CN111825768B - 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法 - Google Patents

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法。本发明将流感病毒血凝素蛋白胞外域与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基N端融合表达，将流感病毒血凝素蛋白展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明将流感病毒血凝素蛋白进行突变优化，提高其可溶性表达量和表达效率，提高疫苗的免疫效力与宽度，提高流感病毒血凝素蛋白的免疫原性。本发明利用大肠杆菌原核表达系统、家蚕及AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统分别表达并制备重组蛋白疫苗，或通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明流感疫苗可引发广泛中和性抗流感抗体，不仅可以提高免疫效力还能扩大免疫范围，具有交叉免疫效力的通用疫苗的潜力。

Description

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法
技术领域
本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由流感病毒血凝素蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的流感疫苗，属于流感疫苗领域。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性呼吸道传染病，流感病毒具有传染性强，发病率高，波及面广等特点，对人类健康和全球经济造成了严重影响。流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来才发现的牛流感病毒将归为丁(D)型。其中，甲型流感病毒经常发生抗原变异，在全球引发了数次流感大流行。防治流感病毒最好的工具主要是疫苗，目前使用的流感疫苗主要机理是诱导机体产生针对流感病毒表面抗原血凝素(hemagglutin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的保护性抗体，但是甲型流感病毒表面容易发生抗原漂移和抗原转换，这就需要定期重新设计疫苗来适应来年最可能引发流感的病毒。针对目前流感病毒防治趋势，制备出一种具有广谱，高效免疫效力的通用疫苗迫在眉睫。针对疾病最好的治疗方案莫过于防患未然，而针对各种疾病的疫苗正式发挥预防作用的主力军。传统的疫苗多为减毒活疫苗，包括天然减毒株和基因重组弱毒株等。应用减毒株疫苗的最大缺陷是减毒株在易感群体中有恢复毒力作用的风险。因此，生产安全、高效及廉价的基因工程疫苗成为新的需求。而由24个亚基自组装而成的铁蛋白纳米粒子正式一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台。
近年来，铁蛋白(Ferritin)作为一种纳米材料在多个领域得到应用。铁蛋白是一种广泛存在于生物体中的笼状蛋白，其蛋白外壳由24个铁蛋白亚基自组装而成，其中每三个亚基组成一个三聚体亚单位。铁蛋白的N末端伸向外表面，易于进行基因修饰，融合蛋白多肽。高度有序重复抗原在微生物体表面以5-10nm间隔分布时易于诱导产生强烈的T细胞依赖的抗体反应。铁蛋白非常稳定，能够耐受高温(70-80℃)和多种变性剂而不影响天然蛋白结构。铁蛋白对pH敏感，在pH2.0的酸性条件下蛋白壳发生解体，而当pH恢复到生理条件(pH 7.0)时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白。近年来对铁蛋白的研究主要集中在：(1)通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成；(2)通过对铁蛋白外表面的修饰与PEG或抗体连接以扩展新的功能；(3)通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；
本发明的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；
本发明的目的之三是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒流感疫苗；
本发明目的之四提供高效表达所述融合蛋白的方法；
本发明目的之五是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与血凝素蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由流感病毒血凝素蛋白和单体铁蛋白亚基的N端连接得到；
所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；、。
所述流感病毒血凝素蛋白是H9流感病毒血凝素蛋白或H5流感病毒血凝素蛋白；优选的，所述流感病毒血凝素蛋白所选区域包含选自以下区域：能够容许血凝素三聚体形成的区域、茎区、胞外结构域；最优选的，所述H9流感病毒血凝素蛋白只选取H9流感病毒血凝素蛋白的胞外结构域这一特定的部位，所述H5流感病毒血凝素蛋白只选取H5流感病毒血凝素蛋白的胞外结构域这一特定部位。
所述的H9流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；所述H5流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示；
优选的，将流感病毒血凝素蛋白和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。
本发明所提供的一种融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示(H9 HA-Ferritin)，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示；本发明所提供的另一种融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示(H5 HA-Ferritin)，其编码基因的核苷酸序列为SEQID NO.10所示。
本发明为了提高流感病毒血凝素蛋白与铁蛋白单体连接后得到的融合蛋白的表达量，本发明进一步将SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.9所示的融合蛋白的同感序列进行突变优化，并在序列优化之后进行糖基化位点分析，以消除糖基化位点来增加可溶性表达。从而在同感序列优化之后进行氨基酸单位点突变，双位点突变和多位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率：
具体的，本发明人通过分析了20条最近年份，流行于不同地区的H5、H9毒株的血凝素蛋白氨基酸序列进行比对分析，找出一条最为通用的同感序列，作为相应毒株的抗原基因，以期取得最佳的保护效果；在此基础上，本发明进一步利用OptimumGeneTM技术对H5、H9血凝素蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的血凝素蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。此外，为了提高铁蛋白的表达量，同时提高可溶表达，对铁蛋白单体亚基进行点突变N19Q。最终，本发明将SEQ ID NO.7所示的融合蛋白的同感序列按照上述优化方式得到优化序列的氨基酸为SEQ ID NO.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.12所示；将SEQ ID NO.9所示融合蛋白的同感序列按照上述优化方式得到的优化序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。
本发明将优化后的同感序列在家蚕表达系统中进行表达，根据基因表达产物ELISA效价结果可见，密码子优化后的同感序列的表达量相比优化前有了显著提高。
本发明获得了H9 HA-Ferritin-C、H5 HA-Ferritin-C突变体，以H9 HA-Ferritin-C、H5 HA-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变：
将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S、N41D、A47T、L51I、M58I、G63N、P83L、P101S、T138K、E181G、N191H、H192Q、D196E、T197A、G236R、I267V、Q304H、D367N、N419S或V469M的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；
将SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列按照V40I、K51R、T52A、K56R、S72R、N100S、H126R、G155E、E186K、D187N、V190I、L191M、G193W、I242M、N289Y、N325S、Y366F、E406G、D462E或Q501H的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；
本发明将突变后的这些单位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S、N41D、A47T、N191H、H192Q或D196E的氨基酸单位点突变方式获得的6个突变体的表达产物的效价呈显著提升；
将SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列按照V40I、K51R、K56R、V190I、L191M或G193W的氨基酸单位点突变方式获得的6个突变体的表达产物的效价呈显著提升。
基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M突变体表达量的目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构并决定着蛋白质的高级结构，且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明进一步进行氨基酸双位点突变。本发明将可以提高表达量的单突变位点H9 HA：N40S、N41D、A47T、N191H、H192Q、或D196E；H5 HA：V40I、K51R、K56R、V190I、L191M或G193W两两组合进行双位点突变，具体如下：
将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S-N41D、N40S-A47T、N40S-N191T、N40S-H192Q、N40S-D196E、N41D-A47T、N41D-N191H、N41D-H192Q、N41D-D196E、A47T-N191H、A47T-H192Q、A47T-D196E、N191H-H192Q、N191H-D196E或H192Q-D196E的氨基酸双位点突变方式获得15个双位点突变体；
将SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列按照V40I-K51R、V40I-K56R、V40I-V190I、V40I-L191M、V40I-G193W、K51R-K56R、K51R-V190I、K51R-L191M、K51R-G193W、K56R-V190I、K56R-L191M、K56R-G193W、V190I-L191M、V190I-G193W或L191M-G193W的氨基酸双位点突变方式获得15个位点突变体；
本发明将获得的30个双位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S-N41D、N41D-A47T或A47T-H192Q的氨基酸双位点突变方式获得的3个位点突变体的表达产物的效价呈显著提升，其中，将SEQ IDNO.11所示的氨基酸按照N41D-A47T氨基酸双位点突变获得的突变体(所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.19所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.20所示)的效价提升最为显著；
将氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示的氨基酸按照V40I-K51R、K51R-V190I或V190I-G193W中的氨基酸双位点突变方式获得的3个位点突变体的表达产物的效价呈显著提升，其中，将氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示的氨基酸按照V190I-G193W氨基酸双位点突变获得的位点突变体(所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.21所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.22所示)效价提升最为显著。
鉴于部分双位点突变能够有效提升表达量后效价，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，本发明进一步尝试进行氨基酸多位点突变。本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是基于上述获得有效的双位点突变序列的基础之上，通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，具体突变方式如下：
将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S-N41D-A47T-N191H-H192Q-D196E氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体，所述多位点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.23所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示；将SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列按照V40I-K51R-K56R-V190I-L191M-G193W氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体，所述多位点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.25所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.26所示。
本发明将获得的两个多位点突变体(SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25)分别在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：所得的两个多位点突变体的表达量相比上述单突变体、双突变体的表达量均有显著提升。本发明进一步将这两个多位点突变体在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
本发明将获得的两个多位点突变体(SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25)编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构建得到呈递基因的重组杆状病毒；将重组杆状病毒呈递给小鼠和鸡，结果发现小鼠和鸡所产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统疫苗。
因此，本发明所提供的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒能应用于制备流感疫苗，其应用方法包括：
(Ⅰ)将所述的融合蛋白编码基因采用原核系统表达系统在原核细胞中进行表达得到纳米抗原颗粒，将所表达的纳米抗原颗粒产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到流感疫苗；
作为参考，采用原核系统表达系统在原核细胞中表达纳米抗原颗粒的步骤包括：
