CN115094088A

CN115094088A - 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

Info

Publication number: CN115094088A
Application number: CN202210412508.7A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 黄梅; 郑航辉; 方倪冉; 刘定祥; 杨小云; 董楠
Original assignee: Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd; South China Agricultural University
Current assignee: Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-09-23

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种pSFV‑flagX‑CMV复制子质粒，采用含塞姆利基森林病毒复制子的载体，并将p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505‑7R和M1249L基因分别插入所述载体而得；所述p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505‑7R基因序列依次如SEQ ID NO.15‑NO.21所示。该质粒通过插入非洲猪瘟抗原基因(X)，制得的pSFV‑flagX‑CMV复制子质粒在真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白，有利于非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通过Flag抗体胶对这些蛋白进行纯化，制取有别于原核表达的，具备翻译后修饰的高质量抗原蛋白；同时，本发明还公开了该质粒的制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

Description

一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是一种病毒性出血病，对家猪和欧亚野猪的致死率极高。近年该病已从欧洲传播至我国及其周边诸国。迄今对该病仍然缺乏安全和有效的疫苗防控，一经发现只能大规模扑杀，造成不可估量的经济损失和社会影响。尽管多个基因缺陷型活疫苗的研究成果已展示了良好的免疫保护效力，但其保护力仍不完全。尤其是免疫功能低下的动物可因接种此类疫苗成为新的病毒携带者和传播者。为此目前对非瘟活疫苗的使用尚未推广。迄今的研究结果表明，灭活病毒疫苗对该病不能提供保护。蛋白亚单位疫苗因其不能刺激有效的细胞免疫反应，不能有效祛除细胞内的病毒而受到局限。已有研究表明单纯的中和性抗体并不能完全阻止ASFV病毒的复制和扩散。目前的DNA疫苗结果也仅显示部分保护作用。病毒载体疫苗也还处于研发阶段，有可能成为对抗ASFV的武器。

塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)复制子DNA是一种能在真核细胞内进行有限自我复制的表达系统。其携带的目的基因能通过载体所携带的复制酶基因产物的作用下进行大量复制，因此具更高的抗原蛋白表达能力。SFV复制子DNA含大量CpG序列，从而具有较强的刺激天然免疫反应的效力。因此基于SFV复制子的DNA疫苗不需要添加任何佐剂就能激发较强的细胞免疫和体液免疫反应。基于SFV的载体己用于抗多种感染性疾病(包括人和畜)的疫苗研究。其中人用疫苗已进入临床前期和临床期(抗癌)。在动物疫苗方面， SFV载体已应用于禽兽疫苗的研发，其中包括猪流感，猪水泡病毒(SVDV)，猪瘟病毒(CSFV) 等猪源病毒的免疫研究，并显示有很好的攻毒保护效力。

非洲猪瘟病毒(ASFV)属双链大DNA病毒，结构非常复杂。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、DNA结合蛋白(p10、 p14、p37、p34等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p32、p54及CD2v 蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。ASFV全基因组约为170–190kbp，含151到167个开放阅读框。迄今用质谱和免疫电镜进行蛋白鉴定已发现68种病毒蛋白，其中54种是结构蛋白，23种是病毒粒子的重要组成部分。

本案要解决的技术问题是：如何开发出一种能够让真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白的质粒，以为开发非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗做出准备。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种 pSFV-flagX-CMV复制子质粒；该质粒通过插入非洲猪瘟抗原基因(X)，制得的 pSFV-flagX-CMV复制子质粒在真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白，有利于非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通过Flag抗体胶对这些蛋白进行纯化，制取有别于原核表达的，具备翻译后修饰的高质量抗原蛋白；同时，本发明还公开了该质粒的制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒，采用含塞姆利基森林病毒复制子的载体，并将p54， p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R和M1249L基因分别插入所述载体而得；所述p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R基因序列依次如SEQ ID NO.15-NO.21 所示。

此外，本发明还公开了一种如上所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建得到pXJ40-FlagpX质粒，以pXJ40-FlagpX质粒为模板扩增FlagpX片段；

(2)将FlagpX片段克隆至含塞姆利基森林病毒复制子的载体，得到pSFV-FlagpX-CMV；

所述pXJ40-FlagpX质粒的制备方法如下：

(1)用BamHI/SmaI酶切，双酶切线性化pXJ40-flag载体；

(2)将SEQ ID NO.15-NO.21任一所示的ASFV p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R和M1249L基因分别插入所述pXJ40-flag载体而得。

在上述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法中，含塞姆利基森林病毒复制子的载体的制备方法为：

