CN112442130B - 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用 - Google Patents

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用。本发明将狂犬病毒G抗原蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基融合得到融合蛋白。本发明还将狂犬病毒G抗原蛋白进行部位位点突变，所得到的突变体的可溶性表达量和表达效率提升显著。本发明利用原核表达系统、家蚕及AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统表达重组蛋白或通过重组杆状病毒在脊椎动物体内进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明所提供的狂犬疫苗通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示抗原蛋白，引起广泛中和性抗狂犬病毒抗体，提高了免疫效力并扩大了免疫范围，具有交叉免疫效力的通用疫苗潜力。本发明疫苗制备方法安全、简便，适合进行快速大规模生产。

Description

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和 应用
技术领域
本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由狂犬病毒G抗原蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的狂犬疫苗，属于狂犬疫苗的制备和应用领域。
背景技术
狂犬病(rabies)是狂犬病毒所致的急性传染病，人兽共患，多见于犬、狼、猫等肉食动物，人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。因恐水症状比较突出，故本病又名恐水症(hydrophobia)。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，单股RNA病毒，动物通过互相间的撕咬而传播病毒。中国的狂犬病主要由犬传播，家犬可以成为无症状携带者，所以表面“健康”的犬对人的健康危害很大。对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率几近100％，患者一般于3～6日内死于呼吸或循环衰竭，故应加强预防措施。狂犬病毒含5种蛋白，即糖蛋白(G)、核蛋白(N)、聚合酶(L)、磷蛋白(NS)及基质(M)等。狂犬病病毒的糖蛋白能与乙酰胆碱结合，决定了狂犬病毒的噬神经性，即常选用G抗原来制备狂犬疫苗选。传染源主要为病犬、其次为病猫及病狼等。人被患病动物咬伤后，动物唾液中的病毒通过伤口进入人体而引发疾病，少数患者也可因眼结膜被病兽唾液污染而患病。针对疾病最好的治疗方案莫过于防患未然，而针对各种疾病的疫苗正式发挥预防作用的主力军。传统的疫苗多为减毒活疫苗，包括天然减毒株和基因重组弱毒株等。应用减毒株疫苗的最大缺陷是减毒株在易感群体中有恢复毒力作用的风险。因此，生产安全、高效及廉价的基因工程疫苗成为新的需求。
空腔铁蛋白是自然界中普遍存在的一种具有球形空腔结构的天然纳米级蛋白，其内径为8nm，外径为12nm。整个球形空腔由24个亚基高度有序自组装而成，并且通过适当改变溶液pH值，可实现其亚基的解离与重新组装。随着纳米技术的发展，空腔铁蛋白已在纳米材料的仿生合成中显示出得天独厚的优势，并具有十分广阔的应用前景。可利用空腔铁蛋白亚基解离与重新组装的性质，将抗原蛋白融合表达在空腔铁蛋白表面，且能显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，形成一种新型的纳米疫苗表达平台。
利用24个亚基自组装而成的铁蛋白纳米粒子作为抗原呈递和疫苗开发平台，研制一种狂犬疫苗，对于狂犬病的防治将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种包含狂犬病毒G抗原蛋白的融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；
本发明的目的之二是将所述融合蛋白进行部位位点突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；
本发明的目的之三是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的狂犬疫苗；
本发明目的之四提供高效表达所述融合蛋白的方法；
本发明目的之五是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与狂犬病毒G抗原蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先提供了一种包含狂犬病毒G抗原蛋白的融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由狂犬病毒G抗原蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到；优选的，将狂犬病毒G抗原蛋白的C端和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到原始融合蛋白。
所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其氨基酸序列为NCBI上GenBank序列号为WP_000949190所示的序列。
所述狂犬病毒G抗原蛋白是将狂犬病毒G抗原蛋白的前19位信号肽去掉后的胞外结构域；优选的，所述的狂犬病毒G抗原蛋白的氨基酸序列为GenBank登录号为GU123635.1所示的序列。
本发明为了提高狂犬病毒G抗原蛋白与铁蛋白单体连接后得到的融合蛋白的表达量，本发明进一步将所示的融合蛋白的同感序列进行突变优化，并在序列优化之后进行糖基化位点分析，以消除糖基化位点来增加可溶性表达。从而在同感序列优化之后进行氨基酸单位点突变，双位点突变和多位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率：
具体的，本发明人通过分析了20条最近年份，流行于不同地区的狂犬病毒G抗原蛋白氨基酸序列进行比对分析，找出一条最为通用的同感序列，作为相应毒株的抗原基因，以期取得最佳的保护效果；在此基础上，本发明进一步利用OptimumGeneTM技术对狂犬病毒G抗原蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的G抗原蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。此外，为了提高铁蛋白的表达量，同时提高可溶表达，对铁蛋白单体亚基进行点突变N19Q。最终，本发明将原始融合蛋白的同感序列SEQ ID NO.2按照上述优化方式得到优化序列的核苷酸为SEQ ID NO.3所示。
本发明将优化后的同感序列在家蚕表达系统中进行表达，根据基因表达产物ELISA效价结果可见，密码子优化后的同感序列的表达量相比优化前有了显著提高。
本发明获得了RV G-Ferritin-C突变体，以RV G-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N、L57M、V75H、G82S、T99P、R126M、Y135Q、R142H、L168T、G175D、N201P、V229E、V260K、P273F、E294K、E300L、K313F、I358V、I392S或A419T的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体。
本发明所述氨基酸单位点突变“W33N”表示将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第33位氨基酸由W突变成N；其余的单位点突变的表述依此类推。
本发明将突变后的这些单位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N、V75H、T99P、R142H、L168T或K313F的氨基酸单位点突变方式获得的这6个突变体的表达产物的效价呈显著提升；其中，将SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列按照V75H氨基酸单位点突变获得的突变体的效价提升最为显著；基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高RV G-Ferritin-C-O-M突变体表达量的目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构并决定着蛋白质的高级结构，且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明进一步进行氨基酸双位点突变。
在单位点突变的基础上，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N-V75H、W33N-T99P、W33N-R142H、W33N-L168T、W33N-K313F、V75H-T99P、V75H-R142H、V75H-L168T、V75H-K313F、T99P-R142H、T99P-L168T、T99P-K313F、R142H-L168T、R142H-K313F或L168T-K313F双位点突变方式获得双位点突变体的表达产物的效价明显提升；其中，其中将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照W33N-V75H、V75H-T99P、L168T-K313F中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体的表达产物的效价呈显著提高；其中，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照W33N-V75H氨基酸双位点突变获得的双位点突变体的效价提升最为显著。
本发明所述氨基酸双位点突变“W33N-V75H”表示将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第33位氨基酸由W突变成N以及将第75位氨基酸由Y突变成H；其余的双位点突变的表述依此类推。