(1)将融合蛋白原始序列或突变优化后的融合蛋白序列克隆到表达载体pET28a上，得到重组质粒pET28a-H9 HA-Ferritin、pET28a-H5 HA-Ferritin；
(2)将重组质粒pET28a-H9 HA-Ferritin、pET28a-H5 HA-Ferritin转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达，随后经过镍柱纯化，即得。
(Ⅱ)将所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达，将所表达的抗原产物纯化后后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到流感疫苗。
作为参考，所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达的方法包括：将所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将所述的融合蛋白编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到重组家蚕杆状病毒；将重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达；
或者将所述的融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得；
(Ⅲ)还可将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒；所得到的重组病毒通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并诱导动物产生抗体。
本发明进一步提供了一种防治流感的疫苗，包括：预防或治疗上有效量的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及药学上可接受的免疫佐剂或载体。
本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制。它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖、和明胶及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC、和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒和乳液。疫苗还可以佐剂配制，以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、核酸诸如CpG和聚I:C、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐诸如铝盐和磷酸钙、乳剂诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。
本发明的流感疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口服。
本发明所提供的疫苗能通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示流感病毒蛋白三聚体结构，从而能够引起广泛中和性流感抗体。此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力，还增加了免疫范围，能免疫不同年份同型以及异型流感病毒。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌、家蚕杆状病毒和AcNPV-昆虫细胞真核表达系统表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统的鸡胚制备流感疫苗方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；
2、本发明提供的纳米流感疫苗可以诱导具有广谱性质的流感抗体，为制备一种通用流感疫苗打下基础。
3、本发明提供的纳米流感疫苗，用这种纳米流感疫苗免疫接种动物而诱导产生的抗流感抗体水平明显比传统疫苗的高。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
词语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。
术语“抗原性”是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力；术语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力；术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答；术语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物；术语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护；术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1H9 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物的血凝试验示意图；初始的稀释值100倍，血凝值达到51200。
图2H5 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物的血凝试验示意图；初始的稀释值400倍，血凝值达到12800。
图3病毒中和实验图。其中，A为中和抗体抑制病毒实验图，图中为正常细胞生长状态；B为部分细胞感染病毒实验图，图中细胞感染病毒后呈皱缩状态。
图4H9 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物Western blotting检测图；A为H9 HA-Ferritin-C-O-M6家蚕表达产物；B为阴性对照。
图5 HHA-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物Western blotting检测图；A为H5 HA-Ferritin-C-O-M6家蚕表达产物；B为阴性对照。
图6H9 HA-Ferritin-C-O-M6或H5 HA-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒蚕血淋巴样品经初步纯化后用透射电镜检测，标尺尺寸：20nm；图中可观察到符合预期大小的大量球状物质，表明融合蛋白成功自组装成纳米颗粒抗原。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、转移载体pVL1393、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、Sf-9细胞、Hi5昆虫细胞、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、苜蓿斜纹夜蛾多角体病毒亲本株AcBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；
(2)铁蛋白序列和流感病毒HA蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到原核表达载体pUC57载体上。
(3)酶与试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K PlusⅡDNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；
(4)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；Ni-NTAAgarose、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物合成与基因测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
(5)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；
(6)流感病毒与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。
2、实验方法中用于定点突变的融合PCR方法
参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
实施例1 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。
2 H9、H5血凝素蛋白基因序列和铁蛋白基因序列的合成。
为了使流感病毒血凝素与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对H9(SEQ ID NO.3)和H5(SEQ ID NO.4)流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列进行分析，分别得出H9血凝素蛋白其信号肽为前18个氨基酸，其胞外结构域为前524个氨基酸。H5血凝素蛋白其信号肽为前16个氨基酸，其胞外结构域为前532个氨基酸。
为了促进流感病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率，并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.1)中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)，以消除糖基化位点。其中流感病毒血凝素蛋白序列与铁蛋白序列之间由一段连接肽连接(SGG)，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。
为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。
将目的基因序列去掉信号肽，利用pET-28a(+)载体上的ATG进行起始起始翻译。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到原核载体pET-28a(+)上。
将上述所设计的流感病毒血凝素基因序列和铁蛋白序列交由相关生物科技有限公司合成。
3流感病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建
3.1流感病毒和铁蛋白融合蛋白的PCR扩增
用融合PCR技术将流感病毒和铁蛋白融合在一起。具体实验方法见上述实验方法2。
3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增
PCR扩增H9 HA胞外域序列：以质粒pUC57-H9 HA为模板
F1 5’-CGGGATCCACTATACTACTAGTAGTAACAG-3’
R1 5’-TTGATGATGTCGCCACCGGAGATTTTGTAAGTTCCTTCAG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F2 5’-CTGAAGGAACTTACAAAATCTCCGGTGGCGACATCATCAA-3’
R2 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物H9 HA和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出H9 HA-Ferritin
F1 5’-CGGGATCCATAACTATACTACTAGTAGTAA-3’
R2 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
PCR扩增H5 HA胞外域序列：以质粒pUC57-H5 HA-Ferritin为模板,
F3 5’-CGGGATCCGATCAGATTTGCATTGGTTAC-3’
R3 5’-TTGATGATGTCGCCACCGGATATTTGGTAAGTTCCTATTG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F4 5’-CAATAGGAACTTACCAAATATCCGGTGGCGACATCATCAA-3’
R4 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物H5 HA和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出H5 HA-Ferritin，
F3 5’-CGGGATCCTTCTTCTTGCAATAGTCAGT-3’
R4 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
3.1.2家蚕表达系统中表达质粒的PCR扩增
PCR扩增H9 HA胞外域序列：以质粒pUC57-H9 HA为模板
F5 5’-CGGGATCCAACATGGAGACAGCATCACTGATAACT-3’
R5 5’-TTGATGATGTCGCCACCGGAGATTTTGTAAGTTCCTTCAG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F6 5’-CTGAAGGTTACAAAATCTCCGGTGGCGACATCATCAA-3’
R6 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物H9 HA和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出H9 HA-Ferritin
F5 5’-CGGGATCCAACATGGAGACAGCATCACTGATAACT-3’
R6 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
PCR扩增H5 HA胞外域序列：以质粒pUC57-H5 HA-Ferritin为模板,
F7 5’-CGGGATCCAACATGGAGAAAATAGTGCTTCT-3’
R7 5’-TTGATGATGTCGCCACCGGATATTTGGTAAGTTCCTATTG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F8 5’-CAATAGGTTACCAAATATCCGGTGGCGACATCATCAA-3’
R8 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物H5 HA和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出H5 HA-Ferritin，
F7 5’-CGGGATCCAACATGGAGAAAATAGTGCTTCT-3’
R8 5’-GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
PCR反应体系为表1：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002028636870000111
PCR参数设置：
Figure BDA0002028636870000112
3.2玻璃奶纯化回收DNA片段
配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。
3.3目的基因PCR产物酶切处理
将PCR产物跑胶，胶回收正确的产物用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin。酶切体系如下表2所示：
表2酶切体系
Figure BDA0002028636870000113
Figure BDA0002028636870000121
3.4感受态细胞的小量制备
制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。
3.5目的基因与pET-28a(+)载体和pVL1393载体的连接与转化
3.5.1酶切处理pET-28a(+)和pVL1393载体
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对转移载体pVL1393和pET-28a(+)进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。
3.5.2连接
酶切回收的目的片段与经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切处理后的转移载体pVL1393和pET-28a(+)的连接。用T4DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下表3所示：
