CN113666990A - 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了一种诱导广谱抗冠状病毒的T细胞疫苗免疫原及其应用。具体而言，本文涉及分离的免疫原性肽，其包含选自各种冠状病毒早期表达蛋白多聚蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、囊膜蛋白和刺突蛋白的一种或多种共享肽；其编码分子、载体或宿主细胞、产品；及其制备方法和应用。本文的疫苗安全、可持续产生高效价广谱T细胞应答，可用于各种冠状病毒的预防和治疗。

Description

一种诱导广谱抗冠状病毒的T细胞疫苗免疫原及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，尤其是抗病毒疫苗。具体而言，本发明涉及一种诱导广谱抗冠状病毒的T细胞疫苗免疫原、及其制备和应用。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)，是一类在动物与人类之间传播的人畜(禽)共患的单链RNA病毒，可感染哺乳动物、鸟类，引起牛和猪的消化道疾病或鸡的上呼吸道疾病。冠状病毒在自然界中很常见，据悉，15％到30％的普通感冒都是由这些病毒导致的。
冠状病毒是由单一的核糖核酸(RNA)构成，这种RNA和N蛋白共同组成病毒。由于其遗传物质是RNA，因此非常容易出现变异。到目前为止，大约有45种不同冠状病毒株被发现，它们能够感染多种哺乳动物和鸟类。至于可感染人的冠状病毒有七种，分别为SARS-CoV-2、229E、NL63、OC43、HKU1、SARS以及MERS，其中第2至5种病毒会引起普通的感冒症状。从冠状病毒相关疾病爆发的规律来看，具有每隔几年爆发的周期性。因此，设计出广谱抗冠状病毒的疫苗至关重要。
自从Doherty和Zinkernagel发现细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能够杀伤外源微生物感染细胞，而且这种杀伤作用依赖于CTL对外源多肽和自身分子(MHC) 的双重识别之后，越来越多的研究表明：病毒特异性的CTL介导的细胞免疫具有清除病毒的功能，是宿主防御病毒感染的主要机制之一。Doherty和Zinkernagel也因他们的发现于1996年获得了生理和医学诺贝尔奖。正因为此， CTL表位及CTL介导的细胞免疫应答的研究受到越来越多的关注，后续则提出了T细胞疫苗的概念。
冠状病毒疫苗免疫后的动物，再次暴露于活病毒时，可能发生更严重的症状。疫苗免疫产生的非中和抗体或较低的抗体水平可能会引起抗体依赖性增强效应 (antibody-dependent enhancement,ADE)，增强病毒致病性。已有的科学研究显示，有些无症状COVID-19感染者虽然没有明显的抗体免疫反应，但是体内存在针对新冠病毒的记忆T细胞。因此，为了减少ADE副作用，同时设计广谱抗冠状病毒的疫苗，T细胞疫苗或许能够作为其发展方向。
发明内容
本发明正是提供了可用于广谱抗冠状病毒感染的免疫原性肽、其产品、制备方法及应用。
在本发明的第一方面中，提供了一种分离的免疫原性肽，其包含选自下组的一种或多种冠状病毒蛋白共享肽：
(a)冠状病毒早期表达蛋白多聚蛋白(ORF1ab)的共享肽；
(b)冠状病毒膜蛋白(M)的共享肽；
(c)冠状病毒核衣壳(N)蛋白的共享肽；
(d)冠状病毒囊膜蛋白(E)蛋白的共享肽；和
(e)冠状病毒刺突蛋白(S)蛋白的共享肽。
在一些实施方式中，免疫原性肽包含选自下组中的一个或多个肽段：SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:29。
在一些实施方式中，由所述免疫原性肽激活的T细胞特异性结合于选自下组的冠状病毒表位：PLPDRWYFYYT(SEQ ID NO:11)；KPISAYAFLMA(SEQ ID NO:13)；LSPRWYFYYL(SEQID NO:30)；LAPRWYFYYTG(SEQ ID NO: 31)；VPAYSFLPG(SEQ ID NO:32)；和/或APISAMVRMYIFFA(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方式中，共享肽来源于选自下组的冠状病毒：SARS-CoV-2、 SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 bat-CoV。
在一些实施方式中，ORF1ab的共享肽包含SEQ ID NO:1所述氨基酸序列，例如，所述ORF1ab的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方式中，M蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:3所述氨基酸序列，例如，所述M蛋白的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方式中，N蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:5所述氨基酸序列，例如，所述N蛋白的共享序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方式中，S蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:7所述氨基酸序列，例如，所述S蛋白的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一些实施方式中，免疫原性肽还包含：两种或以上所述共享肽的连接肽，所述共享肽之间包含或不包含接头序列，例如所述接头序列选自下组：(G4S)n(n ＝1～8，例如(G4S)3、G4S)、GSAGSAAGSGEF、(Gly)6、EFPKPSTPPGSSGGAP、 KESGSVSSEQLAQFRSLD、(Gly)8、EGKSSGSGSESKST、IRES、P2A、T2A。
在一些实施方式中，免疫原性肽还包含与共有序列共表达(例如融合表达 或单独阅读框表达)的其他序列，所述其他序列用于例如扩大抗病毒谱、提高 免疫应答诱导能力，所述其他序列选自例如针对如下病毒的免疫原：冠状病毒 (例如RBD或其修饰序列(如末端Cys修饰RBD氨基酸序列))、流感病毒(例如 HA2)、艾滋病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、 疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革 病毒、汉坦病毒)，尤其是与活化B细胞应答的免疫原，制备能够同时激活中和抗体与T细胞应答的复合疫苗。
在一些实施方式中，与本申请的免疫原性肽共表达的序列为选自下组的免疫调节序列：IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF、CD40L、CD40刺激抗体、PD-1与PD-L1抗体、CTLA4抗体、趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、 CXCL12、CXCL3、XCL1、CCL4、CCL20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、FimH及SopE。
在一些实施方式中，免疫原性肽包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，例如，所述免疫原性肽的序列如SEQ ID NO:9所示；或者，其包含SEQ ID NO: 37和/或38所示的氨基酸序列，例如，所述免疫原性肽的序列如SEQ ID NO:37 和SEQ ID NO:38所示。