鉴于部分双位点突变能够有效提升表达量后效价，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，本发明进一步尝试进行氨基酸多位点突变。本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是基于上述获得有效的双位点突变序列的基础之上，通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，具体突变方式如下：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N-V75H-T99P-R142H-L168T-K313F氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体。
本发明所述氨基酸多位点突变“W33N-V75H-T99P-R142H-L168T-K313F”表示将SEQID NO.1所示的氨基酸序列同时进行下述突变：将第33位的氨基酸由W突变为N，将第75位的氨基酸由Y突变为H，将第99位的氨基酸由T突变为P，将第142位的氨基酸由R突变为H，将第168位的氨基酸由L突变为T以及将第313位的氨基酸由K突变为F。
本发明将获得的多位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：所得的多位点突变体的表达量相比上述单突变体、双突变体的表达量均有显著提升。本发明进一步将多位点突变体在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
本发明将获得的多位点突变体编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构建得到呈递基因的重组杆状病毒；将重组杆状病毒呈递给小鼠，结果发现小鼠所产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统疫苗。
因此，本发明所提供的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒能应用于制备狂犬疫苗，其应用方法包括：
(Ⅰ)将所述的融合蛋白编码基因采用原核表达系统在原核细胞中进行表达得到纳米抗原颗粒，将所表达的纳米抗原颗粒产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂和载体拼接在一起得到狂犬病毒疫苗；
作为参考，采用大肠杆菌原核表达系统表达纳米抗原颗粒的步骤包括：
(1)将融合蛋白原始序列或突变优化后的融合蛋白序列克隆到表达载体pET28a上，得到重组质粒pET28a-RV G-Ferritin；
(2)将重组质粒pET28a-RV G-Ferritin转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达，随后经过镍柱纯化，即得。
(Ⅱ)将所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达，将所表达的抗原产物纯化后后与医学上可接受的免疫佐剂和载体拼接在一起得到狂犬疫苗。
作为参考，所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达的方法包括以下步骤：
(1)分别将融合蛋白RV G-Ferritin或经过突变优化的融合蛋白基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；
(2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得。
(Ⅲ)还可将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒；所得到的重组病毒通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并诱导动物产生抗体。
本发明进一步提供了一种防治狂犬病毒的疫苗，包括：预防或治疗上有效量的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及药学上可接受的载体。
本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋载体配制。它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖、和明胶及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC、和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒和乳液。疫苗还可以佐剂配制，以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、核酸诸如CpG和聚I:C、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐诸如铝盐和磷酸钙、乳剂诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。
本发明的狂犬疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口服。
本发明所提供的疫苗能通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示狂犬病毒G抗原蛋白结构，从而能够引起广泛中和性狂犬病毒抗体。此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力，还增加了免疫范围，能免疫不同年份同型以及异型狂犬病毒。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌和家蚕真核表达系统、家蚕杆状病毒和AcNPV-昆虫细胞表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统制备狂犬疫苗方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；
2、本发明提供的纳米狂犬疫苗可以诱导具有广谱性质的狂犬抗体，为制备一种通用狂犬疫苗打下基础。
3、本发明提供的纳米狂犬疫苗，用这种纳米狂犬疫苗免疫接种动物而诱导产生的抗狂犬抗体水平明显比传统疫苗的高。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
词语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。
术语“抗原性”是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力；术语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力；术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答；术语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物；术语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护；术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1 RV G-Ferritin在原核表达系统中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为Marker；1-7为RV G-Ferritin原核表达样品；空载为pET-28a载体的原核表达样品；未诱导为未诱导的原核表达样品。
图2 RV G-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物Western blotting检测图；A为RV G-Ferritin-C-O-M6家蚕表达产物；B为阴性对照。
图3 RV G-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物的电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、转移载体pVL1393、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；
(2)铁蛋白序列和狂犬病毒G抗原蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到原核表达载体pUC57载体上。
(3)酶与试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K PlusⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；铁蛋白一抗为本实验室提供；
(4)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；Ni-NTA Agarose、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。
(5)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司。
(6)狂犬病毒G抗原蛋白与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。
2、实验方法中用于定点突变的融合PCR方法
参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
实施例1 RV G-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。
2狂犬病毒G抗原蛋白基因序列和铁蛋白基因序列的合成。
为了使狂犬病毒G抗原蛋白与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)对RV G狂犬病毒G抗原蛋白的氨基酸序列进行分析，得出狂犬病毒G抗原蛋白其信号肽为前19个氨基酸，并去掉1-19位氨基酸，其胞外结构域为前458个氨基酸。
为了促进狂犬病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率，并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)，以消除糖基化位点。其中狂犬病毒G抗原蛋白序列与铁蛋白序列之间由一段连接肽连接(SGG)，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。