S1.用EGFP基因取代pSFVCs-lacZ中的lacZ序列，得到质粒pSFVCs-EGFP；

S2.将pSFVCs-EGFP质粒中的SP6启动子更换为CMV启动子，得到质粒 pSFVCs-EGFP-CMV；

S3.删除pSFVCs-EGFP-CMV质粒中的SFV病毒壳膜蛋白序列(Cs)，得到质粒 pSFV-EGFP-CMV。

在上述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法中，步骤S1具体操作过程如下：

A.用BamHI/SmaI双酶切pSFVCs-lacZ质粒DNA，胶纯化11845bp不含lacZ基因序列的片段1；

B.以pEGFP-C1质粒为模板，以EGFP-F/EGFP-R为引物通过PCR扩增EGFP基因片段；

C.将片段1与EGFP基因片段进行体外同源重组，得到质粒pSFVCs-EGFP；

所述引物序列如下：

EGFP-F：5’-gtccgaagagtgggatcccATGGTGAGCAAGG-3’；(SEQ ID NO:1)；

EGFP-R：5’-ttcaattaattacccgggCTTGTACAGCTCGTC-3’；(SEQ ID NO:2)。

在上述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法中，步骤S2具体操作过程如下：

A.用PvuI和EcoRV双酶切pSFVCs-EGFP质粒DNA，胶纯化回收10967bp片段2；

B.以pSFVCs-EGFP质粒为模板，用EcoRV-F/EcoRV-R引物做PCR扩增，胶回收309bp片段3；

C.以pSFVCs-EGFP质粒为模板，用PvuI-F/PvuI-R引物做PCR扩增，胶回收1333bp片段4；

D.以pEGFP-C1质粒为模板，用CMV-F/CMV-R引物做PCR扩增，胶回收549bp片段5；

E.将上述片段2～5进行体外同源重组，得到质粒pSFVCs-EGFP-CMV；

所述引物序列如下：

EcoRV-F：5’-TATAAACCGTCatggcggatgtgtgaca-3’；(SEQ ID NO:3)；

EcoRV-R：5’-ctggaaggcgcactgccgat-3’；(SEQ ID NO:4)；

PvuI-F：5’-ctccttcggtcctccgatcg-3’；(SEQ ID NO:5)；

PvuI-R：5’-GTAACGcgtatgtgtatgatacataagg-3’；(SEQ ID NO:6)；

CMV-F：5’-catacacatacgCGTTACATAACTTACGG-3’；(SEQ ID NO:7)；

CMV-R：5’-atccgccatGACGGTTTATATAACGAGCTCTGCTAGCTCTGCTTATATAGAC-3’；(SEQ ID NO:8)。

在上述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法中，步骤S3具体操作过程如下：

A.用BglII/BamHI双酶切pSFVCs-EGFP-CMV质粒DNA，胶纯化10866bp片段6；

B.以pSFVCs-EGFP-CMV为模板用引物BglII-F/BamHI-R扩增745bp PCR片段7，然后胶纯化回收；

C.以pSFVCs-EGFP-CMV为模板用引物BamHI-F/EGFP-R扩增754bp PCR片段8，然后胶纯化回收。

D.将上述片段6～8进行体外同源重组，得到质粒pSFV-EGFP-CMV；

所述引物序列如下：

BglII-F：5’-ggtttaatgatcctcgaagatc-3’；(SEQ ID NO:9)；

BamHI-R：5’-CCTTGCTCACCATgggatccggtgctataatagtg-3’；(SEQ ID NO:10)；

BamHI-F：5’-tattatagcaccggatcccATGGTGAGCAAGG-3’(SEQ ID NO:11)

EGFP-R：5’-ttcaattaattacccgggCTTGTACAGCTCGTC-3’；(SEQ ID NO:2)。

最后，本发明还公开了一种鸡尾酒混合疫苗，采用多种pSFV-flagX-CMV复制子质粒制备得到。

在上述的鸡尾酒混合疫苗中，含三种pSFV-flagX-CMV复制子质粒；三种pSFV-flagX-CMV复制子质粒分别含P54、CD2v、p32基因。

有益效果

本发明采用塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)复制子为载体构建了一种能在真核细胞内对目的基因，如非洲猪瘟抗原蛋白基因进行有限自我复制的DNA疫苗体系；用这个表达非洲猪瘟抗原蛋白目的基因的DNA转染BHK细胞后，经过IFA和WB鉴定，证明能高效表达非洲猪瘟抗原蛋白；用抗Flag胶能纯化较大量的所述目的蛋白；用含pSFV-flagP54， pSFV-flagCD2v和pSFV-flagp32质粒的混合DNA做成鸡尾酒疫苗接种仔猪1-2次就能检测到良好的细胞和体液免疫效果。为后续创制非洲猪瘟疫苗提供了可靠的实验基础和科学依据，有利于进一步对防控各种禽兽流行病疫苗进行研制。

DNA疫苗非常安全，表达不同抗原蛋白的DNA可合并使用，从而拓宽抗原表位图谱提高疫苗的保护效力。DNA疫苗生产工艺成熟，造价低廉，生产过程中无需特别的生物安全设备，特别适合针对如非洲猪瘟这样的烈性传染病。SFV复制子DNA含大量CpG序列。非甲基化的CpG序列是公认的很强的免疫增强剂，甲基化的CpG序列可能也有一定的免疫增强作用。我们的初步实验结果显示SFV复制子DNA疫苗无需添加任何佐剂可产生强的免疫反应。

因此，本发明有很高的使用价值。

附图说明

图1为第二部分中pSFVCs-lacZ的质粒示意图；

图2为第二部分中所得质粒pSFVCs-EGFP的双酶切鉴定结果图；

图3为第二部分中所得质粒pSFVCs-EGFP的示意图；

图4为第二部分中所得pSFVCs-EGFP-CMV质粒经转化后的PvuI-F/CMV-R(左)和CMV-F/EcoRV-R(右)引物菌落筛选结果图；

图5为第二部分中两个PCR阳性单菌落质粒DNA的BamHI/NotI(左)和BamHI/EcoRV(右) 酶切鉴定结果图；

图6为第二部分中pSFVCs-EGFP-CMV的质粒示意图；

图7为第二部分中所得pSFV-EGFP-CMV质粒的BglII/SmaI双酶切鉴定结果图；

图8为第二部分中所得pSFV-EGFP-CMV质粒的示意图；

图9为第二部分中所得pSFV-Helper1-CMV质粒的SphI/SalI双酶切鉴定结果图。

图10为第二部分中所得pSFV-Helper1-CMV的质粒示意图；

图11为第二部分中pSFV-EGFP-CMV DNA转染BHK21细胞的荧光测试结果图；

图12为第二部分中制备的SFVEGFP复制缺陷型病毒粒子的P0代滴度测定结果图；

图13为第二部分中制备的SFVEGFP复制缺陷型病毒粒子P0代细胞外液感染BHK21细胞24h的荧光显微镜观察结果图；

图14为第三部分中pXJ40-FlagP54的结构示意图；

图15为第三部分中pSFV-FlagP54-CMV的结构示意图；

图16为第三部分中pXJ40-FlagP54酶切结果示意图；

图17为第三部分中pSFV-Flagp54-CMV酶切结果示意图；

图18为第四部分中蛋白质免疫印迹/western blot范例；

图19为第四部分中间接免疫荧光分析(IFA)IFA范例；

图20为第四部分中Flag抗体胶纯化蛋白结果R250染色范例；

图21为第三部分中pSFV-EGFP-CMV质粒的结构图谱；

图22为第三部分中pXJ40-Flag质粒的结构图谱；

图23为第四部分中p32抗体抗体检测结果；

图24为第四部分中p54抗体抗体检测结果；

图25为第四部分中ELISpot检测用分别用特异性抗原活化后T细胞IFN-γ分泌水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

第一部分仪器和试剂

以下实施例中使用的主要仪器设备：电热恒温培养箱HZ-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒温水槽DK-8D(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；海尔BCD-579WE 冰箱(海尔，中国上海)；CO₂恒温培养箱Forma 371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；PCR仪C1000 Touch(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪PowerPac Basic(Bio-Rad公司，美国)；超纯水仪Milli-Q(Millipore公司，美国)；生化培养箱LRH-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)。

以下实施例中使用的主要试剂：TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Streppenicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；常用限制性内切酶购自TAKARA；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113)购自南京诺维赞生物制品有限公司；pSFVCs-LacZ，pSFV-helper1，pEGFP-C1均购自addgene。BHK-21 细胞来自ATCC。