在本文的一些方面中，提供了本文免疫原性肽的编码分子，包含所述编码分子的载体和/或包含所述编码分子或载体的宿主细胞。
在一些实施方式中，所述编码分子包含选自下组中的一个或多个核苷酸分子：SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO:36；可任选地，所述核苷酸分子之间包含或不包含接头序列，所述编码分子包含或不包含前导序列，所述核苷酸分子包含或不包含标签，例如His-tag、AviTag、Calmodulin tag、polyglutamate tag、E-tag、FLAG tag、HA-tag、 Myc-tag、S-tag、SBP-tag、Sof-tag 1、Sof-tag3、Strep-tag、TC tag、V5 tag、T7 tag、VSV tag、Xpress tag、3X FLAG tag、Isopeptag、Spytag、Snoop tag和PNE tag。
在一些方面中，提供了一种产品，其包含：本文的免疫原性肽和/或编码分子、载体或细胞；和可任选的，药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂和/ 或佐剂(例如选自下组的一种或多种佐剂：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、 Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、 IL-21)。
在一些实施方式中，所述产品为例如抗冠状病毒感染的T细胞疫苗或药物，尤其是针对冠状病毒的广谱T细胞疫苗或药物，所述冠状病毒选自下组： SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、bat-CoV，尤其是SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒。
在一些实施方式中，所述产品包含本文所述的免疫原性肽的缀合物或偶联物。
在一些实施方式中，所述产品选自：核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒(例如痘病毒(如选自天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株的痘病毒)、腺病毒(如选自Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、AdC68的腺病毒)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒)载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。
在一些实施方式中，所述产品的形式适于选自下组的给予方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合。
在一些实施方式中，所述产品适于与冠状病毒S或S1所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的S或S1：SARS-CoV-2、SARS-CoV、 MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV。
在一些实施方式中，所述产品适于与流感病毒HA或HA2所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的HA或HA2：H1-H18。
在本文的一些方面中，提供了一种获得本文的免疫原性肽的方法，所述方法包括：
i)对各种冠状病毒(例如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒)的一种或多种选自下组的蛋白质进行大数据分析，提取出其共享肽序列信息：冠状病毒早期表达蛋白多聚蛋白(ORF1ab)、冠状病毒膜蛋白(M)、冠状病毒核衣壳(N)蛋白、冠状病毒囊膜蛋白(E)蛋白和冠状病毒刺突蛋白(S)蛋白；
ii)对所得共享肽序列信息进行T细胞表位预测，获得具有免疫原性的保守区域信息；
iii)根据所述保守区域信息设计并制备免疫原性肽或其编码序列；
iv)可任选地，对所得免疫原性肽或其编码序列进行组合或将其与共表达 (例如融合表达或单独阅读框表达)的其他序列进行组合，所述其他序列用于例如扩大抗病毒谱、提高免疫应答诱导能力。
在本文的一些方面中，还提供了本文的免疫原性肽和/或编码分子、载体或细胞在制备抗冠状病毒感染的产品中的应用。
在一些实施方式中，所述产品为抗冠状病毒感染的T细胞疫苗或药物，尤其是针对冠状病毒的广谱T细胞疫苗或药物。在一些实施方式中，所述冠状病毒选自下组：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、 HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV，尤其是SARS-CoV、MERS-CoV和 SARS-CoV-2病毒。在一些实施方式中，所述产品包含：含本文免疫原性肽的缀合物或偶联物。
在一些实施方式中，产品包含：药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂和/或佐剂(例如选自下组的一种或多种佐剂：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、 IL-18、IL-21。
在一些实施方式中，产品选自：核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒(例如痘病毒(如选自天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株的痘病毒)、腺病毒(如选自Ad5、 Ad11、Ad26、Ad35、AdC68的腺病毒)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒)载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。
在一些实施方式中，所述产品的形式适于选自下组的给予方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合。
在一些实施方式中，所述产品适于与冠状病毒S或S1所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的S或S1：SARS-CoV-2、SARS-CoV、 MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV。
在一些实施方式中，所述产品适于与流感病毒HA或HA2所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的HA或HA2：H1～H18。
在本文的一些方面中，还提供了本文免疫原性肽在制备检测冠状病毒感染的产品中的应用，例如，所述免疫原性肽单独或与MHC形成的肽-MHC复合物单聚体或多聚体(如二聚体、四聚体)。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：新型冠状病毒整体基因组信息。
图2：CoV T腺病毒的构建及验证：
图2A：pAdC68XY3-CoV T质粒构建图谱；
图2B：腺病毒AdC68-CoV T酶切鉴定图。
图3：AdC68-CoV T在hACE2+ ICR小鼠体内的免疫原性：
实验所用小鼠为6-8周龄雌性hACE2+ ICR小鼠，免疫原为腺病毒 AdC68-CoV T。