为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。
将目的基因序列去掉信号肽，利用pET-28a(+)载体上的ATG进行起始起始翻译。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到原核载体pET-28a(+)上。
将上述所设计的狂犬病毒G抗原基因序列和铁蛋白序列人工合成。
3狂犬病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建
3.1狂犬病毒和铁蛋白融合蛋白的PCR扩增
用融合PCR技术将狂犬病毒和铁蛋白融合在一起。具体实验方法见上述实验方法2。
3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增
PCR扩增RV G胞外域序列：以质粒pUC57-RV G为模板
F1 5’-ATGATTCCTCAGGTGCTCCT-3’
R1 5’-AGCAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACTTGCCCCAGCTTGGCA-3’
PCR扩增RV G胞外域序列：以质粒pUC57-RV G-Ferritin为模板,’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F2 5’-TGCCAAGCTGGGGCAAGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTGCT-3’
R2 5’-TTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物RV G和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出RV G-Ferritin
F1 5’-ATGATTCCTCAGGTGCTCCT-3’
R2 5’-TTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
3.1.2家蚕表达系统中表达质粒的PCR扩增
PCR扩增RV G胞外域序列：以质粒pUC57-RV G为模板
F3 5’-AACATGATTCCTCAGGTGCTCCT-3’
R3 5’-AGCAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACTTGCCCCAGCTTGGCA-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，
F4 5’-TGCCAAGCTGGGGCAAGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTGCT-3’
R4 5’-TTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
以PCR产物RV G和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出RV G-Ferritin
F3 5’-CAACATGATTCCTCAGGTGCTCCT-3’
R4 5’-TTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3’
PCR反应体系为表1：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002183069420000071
PCR参数设置：
Figure BDA0002183069420000072
3.2玻璃奶纯化回收DNA片段
配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。
3.3目的基因PCR产物酶切处理
将PCR产物跑胶，胶回收正确的产物用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段RV G-Ferritin。酶切体系如下表2所示：
表2酶切体系
Figure BDA0002183069420000073
Figure BDA0002183069420000081
3.4感受态细胞的小量制备
制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。
3.5目的基因与pET-28a(+)载体和pVL1393载体的连接与转化
3.5.1酶切处理pET-28a(+)和pVL1393载体
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对转移载体pVL1393和pET-28a(+)进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。
3.5.2连接
酶切回收的目的片段与经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切处理后的转移载体pVL1393和pET-28a(+)的连接。用T4DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下表3所示：
表3连接体系
Figure BDA0002183069420000082
3.5.3转化
取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。
3.6核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。
3.7 SDS碱裂解法提取质粒DNA
收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。
3.8阳性克隆的酶切与测序鉴定
酶切体系如下表4所示：
表4酶切体系
Figure BDA0002183069420000083
Figure BDA0002183069420000091
37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-RV G-Ferritin、pVL1393-RV G-Ferritin。
4重组质粒的表达与纯化
4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-RV G-Ferritin转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-RV G-Ferritin在约74kD处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导6h和诱导8h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有少量目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-RV G-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在。聚丙烯凝胶电泳图如图1所示。
4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理
将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH2O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100μL裂解液/mL菌液，冰浴30min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；沉淀用适量包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ重悬并洗涤，弃上清；用适量脲NTA-0 Buffer重悬沉淀，4℃，过夜溶解。
4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白
取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示在25mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，观察大小正确，条带单一的蛋白带，纯化后的蛋白含量为5mg/mL。
4.4多克隆抗体的制备
将纯化后的His-Ferritin蛋白定量后收集1.5mg蛋白，经SDS-PAGE电泳后切下含有目的蛋白的凝胶，尽量切碎，37℃烘干后研磨成粉末，用生理盐水将抗原蛋白稀释到2倍最终浓度，充分混合佐剂，无菌条件下取出所需用量与抗原蛋白按体积比1：1迅速混匀，通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，两免之后收集全部血清，测定血清的抗体效价。
5重组质粒在家蚕真核表达系统中表达与纯化
5.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。
5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBcmid DNA(专利号为：ZL201110142492.4)，2μg重组转移质粒pVL1393-RV G-Ferritin和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)。
5.3重组病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)。
5.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。
取上述病毒基因组DNA11μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
5.5 RV G-Ferritin在家蚕体和蚕蛹中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfurBmBacmid(PPH-RV G-Ferritin)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行ELISA法检测。
5.6 RV G-Ferritin类病毒颗粒的收集与纯化