DTaqDNA聚合酶、10×PCR BufferMgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、Marker、SanPrep 柱式质粒DNA少量抽提试剂盒、琼脂糖均购自生工生物工程股份有限公司；4S Red Plus核酸染色剂购自BBI；ClonExpressMultis One Step Cloning Kit，(C113)购自南京诺维赞；2xqPCR Mix购自诺唯赞；胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)，感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；无内毒素纯质粒DNA提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)购自OMEGA公司；转染试剂Lipofectamine 3000Regeant购自Invitrogen公司；猪淋巴细胞分离液购自深圳市达科为生物技术股份有限公司；非洲猪瘟病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒购自肇庆大华农生物药品有限公司；AsurDxTM ASFV p54 Antibodies Test Kits购自BioStone；PorcineIFN-gamma ELISpotPLUS kit(HRP)购MabTech；Goat Anti-Swine IgG(H+L)HRP/IFTC-conjugated AffiniPure Goat Anti-Swine IgG(H+L)购自Jackson ImmunoResearch；非洲猪瘟阳性血清来自中国兽医药品监督所。anti-Flag Affinity gel kit购至碧云天；蛋白浓宿管购于Thermo Scientific Pierce PES#88513。

胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)、DMEM培养基(DMEM/High glucose)、0.25％Trypsin-EDTA等试剂均来自Gibco公司。

pSFV-EGFP-CMV，pXJ40-flag为本研究拥有。

第二部分pSFV-EGFP-CMV的开发和制备

以下实施例中PCR扩增所用引物如下表1所示。

表1.引物序列对应表

扩增PCR片段的试剂均为购自TAKARA的高保真PCR反应试剂盒Prime STAR GXL(R050)。方法完全按试剂盒说明书进行。菌落PCR则使用购自TAKARA的Premix-Taq(RR902A)。方法完全按试剂盒说明书进行。

以下实施例中体外同源重组用购自南京诺维赞ClonExpressMultis One StepCloning Kit，(C113)。方法完全按试剂盒说明书进行。

以下实施例中细胞转染用Invitrogen的Lipofectamine LTX DNATransfectionReagents转染试剂，并严格按试剂盒指导方法进行转染。

以下实施例中细胞培养采用常规细胞培养方法，含6-10％FBS，1％PS的DMEM培养基，于37℃5％CO₂细胞培养箱内培养。

pSFV-EGFP-CMV的制备

(1)用EGFP基因取代pSFVCs-lacZ中的lacZ序列，制取质粒pSFVCs-EGFP：

A.用BamHI/SmaI双酶切pSFVCs-lacZ质粒DNA(图1)，胶纯化11845bp片段。

B.以pEGFP-C1为模板，用EGFP-F/EGFP-R引物(见表1)通过PCR扩增长度为754bp的EGFP基因DNA片段。

C.将上述两片段进行体外同源重组。

D.将重组产物转化进DH5α感受态细胞。

E.用EGFP-F/EGFP-R引物进行菌落PCR筛选，正确产物为754bp。

F.分别取2个PCR阳性的菌落进行扩增培养，用试剂盒提取质粒DNA。用BamHI和SmaI进行双酶切鉴定。正确的质粒将产生两个分别约为11845bp和726bp的DNA片段(如图2所示)

G.将酶切正确的质粒送DNA测序验证。将验证正确的质粒命名为pSFVCs-EGFP(质粒示意图如图3所示)，置-20℃保存。

(2)改建pSFVCs-EGFP-CMV质粒：

A.用PvuI和EcoRV双酶切pSFVCs-EGFP质粒DNA，胶纯化回收10967bp片段。

B.以pSFVCs-EGFP质粒为模板，用EcoRV-F/EcoRV-R引物做PCR扩增，胶回收309bp片段。

C.以pSFVCs-EGFP质粒为模板，用PvuI-F/PvuI-R引物做PCR扩增，胶回收1333bp片段。

D.以pEGFP-C1质粒为模板，用CMV-F/CMV-R引物做PCR扩增，胶回收549bp片段。

为了提高CMV启动子的转录效率，在常用的CMV启动子与SFV基因组的起始位点间特别引入了20个碱基(CMV-R中的GACGGTTTATATAACGAGCTC)。

E.将上述4个片段做体外同源重组。

F.将同源重组产物转化进Top10感受态细胞。

G.分别用PvuI-F/CMV-R(左)和CMV-F/EcoRV-R(右)引物进行菌落筛选。正确产物分别为1864bp和837bp。结果如图4所示。

H.分别取上述两个PCR均为阳性的单菌落进行扩增培养，并提取质粒DNA。分别用BamHI/NotI(左)和BamHI/EcoRV(右)进行酶切鉴定。正确的质粒将分别产生两个DNA片段10996bp/2085bp；7946bp/5135bp，其结果如图5所示。

I.将上述质粒送DNA测序验证。结果证实原pSFVCs-EGFP质粒中的SP6启动子已被CMV启动子取代。将此改造后的质粒命名为pSFVCs-EGFP-CMV，质粒图示如图6所示。

(3)改建pSFV-EGFP-CMV质粒：

A.用BglII/BamHI双酶切pSFVCs-EGFP-CMV质粒DNA，胶纯化10866bp片段。

B.以pSFVCs-EGFP-CMV为模板用引物BglII-F/BamHI-R扩增745bp PCR片段，然后胶纯化回收。

C.以pSFVCs-EGFP-CMV为模板用引物BamHI-F/EGFP-R扩增754bp PCR片段，然后胶纯化回收。

D.将上述3片段进行体外同源重组。

E.将重组产物转化进DH5α感受态细胞。

F.用BglII-F/EGFP-R引物进行菌落PCR筛选阳性菌落。正确PCR产物应为1467bp。

G.分别取2个PCR阳性的单菌落进行扩增培养，提取质粒DNA，并用BglII/SmaI进行双酶切鉴定。正确的质粒将产生两个DNA片段。分别为10847bp和1434bp的片段(如图 7所示)

H.将正确的质粒命名为pSFV-EGFP-CMV(质粒图如8所示)。

(4)改建pSFV-Helper1-CMV：

A.以pSFVCs-EGFP-CMV质粒DNA为模板，用引物SphI-F/SalI-R扩增长度为1289bp的PCR片段，胶纯化回收。

B.用SphI/SalI双酶切pSFV-helper1质粒DNA，胶纯化回收7543bp片段。

C.将上述两片段做体外同源重组。

D.将重组产物转化进DH5α感受态细胞。

E.用引物SphI-F/SalI-R进行菌落PCR筛选，正确产物为1289bp。

F.分别扩增两个PCR阳性的单菌落，提取质粒DNA。

G.用SphI/SalI双酶切上述质粒DNA。正确的质粒会产生分子量为7453bp和1249bp的DNA片段(如图9所示)。

H.将酶切正确的DNA进行测序验证后保存。该质粒命名pSFV-Helper1-CMV(质粒图如图10所示)。

(5)检测pSFV-EGFP-CMV的表达水平：

用3微克pSFV-EGFP-CMV DNA转染BHK21细胞(35mm培养皿)。转染试剂用赛默飞的Lipofectamine^TMLTX Reagent with PLUS^TMReagent，方法完全遵照说明书进行。分别在转染后8h，24h，28h，32h和36h用荧光倒置显微镜进行观察。结果显示转染8h即有荧光表达，24h后出现大量荧光细胞。观察结果如图11所示(8h略)。该实验用不同批次质粒重复两次，结果一致。

