CN102964433A - 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102964433A
CN102964433A CN2012102206103A CN201210220610A CN102964433A CN 102964433 A CN102964433 A CN 102964433A CN 2012102206103 A CN2012102206103 A CN 2012102206103A CN 201210220610 A CN201210220610 A CN 201210220610A CN 102964433 A CN102964433 A CN 102964433A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rabies virus
virus glycoprotein
high immunogenicity
plasmid
rabies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012102206103A
Other languages
English (en)
Inventor
张守峰
扈荣良
刘晔
王颖
陈奇
张菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Original Assignee
Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA filed Critical Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Priority to CN2012102206103A priority Critical patent/CN102964433A/zh
Publication of CN102964433A publication Critical patent/CN102964433A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用，以人工合成方式获得包含全部优势中和抗原表位并经密码子优化的狂犬病毒糖蛋白基因，再以重组腺病毒、重组杆状病毒或慢病毒为表达载体，在哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或家蚕表达系统内高效表达，获得对目前国内流行狂犬病毒株具有高免疫原性的狂犬病毒糖蛋白，用于动物狂犬病的免疫预防。

Description

一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用
技术领域：
本发明涉及一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，尤其是提供了一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制备方法与应用，属于基因工程疫苗技术领域。
背景技术：
狂犬病是病死率几乎100%的人兽共患传染病。我国是狂犬病的高发地区，人狂犬病主要因被携带狂犬病病毒的犬或猫咬伤或抓伤（暴露）导致。我国流行的狂犬病毒株较多，虽然均属于基因1型，相互间存在交叉保护，但目前狂犬病疫苗所使用毒株均为外国毒株（PV、PM、SAD）及中国早期流行株（CTN、aG），数十年的进化已经使糖蛋白基因出现了明显的差异。研究表明，不同狂犬病毒株的糖蛋白，其免疫原性存在差别。而此种差别主要由糖蛋白优势抗原表位基因决定，糖蛋白的表达产量则受表达系统的基因密码子偏好性所影响。通过表位优化及密码子优化获得的糖蛋白基因，可以表达获得高免疫原性和高表达量的糖蛋白，用于动物狂犬病的免疫预防，将对现有流行株产生完全且持久的免疫保护。
发明内容：
本发明提供一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，对我国当前流行的狂犬病均具有良好的免疫原性，避免了以往狂犬病疫苗株和当前流行株因不同时具备全部优势抗原表位而导致的免疫原性偏低的现象。
本发明还公开了一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制备方法，适应于工业化生产。
本发明提供的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，其特征在于：
其氨基酸序列如SEQ No.1所示，其DNA序列如SEQ No.2所示；
本发明所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成　
将SEQ No.1所示的基因分为1-730bp的A片段和710-1575bp的B片段两部分，分别进行人工合成，合成后的基因片段克隆入pUC18质粒载体的BamHI位点；新质粒命名为pUC18-A和pUC18-B；
2）高免疫原性狂犬病毒糖蛋白腺病毒表达载体的构建　
酶切pUC18-A和pUC18-B质粒，获得目的基因的A、B二片段，同时连接入腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV内，所得质粒命名为pacAd5 CMV-optG；
3）表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒的获得　
重组质粒pacAd5 CMV-optG与辅助质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞，待细胞出现明显病变后冻融收取，即获得携带并表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的重组腺病毒，重组腺病毒命名为rAD5-optG。
高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的应用：
1、病毒达到108TCID50以上的重组病毒rAD5-optG免疫犬或猫，每剂1ml，肌肉注射。
2、肌肉注射后21天，采血分离血清，以荧光抗体病毒中和试验（FAVN）检测血清狂犬病中和抗体，均达到0.5IU/ml以上。