图3A：ELISPOT方法检测免疫结束后第1周小鼠的T细胞应答。横坐标为免疫组别，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量，*表示 p<0.05；
图3B：ELISPOT方法检测免疫结束后第1周小鼠的T细胞应答。横坐标为单个肽库名称，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量；
图3C：ELISPOT方法检测免疫结束后第1周小鼠的T细胞应答。横坐标为单肽名称，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量。
图中R10表示RIPM培养基加入10％FBS及1％双链霉素(P.S.)，作为阴性对照。
图4：AdC68-CoV T免疫后小鼠的脾细胞对多种冠状病毒表位的应答：
实验所用小鼠为6-8周龄雌性hACE2+ ICR小鼠，免疫原为腺病毒 AdC68-CoV T。ELISPOT方法检测免疫结束后第1周小鼠脾细胞针对多种冠状病毒表位的T细胞应答。横坐标为单肽名称，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌 IFN-γ的细胞数量。
图5：AdC68-panCoV/Flu腺病毒的构建和表征：
图5A：重组质粒pAdC68XY3-panCoV/Flu的构建图谱；
图5B：腺病毒AdC68-panCoV/Flu基因组的双酶切鉴定。
图6：AdC68-panCoV/Flu腺病毒在HFH4-hACE2小鼠体内的免疫原性及蝙蝠冠状病毒SHC014攻毒保护试验：
图6A：AdC68组和AdC68-panCoV/Flu组的结合抗体滴度比较；
图6B：AdC68组和AdC68-panCoV/Flu组的中和抗体滴度比较；
图6C：AdC68组和AdC68-panCoV/Flu组的T细胞应答比较；
图6D：AdC68组和AdC68-panCoV/Flu组的攻毒后小鼠体重变化比较；
图6E：AdC68组和AdC68-panCoV/Flu组的攻毒后小鼠生存率比较。
具体实施方式
本公开涉及疫苗领域，特别涉及一种诱导广谱抗冠状病毒的T细胞疫苗免疫原的设计与验证。动物实验结果证实，本公开的疫苗安全，可产生高水平的 T细胞应答，可用于冠状病毒的预防和治疗。
具体而言，本公开中选择冠状病毒早期表达蛋白polyprotein(ORF1ab)等为主要免疫原，并结合对S、E、M和N蛋白基因的分析，通过大数据收集1370 条冠状病毒序列后，从中提取共享序列，并进行T细胞表位预测，将免疫原性高的保守区域组合起来，从而形成T细胞疫苗免疫原，该抗原覆盖了目前几乎所有的致病性冠状病毒。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
定义
本文所用的术语“肽”指某一分子，所述分子包含2-200个氨基酸、由肽键连接的氨基酸序列，但其在具体实施方式中可包含非氨基酸结构(例如，连接有机化合物)。本发明所述的肽可包含任意20个常规氨基酸或其修饰形式，或可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰引入的非天然氨基酸。
本文所用的术语“表位”指蛋白质或因子的一个或数个部分(其可定义一个构象表位)，所述部分被抗体或其部分(Fab'、Fab2'等)或存在于B或T细胞淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合，并能够通过所述结合来诱导免疫应答。
本文所用术语“T细胞表位”或“T细胞表位”指被T细胞的细胞表面受体特异性识别并结合的抗原性蛋白质或因子的部分。T细胞表位可以是显性、亚显性或隐性T细胞表位，这取决于针对所述表位引起的免疫反应。显性取决于所述表位在蛋白质的所有可能T细胞表位中被T细胞识别以及能够激活T细胞的频率。具体而言，T细胞表位是由MHC I型或MHC II型分子结合的表位。蛋白质序列中的T细胞表位可通过功能性实验和/或一种或多种模拟预测实验来鉴定。本文肽内存在的T细胞表位可由8-25个氨基酸，8-16个氨基酸组成，或可由8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成，例如10、11或 12个氨基酸组成。
本文免疫原性肽的T细胞表位可以对应蛋白质的天然表位序列，或者可以是其修饰形式，前提是修饰的T细胞表位与天然T细胞表位序列相似，保留其与MHC结合的能力。修饰的T细胞表位就MHC蛋白而言可具有与天然表位相同的结合亲和性，但也可以具有较低亲和性。在具体的实施方式中，经修饰肽的结合亲和性相较原始肽降低不小于10倍，更优选降低不小于5倍。
术语“MHC”指“主要组织相容性抗原”。在人类中，MHC基因被称为 HLA(“人白细胞抗原”)基因。虽然没有一致遵循的习惯，一些文献使用HLA指代HLA蛋白分子，而使用MHC指代编码HLA蛋白的基因。如此，本文使用的术语“MHC”和“HLA”可互换使用。在人中的HLA系统在小鼠中具有其等价物，例如，H2系统。最详尽研究的HLA基因是9个所谓的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、 HLA-DRA和HLA-DRB1。在人类中，MHC分为3种：I、II和III型。
MHC I型分子在几乎所有的有核细胞上表达。在I型MHC分子中呈递的肽片段由CD8+T淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞或CTL)识别。CD8+T淋巴细胞常常成熟为细胞毒性效应子，其可以裂解带有刺激抗原的细胞。II型MHC 分子主要在激活的淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达。利用对II型MHC分子呈递的独特的肽片段的识别来激活CD4+T淋巴细胞(辅助T淋巴细胞或HTL)，通常在像巨噬细胞或树突细胞的抗原呈递细胞上发现这种II型MHC分子。 CD4+T淋巴细胞增殖并分泌细胞因子，其通过产生IL-4和IL-10支持抗体介导的应答或通过产生IL-2和IFN-γ支持细胞介导的应答。本申请的免疫原性肽可结合CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
T细胞表位可以仅仅由结合至主要组织相容性复合物(MHC)的槽的氨基酸组成，或可以包含连同侧接氨基酸残基的相同氨基酸。这类侧接残基并非有助于表位与MHC的结合而是“伸出”MHC槽外。侧接残基可以存在于T细胞表位的MHC结合部分的N-末端和/或C-末端。
免疫原性肽及其设计
本文中提供了一种免疫原性肽，其通过选择各种类型冠状病毒的早期表达蛋白多聚蛋白(ORF1ab)、膜蛋白、核衣壳蛋白、囊膜蛋白以及刺突蛋白等为主要免疫原，通过大数据收集大量(如1370条)冠状病毒序列后，从中提取共享序列，并进行T细胞表位预测，将免疫原性高的保守区域单独或组合起来，从而形成T细胞免疫原。本文的免疫原性肽覆盖了目前几乎所有的致病性冠状病毒。表位预测可通过对冠状病毒序列和CD8+ /CD4+T细胞的分析获得，例如可通过对本文所述的共享序列进一步进行CD8+T细胞表位预测来获得本文的表位序列。CD8+T细胞表位预测软件是本领域中已知的，包括但不限于 http://tools.immuneepitope.org/main/tcell/和http://www.syfpeithi.de/所提供的软件等。