(6)制备SFVEGFP复制缺陷型病毒粒子，测定P0代滴度：

取pSFV-EGFP-CMV和pSFV-helper1-CMV各1.5微克共转染BHK21细胞(35mm培养皿)。于转染后36h，48h，52h，60h收集细胞培养液进行10倍梯度稀释(10^-1-10^-8)。分别取100微升稀释液感染BHK21细胞(96-孔培养皿)。每个稀释度感染10个孔，2个空白对照。以一个荧光细胞代表一个病毒粒子计算。结果显示病毒粒子的滴度约在转染48小时达高峰，随之逐渐下降。最高可达约10⁷/ML(图12)，图13为P0代细胞外液做10^-1稀释后，取100 微升感染BHK21(96-孔培养皿)24h的荧光显微镜观察结果图。

通过以上结果可以证实本发明所得SFV复制缺陷型重组复制子载体表达系统能通过DNA 的方式或重组病毒的方式高效表达模式蛋白EGFP，且没有明显的安全隐患。可安全地应用于核酸疫苗和活病毒载体疫苗的开发，以及目的蛋白的制备。

第三部分pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备

(1)构建得到质粒pXJ40FlagP54；

(1.1)根据安徽ASFV毒株(GenBank:MK128995.1)中的ASFV p54的基因序列并在其5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGG-3’核苷酸序列，3’端加上 5’-GGGCTGCAGGAGCTC核苷酸序列，合成ASFV p54基因片段，所述ASFV p54基因的序列为SEQ ID NO.14；

(1.2)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pXJ40-flag，胶纯化载体DNA片段；

用BamHI/SmaI双酶切质粒pXJ40-flag，酶切体系共300uL，混匀后分成6管，每管50uL 置37C度孵育30分钟。

pXJ40-Flag质粒可见ZL201910894754.9主题为一种针对II类VII型流行NDV株DHN3 的感染性重组克隆方法的说明书的146-153段关于pXJ40-flag的来源渠道的记载。

体系如下表2：

表2酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，正确片段为4309bp。于紫外光线下将4309bp左右条带的凝胶切下，尽量避免切下过多的凝胶。切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而断裂。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，用DNA胶回收试剂盒，按说明进行胶回收，并测定DNA浓度。

(1.3)胶回收载体片段与所述p54合成片段(SEQID NO.14)用购自南京诺维赞的ClonExpressMultis One Step Cloning Kit，(C113)同源重组组试剂盒，按试剂盒说明书所述方法于冰上配置反应体系(下表)轻轻摇匀后短暂离心5秒钟，在37℃水浴锅中孵育30min 中，然后放置4℃或冰上冷却。

同源重组体系

同源重组后得到pXJ40-FlagP54质粒的结构图如图14所示。

(1.4)用重组产物转化DH5α细菌。

在冰上解冻DH5α化学感受态细菌，取10μL重组产物加入到100μLDH5α感受态细菌中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μLSOC，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。5，000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板。37℃培养箱中倒置培养16h。

(1.5)单菌落PCR鉴定

挑取单菌落4个左右分别接种至0.5ml含氨苄青霉素抗性的LB培养基中(2mL EP管)，置37℃摇床震荡培养约5个小时，然后进行菌液鉴定。鉴定片段为681bp，PCR体系如下表 2.

表2.菌液PCR体系

(1.6)提取质粒

取鉴定为阳性的菌液50uL接种于50mL含氨苄青霉素抗性的LB培养基中过夜培养。用 SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒，按试剂盒说明书进行质粒DNA制备并测定浓度。

(1.7)酶切鉴定及测序鉴定：

取0.3-0.5ug质粒DNA用SmaI、BamHI酶进行双酶切。方法完全按实际说明书进行。酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定(图16，pXJ40-FlagP54，BamHI+SmaI酶切；产物1：4311bp，产物2：576bp)，条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

(2)构建得到质粒pSFV-FlagP54-CMV；

(2.1)设计引物pSFV-p54-R并合成，所述引物pSFV-p54-R的序列(SEQ ID NO.22)为5’ttcaattaattacccgggTTACAAGGAGTTTTCT；

(2.2)利用所述引物pSFV-Flag-F(SEQ ID NO.23)，pSFV-p54-R和所述(1)构建得到的pXJ40-flagp54为模板，通过PCR扩增Flagp54片段。

所述Flagp54片段的特征是：含ASFV p54基因并在N-端与FLAG标签形成融合表达框。在所述Flagp54片段5’端和3’端分别携带与pSFV载体进行同源重组的同源臂；Flagp54片段总长度为593bp；

(2.3)用BamHI/SmaI酶双酶切质粒pSFV-EGFP-CMV；

取10μg质粒pSFV-EGFP-CMV，酶切体系共300μL，分成6管，每管50μL。反应体系和条件完全按照试剂盒说明书进行。

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在726bp、11555bp左右出现明显目的条带.按 (1.2)所述方法胶回收11555bp片段，并测定DNA浓度。

(2.4)将所述Flagp54片段和所述胶回收的11555bp片段进行同源重组，方法与前述(1.3) 相同；同源重组即可得到pSFV-FlagP54-CMV质粒，其结构如图15所示。

(2.5)将重组产物加入到DH5α感受态细菌进行转化；

(2.6)将转化后的细菌进行单菌落PCR鉴定；

(2.7)将鉴定正确的细菌进行扩增后提取质粒DNA；

(2.8)对所述质粒DNA进行酶切及测序鉴定。

具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(2)包括：

(B.1)目的片段的扩增

以pXJ40-flagp54为模板(图14)，用pFlag-F和pSFV-p54-R引物扩增Flagp54片段，PCR体系和条件如下表3-4所示：

表3.PCR扩增Flagp54反应体系

表4.Flagp54扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在593bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，用DNA胶回收试剂进行DNA回收，并测定DNA浓度。

(B.2)BamHI，SmalI双酶切10μg质粒pSFV-EGFP-CMV，酶切体系共300uL，分成6 管，每管50uL，体系如下表5-6：

表5.酶切体系

酶切结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，在3072bp、11851bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11851bp左右条带的凝胶切下，将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行 DNA回收，并测定DNA浓度。