本发明基于狂犬病毒糖蛋白的优势抗原表位分析和密码子优化理论，经人工合成具备全部优势抗原表位且经密码子优化的狂犬病毒糖蛋白基因，以重组腺病毒、重组杆状病毒或重组慢病毒为表达系统，制备基于哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或家蚕系统的基因工程疫苗，直接或纯化后用于动物狂犬病的预防。此类疫苗可以代替目前常规使用的狂犬病弱毒活疫苗或灭活疫苗，在提高免疫原性，避免狂犬病毒变异导致的疫苗失效的同时，可以大大降低疫苗生产过程中大量培养狂犬病毒导致的生物安全风险。
本发明的积极效果在于：高免疫原性狂犬病毒糖蛋白可对当前我国流行的所有狂犬病流行株提供完全的免疫保护，同时通过密码子的优化实现蛋白表达量的大幅度提高，降低了动物狂犬病疫苗的生产成本。
附图说明
图1为pUC18质粒示意图；
图2为腺病毒重组穿梭质粒pacAd5 CMV示意图；
图3为腺病毒重组辅助质粒pacAd5 9.2-100示意图；
图4为质粒pUC18-A示意图；
图5为质粒pUC18-B示意图；
图6　质粒pacAd5 CMV-optG示意图。
具体实施方式
实施例1
高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成
将SEQ No.1所示的基因分为1-730bp的A片段和710-1575bp的B片段两部分，委托TaKaRa（大连）公司分别进行人工合成，合成后的A、B二基因片段均克隆入pUC18质粒载体的BamHI位点，转化大肠杆菌JM109感受态，筛选获得正向连接的重组质粒，即片段上游靠近HindIII位点而下游靠近EcoRI位点，序列第721bp位置的SphI位点可用作下一步基因克隆。新质粒命名为pUC18-A（图4）和pUC18-B（图5），质粒内A、B序列片段经过序列测定，与SEQ No1.所示的DNA序列完全一致。
实施例2
高免疫原性狂犬病毒糖蛋白重组腺病毒的构建
以限制性内切酶HindIII和SphI双酶切质粒pUC18-A，回收730bp的A片段，以SphI和EcoRI双酶切pUC18-B，回收870bp的B片段。再以HindIII和EcoRI双酶切腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV，回收6.2kb的载体片段。载体片段与A、B二基因片段在T4 DNA连接酶作用下连接，转化大肠杆菌JM109感受态，筛选获得正确连接的重组质粒pacAd5 CMV-optG（图6）。质粒pacAd5 CMV-optG与pacAd5 9.2-100各100μg，与脂质体（Invitrogen lipofectamine 2000）混合后转染293AD单层细胞。继续培养5d，至出现明显的细胞变圆、聚集成葡萄串样，收获细胞培养物。细胞培养物经PCR鉴定，表明携带高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因；PAGE电泳后进行Western印迹，结果显示，狂犬病糖蛋白得到高效表达。
实施例3
表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒的制备
实施例2获得的重组腺病毒rAD5-optG种毒按5%体积接种293AD单层细胞，37℃，5%CO2条件下培养4－6天，待细胞明显变圆、聚集成葡萄串样时冻融收获培养物。收获后病毒可以再按此方法扩大接种，大量制备重组腺病毒rAD5-optG。
取各批次制备的重组病毒，按1、10、102、103、104……1011进行梯度稀释，接种96孔板内的293AD单层细胞，每个梯度接种8个重复孔，每孔培养基量为100μl。接种后37℃，5%CO2条件下培养7天，观察并记录各孔内是否出现细胞病变。根据Kaber法计算重组的滴度。结果表明，各批次重组病毒的产毒滴度均超过108.5TCID50。
试验例
表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒rAD5-optG对犬的免疫
取实施例3制备的重组腺病毒rAD5-optG，将病毒滴度稀释为108TCID50，肌肉注射免疫3月龄比格犬10只（试验组）。同时设不免疫犬6只作为对照。正常饲养21天后，全部16只犬抽血分离血清，以荧光抗体病毒中和试验（FAVN）法测定血清狂犬病中和抗体水平。结果显示，试验组10只犬的血清抗体均超过0.5IU/ml保护水平，平均水平为3.42IU/ml。
以10万LD50狂犬病强毒BD06株咬肌注射上述16只犬，攻毒后正常饲养观察，记录各组犬发病和死亡情况。死亡犬取脑组织进行免疫荧光染色（DFA）确认是否死于狂犬病。结果显示，观察至攻毒后28天，试验组全部10只犬均未发病；而对照组6只犬于攻毒后第9天至22天先后发病，出现明显的、沉郁和肌肉麻痹等精神症状。死后脑组织DFA检测显示各犬脑组织内均出现狂犬病病毒。上述结果表明，重组腺病毒rAD5-optG注射犬后，可产生足够强的抗狂犬病免疫保护。
SEQ No.1
MIPQVLLFVPLLVFSSCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPMPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDKSLHSRVFPGGKCSGITVSSTCCSTNHDYTIWMPENPRLGTSCDIFTNSRGKRASKGGKTCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAIQTSDEIKWCSPDQLVNLHDFHSDEIEHLVVEELVKKREECLDALETIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSIRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGHVLIPEMQSSLLHQHMELLESSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHKQISGVDLGLPNWGKYVLISAGALTALMLTIFLMTCCRKTNRAGSIQHSPGETGRKVSVTSHNGRVISSWESYKSGSETKL
 