表3连接体系
Figure BDA0002028636870000122
3.5.3转化
取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。
3.6核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。
3.7 SDS碱裂解法提取质粒DNA
收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。
3.8阳性克隆的酶切与测序鉴定
酶切体系如下表4所示：
表4酶切体系
Figure BDA0002028636870000123
Figure BDA0002028636870000131
37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-H9 HA-Ferritin、pET28a-H5 HA-Ferritin、pVL1393-H9 HA-Ferritin、pVL1393-H5HA-Ferritin。
4重组质粒的表达与纯化
4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-H9 HA-Ferritin、pET28a-H5 HA-Ferritin转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-H9 HA-Ferritin在约81kD处出现了特异条带，pET28a-H5 HA-Ferritin在约84kD处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导5h和诱导4h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有少量目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-H9 HA-Ferritin、His-H5 HA-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在。
4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理
将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH2O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100μL裂解液/mL菌液，冰浴30min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；沉淀用适量包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ重悬并洗涤，弃上清；用适量脲NTA-0Buffer重悬沉淀，4℃，过夜溶解。
4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白
取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示在50mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多，在100mM浓度也有蛋白洗脱下来，而250mM浓度下洗脱下来的很少。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，观察大小正确，条带单一的蛋白带。
5重组质粒在家蚕真核表达系统中表达与纯化
5.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。
5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBcmid DNA(专利号为：ZL201110142492.4)，2μg重组转移质粒pVL1393-H9HA-Ferritin、或pVL1393-H5 HA-Ferritin和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)。
5.3重组病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)。
5.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。
取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
5.5 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin在家蚕体和蚕蛹中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfurBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin、PPH-H5 HA-Ferritin)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。
5.6 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin类病毒颗粒的收集与纯化
将含表达有目的基因的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×105g超高速离心2h。用含0.1M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成类病毒颗粒，而且还建立了相应的家蚕表达基因工程鸡传染性法氏囊病病毒类病毒颗粒抗原的纯化方法。
6 Western blotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin、His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到81kDa(H9HA-Ferritin)、84kDa(H5 HA-Ferritin)大小的特异性条带。
7血凝实验
7.1材料准备
96孔V型微量反应板，微量移液器(配有滴头)；阿氏液(Alsevers)、鸡红细胞悬液(1％)；pH7.2PBS。
7.2操作方法
在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mLPBS，换滴头。吸取0.025mL病毒悬液加入第一孔，混匀。从第一孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行2倍梯度稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。每孔再加入0.025mLPBS。并设不加样品的红细胞对照孔。每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。震荡混匀，在室温下静置20～40分钟后观察结果。对照孔红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底。
表5 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin原始序列表达产物ELISA效价
组别 效价
H9 HA-Ferritin 1：1024
H5 HA-Ferritin 1：800
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin基因表达产物ELISA效价可达1：1024、1：800。
表6 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin原始序列表达产物血凝效价
组别 效价
H9 HA-Ferritin 1：2048
H5 HA-Ferritin 1：1600
表5和表6均为H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin原始基因序列表达产物所测实验数据。
实施例2 H9 HA-Ferritin、H5 HA-Ferritin原始序列进行同感序列设计并优化后的纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
具体溶液和培养基的配置方法见实施例1。
2流感病毒血凝素蛋白保守序列的基因获取
本发明将实施例1中流感病毒血凝素蛋白原始氨基酸序列和从NCBI上获取的其他20条血凝素氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列。将此同感序列进行优化，进一步利用OptimumGeneTM技术对H5、H9血凝素蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的血凝素蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据家蚕密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。命名为H9 HA-Ferritin-C-O(SEQ ID NO.11)、H5HA-Ferritin-C-O(SEQ ID NO.13)具体优化过程见实施例1。
3融合蛋白的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
H9 HA-Ferritin-C-O融合PCR引物：
H9 HA血凝素胞外域PCR引物：
F9:CGGGATCCAACATGGAAGTAGTAAGTCTGATAACC
R9:TTGATGATGTCGCCACCGGAAATCTTGTATGTACCCTCGCTTTC
Ferritin PCR引物：
F10：GAAAGCGAGGGTACATACAAGATTTCCGGTGGCGACATCATCAA
R10：GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG
Over-lapPCR引物：
F9：CGGGATCCAACATGGAAGTAGTAAGTCTGATAACC
R10：GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG
H5 HA-Ferritin-C-O融合PCR引物：
H5 HA血凝素胞外域PCR引物：
F11:CGGGATCCAACATGGAAAAAATCGTGCTGCTG
R11:GGTATTTACCAGATCCTGTCCATTTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG
Ferritin PCR引物：
F12：CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGAAATGGACAGGATCTGGTAAATACC
R12：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT
Over-lapPCR引物：
F11：CGGGATCCAACATGGAAAAAATCGTGCTGCTG
R12：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT
3.1目的基因与pVL1393载体的连接与转化
3.2核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
具体实验方法见实施例一。
3.3 SDS碱裂解法提取质粒DNA
具体实验方法见实施例一。
3.4阳性克隆的酶切与测序鉴定
具体实验方法见实施例一。
4重组质粒pVL1393-H9 HA-Ferritin-C-O、pVL1393-H5 HA-Ferritin-C-O在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
具体实验方法见实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体实验方法见实施例1。
4.3重组病毒rBmBacmid在家蚕细胞中的扩增
具体实验方法见实施例1。
4.4重组病毒的鉴定
具体实验方法见实施例1。
4.5 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体实验方法见实施例1。
4.6 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O类病毒颗粒的收集与纯化
具体实验方法见实施例1。
5 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。
6血凝实验
具体实验方法见实施例1。
7结果鉴定
表7 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价
组别 效价
H9 HA-Ferritin 1：1024
H5 HA-Ferritin 1：800
H9 HA-Ferritin-C-O 1：1600
H5 HA-Ferritin-C-O 1：1600
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价可达1：1600。
表8 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O基因表达产物血凝效价
组别 效价
H9 HA-Ferritin 1：2048
H5 HA-Ferritin 1：1600
H9 HA-Ferritin-C-O 1：3200
H5 HA-Ferritin-C-O 1：3200
从表7和表8的结果可知，密码子优化后的同感序列的表达量有了很大的提高，说明本实施例的改造和优化工作是成功的。
实施例3 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O突变体进行氨基酸单位点突变后的纳米颗粒疫苗制备与效力检测
1实验方法
1.1 H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O氨基酸序列单位点突变体基因的构建基于实施例二的结果，本发明获得了H9 HA-Ferritin-C、H5 HA-Ferritin-C突变体，以H9HA-Ferritin-C、H5 HA-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，融合PCR的方法见实施例1。
突变位点分别为H9：N40S、N41D、A47T、L51I、M58I、G63N、P83L、P101S、T138K、E181G、N191H、H192Q、D196E、T197A、G236R、I267V、Q304H、D367N、N419S、V469M；H5：V40I、K51R、T52A、K56R、S72R、N100S、H126R、G155E、E186K、D187N、V190I、L191M、G193W、I242M、N289Y、N325S、Y366F、E406G、D462E或Q501H。所得突变体命名为H9 HA-Ferritin-C-O-M(N40S、N41D、A47T、L51I、M58I、G63N、P83L、P101S、T138K、E181G、N191H、H192Q、D196E、T197A、G236R、I267V、Q304H、D367N、N419S、V469M)、H5 HA-Ferritin-C-O-M(V40I、K51R、T52A、K56R、S72R、N100S、H126R、G155E、E186K、D187N、V190I、L191M、G193W、I242M、N289Y、N325S、Y366F、E406G、D462E、Q501H)。
H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O进行氨基酸单位点突变所需引物：
H9 HA-Ferritin-C-O:
(1)两侧上下游引物：
F：CGGGATCCAACATGGAAGTAGTAAGTCTGATAACC
R：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCG
(2)中间上下游引物：
1.
F：GGACACGCTGACAGAGAGTAATGTGCCGGTTAC
R：GTAACCGGCACATTACTCTCTGTCAGCGTGTCC
2.
F：CTGACAGAGAACGATGTGCCGGTTACTCACGC
R：GCGTGAGTAACCGGCACATCGTTCTCTGTCAG
3.
F：CCGGTTACTCACACCAAAGAACTGTTGCACACC
R：GGTGTGCAACAGTTCTTTGGTGTGAGTAACCGG
4.