(B.3)同源重组Flagp54片段和11851bp载体片段

于冰上配置以下反应体系(下表)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。

表6.同源重组体系

得到pSFV-Flagp54-CMV质粒。

(B.4)重组产物转化

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μLSOC，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应氨苄青霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5，000rpm离心5min，弃掉900μL 上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氨苄青霉素的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。

(B.5)重组产物鉴定

过夜培养后，挑取3-5单菌落分别接种至含氨苄青霉素的LB培养基200μL于2mL EP管中，置37℃摇床培养约5个小时，然后进行菌液鉴定。鉴定片段为594bp，鉴定PCR体系如下表7：

表7菌液PCR体系

取鉴定为阳性的菌液50uL接种至50mL含氨苄青霉素的LB培养基，于锥形瓶中震荡过夜培养。

(B.6)提取质粒

用SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒，按试剂盒说明书进行质粒DNA制备并测定浓度。

(B.7)酶切鉴定及测序：

用SmaI、BamHI双酶切质粒，酶切体系共20uL，如下表1-7：

表8酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，条带经鉴定正确后(图17，BamHI+SmaI酶切；产物1：11,557bp，产物2：563bp)，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

以上为构建质粒pSFV-Flagp54-CMV的详细方法。

其它类似质粒均可在pSFV-Flagp54-CMV的基础上，通过将p54更换成目的基因制得，得到：pSFV-Flagp22-CMV、pSFV-Flagp32-CMV、pSFV-Flagp72-CMV、pSFV-FlagpCD2v-CMV、 pSFV-FlagM448R-CMV、pSFV-Flag MGF505-7R-CMV、pSFV-FlagM1249L-CMV。

具体步骤是：

1.通过人工合成带同源臂的目的基因p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R 和M1249L片段，与所述11851bp长的pSFV载体片段同源重组(按方法B3-B7)即可得到如图一所示质粒DNA。

所述人工合成的带同源臂的目的基因p22，p30，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R 和M1249L片段核苷酸序列为SEQ ID NO.15-NO.21。注意同源重组时目的基因片段和载体片段的比例需按试剂说明书进行。

其中，p22基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCggatcc-3’核苷酸序列，3’端加上5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

P32基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上 5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

P72基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上 5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

PCD2v基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上 5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

pM448R基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

pMGF505-7R基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上 5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列；

M1249L基因的5’端加上5’-GACGATGATAAGTCCGGATCC-3’核苷酸序列，3’端加上5’-cccgggtaattaattgaa核苷酸序列。

第四部分动物实验

案例1

接种动物：30日龄，三花猪(品种民猪、杜洛克、大约克夏杂交)两头。

接种疫苗：用不含类毒素质粒DNA pSFV-flagP54-CMV，pSFV-flagCD2v-CMV和pSFV-flagp32-CMV各0.2mg；DNA溶剂为生理盐水，总容量为1.5ml；通过短暂涡旋混匀后形成鸡尾酒DNA。

接种途径：将所述DNA混合鸡尾酒分别肌肉注射至猪崽的股四头肌，颈斜方肌和耳部皮下。每处注射0.5ml，共1.5ml。接种一次后第14天抽静脉血进行细胞和体液免疫反应检测。每隔2周接种一次，共3次。

采样：每次接种前经无菌消毒后于静脉采血，分别制备血清和外周血PBMC细胞。

血清为常规制备方法。

PBMC制备方法用猪淋巴细胞分离液按试剂说明书进行。

检测：用非洲猪瘟病毒夹心ELISA p32抗体检测试剂盒和AsurDxTM ASFV p54Antibodies Test Kits，按试剂说明书方法对上述血清采集样本进行检测。用PorcineIFN-γ ELISpotPLUS kit(HRP)按试剂盒说明书使用方法进行IFN-γ测定。

结果示：特应性抗体检测1号猪抗p32和抗p54均为强阳性。2号猪仅有微弱反应。反应特异性细胞免疫的IFN-γ测定2号猪呈强阳性，1号猪仅有微弱反应，与对照比无显著性差异。由于受试猪不是纯种猪，因此每只猪的遗传背景和身体机能有所不同，因此对抗原刺激的反应可以不同。p32和抗p54抗体检测结果参考图23和图24；

上述PBMC分离，抗体检测和IFN-γ测定也可用其它类似试剂盒进行检测，IFN-γ测定具体可参考图25，抗原刺激物为p32蛋白，p54蛋白或CD2v人工合成多肽，CD2v人工合成多肽可参考序列(SEQ ID NO.27-28)。

案例2

对所述表达质粒的蛋白表达水平可以通过WB或IFA进行检测。

蛋白质免疫印迹(WB)：分别用pSFV-Flag32-CMV，pSFV-Flag72-CMV或 pSFV-Flag22-CMV转染BHK细胞。24小时后收集细胞裂解液进行SDS-PAGE蛋白电泳，然后进行WB鉴定。一抗可用anti-flag也可用ASFV抗血清。上述方法均为常规分子生物学方法，没有特别要求。具体结果可参考图18。

(2)间接免疫荧分析(IFA)：分别用pSFV-Flag32-CMV pSFV-Flag72-CMV， pSFV-FlagP54-CMV，pSFV-FlagM1249L-CMV转染BHK细胞(96-well平板)。24h后吸出培养液，用4％多聚甲醛固定细胞20min，再用PBS慢摇冲洗3min。冲洗三次后，用 0.5％TritonX-100(PBS)在室温下渗透细胞20min，再用PBS洗涤3次。用5％的山羊血清在室温下封闭细胞，孵育30min，然后用100μl(1：2000)稀释的ASF血清替换封闭液，并在 37℃的潮湿盒子中保存1小时或4℃过夜。取出抗体溶液，用PBS洗涤平板3次，每次缓慢摇晃3min。使用吸水纸吸收多余的液体，然后在每孔中加入100μl(1：500)稀释的荧光染料偶联二抗。在室温下孵育1小时后再用PBST洗板3次，每次3min。加入适量PBS液，在荧光显微镜下观察图像，拍照。注：一旦加入荧光染料偶联的二抗，所有后续的操作步骤都必须尽量避免光照。具体结果可参考图19。

蛋白纯化：分别用pSFV-Flag32-CMV，pSFV-FlagP54-CMV和另一阳性对照质粒转染BHK细胞。24小时后收集细胞裂解液。用anti-Flag Affinity Gel按说明书描述的方法进行纯化。纯化后的蛋白再加入0.5ml PBS稀释，转入蛋白浓缩管，离心12000g 1-3分钟，弃去液体，加0.5ml PBS按上述方法再洗涤2次后用适量PBS重悬浓缩蛋白，置-80保存。具体结果可参考图20。

