～144h死胚或者144h剖检鸡胚，鸡胚出现生长发育迟缓，蜷缩等症状判为感染，检测结果不低于10^7.83EID₅₀/0.1ml。

按比例加入1％明胶和5％蔗糖作为冻干保护剂，充分摇匀，2ml定量分装后进行冷冻真空干燥的方式冻干，即为Q3冻干疫苗，成品检验每羽份不低于 10^4.0EID₅₀/0.1ml。

3重组病毒免疫实验

取30只1日龄SPF鸡，其中10只滴鼻免疫H52株疫苗(10^4.0EID₅₀/只)， 10只滴鼻免疫Q3疫苗(10^4.0EID₅₀/只)，另10只作为非免疫空白对照，分别饲养于负压隔离器中。免疫14天后，连同对照鸡10只，用10倍稀释的野毒株 QD19-3株滴鼻，每只100μl，连续观察10天。非免疫对照组8只死亡，2只出现发病症状即精神沉郁、气管明显呼噜声，喜蹲，羽毛蓬松；H52免疫组死亡1 只，4只出现发病症状，5只采食饮水精神正常；Q3组10只饮水采食精神均正常。根据攻毒保护实验结果来看，Q3株重组活疫苗免疫后完全能保护QX分支流行毒。

为了评价本发明的Q3疫苗株制备的疫苗与国内市场现售的传染性支气管炎活疫苗免疫效果，以瑞普生物公司的支必灵(鸡传染性支气管炎活疫苗H52 株)和青岛易邦生物工程有限公司的新易支(鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+QXL87株)为对照组进行比较。分别用Q3疫苗、支必灵、新易支对SPF鸡进行免疫，1羽份/只，免后14天，用10倍稀释的野毒株QD19-3 株滴鼻，每只100μl，连续观察10天，记录各组试验鸡的发病和死亡情况。实验结果如下表2所示。

表2 Q3疫苗株与支必灵免疫效果比对表

上述实验结果表明，对于QD19-3毒株的攻毒，本发明的Q3株疫苗能够提供完全的保护，并且该组实验动物未表现任何临床症状，也无死亡现象；而支必灵的保护率仅为40％，其中6/10的鸡只出现了精神沉郁、气管明显呼噜声，炸毛等现象；新易支的保护率为80％，其中2/10出现了精神沉郁、气管呼噜声现象；对照组5只均出现了精神沉郁、炸毛、气管明显呼噜声现象。

综上所述，本发明所重组的鸡传染性支气管炎病毒Q3株，具有良好的免疫原性，做成活疫苗免疫动物发现，该疫苗对鸡只安全，免疫后14天能够保护当前流行QX型野毒株的攻击，产生理想的保护效果，有广阔的应用前景。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种鸡传染性支气管炎疫苗株

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Val Lys Ser Leu Phe Leu Val Thr Ile Leu Cys Ala Leu Cys

1 5 10 15

Ser Ala Asn Leu Phe Asp Ser Asp Asn Asn Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln

20 25 30

Ser Ala Phe Arg Pro Pro Asn Gly Trp His Leu Gln Gly Gly Ala Tyr

35 40 45

Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Tyr Thr Ser Asn Ala Gly Ser Ala Ser

50 55 60

Ala Cys Thr Val Gly Ile Ile Lys Asp Val Tyr Asn Gln Ser Ala Ala

65 70 75 80

Ser Ile Ala Met Thr Ala Pro Ser Gln Gly Met Ala Trp Ser Lys Ser

85 90 95

Gln Phe Cys Ser Ala His Cys Asn Phe Ser Glu Ile Thr Val Phe Val

100 105 110

Thr His Cys Tyr Ser Ser Gly Thr Gly Ser Cys Pro Ile Thr Gly Met

115 120 125

Ile Ala Arg Asp His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Asn Gly Ser Leu

130 135 140

Phe Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Ser Arg Phe Lys Ser

145 150 155 160

Phe Gln Cys Val Asn Asn Leu Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu

165 170 175

Val Phe Thr Ser Asn Lys Thr Thr Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr

180 185 190

Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Ser Val Met Lys Glu Phe Lys

195 200 205

Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys

210 215 220

Asp Lys Ser Pro Lys Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn

225 230 235 240

Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Thr Thr Leu Val Arg Glu

245 250 255

Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Thr Thr Leu Ala Leu

260 265 270

Thr Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Gln Pro Asn Ser Gly

275 280 285

Gly Val Asn Thr Phe His Leu Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly

290 295 300

Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Gln Phe Val Tyr Lys Ala

305 310 315 320

Ser Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Arg Cys Ser Phe Arg Pro

325 330 335

Glu Thr Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu

340 345 350

Thr Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Gly

355 360 365

Lys Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Asn Gly Pro Arg Ala Cys

370 375 380

Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Ser Lys Thr Phe Glu Cys Gly Leu

385 390 395 400

Leu Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Thr

405 410 415

Glu Pro Leu Val Leu Met Gln His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asp

420 425 430

Lys Cys Val Asn Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile

435 440 445

Thr Asn Val Thr Asp Ser Ala Ala Asn Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Gly

450 455 460

Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Val Phe Val Ala

465 470 475 480

Gln Gly Ser Tyr Gly Pro Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp

485 490 495

Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Ile Val Gly Ile Leu

500 505 510

Thr Ser Arg Asn Glu Thr Gly Ser Glu Gln Val Glu Asn Gln

515 520 525

<210> 2

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttggtga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60

tttgattctg ataataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120

tggcatttgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac tagtaatgcc 180

ggttctgcaa gtgcgtgcac tgttggtatt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240

tccatagcta tgacagcacc ttctcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300

gcacactgta acttttctga aattacagtt ttcgtcacac attgttatag tagcggtaca 360

gggtcttgcc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420

aatggttctt tattttataa cttaacagtt agcgtatcta aatactctag gtttaagtct 480

tttcaatgtg ttaacaacct cacatctgtt tatctaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540

aacaaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600

tatagtgtta tgaaagaatt taaggttctt gcttattttg ttaatggtac agcacaagat 660

gtaattttgt gtgacaagtc ccctaagggt ttgctagctt gtcaatataa tactggcaat 720

ttttcagatg gcttttatcc ttttactaat actactttag ttagggaaaa gttcatcgta 780

tatcgtgaaa gtagtgttaa tactactctg gcgttaacta atttcacttt tactaatgta 840

agtaatgcac agcctaatag tggtggtgtt aatacttttc atttatatca aacacaaaca 900

gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960

agtgatttta tgtatgggtc ttatcatcct aggtgttctt ttagaccaga aaccattaat 1020

aatggtttgt ggtttaattc attgtcagtt tctcttacgt atggacccct acagggaggg 1080

tgtaagcaat ctgtttttag tggtaaggca acgtgttgtt atgcctactc ttataatggc 1140

cctagagcat gtaaaggtgt ttattcaggt gaattaagca agacttttga atgtggattg 1200

ctggtttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaaa ctagaacgga gcccttagta 1260

ttaatgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttaacta taatatatat 1320

ggcagagtgg gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgctgctaa ttttagttat 1380

ttagcagatg gtgggttagc tattttagac acttcgggtg ccatagatgt ttttgttgca 1440

cagggcagct atggtcctaa ttattacaag gtcaatcctt gtgaagatgt taaccaacag 1500

tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560

gaacaggttg agaaccag 1578

<210> 3

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Ser Gly Lys Ala Thr Gly Lys Thr Asp Ala Pro Thr Pro Val

1 5 10 15

Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn

20 25 30

Val Ser Trp Phe Gln Ala Ile Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Pro

35 40 45

Pro Lys Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Pro

50 55 60

Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Phe Lys Pro Gly

65 70 75 80

Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr

85 90 95

Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asn Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly

100 105 110

Ile Val Trp Val Ala Gly Lys Gly Ala Asp Thr Lys Phe Arg Ser Asn

115 120 125

Gln Gly Thr Arg Asp Ser Asp Lys Phe Asp Gln Tyr Pro Leu Arg Phe

130 135 140

Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu

145 150 155 160

Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Arg Ala Pro Ser Arg Asp Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ala

180 185 190

Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln

195 200 205

Lys Lys Gly Ser Arg Ile Thr Lys Ala Lys Ala Asp Glu Met Ala His

210 215 220

Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Lys Val Asp Gln

225 230 235 240

Val Phe Gly Pro Arg Thr Lys Cys Lys Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp

245 250 255

Lys Met Asn Glu Glu Gly Ile Lys Asp Gly Arg Val Thr Ala Met Leu

260 265 270

Asn Leu Val Pro Ser Ser His Ala Cys Leu Phe Gly Ser Arg Val Thr

275 280 285

Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His Leu Arg Phe Glu Phe Thr Thr