将含表达有目的基因的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×105g超高速离心2h。用含0.1M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成类病毒颗粒，而且还建立了相应的家蚕表达基因工程类病毒颗粒抗原的纯化方法。
6 Western blotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin、His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释，实验室自制)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到70kDa(RV G-Ferritin)大小的特异性条带。
7 ELISA检测
将待检蚕血淋巴样品用包被液适度倍比稀释，另设亲本病毒感染的蚕血样品做阴性对照，只加包被液作为空白对照，每孔加100μL于酶标板中，4℃过夜。快速弃掉孔内液体，用PBST洗3次。每孔加300μL3％BSA封闭液，37℃作用3h，用PBST洗涤3次。将实验室自制His-Ferritin多克隆抗体稀释1：1000，每孔加100μL，37℃作用1.5h，用PBST洗4次。每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠(1：5000)，37℃温育45～60min，用PBST洗涤4次。再加入新鲜配置的OPD(邻苯二胺)显色液100μL，室温，暗处显色10～30min。于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。在酶标仪上用492nm处波长测定OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明RV G-Ferritin基因表达产物ELISA效价可达1：64。
表1为RV G-Ferritin原始基因序列表达产物所测的效价实验数据，结果表明RVG-Ferritin基因表达产物ELISA效价可达1：64。
表1 RV G-Ferritin原始序列表达产物ELISA效价
组别 效价
RV G-Ferritin 1：64
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
实施例2 RV G-Ferritin原始序列进行同感序列设计以及优化后的纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
具体溶液和培养基的配置方法见实施例1。
2狂犬病毒G蛋白保守序列的基因获取
本发明将实施例1中狂犬病毒G蛋白原始氨基酸序列和从NCBI上获取的其他20条RV G蛋白氨基酸序列进行比对，得到一条同感序列。将此同感序列进行优化，进一步利用OptimumGeneTM技术对RV G蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的RV G蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据家蚕密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。将同感序列命名为RV G-Ferritin-C(SEQ ID NO.1)、同感序列优化后的序列命名为RV G-Ferritin-C-O(SEQ ID NO.3)，优化过程见实施例1。
3融合蛋白的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
RV G-Ferritin-C-O融合PCR引物：
狂犬病毒G抗原胞外域PCR引物：
F5:5’-CGGGATCCAACATGAAGTTTCCTATCTATAC-3’
R5:5’-CAAAACTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTGCTGAACG-3’
Ferritin PCR引物：
F6：5’-CAAAACTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTGCTGAACG-3’
R6：5’-CTCCGTCCGGATTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
Over-lapPCR引物：
F5：5’-CAAAACTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTGCTGAACG-3’
R6：5’-CTCCGTCCGGATTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
4重组质粒pVL1393-RV G-Ferritin-C、pVL1393-RV G--Ferritin-C-O在家蚕表达系统中表达与纯化
具体实验方法见实施例1。
5 ELISA检测
具体实验方法见实施例1。
6结果鉴定
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，结果表明RV G-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价可达1：256。
从表2的效价检测结果可见，RV G-Ferritin-C基因表达产物ELISA效价可达1：128，RV G-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价可达1：256。密码子优化后的同感序列的表达量有了很大的提高，说明本实施例的改造和优化工作是成功的。
表2 RV G-Ferritin-C、RV G-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价
组别 效价
RV G-Ferritin 1：64
RV G-Ferritin-C 1：128
RV G-Ferritin-C-O 1：256
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
实施例3 RV G-Ferritin-C-O突变体进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变后的纳米颗粒疫苗制备与效力检测
1实验方法
1.1 RV G-Ferritin-C-O氨基酸序列单位点、双位点、多位点突变体基因的构建
基于实施例2的结果，本发明获得了RV G-Ferritin-C突变体，以RV G-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，融合PCR的方法见实施例1。
突变位点分别为RV G：W33N、L57M、V75H、G82S、T99P、R126M、Y135Q、R142H、L168T、G175D、N201P、V229E、V260K、P273F、E294K、E300L、K313F、I358V、I392S、A419T。所得突变体命名为RV G-Ferritin-C-O-M(W33N、L57M、V75H、G82S、T99P、R126M、Y135Q、R142H、L168T、G175D、N201P、V229E、V260K、P273F、E294K、E300L、K313F、I358V、I392S、A419T)。
在此基础上，本发明将单突变位点RV G：W33N、V75H、T99P、R142H、K313F、I392S两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在单位点突变序列的基础之上，以其(RV G-Ferritin-C-O-M)作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
双突变位点为RV G：W33N-V75H、W33N-T99P、W33N-R142H、W33N-L168T、W33N-K313F、V75H-T99P、V75H-R142H、V75H-L168T、V75H-K313F、T99P-R142H、T99P-L168T、T99P-K313F、R142H-L168T、R142H-K313F或L168T-K313F共15种组合，所获得的突变体命名为RVG-Ferritin-C-O-D(W33N-V75H、W33N-T99P、W33N-R142H、W33N-L168T、W33N-K313F、V75H-T99P、V75H-R142H、V75H-L168T、V75H-K313F、T99P-R142H、T99P-L168T、T99P-K313F、R142H-L168T、R142H-K313F或L168T-K313F)突变体。
本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是双位点突变序列的基础之上，以其(RV G-Ferritin-C-O-D)为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，从而获得多位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N-V75H-T99P-R142H-K313F-I392S氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体；。
获得了以下组合：RV G(W33N-V75H-T99P-R142H-K313F-I392S)。命名为RV G-Ferritin-C-O-M6(W33N-V75H-T99P-R142H-K313F-I392S)。
RV G-Ferritin-C-O进行氨基酸单位点、双位点及多位点突变所需引物：
RV G-Ferritin-C-O:
(1)两侧上下游引物：
F：CGGGATCCAACATGGAAGATGATTCCTCAGGTGCTCCT
R：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG
(2)中间上下游引物：
1.
F：GACAAACTGGGCCCTAACTCTCCAATCGATATT
R：AATATCGATTGGAGAGTTAGGGCCCAGTTTGTC
2.
F：GAAGGATGTACCAACATGAGCGGCTTCTCCTAC
R：GTAGGAGAAGCCGCTCATGTTGGTACATCCTTC
3.
F：GAGCTGAAAGTGGGCCACATCTCCGCCATTAAG
R：CTTAATGGCGGAGATGTGGCCCACTTTCAGCTC
4.