如本文所用，术语“共享肽”和“共享序列”可互换使用，是指包含各种冠状病毒主要蛋白质中共有的氨基酸序列的肽分子。可选取不同类型、不同亚型、不同株系的冠状病毒序列进行分析，例如可对选自下组的冠状病毒序列进行分析：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、 HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV，尤其是SARS-CoV、MERS-CoV和 SARS-CoV-2病毒。
如本文所用，术语“免疫原性肽”包含了通过上述方法设计并制得的肽，其具有激发T细胞应答的活性，且对各种冠状病毒具有广谱性。
本文的免疫原性肽可包含一个或多个冠状病毒共享表位。在一些实施方式中，本文的共享表位可为选自下组的一个或多个表位肽：PLPDRWYFYYT (SEQ ID NO:11，单肽6和7共有)、VVNKQFGAISS(SEQ ID NO:12，单肽 31和32共有)、KPISAYAFLMA(SEQ ID NO:13，单肽73和74共有)、 SYGPGNTFITD(SEQ ID NO:14，单肽124和125共有)、IKYYSIIPHSIR(SEQ IDNO:15，单肽44含)、IEDLLFDKVET(SEQ ID NO:16，单肽13和14共有)、 SALQKIQDVVN(SEQ IDNO:17，单肽13和14共有)、ADDEGFITLKN(SEQ ID NO:18，单肽80和81共有)、YRVFPYDMDSGVSSF(SEQ ID NO:19，单肽94含)、SVTVEYNIHAVLDTL(SEQ ID NO:20，单肽102含)、QWLVMYGPI (SEQ ID NO:21，单肽141和142共有)、QSGLVKMAQPSGKVE(SEQ ID NO: 22，单肽156含)、NGRPQGVFHVTMRSN(SEQ ID NO:23，单肽169含)、 VTYGNMTLNGL(SEQ ID NO:24，单肽160和161共有)、SVGNFCYMHQL (SEQ ID NO:25，单肽175和176共有)、LSDNDGLKYAKWEKD(SEQ ID NO: 26，单肽246含)、KIKYLYFVKNL(SEQ ID NO:27，单肽251和252共有)、GAVLGTISATVRLQA(SEQ ID NO:28，单肽256含)和TGQAITVKPEA(SEQ ID NO:29，单肽271和272共有)。在一些实施方式中，两个或以上的表位肽可直接连接或通过接头序列连接。
本文的免疫原性肽可包含：n个针对T细胞的冠状病毒表位序列，n为1～ 100的整数。
本文的免疫原性肽可包含一种或多种冠状病毒蛋白的共享序列。在一些实施方式中，本文的免疫原性肽可包含ORF1ab共享肽、M蛋白共享肽、N蛋白共享肽、E蛋白共享肽和/或S蛋白共享肽。例如，选自SEQ ID NO:1、3、 5、7和9的共享肽；或者与前述共享肽具有高同源性或序列相同性(如至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％、至少99.9％)且具有结合和/或激活T细胞活性的肽。
本文的免疫原性肽还可包含有助于识别和/或激活T细胞和/或增强T细胞活性或者增强抗冠状病毒感染效果的其他片段，例如免疫调节序列，如IL-2、 IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF、CD40L、CD40刺激抗体、PD-1与PD-L1 抗体、CTLA4抗体、趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL3、 XCL1、CCL4、CCL20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、FimH、SopE 等。
在一些实施方式中，本文的免疫原性肽除了彼此组合以外，还可与共有序列共表达(例如融合表达或单独阅读框表达)的其他序列组合。其他序列可用于例如但不限于：扩大抗病毒谱、提高免疫应答诱导能力。
在一些实施方式中，其他序列选自例如针对如下病毒的免疫原：冠状病毒 (例如RBD或其修饰序列(如末端Cys修饰RBD氨基酸序列))、流感病毒(例如 HA2)、艾滋病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、 疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革 病毒、汉坦病毒)，尤其是与活化B细胞应答的免疫原，制备能够同时激活中 和抗体与T细胞应答的复合疫苗。例如，本文中还提供了进一步包含冠状病毒 RBD区和/或流感病毒HA2区免疫原性肽的序列，如包含SEQ ID NO:34所示 的氨基酸序列。
在一些实施方式中，共表达的序列为选自下组的免疫调节序列：IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF、CD40L、CD40刺激抗体、PD-1与PD-L1抗体、CTLA4抗体、趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL3、 XCL1、CCL4、CCL20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、FimH及SopE。
本文的免疫原性肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本文可允许引入非天然氨基酸。例如，半胱氨酸残基可由带有硫醇基团的其它氨基酸替代，例如巯基缬氨酸、高半胱氨酸，或具有硫醇功能的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，半胱氨酸残基应不作为半胱氨酸二硫桥的部分出现。不过，半胱氨酸残基可以经(例如通过甲基化)修饰，由于甲基化的半胱氨酸在体内转化为含游离硫醇基团的半胱氨酸。
可对本文的免疫原性肽进行修饰，而不显著影响、不影响或甚至增强其免疫原性和/或反应性。例如，本文免疫原性肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和 /或取代；在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为 10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能。
本文的免疫原性肽还可包含促进所述肽被摄取进入内体以加工并在 MHC II型决定簇内呈递的氨基酸序列(或其他有机化合物)。因此，本文的免疫原性肽还可以包含，例如，内体靶向序列。这类内体靶向序列包含在例如gp75 蛋白、人CD3γ蛋白、HLA-BMβ、DEC205受体的胞质尾的内部。作为内体分选信号的肽的其它例子公开于Bonifacio和Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72, 395-447的综述。
免疫原性肽编码分子、载体和宿主细胞
本文中还提供了编码本文免疫原性肽的分子、包含所述分子的载体和宿主细胞。
如本文所用，术语“免疫原性肽编码分子”是指编码本文所述免疫原性肽的序列。在一些实施方式中，其可包含例如SEQ ID NO：2、4、6、8或10的核苷酸序列；在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的核苷酸分子，只要其可有效编码并表达所需的免疫原性肽。应理解，在获得了本文的表位肽和免疫原性肽的氨基酸序列之后，可采用本领域中的常规技术手段获得其编码序列，并可对其进行优化。因此，可提供针对同一条表位肽和/ 或免疫原性肽的一种或多种编码分子，只要该编码分子能正确有效地表达该表位肽和/或免疫原性肽。
如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v) 甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。