图20中各代号的意义为：

M：Marker

1：P32、纯化产物(1.2ug)

2：其它

3：P54纯化产物(0.4ug)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gtccgaagag tgggatccca tggtgagcaa gg 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ttcaattaat tacccgggct tgtacagctc gtc 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tataaaccgt catggcggat gtgtgaca 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ctggaaggcg cactgccgat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ctccttcggt cctccgatcg 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

gtaacgcgta tgtgtatgat acataagg 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

catacacata cgcgttacat aacttacgg 29

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

atccgccatg acggtttata taacgagctc tgctagctct gcttatatag ac 52

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

ggtttaatga tcctcgaaga tc 22

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

ccttgctcac catgggatcc ggtgctataa tagtg 35

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

tattatagca ccggatccca tggtgagcaa gg 32

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

gcaaggaatg gtgcatgcaa g 21

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

tttgacatct cgtttcatgt cgacatcatt ctcctggaa 39

<210> 14

<211> 593

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

gacgatgata agtccggatc atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt 60

atggtgagtg tttgtcacca gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta 120

ttctcattgc tatcgtggtc ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt 180

caagaaagaa aaaagctgct gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc 240

aagatcagca gtgggtagaa gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga 300

ctacagcaag tgtaggcaag ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa 360

acaaaccagt tacggacaac ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg 420

cggccgcacc tgcggccgcg agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca 480

ctactcagaa cactgcttca caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca 540