F：GGGTTCACATGCACTTCAGTGGTCACAGAGGCT
R：AGCCTCTGTGACCACTGAAGTGCATGTGAACCC
5.
F：GTGGGCTATGTCACCCCTACTTTCAAGCGAAAA
R：TTTTCGCTTGAAAGTAGGGGTGACATAGCCCAC
6.
F：ATGGCTGGAGATCCTATGTATGAGGAAAGCCTG
R：CAGGCTTTCCTCATACATAGGATCTCCAGCCAT
7.
F：AGCCTGCACAATCCACAGCCCGACTATCATTGG
R：CCAATGATAGTCGGGCTGTGGATTGTGCAGGCT
8.
F：GACTATCATTGGCTGCACACCGTGAAGACCACA
R：TGTGGTCTTCACGGTGTGCAGCCAATGATAGTC
9.
F：CCCTACGACAAATCTACCCACAGTCGGGTGTTT
R：AAACACCCGACTGTGGGTAGATTTGTCGTAGGG
10.
F：AGTCGGGTGTTTCCAGACGGGAAGTGCTCTGGG
R：CCCAGAGCACTTCCCGTCTGGAAACACCCGACT
11.
F：ATCTGGATGCCCGAGCCTCCTCGCCTGGGAACC
R：GGTTCCCAGGCGAGGAGGCTCGGGCATCCAGAT
12.
F：AAAACATGTGGGTTTGAGGATGAACGCGGACTG
R：CAGTCCGCGTTCATCCTCAAACCCACATGTTTT
13.
F：ATGGACGGAACTTGGAAGGCTATCCAGACCAGC
R：GCTGGTCTGGATAGCCTTCCAAGTTCCGTCCAT
14.
F：ATTAAGTGGTGCTCCTTCGATCAGCTCGTGAAT
R：ATTCACGAGCTGATCGAAGGAGCACCACTTAAT
15.
F：CACCTGGTGGTCGAGAAGCTCGTGAAGAAACGA
R：TCGTTTCTTCACGAGCTTCTCGACCACCAGGTG
16.
F：CTCGTGAAGAAACGACTCGAATGTCTCGATGCC
R：GGCATCGAGACATTCGAGTCGTTTCTTCACGAG
17.
F：ACCATCATGACTACCTTCAGCGTGAGCTTCAGG
R：CCTGAAGCTCACGCTGAAGGTAGTCATGATGGT
18.
F：ACCTGGAATGAAATCGTCCCCTCTAAGGGATGC
R：GCATCCCTTAGAGGGGACGATTTCATTCCAGGT
19.
F：GACGGACACGTGCTGTCACCAGAGATGCAGTCT
R：AGACTGCATCTCTGGTGACAGCACGTGTCCGTC
20.
F：CTGATGCATCCCCTCACCGATCCTAGCACCGTG
R：CACGGTGCTAGGATCGGTGAGGGGATGCATCAG
2 RV G-Ferritin-C-O-M、RV G-Ferritin-C-O-D、RV G-Ferritin-C-O-M6、突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组质粒在家蚕表达系统及AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达与纯化
具体方法同实施例1。另外，AcBacmid DNA的构建和制备：按下述方法(张志芳，李轶女，易咏竹，等.表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用[P].中国：CN102286534A,2011.)进行制备。
重组病毒rAcBacmid的鉴定和在昆虫细胞中的表达：利用PCR方法分析外源基因整合。提取病毒基因组DNA。取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒rAcBacmid-RV G-Ferritin-C-O-M6。将上述重组病毒rAcBacmid-RV G-Ferritin-C-O-M6培养液按106-7pfu感染100mL的昆虫细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存以进行ELISA检测。
5结果鉴定
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，虽然最高的ELISA值在为512左右，因为本实验是用阈值和稀释倍数作为定量指标的，具体的样本的量因为P/N值的大小不同，还是有所差别的。
从表3的效价检测数据可以看出，在同感序列(SEQ ID NO.1)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(W33N、V75H、T99P、R142H、L168T、K313F)的表达产物的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
表3 RV G-Ferritin-C-O-M突变体表达产物的ELISA效价
组别 效价
RV G-Ferritin 1：64
RV G-Ferritin-C-O 1：256
RV G-Ferritin-C-O-W33N 1：512
RV G-Ferritin-C-O-L57M 1：64
RV G-Ferritin-C-O-V75H 1:512
RV G-Ferritin-C-O-G82S 1：128
RV G-Ferritin-C-O-T99Q 1：512
RV G-Ferritin-C-O-R126M 1：64
RV G-Ferritin-C-O-Y135Q 1：512
RV G-Ferritin-C-O-R142H 1：64
RV G-Ferritin-C-O-L168T 1：512
RV G-Ferritin-C-O-G175D 1：64
RV G-Ferritin-C-O-N201P 1：128
RV G-Ferritin-C-O-V229E 1：64
RV G-Ferritin-C-O-V260K 1：64
RV G-Ferritin-C-O-P273F 1：64
RV G-Ferritin-C-O-E294K 1：64
RV G-Ferritin-C-O-E300L 1：128
RV G-Ferritin-C-O-K313F 1：512
RV G-Ferritin-C-O-I358V 1：64
RV G-Ferritin-C-O-I392S 1：128
RV G-Ferritin-C-O-A419T 1：64
根据以上结果可见进行部分的单突变位点是有效的，因此选取了6个有明显效价提高的单突变位点(W33N、V75H、T99P、R142H、L168T、K313F)两两组合进行双位点突变，对双突变体产物进行ELISA效价检测。
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
从表4中数据看出同感序列氨基酸双位点突变中，在同感序列(SEQ ID NO.1)的基础上进行氨基酸双位点突变所得突变体有三个双突变体(W33N-V75H、W33N-K313F或T99P-K313F)的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
表4 RV G-Ferritin-C-O-D突变体表达产物的ELISA效价
组别 效价
RV G-Ferritin 1：64
RV G-Ferritin-C-O-M 1：512
RV G-Ferritin-C-O-W33N-V75H 1：2048
RV G-Ferritin-C-O-W33N-T99P 1：128
RV G-Ferritin-C-O-W33N-Y135Q 1：64
RV G-Ferritin-C-O-W33N-Y135Q 1：64
RV G-Ferritin-C-O-W33N-K313F 1：1024
RV G-Ferritin-C-O-V75H-T99P 1：128
RV G Ferritin-C-O-V75H-Y135Q 1：128
RV G-Ferritin-C-O-V75H-L168T 1：64
RV G-Ferritin-C-O-V75H-K313F 1：128
RV G-Ferritin-C-O-T99P-Y135Q 1：256
RV G-Ferritin-C-O-T99P-L168T 1：256
RV G-Ferritin-C-O-T99P-K313F 1：1024
RV G-Ferritin-C-O-Y135Q-L168T 1：256
RV G-Ferritin-C-O-Y135Q-K313F 1：128
RV G-Ferritin-C-O-L168T-K313F 1：64
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
以上结果中已得到三个表达量明显提高的双突变体(W33N-V75H、W33N-K313F和T99P-K313F)，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，因此尝试将以上的6突变位点(W33N、V75H、T99P、R142H、L168T、K313F)同时突变以获得一个多位点突变体，对多突变体产物进行ELISA效价检测。