本文的编码分子通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本文还涉及包含免疫原性肽编码分子的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或重组生产免疫原性肽。一般来说有以下步骤：
(1)用本文的免疫原性肽编码核苷酸分子，或用含有该核苷酸分子的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。
本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本发明中，优选采用大肠杆菌细菌细胞、小鼠树突状细胞作为宿主细胞。
产品
本文中还提供了包含本发明所述免疫原性肽、其编码序列、载体或宿主细胞的产品，所述产品可为例如可广谱抗冠状病毒感染的T细胞疫苗、药物、药物组合物或试剂盒、偶联物、缀合物等。如本文所用，术语“活性物质”或“本发明的活性物质”可互换使用，是指本文的免疫原性肽、其编码序列、载体或宿主细胞。
由此，本文中还提供了一种包含所述免疫原的疫苗组合物(或称疫苗)。该疫苗组合物包含其形式能够被给予脊椎动物(优选哺乳动物)的本公开的表位、免疫原性肽和/或核酸分子的配制品，并且其诱导提高免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻疾病和/或其至少一种症状。术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指通过免疫原介导的针对传染原或疾病的免疫应答，通过脊椎动物(例如人)展现，预防或减轻感染或减少其至少一种疾病症状。
术语“脊椎动物”或“对象”或“患者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟包括驯养、野生和猎鸟诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中，旨在涵盖成年、幼年以及新生个体。
本文的疫苗可为重组蛋白疫苗、重组DNA疫苗、重组病毒载体疫苗(例如腺病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、巨细胞病毒载体)、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗。在一些实施方式中，本文的疫苗选自重组DNA疫苗、重组腺病毒载体、重组痘病毒载体或其中一种或两种或三种的组合。
本文的疫苗组合物中包含有效量的本文免疫原。本公开的疫苗组合物中包含足以实现希望的生物效应的量的免疫原。术语“有效量”通常是指可以诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病和/或以减少感染或疾病的至少一种症状的免疫原的量。
本文的疫苗中还可包含佐剂。可采用本领域普通技术人员已知的佐剂，例如Vogel等人，“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients”(第2版) 中所记载的佐剂(通过引用以其全文结合在此)。已知佐剂的例子包括但不限于：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、脂多糖(LPS)、RIBI佐剂、 MF-59等。
本文的疫苗组合物还可包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂等辅料。例如，药学上可接受的载体是已知的，并且包括但不限于注射用水、盐溶液、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液及其组合。药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂可例如参见《雷明顿药物科学》(Remngton's Pharmaceutcal Sciences)中。
本文疫苗组合物的形式可适于系统性或局部(尤其是呼吸道内)给予。给予疫苗组合物的方法包括但不限于：胃肠外给予(例如，真皮内的、肌内的、静脉内的以及皮下的)、硬膜外给予、粘膜给予(例如，鼻内的和口腔或肺的途径给予)。在特定实施例中，
在一些实施方式中，本文的疫苗预防、消除或减轻对象中的冠状病毒感染或其至少一种症状，例如呼吸道症状(如鼻塞、咽喉痛、声嘶)、头痛、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息、呼吸困难、因感染引起的肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭等。
本文中还涉及了一种免疫偶联物(也可称免疫缀合物)，其包含本文的免疫原以及与其偶联的其他物质。所述的其他物质可为靶向性物质(如特异性识别特定靶标的部分)、治疗性物质(如药物、毒素、细胞毒剂)、标记性物质(如荧光标记物、放射性同位素标记物)。
在本公开中还提供了一种组合产品，其包括本公开的宿主细胞和/或疫苗，且还可包含一种或多种有助于更好发挥预防和/或治疗冠状病毒感染或其症状的功能或增强前述物质稳定性的其他物质。例如，其他物质可包括针对冠状病毒S或S1的其他疫苗，如来自于包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、 MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV 的S或S1疫苗；受益于T细胞活化和/或与T细胞的记忆性免疫反应的疾病或病症的其他活性物质。
本公开中还提供了本文所述免疫原性肽、其组合在制备检测试剂盒中的应用。本文的免疫原性肽可单独或与MHC形成肽-MHC复合物单聚体或多聚体(如二聚体、四聚体)。在一些实施方式中，可将本文的免疫原性肽与HLA-A2 重链蛋白、轻链蛋白(如β2m蛋白)复合形成肽-MHC复合物单聚体，并可任选地由复合物单聚体形成复合物多聚体。在一些实施方式中，试剂盒可用于冠状病毒检测中。
免疫方法
本文还提供了一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开的一种或多种疫苗。可采用的接种方式包括但不限于：系统性免疫接种方式，如肌肉注射、皮下注射和皮内注射等；呼吸道内免疫接种方式，如雾化、滴鼻等。在一些实施方式中，初次免疫采用系统性接种或呼吸道内接种，优选系统性接种。
在本公开的一些实施方式中，每两次接种之间的间隔至少为1周，例如2 周、4周、2个月、3个月、6个月或更长间隔。
在一些实施方式中，采用DNA疫苗进行初次免疫，并采用细胞疫苗进行一次或多次加强免疫。本公开的免疫方法可采用“初免-加强”或“初免-加强-再加强”的方式，可采用单一的全身系统免疫或呼吸道局部免疫方式，或采用两种免疫方式的组合。
在一些优选的实施方式中，采用重组DNA疫苗进行系统性初免，从而建立全身系统免疫应答，再用细胞疫苗进行一次或多种免疫加强。
采用本文的免疫方法可在呼吸道局部和全身系统有效建立的疫苗特异性免疫应答，有助于增强疫苗保护的有效性。
以药物包或试剂盒的形式提供本文的组合产品可，例如可将本文的一种或多种疫苗组合物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供疫苗组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
动物、材料与方法
实施例的实验中涉及到的实验动物、免疫方式、免疫原及检测方法如下：
I.实验动物