F：AAAGAACTGATACACACCGAGCATAACGGTATGC
R：GCATACCGTTATGCTCGGTGTGTATCAGTTCTTT
5.
F：CGAGCATAACGGTATACTCTGCGCCACTGGTTTAG
R：CTAAACCAGTGGCGCAGAGTATACCGTTATGCTCG
6.
F：CTCTGCGCCACTAATTTAGGACATCCTCTTATCCTG
R：CAGGATAAGAGGATGTCCTAATTAAGTGGCGCAGAG
7.
F：GTTTAATTTACGGAAACTTGTCCTGTGATCTCTTAC
R：GTAAGAGATCACAGGACAAGTTTCCGTAAATTAAAC
8.
F：CATTGTGGAGAGGAGTTCTGCTGTTAATGGAC
R：GTCCATTAACAGCAGAACTCCTCTCCACAATG
9.
F：CAAATCTTCCCTGACAAGATATGGAACGTAAC
R：GTTACGTTCCATATCTTGTCAGGGAAGATTTG
10.
F：CCAACAATCAGGGTAAGAACATCCTTTTTATG
R：CATAAAAAGGATGTTCTTACCCTGATTGTTCC
11.
F：GTGGGGAATTCACCACCCTCCAACGGACACAG
R：CTGTGTCCGTTGGAGGGTGGTGAATTCCCCAC
12.
F：CTTTTTATGTGGGGAATTAATCAACCTCCAACGG
R：CCGTTGGAGGTTGATTAATTCCCCACATAAAAAG
13.
F：CACCCTCCAACGGAAACAGTCCAAACTAATCTGTAC
R：GTACAGATTAGTTTGGACTGTTTCCGTTGGAGGGTG
14.
F：CACCCTCCAACGGACGCTGTCCAAACTAATCTG
R：CAGATTAGTTTGGACAGCGTCCGTTGGAGGGTG
15.
F：GGTGAATGGTCTCCAACGCAGAATTGACTAC
R：GTAGTCAATTCTGCGTTGGAGACCATTCACC
16.
F：CCTGGTACGGCCACGTACTTTCGGGCGAAAGTC
R：GACTTTCGCCCGAAAGTACGTGGCCGTACCAGG
17.
F：GACATTGCCGTTCCACAATGTATCCAAATACG
R：CGTATTTGGATACATTGTGGAACGGCAATGTC
18.
F：CAACACTCTAACAATCAGGGCGTTGGTATG
R：CATACCAACGCCCTGATTGTTAGAGTGTTG
19.
F：GACTGAACATGATCAGTAACAAAATCGAC
R：GTCGATTTTGTTACTGATCATGTTCAGTC
20.
F：GATCGAACGCGATGGAAGACGGAAAAGG
R：CCTTTTCCGTCTTCCATCGCGTTCGATC
H5 HA-Ferritin-C-O:
(1)两侧上下游引物：
F：CGGGATCCAACATGGAAAAAATCGTGCTGCTGTTCGC
R：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCG
(2)中间上下游引物：
1.
F：CCATTATGGAGAAGAACATTACTGTGACCCACGC
R：GCGTGGGTCACAGTAATGTTCTTCTCCATAATGG
2.
F：GGACATCCTGGAGCGCACACATAACGGCAAG
R：CTTGCCGTTATGTGTGCGCTCCAGGATGTCC
3.
F：GGACATCCTGGAGAAAGCTCATAACGGCAAGC
R：GCTTGCCGTTATGAGCTTTCTCCAGGATGTCC
4.
F：GAAAACACATAACGGCCGCCTGTGCGATC
R：GATCGCACAGGCGGCCGTTATGTGTTTTC
5.
F：GATCCTGAAGGACTGCCGCGTGGCAGGC
R：GCCTGCCACGCGGCAGTCCTTCAGGATC
6.
F：GTGGAGAAAGCCAGTCCTGCTAATGATCTGTGC
R：GCACAGATCATTAGCAGGACTGGCTTTCTCCAC
7.
F：GTCCAGAATCAACCGCTTCGAAAAGATCC
R：GGATCTTTTCGAAGCGGTTGATTCTGGAC
8.
F：CGCTTGTCCATACCAGGAAAACAGCTCCTTC
R：GAAGGAGCTGTTTTCCTGGTATGGACAAGCG
9.
F：CAACACCAACCAGAAAGATCTGCTGGTG
R：CACCAGCAGATCTTTCTGGTTGGTGTTG
10.
F：CAACACCAACCAGGAGAACCTGCTGGTGCTGTG
R：CACAGCACCAGCAGGTTCTCCTGGTTGGTGTTG
11.
F：GGAGGATCTGCTGATTCTGTGGGGAATC
R：GATTCCCCACAGAATCAGCAGATCCTCC
12.
F：GAGGATCTGCTGGTGATGTGGGGAATCCACC
R：GGTGGATTCCCCACATCACCAGCAGATCCTC
13.
F：GGTGCTGTGGTGGATCCACCATCCAAACG
R：CGTTTGGATGGTGGATCCACCACAGCACC
14.
F：CCAGTCTGGACGGATGGATTTCTTTTGG
R：CCAAAAGAAATCCATCCGTCCAGACTGG
15.
F：GGTGGAATACGGGTACTGCAATACCCGCTGTC
R：GACAGCGGGTATTGCAGTACCCGTATTCCACC
16.
F：GTGAAAAGCAGTAAGCTGGTGCTGGCTAC
R：GTAGCCAGCACCAGCTTACTGCTTTTCAC
17.
F：GTGGATGGGTGGTACGGTTTCCACCATAGTAAC
R：GTTACTATGGTGGAAACCGTACCACCCATCCAC
18.
F：GAACACCCAGTTCGGTGCTGTGGGGAGG
R：CCTCCCCACAGCACCGAACTGGGTGTTC
19.
F：GAAAAATCTGTATGAAAAAGTGAGGCTCC
R：GGAGCCTCACTTTTTCATACAGATTTTTC
20.