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；结果表明RV G-Ferritin-C-O-M6基因表达产物ELISA效价可达1：4096。
RV G-Ferritin-C-O-M6突变体在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物检测的ELISA值代表每毫升昆虫细胞的表达量。
从表5中的数据可以看出将融合蛋白同感序列进行氨基酸位点多突变，所得多突变体的表达量相比上述单突变体、双突变体等的表达量有了明显提升。
表5 RV G-Ferritin-C-O-M6突变体在家蚕和AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物ELISA检测
组别 效价
RV G-Ferritin 1：64
RV G-Ferritin-C-O-D 1：2048
RV G-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(家蚕) 1：4096
AcRV G-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>(AcMNPV-昆虫细胞) 1：1024
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
6 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到70kDa(RV G-Ferritin-C-O-M6)大小的特异性条带(图2)。
7电镜观察
用1ml注射器吸一定量的1％醋酸铀待用，用另一注射器吸一定数量的蒸馏水。将RV G-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒蚕血淋巴分别经过初步纯化后，用悬浮液稀释，将悬浮样品滴在封口膜上，使之形成一个小液珠，用镊子尖端夹住载网，并使带膜的一面朝下，沾取样品，而后用滤纸吸干，再洗去多余的悬浮物，清洗5次。吸干后，将载网摆在1％醋酸铀染液的液滴上，染色3分钟，用滤纸从铜网边缘吸干多余的染液，重复2-3次，待干燥后镜检。结果如图3所示，可见大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
实施例4 RV G-Ferritin-Ferritin-C-O-M6杆状病毒哺乳动物表达用重组病毒的构建和动物实验
1构建pVLCAG载体
具体实验方法参照(张志芳，姚斌，李轶女等。在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法[P].中国：ZL 201210408558.4.)进行，构建向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体。
2构建呈递报告基因的重组病毒
2.1将RV G-Ferritin-C-O-M6基因克隆到基因呈递转移载体上
将实施例3中带有酶切位点的RV G-Ferritin-C-O-M6基因片段酶切回收连接到同样酶切处理的pVLCAG载体，鉴定正确后获得pVLCAG-RV G-Ferritin-C-O-M6。
2.2构建基因呈递用的重组病毒并大量制备
分别用pVLCAG-RV G-Ferritin-C-O-M6转移载体用reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒Bm-CAG RV G-Ferritin-C-O-M6，在共转染过程中依然需要pVL1393-Luc作为对照来确定共转染的成功与否，病毒纯化过程同上。
用重组病毒感染5龄起家蚕幼虫，4-5d收获蚕血淋巴其中含有大量扩增的重组病毒。
将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，再用15×104g离心3h，去除上清，沉淀用适量PBS重悬获得初步纯化的重组杆状病毒的病毒粒子，这里一般10mL蚕血的重组病毒离心后用2mLPBS重悬，重悬后重组病毒量约为2.5×1012PFU/ML(约为5×1012viral genomes(vg)/mL，病毒拷贝数利用BmNPV病毒DNA骨架序列引物，GJ-1F(CGAACGGAGACGATGGATGTGG)和GJ-1R(GTGCCGAGCGATTGTAAGGGATC)通过荧光定量PCR计算。
3重组病毒在哺乳动物细胞中表达
采用VERO细胞作为基因呈递的目标，将重组病毒Bm-CAG RV G-Ferritin-C-O-M6取100MOI的病毒来进行研究。方法步骤如下：
1)在六孔板中接种上VERO细胞(1×106cell/well)，37℃贴壁培养8-12h
2)取1×108PFU纯化后的重组病毒Bm-CAG RV G--Ferritin-C-O-M6加到六孔板的细胞中，37℃孵育1h
3)孵育后去掉含有病毒的培养基，换上正常的DMEM含血清培养基，42小时左右处理细胞，收集表达产物，ELISA检测效价为1：256
4动物试验
4.1将RV G-Ferritin-C-O-M6表达产物免疫动物
将分析得出的最优序列RV G-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达，将所得蚕蛹按照25μg/只的抗原量制备疫苗来注射动物。根据ELISA效价制备35份/g蚕蛹的疫苗。
制备方法为：称取10g表达RV G-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒抗原的蚕蛹，加入90mlPBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。适量的母液先放在冰上并进行调整，与佐剂混合时，先在15ml离心管中加佐剂3ml，慢慢滴加母液3ml，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。
将分析得出的最优序列RV G-Ferritin-C-O-M6在AcBacmid-昆虫细胞真核表达系统中表达所得细胞沉淀，按照25μg/只的量来注射动物。
制备方法：昆虫细胞表达的抗原按测定的制备疫苗所需的单位的细胞沉淀量经超声破碎后，混合相应的佐剂而成。
取SPF小鼠50只适应性饲养一周后，随机分为5组，每组10只，小鼠分别通过腹腔或肌内注射RV G-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达产物制备的疫苗1份(0.2mL)和在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达产物制备的疫苗1羽份(0.2ml)。10只接种健康蚕蛹制备的疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种传统疫苗株作为阴性对照。接种15天后，采用眼眶取血，采1mL左右，放试管中倾斜放置，37℃放置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，用原核蛋白pET-28a-RV G-Ferritin-C-O-M6作为抗原，检测血清中抗体效价。阴性蚕蛹免疫组的抗体效价应不高于1：4，传统疫苗株的抗体效价均为1：64-128，而RV G-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达样品组的抗体效价为1：256以上，RV G-Ferritin-C-O-M6在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达样品组的抗体效价为1：128以上。
4.2利用重组病毒向小鼠体内呈递外源基因RV G-Ferritin-C-O-M6基因
4.2.1向小鼠体内呈递RV G-Ferritin-C-O-M6基因
纯化的重组病毒Bm-CAG RV G-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(1×1012vg/只)和灌注(1×1013vg/只)的方式送入小鼠体内，小鼠体重约为25g。分别在第5d、11d、17d、21d收集小鼠血清，用原核蛋白pET-28a-RV G-Ferritin-C-O-M6做为检测目的蛋白，检测血清中抗体效价。
5抗体效价
具体实验步骤见上，21天时的抗体效价为最高，具体结果见表6。
从表6中的数据可以看出，融合蛋白氨基酸多位点突变后的突变体呈递给小鼠中所产生的抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗要优。
表6 RV G-Ferritin-C-O-M6小鼠血清抗体效价(21天)
组成 效价
健康蚕蛹对照(小鼠) 1：4
传统疫苗(小鼠) 1：64
RV G-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清(注射) 1：256