6-8周龄雌性hACE2+ ICR小鼠(即重组表达人ACE2的转基因ICR小鼠)，购自北京唯尚立德科技有限公司。
6-8周龄雄性HFH4-hACE2-C57BL/6小鼠，使用HFH4肺纤毛上皮细胞特异性启动子将hACE2基因转入小鼠中所得(具体构建方法参考Menachery,V.D 等，SARS-like WIV1-CoVpoised for human emergence.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A.113,3048–3053(2016)；Ostrowski LE,Hutchins JR,Zakel K,O'Neal WK. Targeting expression of atransgene to the airway surface epithelium using a ciliated cell-specificpromoter.Mol Ther.2003；8(4):637–645)。
II.免疫方式
对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射，或进行滴鼻。具体剂量见实施例。
III.免疫原的设计
1.背景
新型冠状病毒整体基因组信息如图1所示。
设计时选择了多聚蛋白(polyprotein，orf1ab)、刺突蛋白(spike protein，S)、膜蛋白(Membrane，M)、囊膜蛋白(Envelope，E)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid， N)共计5种蛋白质/多肽。可能非冠状病毒共享的其他蛋白质/多肽在此未考虑。
2.数据收集
分别收集NCBI和Uniprot中上述5种蛋白质的序列，数据情况如表1：
表1.蛋白质序列数据
Figure BDA0003227791150000191
*：箭头后是100％序列去冗余的结果。
3.运算步骤
3.1多序列比对
分别对于5个蛋白质进行多序列比对，将序列每一个氨基酸的位置对齐。
3.2提取共享序列(consensus sequence)
在每一个位置提取出现频率最高的氨基酸，需要注意的是，冠状病毒蛋白差异较大，很多位置出现最多的是缺口(gap)。
3.3T细胞表位预测
为了全面模拟共享序列可能引起的T细胞免疫反应，同时进行了MHC I 类和II类表位预测，共9个MHC I类亚型，13个MHC II类亚型，选用MHCpan (采用默认参数)进行预测。
3.4搜索保守区域
由于共享序列存在gap或出现频率较低的氨基酸，故在此构建保守区域筛选公式：
Figure 1
式中，CP(aan，…，aan+m)代表一串共享肽；fre(50％aa)＞[0.7(m+1)] 代表其中每个位点氨基酸偏好性超过50％的数目需要大于序列长度的70％； num(gap)＜20％(m+1)代表其中gap的数量要小于全长的20％。
找出所有在冠状病毒中保守的区域，并扫描IEDB人源肽段库进行筛选。
3.5将保守区域映射到新冠病毒上
将保守区域映射到新冠病毒上，并按照T细胞表位预测结果推荐免疫原性高的区域。
最终设计出来的共享序列(即CoV T)采自1370条冠状病毒序列，其具体序列见SEQID NO：9(CoV T氨基酸序列，1238Aa)和SEQ ID NO：10(CoV T编码序列，3714Nt)。
重组腺病毒载体疫苗：AdC68、AdC68-CoV T、AdC68-panCoV/Flu。
IV.免疫原制备及免疫剂量
免疫原的制备参见实施例1。
在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：
重组腺病毒载体疫苗：5E10vp/只小鼠(对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射，左右后肢各50μL)，100μL(肌肉注射)；5E10vp/只小鼠，30μL(滴鼻)。
V.免疫间隔
具体免疫间隔见下文表格。
VI.SARS-CoV2包膜假病毒(Pseudovirus)包装
1.转染前一天准备293T细胞，用于包装质粒的转染与表达。用DMEM 完全培养基将细胞稀释至5×106个/mL细胞，取1mL稀释好的细胞，铺在10cm 的皿中，37℃，5％CO2，培养过夜；
2.吸取SARS-CoV2膜蛋白质粒pcDNA3.1-S 4μg和pNL4-3Δenv骨架质粒8μg(NIHAIDS Reagent Program,3418)加入500μL双无(无血清、无双抗，双抗为青链霉素混合液)的DMEM中，室温孵育5min；
3.用双无DMEM将24μL TurboFect(Thermo Fisher Scientific)稀释，终体积为500μL/样品，室温孵育5min；
4.将2与3两者混匀，1000μL/样品终体积，室温孵育20min，孵育结束后加到10cm培养皿的293T细胞中。6h后更换新鲜的15mL完全培养基，继续在细胞培养箱中培养48h；
5.培养结束后，收集10cm皿的细胞培养上清，于15mL离心管里，然后4000g，4℃，离心10min，用0.45μm的滤器过滤到新的15mL离心管中，冻存于-80℃保存，滴定后备用。
上述方法也用于panCoV/Flu的制备。
VII.构建稳定表达hACE2受体的293T细胞
1.人工合成人源ACE2(hACE2)序列(Genebank#NCBI_NP_001358344.1)，如SEQ IDNO:13所示，序列5’端带有Age1酶切位点，3’端带有Xba1酶切位点，合成片段与载体质粒pHAGE-MCS-puro使用Age1酶切(Thermo Scientific 公司，货号FD1464)与Xba1酶切(Thermo Scientific公司，FD0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收酶切片段。
2.基因回收产物与酶切线性化载体用T4 DNA连接酶的方法连接(ThermoScientific公司，货号2011A)：将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Stable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出hACE2基因的慢病毒表达质粒 (pHAGE-hACE2-puro)。
3.取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293T细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将pHAGE-hACE2-puro、慢病毒包装质粒psPAX 以及VSVG三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293T细胞。
4.37℃，5％CO2的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用PEG 8000 进行浓缩，即可得到较为纯化的hACE2慢病毒。
5.提前一天铺5×105个的293T细胞于12孔板的一个孔内，次日向铺好的细胞中加入步骤2中浓缩的病毒500μL，1000g，离心2小时。
6.离心感染结束后，继续在37℃，5％CO2的孵箱培养12小时左右，将培养基换成添加1μg/mL嘌呤霉素(puro)的细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有hACE2基因的293T细胞，并通过流式分选筛选出稳定表达 hACE2的293T细胞(能与S蛋白结合)。
VIII.检测方法
采血：