F：GGCACTTACGACCACCCTCAGTATTCAGAGG
R：CCTCTGAATACTGAGGGTGGTCGTAAGTGCC
2 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M突变体的质粒构建具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组质粒在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒的构建和获得
具体方法同实施例1。
4.3重组病毒rBmBacmid在家蚕细胞中的扩增
具体实验方法见实施例1。
4.4重组病毒的鉴定
具体实验方法见实施例1。
4.5 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M突变体基因在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
4.6 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M类病毒颗粒的收集与纯化
具体方法同实施例1。
5 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。
6血凝试验
具体实验方法见实施例1。
7结果鉴定
表9 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-M突变体表达产物的ELISA效价
Figure BDA0002028636870000211
Figure BDA0002028636870000221
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，虽然最高的ELISA值在为3200左右，因为本实验是用阈值和稀释倍数作为定量指标的，具体的样本的量因为P/N值的大小不同，还是有所差别的；同样的血凝因为也是二倍稀释，血凝现象可确定的时间也有先后，虽然是同一血凝值，并不代表含量完全一致。在后面的实验中也存在类似的现象而不一一做出说明。
表10 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M突变体表达产物血凝效价
Figure BDA0002028636870000222
Figure BDA0002028636870000231
从表9和表10数据可以看出在同感序列(SEQ ID NO.11)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(N40S、N41D、A47T、N191H、H192Q、D196E)的表达产物的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
从表9和表10数据可以看出在同感序列(SEQ ID NO.13)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(V40I、K51R、K56R、V190I、L191M、G193W)的表达产物的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
实施例4 H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M进行氨基酸双位点突变后的纳米颗粒疫苗制备与效力检测
鉴于实施例3的结果，确定部分位点的突变是有效突变，可以达到提高H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M突变体表达量的目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，且实施例3中进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，故尝试进行氨基酸双位点突变。本发明将可以提高表达量的单突变位点H9 HA：N40S、N41D、A47T、N191H、H192Q、或D196E；H5 HA：V40I、K51R、K56R、V190I、L191M或G193W两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在实施例三获得的单位点突变序列的基础之上，以其(H9 HA-Ferritin-C-O-M、H5 HA-Ferritin-C-O-M)作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
双突变位点为H9 HA：N40S-N41D、N40S-A47T、N40S-N191T、N40S-H192Q、N40S-D196E、N41D-A47T、N41D-N191H、N41D-H192Q、N41D-D196E、A47T-N191H、A47T-H192Q、A47T-D196E、N191H-H192Q、N191H-D196E或H192Q-D196E共15种组合，所获得的突变体命名为H9HA-Ferritin-C-O-D(N40S-N41D、N40S-A47T、N40S-N191T、N40S-H192Q、N40S-D196E、N41D-A47T、N41D-N191H、N41D-H192Q、N41D-D196E、A47T-N191H、A47T-H192Q、A47T-D196E、N191H-H192Q、N191H-D196E或H192Q-D196E)、H5 HA-Ferritin-C-O-D(V40I-K51R、V40I-K56R、V40I-V190I、V40I-L191M、V40I-G193W、K51R-K56R、K51R-V190I、K51R-L191M、K51R-G193W、K56R-V190I、K56R-L191M、K56R-G193W、V190I-L191M、V190I-G193W或L191M-G193W)突变体。
H9 HA-Ferritin-C-O、H5 HA-Ferritin-C-O部分氨基酸双位点突变由于突变位点较近，为了避免重复突变，需另设引物如下：
H9 HA-Ferritin-C-O-D:
N40S-N41D：
F：GGACACGCTGACAGAGAGTGATGTGCCGGTTAC
R：GTAACCGGCACATCACTCTCTGTCAGCGTGTCC
N191-H192Q
F：GTGGGGAATTCACCAACCTCCAACGGACACAG
R：CTGTGTCCGTTGGAGGTTGGTGAATTCCCCAC
H192Q-D196E
F：GAATTAATCAACCTCCAACGGAAACAGTCCAAACTAATCTG
R：CAGATTAGTTTGGACTGTTTCCGTTGGAGGTTGATTAATTC
H5 HA-Ferritin-C-O-D:
K51R-K56R：
F：GGACATCCTGGAGCGCACACATAACGGCCGCCTGTGCGATCTG
R：CAGATCGCACAGGCGGCCGTTATGTGTGCGCTCCAGGATGTCC
V190I-L191M：
F：CAACCAGGAGGATCTGCTGATTATGTGGGGAATCCACCATCC
R：GGATGGTGGATTCCCCACATAATCAGCAGATCCTCCTGGTTG
V190I-G193W：
F：CAGGAGGATCTGCTGATTCTGTGGTGGATCCACCATCCAAAC
R：GTTTGGATGGTGGATCCACCACAGAATCAGCAGATCCTCCTG
L191M-G193W：
F：GAGGATCTGCTGGTGATGTGGTGGATCCACCATCC
R：GGATGGTGGATCCACCACATCACCAGCAGATCCTC
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。
2H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组质粒pVL1393-H9 HA-Ferritin-C-O-D、pVL1393-H5 HA-Ferritin-C-O-D在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体方法同实施例1。
经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin-C-O-D、PPH-H5 HA-Ferritin-C-O-D)。
4.3重组病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin-C-O-D、PPH-H5 HA-Ferritin-C-O-D)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin-C-O-D、PPH-H5 HA-Ferritin-C-O-D)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-H9 HA-Ferritin-C-O-D、PPH-H5 HA-Ferritin-C-O-D)。
4.4重组病毒的鉴定
具体方法同实施例1。
4.5 H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
4.6 H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D类病毒颗粒的收集与纯化
具体方法同实施例1。
5 Western blotting检测
具体实验方法同实施例1。
6血凝试验
具体实验方法同实施例1。
7结果鉴定
表11 H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D突变体表达产物的ELISA效价
Figure BDA0002028636870000251
Figure BDA0002028636870000261
表12 H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D突变体表达产物的血凝效价测定
Figure BDA0002028636870000262
Figure BDA0002028636870000271
从表11和表12中数据看出同感序列氨基酸双位点突变中，在同感序列(SEQ IDNO.11)的基础上进行氨基酸双位点突变所得突变体有三个双突变体(N40S-N41D、N41D-A47T、A47T-H192Q)的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
从表11和表12数据可以看出在同感序列(SEQ ID NO.13)的基础上进行氨基酸双位点突变，所得突变体有三个双突变体(V40I-K51R、K51R-V190I或V190I-G193W)的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
实施例5 H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D进行氨基酸多位点突变后的纳米颗粒疫苗制备与效力检测
基于实施例4的结果考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，故尝试进行氨基酸多位点突变。本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是实施例四获得的双位点突变序列的基础之上，以其(H9 HA-Ferritin-C-O-D、H5 HA-Ferritin-C-O-D)为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行多突变位点的突变，从而获得多位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
为了避免多位点突变在PCR的过程发生重复突变，另外设置两对引物：
H9 HA-Ferritin-C-O-M6D196E：
F：TCACCACCCTCCAACGGAAACAGTCCAAACTAATC
R：GATTAGTTTGGACTGTTTCCGTTGGAGGGTGGTGA
H5 HA-Ferritin-C-O-M6G193W：
F：GATCTGCTGATTATGTGGTGGATCCACCATCCAAAC
R：GTTTGGATGGTGGATCCACCACATAATCAGCAGATC
获得了以下2种组合：H9 HA(N40S-N41D-A47T-N191H-H192Q-D196E)；H5HA(V40I-K51R-K56R-V190I-L191M-G193W)。命名为H9 HA-Ferritin-C-O-M6(N40S-N41D-A47T-N191H-H192Q-D196E)、H5 HA-Ferritin-C-O-M6(V40I-K51R-K56R-V190I-L191M-G193W)。
将H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统及AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达。
1 H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
2重组质粒的转化与鉴定
具体方法同实施例1。
3重组质粒在家蚕表达系统及AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达与纯化
3.1病毒亲本株的繁殖及病毒DNA的制备
3.1.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
3.1.2 AcBacmid DNA的构建和制备
按下述方法(张志芳，李轶女，易咏竹，等.表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用[P].中国：CN102286534A,2011.)进行制备：
含目的基因的重组病毒DNA的制备按下述方法进行，按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养Sf-9细胞。用含目的基因的重组的AcBacmid病毒感染对数生长期的细胞约5mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。
3.2重组杆状病毒的构建和获得
3.2.1重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体方法同实施例1。
3.2.2重组杆状病毒rAcBacmid的构建和获得
接种约0.5～1×106Sf-9细胞于15cm2培养瓶中，贴壁培养过夜。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞三次，再加1.5ml无血清培养基。向一灭菌管中依次加入1μgAcBcmid DNA，2μg重组转移质粒pVL1393-H9 HA-Ferritin、或pVL1393-H5 HA-Ferritin和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rAcBacmid的筛选。接种适量Sf-9细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组杆状病毒rAcBacmid-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、rAcBacmid-H5 HA-Ferritin-C-O-M6。
3.3重组病毒在细胞中扩增
3.3.1重组病毒rBmBacmid在家蚕细胞中的扩增
具体方法同实施例1。
3.3.2重组病毒rAcBacmid在昆虫Sf-9细胞中的扩增
将上述重组家蚕杆状病毒rAcBacmid-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、rAcBacmid-H5HA-Ferritin-C-O-M6感染正常生长的Sf-9细胞，培养96小时后收集感染的细胞，上清中即含有大量的重组病毒rAcBacmid-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、rAcBacmid-H5 HA-Ferritin-C-O-M6。
3.4重组病毒rBmBacmid的鉴定
具体方法同实施例1。
3.5目的基因在家蚕体内和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
3.6重组病毒rAcBacmid的鉴定和在昆虫Hi5-细胞中的表达
利用PCR方法分析外源基因整合。提取病毒基因组DNA。
取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒rAcBacmid-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、rAcBacmid-H5 HA-Ferritin-C-O-M6。
将上述重组病毒rAcBacmid-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、rAcBacmid-H5HA-Ferritin-C-O-M6培养液按106-7pfu感染100毫升的Hi5细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存以进行ELISA检测。
3.7目的基因表达产物类病毒颗粒的收集与纯化
具体方法同实施例1。