RV G-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清(灌注) 1：512
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用
<130> BJ-2002-190803A
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 624
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 1
Met Ile Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Ser Ser
1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20 25 30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35 40 45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Met Pro Asp Ala
100 105 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115 120 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130 135 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Phe Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145 150 155 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly
165 170 175
Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Cys Cys Ser Thr Asn His
180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys
195 200 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Gly Lys
210 215 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225 230 235 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245 250 255
Gly Thr Trp Val Ala Ile Gln Thr Ser Asp Glu Ile Lys Trp Cys Ser
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe His Ser Asp Glu Ile Glu
275 280 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290 295 300
Ala Leu Glu Thr Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305 310 315 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325 330 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Ile Arg
340 345 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355 360 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370 375 380
Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385 390 395 400
His Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His
405 410 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Lys Gln Ile Ser Gly
435 440 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Gly Lys Ser Gly Gly Asp Ile Ile
450 455 460
Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu
465 470 475 480
Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala
485 490 495
Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys
500 505 510
Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr
515 520 525
Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe
530 535 540
Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn
545 550 555 560
Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe
565 570 575
Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys
580 585 590
Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu
595 600 605
Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
610 615 620
<210> 2
<211> 1875
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
atgattcctc aggtgctcct cttcgtcccc ctcctcgtgt tttcaagctg tttcggcaag 60
tttcctatct ataccatccc agacaaactg ggcccttggt ctccaatcga tattcaccat 120
ctgagttgcc ccaacaatct cgtggtcgag gacgaaggat gtaccaacct gagcggcttc 180
tcctacatgg agctgaaagt gggctatatc tccgccatta aggtcaacgg gttcacatgc 240
actggagtgg tcacagaggc tgaaacctac acaaattttg tgggctatgt caccacaact 300
ttcaagcgaa aacactttag gcccatgcct gacgcctgta gggccgctta caactggaag 360
atggctggag atcctcggta tgaggaaagc ctgcacaatc cataccccga ctatcattgg 420
ctgaggaccg tgaagaccac aaaagagagc ttcgtgatca tttccccatc tgtcgccgac 480
ctggacccct acgacaaatc tctgcacagt cgggtgtttc caggcgggaa gtgctctggg 540
atcactgtca gctccacctg ctgtagtaca aaccatgatt atactatctg gatgcccgag 600
aatcctcgcc tgggaacctc ctgcgacatt ttcacaaaca gtcgcggcaa gagagcctca 660
aagggaggca aaacatgtgg gtttgtggat gaacgcggac tgtacaagtc tctcaaaggg 720
gcctgcaagc tgaaactctg tggagtgctg ggcctcagac tgatggacgg aacttgggtc 780
gctatccaga ccagcgacga gattaagtgg tgctcccccg atcagctcgt gaatctgcac 840
gacttccata gcgatgagat cgaacacctg gtggtcgagg aactcgtgaa gaaacgagag 900
gaatgtctcg atgccctgga aaccatcatg actaccaaga gcgtgagctt caggaggctg 960
agccacctga gaaagctcgt ccctggcttc gggaaagcct acactatctt taacaagacc 1020