最后一次免疫结束后第2周，将小鼠脱颈处死前，通过摘眼球的方法采集小鼠外周全血，收集于1.5mL EP管中，室温静置使其自然凝血，凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。将小鼠血清转移至新的1.5mL EP管中。实验前需要将样品在56℃灭活30min，来破坏血清内的补体活性。灭活前短暂离心，避免管壁和瓶盖上的样品残存。水浴液面要没过样品液面，但不能超过瓶盖。
ELSIA检测结合抗体
1.用4℃预冷的ELISA包被液稀释检测的抗原蛋白(RBD，购自上海近岸生物科技有限公司)，至终浓度为1μg/mL。在ELISA板的每孔加入100μL包被抗原溶液，4℃过夜；
2.第二天，取出ELISA板，弃掉包被液，用0.05％的PBST缓冲液洗板3 次，每次220μL；
3.洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200μL ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)进行封闭，室温封闭2h；
4.封闭结束后，用0.05％的PBST洗板3次，每次220μL；
5.对于血清或者血浆，用ELISA样品稀释液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解) 稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置空白孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100μL，室温孵育3h；
6.样品孵育结束后，继续用PBST洗板5次，每次220μL；
7.用ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2305)，每孔加入100 μL，室温孵育1-1.5h；
8.二抗孵育结束后，用0.05％的PBST洗板5次，每次220μL；
9.取一对金银片OPD底物，溶解于20mL去离子水中，随后每孔加入100 μL，避光反应5min；
10.显色结束后，用50μL 2nM H2SO4进行终止，在酶标仪上读取 OD492～OD630值；
11.以最后一个稀释度OD492大于2倍的(negative mean+SD)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。
293T-ACE2细胞检测中和抗体
1.取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(CC)(150μL)，第二列设置病毒对照(VC)(100μL)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100μL。
2.除细胞对照组外，每孔加50μL SARS-CoV-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200 TCID50。
3.轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5％CO2孵育1h。
4.当孵育时间至20min时，开始准备293T-hACE2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至105个细胞/mL。
5.当孵育时间至1h，向96孔透明底黑板中每孔加100μL靶细胞，使每孔细胞为104个。
6.前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养48h。
7.培养48h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100μL PBS清洗一遍，吸去PBS，每孔加入50μL 1×的裂解缓冲液(购自Promega公司Cat#E153A)，室温在水平摇床上孵育30min使细胞充分裂解；
8.加30μL荧光素酶的底物(购自Promega公司，Cat#E1501)于96孔黑板中，用仪器
Figure BDA0003227791150000241
96微孔板发光-检测仪检测荧光素酶活性。
9.导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用 GraphpadPrism 5.0软件计算ID50。
Figure BDA0003227791150000242
ELISPOT检测T细胞应答
小鼠脾脏单细胞分离：
1)将小鼠仰卧，剖开右侧腹部皮肤，打开腹膜，取下小鼠脾脏，放入加有5mL完全RPIM1640培养基的小平皿中；
2)用无菌镊子将脾脏用无菌纱布包裹起来，用小弯镊夹起纱布，轻轻磨碎脾脏，可使脾细胞全部释放到培养基中；
3)随后用5mL移液器将脾细胞悬液经纱布吸到无菌的15mL离心管中， 800g，离心5min；
4)弃掉离心后的上清，轻敲15mL离心管重悬细胞沉淀，每个离心管中加入3mL红细胞裂解液裂解红细胞，颠倒混匀后室温静置5min，使红细胞充分裂解又不会损伤脾细胞；
5)裂红结束后，用5mL RPIM1640培养基终止裂红，800g，离心5min；
6)弃掉离心后的上清，用5mL RPIM1640培养基洗1次，800g离心5min；
7)弃离心后上清，脾细胞放于冻存液(90％FBS和10％DMSO)中进行冻存备用。
ELISpot实验操作按照小鼠IFN-γ/猴IFN-γ说明书进行(购自BD，货号 551083)：
1)用纯化的IFN-γ抗体包被试剂盒提供的Millipore板，比例1:250，4℃过夜包被；
2)甩掉板中的包被抗体溶液，用200μL RPMI 1640完全培养基洗板一遍，随后用200μL RPMI 1640完全培养基封闭液封闭Millipore板，室温孵育2h；
3)弃掉孔板中的封闭液，根据不同的实验设计，在Millipore板中加入刺激肽库或者单肽(苏州强耀生物科技有限公司合成)，50μL/孔，每条肽的浓度为5μg/mL。在阴性对照孔加入50μL RPMI 1640完全培养基；阳性对照孔中加入50μL佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA，终浓度100ng/mL)和离子霉素 (Ionomycin，终浓度2μg/mL)的RPMI 1640完全培养基；
关于CoV T单肽和肽库分别说明如下：
——单肽1～单肽308：每条单肽15个氨基酸(除了单肽307为13个氨基酸)，覆盖整条CoV T序列，共308条单肽(即n＝1～308)，其中：从单肽1～ 306(即n＝1～306)，其与CoVT(SEQ ID NO:9)相对应的氨基酸位置符合如下规则：起始位置＝n×4－2，终止位置＝n×4+12。例如，单肽1(即n＝1)，其起始位置为SEQ ID NO:9的第2位氨基酸，终止位置为SEQ IDNO:9的第16 位氨基酸；单肽2(即n＝2)，为SEQ ID NO:9的第6位至第20位氨基酸；以此类推，单肽306(即n＝306)，为SEQ ID NO:9的第1222位至第1236位氨基酸。单肽307和单肽308因已达SEQ ID NO:9末尾，其序列分别对应于SEQ ID NO:的第1226～1238位和第1224～1238位。
——肽库：以上述单肽建立31个肽库，肽库1～30中每个肽库包含10条单肽，肽库31包含8条单肽(即单肽301～308)。
4)对小鼠脾细胞进行计数，细胞调整为4×106个细胞/mL，每孔加入50μL 细胞，最终使每孔的细胞数为2×105个细胞。将Millipore板放入湿盒，在37℃ 5％CO2培养箱中孵育20-22h，期间切勿摇动板子，造成细胞的偏移；
5)培养孵育结束后，从培养箱中取出Millipore板，将板中的液体弃掉，用预冷的去离子水洗两遍，每次220μL，每次清洗孵育3min；