4结果鉴定
表13 H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6突变体在家蚕和AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物ELISA检测
组别 效价
H9 HA-Ferritin-C-O-D 1：6400
H5 HA-Ferritin-C-O-D 1：6400
H9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(家蚕) 1：12800
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(家蚕) 1：12800
AcH9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(AcMNPV-昆虫细胞) 1：1280
AcH5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(AcMNPV-昆虫细胞) 1：1280
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；结果表明H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6基因表达产物ELISA效价可达1：12800。
H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6突变体在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物检测的ELISA值代表每毫升昆虫细胞的表达量。血凝效价同理。
表14 H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6突变体在家蚕和AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物血凝检测
组别 效价
H9 HA-Ferritin-C-O-D 1：12800
H5 HA-Ferritin-C-O-D 1：12800
H9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(家蚕) 1：51200
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(家蚕) 1：32768
AcH9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(AcMNPV-昆虫细胞) 1：5120
AcH5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(AcMNPV-昆虫细胞) 1：2560
从表13和表14中的数据可以看出将融合蛋白同感序列进行氨基酸位点多突变，所得突变体的表达量相比上述单突变体、双突变体等的表达量有了明显提升。
5 Western Blotting检测
具体方法同实施例1。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到81kDa(H9 HA-Ferritin)、84kDa(H5 HA-Ferritin)大小的特异性条带(见图4和图5)。
6电镜观察
用1ml注射器吸一定量的1％醋酸铀待用，用另一注射器吸一定数量的蒸馏水。将H9HA-Ferritin-C-O-M6或H5 HA-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒蚕血淋巴经过初步纯化后，用悬浮液稀释，将悬浮样品滴在封口膜上，使之形成一个小液珠，用镊子尖端夹住载网，并使带膜的一面朝下，沾取样品，而后用滤纸吸干，再洗去多余的悬浮物，清洗5次。吸干后，将载网摆在1％醋酸铀染液的液滴上，染色3分钟，用滤纸从铜网边缘吸干多余的染液，重复2-3次，待干燥后镜检。结果如图6所示，可见大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
实施例6 pVLCAG-H9 HA-Ferritin-C-O-M6、pVLCAG-H5 HA-Ferritin-C-O-M6杆状病毒哺乳动物表达用重组病毒的构建和动物实验
1构建pVLCAG载体
pVL1393载体的多克隆酶切位点上游是一段多角体基因启动子(Pph)，该启动子上游是一个EcoR V酶切位点，下游多克隆酶切位点位置第一个酶切位点是BamH I，利用这两个酶切位点将Pph切下,并连上CAG启动子，CAG启动子的来源是pCAGGS载体。SV40-polyA终止子来源于pEGFP-N3载体。设计CAG启动子上下游PCR引物，CAG-1F为上游引物，加上一个HincII酶切位点，CAG-1R为下游引物，加上了一个EcoR I酶切位点。以pCAGGS载体为模板将CAG启动子扩增出来并连接到pMD18T载体上，测序验证正确后用HincII和EcoR I双酶切回收。由于，HincII酶切后为平末端，将回收的CAG启动子与用EcoR V和BamH I酶切回收的载体连接，在Amp抗性LB平板上筛选并酶切鉴定最后测序确认后得到连接上CAG启动子的pVL1393载体。利用多克隆位点中NotI和BglII两个酶切位点将与CAG启动子配套的SV40终止子插入。
设计SV40终止子的上下游PCR引物，SV10-1F为上游引物，加上NotI和PstI两个酶切位点，SV10-1R为下游引物，加上BglII酶切位点。以pEGFP载体为模板将SV40终止子扩增下来并连接到pMD18T，测序验证正确后用NotI和BglII酶切回收250bp左右的片段，将该片段同用NotI和BglII处理的插入了CAG启动子的pVL1393载体进行连接，验证正确后即可获得pVLCAG载体，用于将外源基因连同上下游的CAG启动子和SV40终止子在共转染的过程中转移到杆状病毒多角体基因位点，构建向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体。
2构建呈递报告基因的重组病毒
2.1将H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6基因克隆到基因呈递转移载体上
将实施例4中带有酶切位点的H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6基因片段酶切回收连接到同样酶切处理的pVLCAG载体，鉴定正确后获得pVLCAG-H9HA-Ferritin-C-O-M6、pVLCAG-H5 HA-Ferritin-C-O-M6。
2.2构建基因呈递用的重组病毒并大量制备
分别用pVLCAG-H9 HA-Ferritin-C-O-M6和pVLCAG-H5 HA-Ferritin-C-O-M6转移载体用reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒Bm-CAG H9 HA-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAG H5HA-Ferritin-C-O-M6，在共转染过程中依然需要pVL1393-Luc作为对照来确定共转染的成功与否，病毒纯化过程同上。
用重组病毒感染5龄起家蚕幼虫，4-5d后收获蚕血淋巴其中含有大量扩增的重组病毒。
将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，再用15×104g离心3h，去除上清，沉淀用适量PBS重悬获得初步纯化的重组杆状病毒的病毒粒子，这里一般10mL蚕血的重组病毒离心后用2mLPBS重悬，重悬后重组病毒量约为2.5×1012PFU/ML(约为5×1012viral genomes(vg)/mL，病毒拷贝数利用BmNPV病毒DNA骨架序列引物，GJ-1F(CGAACGGAGACGATGGATGTGG)和GJ-1R(GTGCCGAGCGATTGTAAGGGATC)通过荧光定量PCR计算。
3重组病毒在哺乳动物细胞中表达
采用VERO细胞作为基因呈递的目标，将重组病毒Bm-CAG H9 HA-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAG H5 HA-Ferritin-C-O-M6各取100MOI的病毒来进行研究。方法步骤如下：
1)在六孔板中接种上VERO细胞(1×106cell/well)，37℃贴壁培养8-12h
2)取1×108PFU纯化后的重组病毒Bm-CAG H9 HA-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAG H5HA-Ferritin-C-O-M6加到六孔板的细胞中，37℃孵育1h
3)孵育后去掉含有病毒的培养基，换上正常的DMEM含血清培养基，42小时左右处理细胞，收集表达产物，血凝检测效价1：800。
4动物试验
4.1将H9 HA-Ferritin-C-O-M6和H5 HA-Ferritin-C-O-M6表达产物注射动物
将分析得出的最优序列H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达所得蚕蛹，按照29-10HA单位/羽的量来注射动物，制备250羽份/g和160羽份/g蚕蛹的疫苗。
制备方法为：分别称取10g表达H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒抗原的蚕蛹，加入90ml PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。母液先放在冰上，与佐剂混合时，先在15ml离心管中加佐剂3ml，慢慢滴加母液3ml，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星，使用量为30～50mg/1kg鸡体重。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。
将分析得出的最优序列H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在AcBacmid-昆虫细胞真核表达系统中表达所得细胞沉淀，按照29-10HA单位/羽的量来注射动物。
制备方法：昆虫细胞表达的抗原按测定的制备疫苗所需的血凝单位的细胞沉淀量经超声破碎后，混合相应的佐剂而成。
按中华人民共和国兽药典(2010版，中国农业出版社)的方法进行，取21日龄的SPF鸡70只，各10只颈背部分别皮下注射H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达产物制备的疫苗1羽份(0.2ml)。各10只每只颈背部分别皮下注射H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达产物制备的疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹制备的疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种传统疫苗株为阳性对照。接种21日后，采用翅下静脉采血，采2ml左右，放试管中倾斜放置，37℃静置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，用禽流感病毒(H9亚型)抗原测定HI抗体。阴性蚕蛹免疫组和正常对照组的HI效价均应不高于1：4，传统疫苗株的HI效价均为：1：64-128，而H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达样品组的HI效价为1：256和1:200以上。H9 HA-Ferritin-C-O-M6、H5 HA-Ferritin-C-O-M6在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达样品组的HI效价为1：128和1：100以上。
4.2利用重组病毒向小鼠和鸡体内呈递外源基因
4.2.1向小鼠体内呈递H9 HA-Ferritin-C-O-M6基因
纯化的重组病毒Bm-CAG H9 HA-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(1×1010vg/只)和灌注(1×1010vg/只)的方式送入小鼠体内，小鼠体重约为25g。分别在第5d、11d、17d、21d收集小鼠血清，检测抗体效价。
4.2.2向小鼠体内呈递H5 HA-Ferritin-C-O-M6基因
纯化的重组病毒Bm-CAG H5 HA-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(1×1010vg/只)和灌注(1×1010vg/只)的方式送入小鼠体内，小鼠体重约为25g。分别在第5d、11d、17d、21d收集小鼠血清，检测抗体效价。
4.2.3向鸡体内呈递H9 HA-Ferritin-C-O-M6基因
与小鼠的处理方式类似，纯化的重组病毒Bm-CAG H9 HA-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(3×1010vg/羽)和灌注(6×1010vg/羽)的方式送入15日龄鸡体内，鸡体重约为150g。分别在第5d、11d、17d、21d收集鸡血清，检测抗体效价。
4.2.4向鸡体内呈递H5 HA-Ferritin-C-O-M6鸡血清基因
纯化的重组病毒Bm-CAG H5 HA-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(3×1010vg/羽)和灌注(6×1010vg/羽)的方式送入15日龄鸡体内，鸡体重约为150g。分别在第5d、11d、17d、21d收集鸡血清，检测抗体效价。
5中和抗体效价
具体实验步骤见上，21天时的中和抗体效价为最高，具体结果见(表15)。
表15 H9 HA-Ferritin-C-O-M6和H5 HA-Ferritin-C-O-M6小鼠和鸡血清中和抗体效价(21天)
组成 效价
健康蚕蛹对照(鸡) 1：4
传统疫苗(鸡) 1：512
健康蚕蛹对照(小鼠) 1：4
传统疫苗(小鼠) 1：256
HHA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清 1：2048
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清 1：1600
H9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>鸡血清 1：3200
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>鸡血清 1：3200
从表15中的数据可以看出，融合蛋白氨基酸多位点突变后的突变体呈递给小鼠和鸡中所产生的抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗高。
6血凝抑制
具体步骤见实施例四，以21天的结果为最好，结果见表16。
表16 H9 HA-Ferritin-C-O-M6和H5 HA-Ferritin-C-O-M6小鼠和鸡血清血凝抑制效价
组成 效价
健康蚕蛹对照(鸡) 1：4
传统疫苗(鸡) 1：128
健康蚕蛹对照(小鼠) 1：4
传统疫苗(小鼠) 1：128
H9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清 1：160
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清 1：160
H9 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>鸡血清 1：256
H5 HA-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>鸡血清 1：256
从表16中的数据可以看出，融合蛋白氨基酸多位点突变后的突变体呈递给小鼠和鸡中所产生的抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗高。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法
<130> BJ-2002-190327A
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 1
Met Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys
1 5 10 15
Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr
20 25 30
Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala
35 40 45
Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn
50 55 60
Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe
65 70 75 80
Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His
85 90 95
Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp Ala Ile Lys Ser Lys Asp