ctgatggagg ccgacgctca ttataaatcc attcgcacct ggaatgaaat cattccctct 1080
aagggatgcc tgcgagtggg gggacgctgt caccctcatg tgaacggcgt cttctttaat 1140
gggatcattc tggggcctga cggacacgtg ctgatcccag agatgcagtc tagtctgctc 1200
caccagcaca tggagctgct cgaatcaagc gtgattccac tgatgcatcc cctcgccgat 1260
cctagcaccg tgttcaagga cggcgatgag gctgaagact ttgtggaggt ccacctgcca 1320
gatgtgcata aacagatcag cggagtggac ctgggactgc caagctgggg caagtccggt 1380
ggcgacatca tcaagctgct gaacgaacag gtgaacaagg agatgcagtc cagcaacctg 1440
tacatgtcta tgtcttcatg gtgctacacc cactcactgg acggagctgg tctgttcctg 1500
ttcgaccacg ctgccgagga atacgaacac gccaagaagc tgatcatctt cctgaacgag 1560
aacaacgtgc ctgtccagct gacctccatc agcgctcccg aacacaagtt cgagggtctg 1620
actcaaatct tccagaaggc ctacgaacac gagcagcaca tctctgaatc aatcaacaac 1680
atcgtggacc acgctatcaa gagcaaggac cacgccactt tcaacttcct gcaatggtac 1740
gtggctgagc agcacgagga agaggtcctg ttcaaggaca tcctggacaa gatcgaactg 1800
atcggcaacg agaaccacgg actgtacctg gctgaccagt acgtcaaggg catcgccaag 1860
tcccgcaaga gctaa 1875
<210> 3
<211> 1575
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
atgattcctc aggtgctcct cttcgtcccc ctcctcgtgt tttcaagctg tttcggcaag 60
tttcctatct ataccatccc agacaaactg ggcccttggt ctccaatcga tattcaccat 120
ctgagttgcc ccaacaatct cgtggtcgag gacgaaggat gtaccaacct gagcggcttc 180
tcctacatgg agctgaaagt gggctatatc tccgccatta aggtcaacgg gttcacatgc 240
actggagtgg tcacagaggc tgaaacctac acaaattttg tgggctatgt caccacaact 300
ttcaagcgaa aacactttag gcccatgcct gacgcctgta gggccgctta caactggaag 360
atggctggag atcctcggta tgaggaaagc ctgcacaatc cataccccga ctatcattgg 420
ctgaggaccg tgaagaccac aaaagagagc ttcgtgatca tttccccatc tgtcgccgac 480
ctggacccct acgacaaatc tctgcacagt cgggtgtttc caggcgggaa gtgctctggg 540
atcactgtca gctccacctg ctgtagtaca aaccatgatt atactatctg gatgcccgag 600
aatcctcgcc tgggaacctc ctgcgacatt ttcacaaaca gtcgcggcaa gagagcctca 660
aagggaggca aaacatgtgg gtttgtggat gaacgcggac tgtacaagtc tctcaaaggg 720
gcctgcaagc tgaaactctg tggagtgctg ggcctcagac tgatggacgg aacttgggtc 780
gctatccaga ccagcgacga gattaagtgg tgctcccccg atcagctcgt gaatctgcac 840
gacttccata gcgatgagat cgaacacctg gtggtcgagg aactcgtgaa gaaacgagag 900
gaatgtctcg atgccctgga aaccatcatg actaccaaga gcgtgagctt caggaggctg 960
agccacctga gaaagctcgt ccctggcttc gggaaagcct acactatctt taacaagacc 1020
ctgatggagg ccgacgctca ttataaatcc attcgcacct ggaatgaaat cattccctct 1080
aagggatgcc tgcgagtggg gggacgctgt caccctcatg tgaacggcgt cttctttaat 1140
gggatcattc tggggcctga cggacacgtg ctgatcccag agatgcagtc tagtctgctc 1200
caccagcaca tggagctgct cgaatcaagc gtgattccac tgatgcatcc cctcgccgat 1260
cctagcaccg tgttcaagga cggcgatgag gctgaagact ttgtggaggt ccacctgcca 1320
gatgtgcata aacagatcag cggagtggac ctgggactgc caagctgggg caagtacgtg 1380
ctgatctccg ccggggctct caccgccctc atgctgatga ttttcctgat gacatgctgt 1440
agaaaaacta accgagctga gtccatccag cactctcccg gcgaaacagg gagaaaggtg 1500
tcagtcacta gccacaacgg gcgagtcatt agtagctggg agtcatacaa gagtggcggg 1560
gaaacaaaac tgtga 1575

Claims (7)

1.一种融合蛋白的同感序列的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N、V75H、T99P、R142H、L168T或K313F中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体。
2.一种融合蛋白的同感序列的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N-V75H、V75H-T99P或L168T-K313F中任何一种双位点突变方式获得的双位点突变体。
3.一种融合蛋白的同感序列的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W33N-V75H-T99P-R142H-L168T-K313F进行多位点突变方式获得的多位点突变体。
4.权利要求1-3任何一项所述的突变体在制备狂犬疫苗中的用途。
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于，包括：将权利要求1-3任何一项所述突变体的编码基因在大肠杆菌原核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者，将权利要求1-3任何一项所述的突变体的编码基因在家蚕表达系统或AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者，将权利要求1-3任何一项所述的突变体的编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中得到重组杆状病毒；将重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，将突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组转移载体；将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得。
7.一种狂犬疫苗，其特征在于，包含有效量的权利要求1-3任何一项所述的突变体和药学上可接受的佐剂或载体。
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