SEQ No. 2
ATGATTCCTCAAGTTCTTTTGTTTGTTCCCCTTCTAGTTTTCTCCTCCTGCTTTGGCAAATTCCCCATTTACACCATTCCAGACAAACTTGGTCCATGGAGCCCCATCGATATTCATCATCTGAGCTGCCCAAACAATCTGGTTGTGGAAGATGAAGGATGCACCAATTTGTCTGGATTTTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATATATTTCAGCCATTAAAGTGAACGGATTCACCTGCACAGGTGTGGTGACCGAAGCAGAAACCTACACTAACTTTGTTGGTTATGTCACCACCACCTTTAAGAGGAAGCACTTTAGGCCTATGCCAGATGCCTGCAGGGCCGCATACAACTGGAAGATGGCTGGTGACCCCAGGTATGAAGAGTCTCTGCACAATCCATACCCCGACTACCACTGGCTCAGGACTGTCAAGACCACCAAGGAGTCCCTTGTCATCATTTCTCCAAGCGTTGCAGATTTGGACCCATACGATAAATCCCTTCACTCCAGGGTTTTTCCTGGCGGAAAATGCTCAGGAATTACCGTGTCCTCCACTTGCTGCTCTACTAACCACGACTACACCATCTGGATGCCTGAAAATCCTAGGCTGGGAACTTCATGCGACATTTTCACCAATAGCAGGGGCAAGAGGGCATCAAAAGGCGGCAAGACTTGCGGATTTGTGGATGAAAGGGGCTTGTACAAGTCTCTAAAGGGAGCATGCAAGCTGAAGCTATGCGGCGTTCTAGGACTTAGGCTTATGGACGGAACATGGGTCGCCATTCAGACATCAGATGAGATCAAATGGTGCTCTCCTGATCAGCTAGTAAATCTACACGACTTTCACTCCGATGAGATTGAACATCTTGTTGTGGAGGAGTTGGTCAAAAAGAGGGAAGAGTGCCTGGACGCACTGGAGACTATTATGACCACAAAGTCCGTGAGCTTCAGGAGGCTTAGCCATTTGAGGAAGCTAGTCCCTGGCTTTGGAAAGGCCTATACCATTTTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAATCAATCAGGACTTGGAATGAAATCATCCCCTCCAAAGGTTGCTTGAGGGTTGGCGGCAGGTGCCATCCTCATGTGAACGGCGTGTTCTTCAACGGCATTATTCTGGGTCCTGACGGACATGTTCTAATCCCAGAGATGCAGTCCTCCCTCCTCCACCAGCATATGGAATTGTTGGAGTCCTCAGTCATCCCTTTGATGCATCCCTTGGCAGACCCATCAACAGTCTTTAAAGACGGCGACGAGGCAGAGGACTTTGTTGAGGTTCACCTTCCAGATGTGCACAAGCAGATCTCCGGCGTTGATCTTGGTCTCCCAAACTGGGGCAAGTATGTGCTGATTAGCGCAGGTGCTTTGACTGCATTGATGTTGACCATTTTCTTGATGACCTGCTGCAGGAAGACTAATAGGGCAGGCTCAATTCAACACAGCCCTGGAGAGACAGGCAGGAAAGTGTCCGTGACTTCTCACAACGGAAGGGTCATTTCTTCATGGGAATCATATAAAAGCGGAAGCGAGACCAAGCTGTGA
 

Claims (3)