100 105 110
His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu
115 120 125
Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly
130 135 140
Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile
145 150 155 160
Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165
<210> 2
<211> 510
<212> DNA
<213> Helicobacter pylori
<400> 2
atgtccggtg gcgacatcat caagctgctg aacgaacagg tgaacaagga gatgcagtcc 60
agcaacctgt acatgtctat gtcttcatgg tgctacaccc actcactgga cggagctggt 120
ctgttcctgt tcgaccacgc tgccgaggaa tacgaacacg ccaagaagct gatcatcttc 180
ctgaacgaga acaacgtgcc tgtccagctg acctccatca gcgctcccga acacaagttc 240
gagggtctga ctcaaatctt ccagaaggcc tacgaacacg agcagcacat ctctgaatca 300
atcaacaaca tcgtggacca cgctatcaag agcaaggacc acgccacttt caacttcctg 360
caatggtacg tggctgagca gcacgaggaa gaggtcctgt tcaaggacat cctggacaag 420
atcgaactga tcggcaacga gaaccacgga ctgtacctgg ctgaccagta cgtcaagggc 480
atcgccaagt cccgcaagag ctaagaattc 510
<210> 3
<211> 560
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 3
Met Glu Thr Ala Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu
50 55 60
Gly Gln Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Ile Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Lys Ser
115 120 125
Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr
130 135 140
Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Ala Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asn Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asn Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Phe Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Leu Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 4
<211> 1742
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 4
agcaaaagca ggggaatttc ataaccactc aaaatggaga cagcatcact gataactata 60
ctactagtag taacaggaag cagtgcagat aagatctgca tcggctatca atcaacaaac 120
tccacagaaa ctgtagacac actaacagaa aacaatgtcc ctgtgacaca tgccaaagaa 180
ttgctccaca cagagcataa tgggatgctg tgtgcaacaa gcttgggaca acctcttatt 240
ctagacactt gtaccattga aggactaatc tatggcaatc cttcttgtga tatattgttg 300
ggaggaagag aatggtccta tatcgtcgag agaccatcag ctgttaacgg attgtgttat 360
cccgggaatg tagaaaatct agaagagcta aggtcactct ttagttctgc taagtcttat 420
caaaggatcc agattttccc agacacaatc tggaatgtgt cttatagtgg gacaagcaag 480
gcatgttcgg attcattcta cagaagcatg agatggttga ctcaaaagaa caacgcttac 540
cctattcaag acgcccaata cacaaataat caagaaaaga acattctttt catgtggggc 600
ataaatcacc cacccactga cactgcacag acaaatctgt acacaagaac cgacacaaca 660
acgagtgtgg caacagaaga aataaatagg accttcaaac cattgatagg accaaggcct 720
cttgtcaacg gtttgatggg aagaattaat tattattggt cagtattaaa accgggtcaa 780
acactgcgaa taaaatctaa tggaaatcta atagctccat ggtatggaca cattctttca 840
ggagagagcc acgggagaat cctgaagact gacttaaaaa gaggtagctg cacagtgcaa 900
tgtcagacag agaagggtgg cttaaacaca acattgccat tccaaaatgt gagtaagtat 960
gcatttggaa actgctcaaa atacattggc ataaagagtc tcaaacttgc agttggtctg 1020
aggaatgtac cttctagatc cagtagagga ctattcgggg ccatagcagg attcatagag 1080
ggaggttggt caggactagt tgctggttgg tatgggttcc agcattcaaa taaccaaggg 1140
gttggtatgg cagcagatag ggactcaacc caaaaggcaa ttgataaaat aacatccaaa 1200
gtgaataaca tagtagacaa aatgaacaag cagtatgaaa ttatcgatca tgaattcagc 1260
gagtttgaaa ctagacttaa catgattaac aataagattg acgatcaaat cctggatata 1320
tgggcatata atgcagaatt gctagttctg cttgaaaacc agaaaacact cgatgagcat 1380
gatgcaaatg taaacaattt gtacaataaa gtgaagaggg cattgggttc caatgcggtg 1440
gaagatggga aaggatgttt cgagctatac cacaaatgtg atgaccaatg catggagaca 1500
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ct 1742
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Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr
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Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn
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Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
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Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
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Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
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Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
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Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
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Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe
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Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu
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Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
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Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
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Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly
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Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
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Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
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Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
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Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
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Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Met
530 535 540
Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
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Arg Ile Cys Ile Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln
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Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile
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Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile
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<213> Artifical sequence
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130 135 140
Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile His Gln
180 185 190
Pro Pro Thr Glu Thr Val Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Ala Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asn Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Ser Gly Gly Asp
515 520 525
Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser
530 535 540
Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp
545 550 555 560
Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His
565 570 575
Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln
580 585 590
Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln
595 600 605
Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile
610 615 620
Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe
625 630 635 640
Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu
645 650 655
Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His
660 665 670
Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg
675 680 685
Lys Ser
690
<210> 24
<211> 2073
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 24
atggaagtag taagtctgat aaccattctg ctcgtcgtca ccgtctcaaa cgctgataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc cacaaatagc actgaaaccg tggacacgct gacagagagt 120
gatgtgccgg ttactcacac caaagaactg ttgcacaccg agcataacgg tatgctctgc 180
gccactggtt taggacatcc tcttatcctg gacacttgca ccatcgaagg tttaatttac 240
ggaaacccat cctgtgatct cttacttggt ggacgtgaat ggtcatacat tgtggagagg 300
ccttctgctg ttaatggact ttgctatcca ggcaacgtcg agaatttaga agagcttcgc 360
agcctgttct catctgccag atcctaccaa agaatccaaa tcttccctga cacaatatgg 420
aacgtaacgt acagcggtac atccaaagct tgttcagatt ctttctatag atcaatgcgc 480
tggctcactc aaaagaacaa tgcttaccca atccaagatg cccagtatac caacaatcag 540