cctatacgca taaagaccta gaaaactcct tgtaacccgg gctgcaggag ctc 593

<210> 15

<211> 573

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

gacgatgata agtccggatc catgtttaat attaaaatga caatttctac attgcttatt 60

gctcttatta tactacttat tattatttta gtagtgtttt tatactataa gaaacaacaa 120

ccaccgaaaa aggtctgtaa agtagataaa gattgtggta gtggagagca ttgtgttcgt 180

ggatcatgta gctcattgag ctgcttagat gccgtaaaaa tggacaaacg aaatattaag 240

atagattcta agatttcctc atgcgaattc actcccaatt tttaccgttt tacggatact 300

gctgctgatg agcagcaaga atttggaaaa acacggcatc ctataaaaat aactccatct 360

ccaagtgaat cccatagccc ccaagaggtg tgtgaaaaat attgttcatg gggaaccgat 420

gactgtacag gttgggaata tgttggtgat gaaaaggagg gaacatgtta tgtatataat 480

aatccacatc acccggttct taaatatggt aaggatcaca tcatagcctt acctagaaat 540

cataaacatg cataacccgg gtaattaatt gaa 573

<210> 16

<211> 624

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 16

gacgatgata agtccggatc catggatttt attttaaata tatccatgaa aatggaggtc 60

atcttcaaaa cggatttaag atcatcttca caagttgtgt ttcatgcggg tagcctgtat 120

aattggtttt ctgttgagat tatcaatagc ggtagaattg ttacgaccgc tataaaaaca 180

ttgcttagta ctgttaagta tgatattgtg aaatctgctc gtatatatgc agggcaaggg 240

tatactgaac atcaggctca agaagaatgg aatatgattc tgcatgtgct gtttgaagag 300

gagacggaat cctcagcatc ttcggagaac attcatgaaa aaaatgataa tgaaaccaat 360

gaatgcacat cctcctttga aacgttgttt gagcaagagc cctcatcgga ggtacctaaa 420

gactccaagc tgtatatgct tgcacaaaag actgtgcaac atattgaaca atatggaaag 480

gcacctgatt ttaacaaggt tattagagca cataatttta ttcaaaccat ttatggaacc 540

cctctaaagg aagaagaaaa agaggtggta agactcatgg ttattaaact tttaaaaaaa 600

aaataacccg ggtaattaat tgaa 624

<210> 17

<211> 594

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 17

gacgatgata agtccggatc catggattct gaattttttc aaccggttta tccgcggcat 60

tatggtgagt gtttgtcacc agtcactaca ccaagcttct tctccacaca tatgtatact 120

attctcattg ctatcgtggt cttagtcatc attatcatcg ttctaatcta tctattctct 180

tcaagaaaga aaaaagctgc tgctattgag gaggaagata tacagtttat aaatccttat 240

caagatcagc agtgggtaga agtcactcca caaccaggta cctctaaacc agctggagcg 300

actacagcaa gtgtaggcaa gccagtcacg ggcagaccgg caacaaacag accagcaaca 360

aacaaaccag ttacggacaa cccagttacg gacagactag tcatggcaac tggcgggccg 420

gcggccgcac ctgcggccgc gagtgctcct gctcatccgg ctgagcctta cacgacagtc 480

actactcaga acactgcttc acaaacaatg tcggctattg aaaatttacg acaaagaaac 540

acctatacgc ataaagacct agaaaactcc ttgtaacccg ggtaattaat tgaa 594

<210> 18

<211> 1122

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 18

gacgatgata agtccggatc catgataata cttatttttt taatattttc taacatagtt 60

ttaagtattg attattgggt tagttttaat aaaacaataa ttttagatag taatattact 120

aatgataata atgatataaa tggagtatca tggaattttt ttaataattc ttttaataca 180

ctagctacat gtggaaaagc aggtaacttt tgtgaatgtt ctaattatag tacatcaata 240

tataatataa caaataattg tagcttaact atttttcctc ataatgatgt atttgataca 300

acatatcaag tagtatggaa tcaaataatt aattatacaa taaaattatt aacacctgct 360

actcccccaa atatcacata taattgtact aattttttaa taacatgtaa aaaaaataat 420

ggaacaaaca ctaatatata tttaaatata aatgatactt ttgttaaata tactaatgaa 480

agtatacttg aatataactg gaataatagt aacattaaca attttacagc tacatgtata 540

attaataata caattagtac atctaatgaa acaacactta taaattgtac ttatttaaca 600

ttgtcatcta actattttta tacttttttt aaattatatt atattccatt aagcatcata 660

attgggataa caataagtat tcttcttata tccatcataa cttttttatc tttacgaaaa 720

agaaaaaaac atgttgaaga aatagaaagt ccaccacctg aatctaatga agaagaacaa 780

tgtcagcatg atgacaccac ttccatacat gaaccatctc ccagagaacc attacttcct 840

aagccttaca gtcgttatca gtataataca cctatttact acatgcgtcc ctcaacacaa 900

ccactcaacc catttccctt acctaaaccg tgtcctccac ccaaaccatg tccgccaccc 960

aaaccatgtc ctccacctaa accatgtcct tcagctgaat cctattctcc acccaaacca 1020

ctacctagta tcccgctact acccaatatc ccgccattat ctacccaaaa tatttcgctt 1080

attcacgtag atagaattat ttaacccggg taattaattg aa 1122

<210> 19

<211> 594

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 19

gacgatgata agtccggatc catggattct gaattttttc aaccggttta tccgcggcat 60

tatggtgagt gtttgtcacc agtcactaca ccaagcttct tctccacaca tatgtatact 120

attctcattg ctatcgtggt cttagtcatc attatcatcg ttctaatcta tctattctct 180

tcaagaaaga aaaaagctgc tgctattgag gaggaagata tacagtttat aaatccttat 240

caagatcagc agtgggtaga agtcactcca caaccaggta cctctaaacc agctggagcg 300

actacagcaa gtgtaggcaa gccagtcacg ggcagaccgg caacaaacag accagcaaca 360

aacaaaccag ttacggacaa cccagttacg gacagactag tcatggcaac tggcgggccg 420

gcggccgcac ctgcggccgc gagtgctcct gctcatccgg ctgagcctta cacgacagtc 480

actactcaga acactgcttc acaaacaatg tcggctattg aaaatttacg acaaagaaac 540

acctatacgc ataaagacct agaaaactcc ttgtaacccg ggtaattaat tgaa 594

<210> 20

<211> 594

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 20

gacgatgata agtccggatc catggattct gaattttttc aaccggttta tccgcggcat 60

tatggtgagt gtttgtcacc agtcactaca ccaagcttct tctccacaca tatgtatact 120

attctcattg ctatcgtggt cttagtcatc attatcatcg ttctaatcta tctattctct 180

tcaagaaaga aaaaagctgc tgctattgag gaggaagata tacagtttat aaatccttat 240

caagatcagc agtgggtaga agtcactcca caaccaggta cctctaaacc agctggagcg 300

actacagcaa gtgtaggcaa gccagtcacg ggcagaccgg caacaaacag accagcaaca 360

aacaaaccag ttacggacaa cccagttacg gacagactag tcatggcaac tggcgggccg 420

gcggccgcac ctgcggccgc gagtgctcct gctcatccgg ctgagcctta cacgacagtc 480

actactcaga acactgcttc acaaacaatg tcggctattg aaaatttacg acaaagaaac 540

acctatacgc ataaagacct agaaaactcc ttgtaacccg ggtaattaat tgaa 594

<210> 21

<211> 3788

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 21

gacgatgata agtccggatc catggaggaa gtaattacga tcgcgcaaat agtccaccgt 60

ggcacagata tcttatcgct caataatgag gaaatcgagg cactagtgga tgaaatctac 120

tctaccctta aagggtctaa tgatataaaa aacatacgtt taatagactt tcttttcact 180

ctaaaagatt ttgtgaacca tgttcgcgcc gagcagtcaa agctgcccga tctatccatg 240

cccatagagg cctacatacg tcaactgctg gtagaccccg atgtggtccc catcgtgagt 300

gaaaaaaaaa aggaattacg tgttcgccct agcacacgca aagaaatttt tttaattaat 360

gggacgcacc tggccgttcc cgcagaagcc cccattgaaa tctatggact taagttgcgg 420

ctaaaaactt tttccccgca gtgttttatg cgtatggctg agataggctc cttctcgcct 480

gaaaccttgg gctacgtcgc ctcaggagcc aatttgacca attttattcg agtatttatg 540

aaatgcgtgg atcaagaaac ctggaaaaaa aacggagaag gggttgtcgt aaccaccaag 600

gaaaacatca tccagtttac gcaccagtat atcgaacttt ataagttttt gcggagcggc 660

gggcatagct ggctcattaa tcggctagca gaggagatgg tacaccgaaa gctagaccgt 720

gaggatcagg gcagtcatat atctaatatc gttgaaaccg aggagattga accggaggag 780