290 295 300

Val Val Ser Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys Ile Cys

305 310 315 320

Asp Gln Cys Val Asp Gly Val Gly Thr Arg Pro Lys Asp Asp Glu Pro

325 330 335

Arg Pro Lys Ser Arg Pro Asn Ser Arg Pro Ala Thr Arg Thr Ser Ser

340 345 350

Pro Ala Pro Arg Gln Gln Arg Gln Lys Lys Glu Lys Lys Ser Lys Lys

355 360 365

Gln Asp Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Thr Ser Asp Glu Glu Arg Asn

370 375 380

Asn Ala Gln Leu Glu Phe Asp Asp Glu Pro Lys Val Ile Asn Trp Gly

385 390 395 400

Glu Ser Ala Leu Gly Glu Asn Glu Leu

405

<210> 4

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcaagcg gtaaggcaac tggaaagaca gatgccccaa ctccagtcat caaactagga 60

ggaccaaagc cacctaaagt tggttcttct ggaaatgtat cttggtttca agcaataaaa 120

gccaagaagt taaattcacc tccgcctaag tttgaaggta gcggtgttcc tgataatgaa 180

aatctaaaac caagtcagca gcatggatat tggagacgcc aagctaggtt taagccaggt 240

aaaggtggaa gaaaaccagt cccagatgct tggtattttt actatactgg aacaggacca 300

gccgctaacc tgaattgggg tgatagccaa gatggtatag tgtgggttgc tggtaagggt 360

gctgatacta aatttagatc taatcagggt actcgtgact ctgacaagtt tgaccaatat 420

ccgctacggt tttcagacgg aggacctgat ggtaatttcc gttgggattt cattcctctg 480

aatcgtggta ggagtggaag atcaacagcg gcttcatcag cagcatctag tagagcaccg 540

tcgcgtgatg gctcgcgtgg acgtagaagc ggagctgaag atgatcttat agctcgtgca 600

gcaaagatca ttcaggatca gcagaagaag ggttctcgca ttactaaagc taaggccgat 660

gaaatggctc atcgccggta ttgtaagcgt actatcccac ctggttataa ggttgatcaa 720

gtatttggtc cccgtactaa atgtaaggag ggaaattttg gtgatgacaa gatgaatgag 780

gagggtatta aggatgggcg cgttacagca atgctcaacc tagtccctag cagccatgct 840

tgtctttttg gaagtagagt gacgcccaaa cttcaaccag atgggctgca cttgagattt 900

gaatttacta ctgtggtttc acgtgatgat ccgcagtttg ataattatgt gaaaatttgt 960

gatcagtgtg tcgatggtgt agggacgcgt ccaaaagacg atgaaccgag accaaagtca 1020

cgcccaaatt caagacctgc tacaagaaca agttctccag cgccaagaca acagcgtcaa 1080

aagaaggaga agaagtcaaa gaagcaggat gatgaagtag ataaggcatt gacctcagat 1140

gaggagagga acaatgcaca gctggaattt gatgatgaac ccaaggtgat taactggggg 1200

gagtcagcac ttggagagaa tgagttgtaa 1230

Claims

1.一种鸡传染性支气管炎疫苗株，其特征在于，所述的鸡传染性支气管炎疫苗株是将插入有鸡传染性支气管炎病毒QX型病毒的S1基因片段的疫苗株H52的核酸片段连接入载体，制成重组质粒；然后将重组质粒与辅助质粒共转染宿主细胞后拯救出重组病毒株作为疫苗株。

2.如权利要求1所述的疫苗株，其特征在于，所述的插入有S1基因片段的疫苗株H52的核酸片段通过酵母同源重组的方式连接入载体中。

3.如权利要求1或2所述的疫苗株，其特征在于，所述的S1基因的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。

4.如权利要求3所述的疫苗株，其特征在于，所述的S1基因的编码基因的序列为SEQ IDNO:2。

5.如权利要求1或2所述的疫苗株，其特征在于，所述的载体为酵母人工染色体载体。

6.如权利要求5所述的疫苗株，其特征在于，所述的载体为pYES1L载体。

7.如权利要求1所述的疫苗株，其特征在于，所述的辅助质粒是表达H52株的N基因的重组质粒。

8.如权利要求1所述的疫苗株，其特征在于，所述宿主细胞为BHK细胞。

9.权利要求1-8任一项所述的疫苗株在制备疫苗中的应用。

10.一种供鸡传染性支气管疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原为权利要求1-8任一项所述的疫苗株。