gaaaagaaca tcctttttat gtggggaatt caccaacctc caacggaaac agtccaaact 600
aatctgtaca ctcgtaccga tacaactacc tctgtagcca cggaagagat aaaccgtaca 660
ttcaaacctt taatcggccc gaggcccttg gtgaatggtc tccaaggaag aattgactac 720
tattggtcgg ttcttaagcc gggtcagacg ctgcgtataa ggagtaacgg aaatttaatc 780
gctccctggt acggccacat tctttcgggc gaaagtcatg gtagaatatt aaagaccgat 840
cttaagcgcg gcagctgcac ggtccaatgt cagacagaga agggcggtct gaacacgaca 900
ttgccgttcc agaatgtatc caaatacgca tttggtaact gctcgaagta tattggtatc 960
aaaagtttga agctcgcggt gggactcaga aatgttccct cgcgtagctc caggggctta 1020
ttcggtgcaa tagcgggttt tatcgaagga ggctggtcag gactcgtggc aggatggtac 1080
ggcttccaac actctaacga ccagggcgtt ggtatggctg ccgacaggga ttcaacgcaa 1140
aaagccatcg ataagataac atctaaggtc aacaacatag tagacaaaat gaacaagcag 1200
tacgaaatca ttgatcatga gttttcagaa gtggaggcta gactgaacat gatcaacaac 1260
aaaatcgacg atcaaataca ggacatctgg gcttataacg ccgaactgtt ggttctctta 1320
gagaatcaaa agaccttgga cgaacacgat gctaacgtca acaacttgta caacaaagta 1380
aagagagcac tcggatcgaa cgcggtggaa gacggaaaag gctgtttcga gttgtatcat 1440
aagtgcgata atcagtgtat ggaaactatt cgcaacggca cctacaatag acgcaaatat 1500
caagaagaga gtaagctcga acgtcagaaa atagagggcg ttaagctgga aagcgagggt 1560
acatacaaga tttccggtgg cgacatcatc aagctgctga acgaacaggt gaacaaggag 1620
atgcagtcca gcaacctgta catgtctatg tcttcatggt gctacaccca ctcactggac 1680
ggagctggtc tgttcctgtt cgaccacgct gccgaggaat acgaacacgc caagaagctg 1740
atcatcttcc tgaacgagaa caacgtgcct gtccagctga cctccatcag cgctcccgaa 1800
cacaagttcg agggtctgac tcaaatcttc cagaaggcct acgaacacga gcagcacatc 1860
tctgaatcaa tcaacaacat cgtggaccac gctatcaaga gcaaggacca cgccactttc 1920
aacttcctgc aatggtacgt ggctgagcag cacgaggaag aggtcctgtt caaggacatc 1980
ctggacaaga tcgaactgat cggcaacgag aaccacggac tgtacctggc tgaccagtac 2040
gtcaagggca tcgccaagtc ccgcaagagc taa 2073
<210> 25
<211> 730
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 25
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Ile Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Arg Thr His Asn Gly Arg Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Pro Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Asn Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Met Trp
180 185 190
Trp Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Val Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
370 375 380
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
405 410 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
450 455 460
Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
485 490 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg
500 505 510
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile
515 520 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Met
530 535 540
Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln
565 570 575
Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser
580 585 590
Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp
595 600 605
His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu
610 615 620
Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu
625 630 635 640
His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His
645 650 655
Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile
660 665 670
Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala
675 680 685
Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile
690 695 700
Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr
705 710 715 720
Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
725 730
<210> 26
<211> 2193
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 26
atggaaaaaa tcgtgctgct gttcgcaatc gtgagcctgg tgaagagtga ccatatctgt 60
atcgggtatc atgctaataa ttctactgaa caggtggata ccattatgga gaagaacatt 120
actgtgaccc acgctcagga catcctggag cgcacacata acggccgcct gtgcgatctg 180
aatggagtga aacccctgat cctgaaggac tgctcagtgg caggctggct gctgggaaac 240
cccatgtgtg atgagttcat caatgtgcct gaatggtcct acattgtgga gaaagccaac 300
cctgctaatg atctgtgcta cccaggcaac ttcaatgact atgaggaact gaagcacctg 360
ctgtccagaa tcaaccattt cgaaaagatc cagatcattc ccaaggattc ttggcctgac 420
cacgaggcct cactgggtgt gagtgccgct tgtccatacc agggaaacag ctccttcttt 480
aggaatgtgg tgtggctgat taagaaagac aacgcttacc ccactatcaa gaaatcttac 540
aacaacacca accaggagga tctgctgatt agttggtgga tccaccatcc aaacgacgag 600
gcagaacaga cacgcctgta ccagaatccc accacatatg tgagcattgg gacatccact 660
ctgaaccagc gcctggtgcc taaaatcgca actcggtcca aggtgaacgg ccagtctgga 720
cggatcgatt tcttttggac cattctgaag cctaacgacg ccatcaattt cgaatccaac 780
ggcaatttta tcgcaccaga gtacgcctac aagatcgtga agaaaggaga ttctactatc 840
atgaagtcag aggtggaata cgggaactgc aatacccgct gtcagacacc aatcggtgcc 900
attaactctt caatgccatt tcacaatatc catcccctga caattgggga gtgccccaag 960
tatgtgaaaa gcaacaagct ggtgctggct actggtctga gaaacagccc tcagagggag 1020
ggtaggggtc tgttcggggc tatcgcaggt tttattgagg gcggatggca gggaatggtg 1080
gatgggtggt acggttatca ccatagtaac gaacagggca gcggatacgc agccgataaa 1140
gagagtacac agaaggccat tgacggagtg actaacaaag tgaatagcat cattgacaag 1200
atgaacaccc agttcgaggc tgtggggagg gaatttaaca atctggagag aaggatcgaa 1260
aacctgaata agaaaatgga agatggcttc ctggacgtgt ggacctacaa cgcagagctg 1320
ctggtgctga tggagaatga aagaacactg gattttcacg acagcaacgt gaaaaatctg 1380
tatgataaag tgaggctcca gctgaaagac aacgccaagg aactggggaa tggttgtttc 1440
gagttttacc ataagtgcga taacgagtgt atggaatctg tgagaaatgg cacttacgac 1500
tatcctcagt attcagagga agctagactg aaaagggagg aaatttcagg ggtgaagctg 1560
gagagtatcg gtatttacca gatcctgtcc atttattcta ccgtggctag tagcctggtg 1620
ctggcaatca tgatggctgg gctgtccctg tggatgtgta gcaatggaag tctccagtgt 1680
cggatttgta tctccggtgg cgacatcatc aagctgctga acgaacaggt gaacaaggag 1740
atgcagtcca gcaacctgta catgtctatg tcttcatggt gctacaccca ctcactggac 1800
ggagctggtc tgttcctgtt cgaccacgct gccgaggaat acgaacacgc caagaagctg 1860
atcatcttcc tgaacgagaa caacgtgcct gtccagctga cctccatcag cgctcccgaa 1920
cacaagttcg agggtctgac tcaaatcttc cagaaggcct acgaacacga gcagcacatc 1980
tctgaatcaa tcaacaacat cgtggaccac gctatcaaga gcaaggacca cgccactttc 2040
aacttcctgc aatggtacgt ggctgagcag cacgaggaag aggtcctgtt caaggacatc 2100
ctggacaaga tcgaactgat cggcaacgag aaccacggac tgtacctggc tgaccagtac 2160
gtcaagggca tcgccaagtc ccgcaagagc taa 2193

Claims (5)

1.一种包含融合蛋白的同感序列的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示，所述融合蛋白的同感序列的氨基酸序列选自以下（1）-（4）中的任何一种：
（1）氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示；
（2）将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S、N41D、A47T、N191H、H192Q或D196E中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体；
（3）将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S-N41D、N41D-A47T或A47T-H192Q中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；
（4）将SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列按照N40S-N41D-A47T-N191H-H192Q-D196E氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体，所述多位点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.23所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示。
2.权利要求1所述的纳米抗原颗粒在制备流感疫苗中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，包括：将权利要求1所述的融合蛋白的同感序列的编码基因在大肠杆菌原核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者，将权利要求1所述的融合蛋白的同感序列的编码基因在家蚕表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者将权利要求1所述的融合蛋白的同感序列的编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者，将权利要求1所述的融合蛋白的同感序列的编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中得到重组杆状病毒；将重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，将所述的融合蛋白的同感序列的编码基因构建到家蚕杆状表达载体中并制备得到重组家蚕杆状病毒；将重组家蚕杆状病毒在家蚕或蚕蛹中进行表达；
或者将融合蛋白的同感序列的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒在昆虫细胞或昆虫宿主中表达相应的抗原，纯化，即得。
5.一种流感疫苗，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的纳米抗原颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
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