1.一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ No.1所示，其DNA序列如SEQ No.2所示。
2. 根据权利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的人工合成　
将SEQ No.1所示的基因分为1-730bp的A片段和710-1575bp的B片段两部分，分别进行人工合成，合成后的基因片段克隆入pUC18质粒载体的BamHI位点，新质粒命名为pUC18-A和pUC18-B；
2）高免疫原性狂犬病毒糖蛋白腺病毒表达载体的构建　
酶切pUC18-A和pUC18-B质粒，获得目的基因的A、B二片段，同时连接入腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV内，所得质粒命名为pacAd5 CMV-optG；
3）表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒的获得　
重组质粒pacAd5 CMV-optG与辅助质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞，待细胞出现明显病变后冻融收取，即获得携带并表达高免疫原性狂犬病毒糖蛋白基因的重组腺病毒，重组腺病毒命名为rAD5-optG。
3. 根据权利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒糖蛋白在制备动物狂犬病免疫预防药物中的应用。
CN2012102206103A 2012-06-29 2012-06-29 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用 Pending CN102964433A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012102206103A CN102964433A (zh) 2012-06-29 2012-06-29 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012102206103A CN102964433A (zh) 2012-06-29 2012-06-29 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102964433A true CN102964433A (zh) 2013-03-13

Family

ID=47794890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012102206103A Pending CN102964433A (zh) 2012-06-29 2012-06-29 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102964433A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925542A (zh) * 2016-06-17 2016-09-07 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 表达ifitm3的重组腺病毒、其构建方法及应用
CN108588038A (zh) * 2018-04-10 2018-09-28 华中农业大学 一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病新型重组疫苗
CN112442130A (zh) * 2019-08-28 2021-03-05 中国农业科学院生物技术研究所 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1718242A (zh) * 2004-07-07 2006-01-11 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗
CN101537179A (zh) * 2009-02-06 2009-09-23 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 一种动物用长效狂犬病疫苗及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1718242A (zh) * 2004-07-07 2006-01-11 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗
CN101537179A (zh) * 2009-02-06 2009-09-23 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 一种动物用长效狂犬病疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S.-L. MENG ET AL.: "A molecular epidemiological study targeting the glycoprotein gene of rabies virus isolates from China", 《VIRUS RESEARCH》, 28 November 2006 (2006-11-28), pages 125 - 138 *
孙程龙: "狂犬病病毒SRV9株糖蛋白333位氨基酸变异对其免疫原性的影响", 《中国生物制品学杂志》, vol. 25, no. 5, 31 May 2012 (2012-05-31), pages 539 - 544 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925542A (zh) * 2016-06-17 2016-09-07 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 表达ifitm3的重组腺病毒、其构建方法及应用
CN108588038A (zh) * 2018-04-10 2018-09-28 华中农业大学 一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病新型重组疫苗
CN112442130A (zh) * 2019-08-28 2021-03-05 中国农业科学院生物技术研究所 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用
CN112442130B (zh) * 2019-08-28 2022-06-21 中国农业科学院生物技术研究所 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的狂犬疫苗和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Franceschi et al. Immunization of knock-out α/β interferon receptor mice against lethal bluetongue infection with a BoHV-4-based vector expressing BTV-8 VP2 antigen
CN104788554B (zh) 猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
CN101422607B (zh) 小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗
CN102888383B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株
CN104178505B (zh) 一种表达猪瘟病毒e2基因重组病毒及制备方法与应用
US9051584B2 (en) Heat-resistant newcastle disease virus live vaccine vector system and use thereof
CN106834352B (zh) 基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒ii型抗原的多角体的方法
CN110981968B (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN110628730B (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用
CN103937835A (zh) 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN108728490A (zh) 一种基于杆状病毒载体的鲤疱疹病毒ii型dna疫苗及其构建方法与应用
CN101307317A (zh) 狂犬病毒抗原的制备方法
US20160137699A1 (en) Recombinant fusion antigen gene, recombinant fusion antigen protein and subunit vaccine composition having the same against infection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
CN106967748B (zh) 无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprv h/f蛋白疫苗的构建
WO2017124588A1 (zh) 一种重组腺相关病毒的制备方法
CN104059927B (zh) 鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品
CN102964433A (zh) 一种高免疫原性狂犬病毒糖蛋白及其制备方法与应用
CN109207522A (zh) 表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN103169963B (zh) 狂犬病dna疫苗的构建及应用
CN105392362B (zh) 用于在宿主昆虫中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件
CN104353070A (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法
CN102302774B (zh) 小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗
CN105039268A (zh) 表达鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用
CN102614509A (zh) 一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130313