aacattaagc gcgtgatatt ttttttaaaa gagttgtcta cgatgtactc ggtgtccccg 840

gtttttacat cgggatacat gcccttgctt tatgacctat atagagcagg ctatttggag 900

gtgctttgga accctgtaga acaaaagttt ttacaacatg ctgaacagcg tgaaaaggag 960

caaatgattc tgcagcaggt ggacatgaag ctcacagagg tcattaccca ggcgagacag 1020

tattttaaaa ttatggaaga aaaaataggt agggtgcagt cggatgctat acgtgaaatt 1080

cttacaatgg agggtaaagt ggatgaccct aacagcatcc ttcaagaagt cattaaagcc 1140

tgtgggaaac aggaggcaga acttattaca acagaatacc taaacattaa aaaacagtgg 1200

gaactccaag aaaaaaatgc atgtgctcat ctcaagctgg taaaacagtt gcgttcgggt 1260

cttcaatacg cggagttatt aaaagtatta gaaagtattc gtgtactcta caaggaaaaa 1320

aacaatacca ccaattggaa tctatgcaaa gcctgcgggt ttaagctgct ttgtccccat 1380

gtggacatgc ttatacagct tcaagcggca gaagcgtcct acgacaccat gcgaaccaag 1440

ctaatgaaat tttcaggaat aaacaaggag aaagaaaaca accaggggct tatttactcc 1500

tacttttgca aaatttgtgg cgaagagctg gcccatttta ttcaagagga tcgtacggca 1560

gatgtgggca tcatcggcga tcttaatagt aagctccgtg tttttatttg gcaggaaacc 1620

atgaaggcct gcacgtttat ccactttgga aagcttgtag acgtgaaaca gtttgccaat 1680

atagccgtaa atgtctgcct gccgctcgtg tatagcatcg aaaatattaa aaaggaagag 1740

gattacgatc ctttaacgca gctgtatgct gtgatctaca tctatgccta tattttgaat 1800

ctcatttata gctcgcaaaa aaataaagaa tttcttacga ttaccattca tggaatgaag 1860

gcggatagct ctttgaatgc atacgtgacc tttcttttgg agaaaatgat gcagcaatat 1920

agcggtataa taaatcagct atctgagatt acggatcagt ggattgctaa taattttcgg 1980

gaggctttca aaaaaattat ccaccaaaat gggctacaag ggcttagcgt gcaggacgac 2040

accaaggtac ttttgacaga gattctgctg gaccccatgt atgattatgc tgccacagtg 2100

gcccgtattg acggcagcat ccctatgcac aaaccacgga ctcccaagga ggctgaatat 2160

gagtttaaaa ccgtgatagg acgtaccccg gccgagctat tatcgcaaaa agaattttat 2220

gataaaattt atacctctaa atatcggcct gattttacgc agttgacgcg tctgaatgac 2280

atctattttc aagaagaaag cctgcgggtg tggtggggag gacgggatga ggaaaaaacc 2340

tcaactctca tttaccttag agcctatgaa ttatttctta agtatttaca aaatgcacct 2400

aattttaact ccgaacttgc agaattcaaa acgtacgaaa atgcttatgg cgagcaaaag 2460

gccctgcttg ctcagcaagg attttataac atatttgatc ctaacacagg aagagccgac 2520

caacggactc ggctgtttga gtataaaagg cttcccattt caaccctata cgatgaaagg 2580

gggcttcctc ataagtggac catttacgtt tacaaggccg tagacagttc gcagaaaccc 2640

gccgagattg aagtaacacg caaagacgtc ataaaaaaaa ttgacaacca ttatgcactt 2700

gccgatctac gctgttctgt atgccacgtg ctacaacatg aggtggggca attaaacata 2760

aaaaaggtcc aaacagccct aaaggcgagc ttagaattta acacctttta tgccttctac 2820

gagtcacgct gccccaaggg aggattacac gacttccagg ataaaaaatg tgtcaagtgc 2880

ggacttttta cctatattat atacgatcat ctttctcaac ccgaattagt tcatgactat 2940

tataataatt ataaagacca gtacgataag gaaaagatgt cgatccgttc tattcaaata 3000

aagaaagata tgaccacgcc ctccaccgaa acacaaccca agcctccaca ggagccatgg 3060

actttcgatt acggaaaaat aatcaagacg gccaagattt tggatatcag tcctgctgtg 3120

atagaggcca taggggccat ggaggggcgc tcctacgcag acatcaggga aggccagggt 3180

gccccgccac cacctacctc aatggatgat ccaaggctca tggcggtcga ctctgccgta 3240

cgtattttct tatataatta taactgtttg cggcacgtta gtacatttaa caagcctcct 3300

atacatgttg aaaggcttgt aaagcacctg tcgtacgagg aaaaggagga tttggaaaag 3360

gtgctgccta acgttgtgaa tgaatatcac actacattta aacacctacg ggtaacagat 3420

cctgccagcg ccttgcttta ctctatagaa tttttatgta taagtttctt aacgctgtat 3480

gaaattaaag agccctcctg ggttgtgaat attgtgagag agtttgcgct gacagaactc 3540

aacactatta ttcaaagcga aaagctgtta agtaagcccg gtgcatttaa ctttatgatt 3600

tttggagagg actttgtgtg ctctggggaa gatagctcca tggacgacat ctcggcctac 3660

agttctcccg gactttttgg ggaagacatt attgaccggc tcgatgaccc ttttagcatc 3720

gaggatgttg acatttcttt agatgtgttg gacaacttag cgccccagta cccgggtaat 3780

taattgaa 3788

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 22

ttcaattaat tacccgggtt acaaggagtt ttct 34

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 23

tatagcacca tgaatggatc atggactaca aggac 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 24

gccgtaaaac gtttgcgtag 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 25

gtaccgagct cctgcagc 18

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 26

acgatgataa gtccggatcc 20

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 27

Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr

1 5 10 15

Cys Gly Lys

<210> 28

<211> 26

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 28

Thr Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu

1 5 10 15

Leu Thr Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr

20 25

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 29

caccatggac tacaaggac 19

Claims

1.一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒，其特征在于，采用含塞姆利基森林病毒复制子的载体，并将p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R和M1249L基因分别插入所述载体而得；所述p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505-7R基因序列依次如SEQ ID NO.15-NO.21所示。

2.一种如权利要求1所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述pXJ40-FlagpX质粒的制备方法如下：

(1)用BamHI/SmaI酶切，双酶切线性化pXJ40-flag载体；

3.根据权利要求2所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，其特征在于，含塞姆利基森林病毒复制子的载体的制备方法为：

S1.用EGFP基因取代pSFVCs-lacZ中的lacZ序列，得到质粒pSFVCs-EGFP；

S2.将pSFVCs-EGFP质粒中的SP6启动子更换为CMV启动子，得到质粒pSFVCs-EGFP-CMV；

S3.删除pSFVCs-EGFP-CMV质粒中的SFV病毒壳膜蛋白序列，得到质粒pSFV-EGFP-CMV。

4.根据权利要求3所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，其特征在于，步骤S1具体操作过程如下：

所述引物序列如下：

EGFP-F：5’-gtccgaagagtgggatcccATGGTGAGCAAGG-3’；(SEQ ID NO:1)；

EGFP-R：5’-ttcaattaattacccgggcttgtacagctcgtc-3’；(SEQ ID NO:2)。

5.根据权利要求4所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，其特征在于，步骤S2具体操作过程如下：

E.将上述片段2～5进行体外同源重组，得到质粒pSFVCs-EGFP-CMV；

所述引物序列如下：

EcoRV-F：5’-tataaaccgtcatggcggatgtgtgaca-3’；(SEQ ID NO:3)；

EcoRV-R：5’-ctggaaggcgcactgccgat-3’；(SEQ ID NO:4)；

PvuI-F：5’-ctccttcggtcctccgatcg-3’；(SEQ ID NO:5)；

PvuI-R：5’-gtaacgcgtatgtgtatgatacataagg-3’；(SEQ ID NO:6)；

CMV-F：5’-catacacatacgcgttacataacttacgg-3’；(SEQ ID NO:7)；

CMV-R：5’-atccgccatgacggtttatataacgagctctgctagctctgcttatatagac-3’；(SEQ IDNO:8)。

6.根据权利要求5所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒的制备方法，其特征在于：步骤S3具体操作过程如下：

A.用BglII/BamHI双酶切pSFVCs-EGFP-CMV质粒DNA，胶纯化10866bp片段6；

D.将上述片段6～8进行体外同源重组，得到质粒pSFV-EGFP-CMV；

所述引物序列如下：

BglII-F：5’-ggtttaatgatcctcgaagatc-3’；(SEQ ID NO:9)；

BamHI-R：5’-ccttgctcaccatgggatccggtgctataatagtg-3’；(SEQ ID NO:10)；

BamHI-F：5’-tattatagcaccggatcccatggtgagcaagg-3’(SEQ ID NO:11)

EGFP-R：5’-ttcaattaattacccgggCTTGTACAGCTCGTC-3’；(SEQ ID NO:2)。

7.一种鸡尾酒混合疫苗，其特征在于，采用多种如权利要求1所述的pSFV-flagX-CMV复制子质粒制备得到。

8.根据权利要求7所述的鸡尾酒混合疫苗，其特征在于，含三种pSFV-flagX-CMV复制子质粒；三种pSFV-flagX-CMV复制子质粒分别含P54、CD2v、p32基因。