6)用0.05％的PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗板3次，每次200μL；
7)用10％FBS的PBS抗体稀释液稀释生物素化检测抗体(Biotinylated Detectionantibody，比例1:200)，每孔加入100μL，室温孵育2h；
8)孵育结束后，再用0.05％的PBST洗板3次，每次220μL；
9)将链霉亲和素-HRP偶联抗体(Streptavidin-HRP Conjugate antibody)用抗体稀释液进行稀释(比例1:100)，每孔加入100μL，室温孵育1h；
10)孵育结束后，用0.05％的PBST洗板4次，每次220μL；
11)再用PBS清洗板子2次，每次220μL；
12)准备底物溶液(1mL的底物缓冲液加1滴底物溶液)，每孔加入100μL 底物溶液。反应5-60min，孵育时间根据斑点形成的情况而定。
13)用去离子水冲洗终止反应，室温晾干后进行计数；
14)利用ChampSpot III型酶联斑点图像分析仪进行斑点形成细胞SFC (spotforming cell)的计数以及QC(Quality Control)。
实施例1：pAdC68XY3-CoV T腺病毒表达载体的构建及酶切鉴定
为了研究CoV T的功能，我们构建了CoV T的腺病毒表达载体，并构建了腺病毒AdC68-CoV T，且进行了酶切鉴定。
首先，我们人工合成了CoV T基因(具体序列如SEQ ID NO:9和10所示)。将合成片段直接加载于载体质粒pAdC68XY3(根据中国专利申请号 CN201910777937.2中所记载方法构建，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，E1/E3删除，E4区域ORF6/7和ORF6替换成AdHu5：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-34671bp(对应AC_000011.1)；AdHu5E4序列的插入区域为 32914bp-34077bp(对应AC_000008.1)。其中，保留了AdC68的ORF1-4序列。) 上，得到CoV T的腺病毒表达载体pAdC68XY3-CoV T，质粒构建图谱如图2A 所示。
我们进一步对重组腺病毒进行了包装及扩增。
将构建好的重组质粒pAdC68XY3-CoV T经限制性内切酶Pac 1在37℃水浴中线性化3.5h，65℃灭活内切酶。用293A细胞铺六孔板，将线性化后的重组质粒分别以2.5μg、2μg、1.5μg/孔的量转染至293A细胞(购自ATCC)，培养11天左右噬斑出现，14天左右至细胞均被病毒感染时收样，细胞上清一起收集，置于-80℃反复冻融三次后，取少量感染293A细胞，抽取基因组进行 Bgl II和Mfe I双酶切鉴定(图2B)。结果显示：酶切后条带正确。
将上述收集的腺病毒样品感染至1个T175培养瓶的293A细胞，24h后收样，置于-80℃反复冻融三次后，感染至6个T175培养瓶的293A细胞，以此类推进行大量扩增，扩增至36个T175培养瓶时，收集细胞沉淀，弃上清，用10mL左右无血清无抗性的DMED培养基重悬，-80℃反复冻融三次后，采用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，分装后，-80℃保存。
氯化铯密度梯度纯化腺病毒步骤如下：
1)将扩增冻融后的腺病毒4℃，4000g，离心30min，取上清，用0.8μm 的滤膜过滤；
2)向超速离心管中加入3mL 1.2M CsCl溶液，将3mL 1.4M CsCl溶液用注射器从底部轻轻缓慢打入，铺好氯化铯梯度；
3)将过滤后的腺病毒溶液轻轻加入超速离心管中，用PBS将液面补满，配平后放入SW41(Beckman)套筒中；
4)选取SW41转子，4℃，25000rpm，离心2.5h，降速调为“no brake”自然降速；
5)待离心结束后，轻轻取出超速离心管，可见两条白色病毒条带，用注射器从侧面戳入超立管中，将下层条带吸出，注意避免吸到上层条带；
6)将Bio-Gel P-6PG gel脱盐胶注入液相色谱柱(C4169-5，购自Sigma)中，待液体落完，留下2-3cm左右的胶为宜，加入PBS洗涤两遍；
7)将上述吸出的病毒液加入脱盐胶(填胶的柱)，待液体落完后，加入2mL 左右PBS洗脱，每个1.5mL EP管收集3-4滴洗脱液；
8)Nanogrop 2000(Thermo Scientific)测定每管洗脱液的OD260值，将OD260大于2的洗脱液合并，加入10％无菌甘油，分装；
9)Nanogrop 2000测定分装后腺病毒溶液的OD260值，OD260值×1.1×1012/mL 即为纯化后腺病毒的最终滴度。
实施例2：AdC68-CoV T在hACE2+ ICR小鼠体内的免疫原性
采用腺病毒AdC68及AdC68-CoV T免疫hACE2+ ICR小鼠，两针均为肌肉注射，剂量为5E10vp/小鼠。在完成免疫1周后(即首次免疫后4周时)，评价免疫组合诱导针对CoV T肽库的T细胞应答水平。
将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为AdC68组和AdC68-CoV T 组。具体免疫组合如表2所示：
表2.AdC68和AdC68-CoV T对hACE2+ ICR小鼠的体内免疫方案
Figure BDA0003227791150000281
AdC68-CoV T组产生针对CoV T肽库的总的T细胞应答如图3A所示：每百万个脾细胞里面分泌IFN-γ的细胞数均值在7530左右，最高能到达13595，显著高于AdC68。
同时，我们分析了AdC68-CoV T诱导的针对CoV T各个肽库的应答，如图3B所示：在CoV T的31个肽库中，有19个肽库能够有效或高效刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ，即AdC68-CoV T诱导的T细胞应答在肽库上具有广谱性，可对多个表位有应答，有别于一般腺病毒单表位应答较强的情况。
随后我们对有反应的18个肽库，用其中的单肽刺激小鼠脾细胞，结果如图3C所示：我们发现单肽6、7、13、14、29、30、31、32、43、44、73、74、 75、80、81、94、102、124、125、142、156、160、161、169、175、246、251、 252、256、272能够刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ。
随后我们分析反应最强的单个肽氨基酸序列的共享序列，得到了两个表位：
表位A：PLPDRWYFYYT(SEQ ID NO:11，单肽6和7共享)，来自冠状病毒的N蛋白；
表位B：KPISAYAFLMA (SEQ ID NO:13，单肽73和74共享)来自冠状病毒的ORF1ab蛋白；
分别与SARS病毒、MERS病毒和SARS-CoV-2病毒进行了以上表位的对应位置匹配，结果如表3所示。
表3.AdC68-CoV T在hACE2+ ICR小鼠体内免疫原性
Figure BDA0003227791150000291
表位A和表位B均可在SARS、MERS和SARS-CoV-2病毒蛋白中找到对应序列，即我们所构建的疫苗AdC68-CoV T能够诱导广谱抗冠状病毒的T细胞应答。
该实验证实，在hACE2+ ICR小鼠中，AdC68-CoV T能够诱导针对冠状病毒的广谱T细胞应答，包括SARS、MERS、SARS-CoV-2等。
实施例3：AdC68-CoV T免疫后小鼠的脾细胞对多种冠状病毒表位的应答
为了验证我们所诱导的反应确实能够对真实的冠状病毒感染起到效果，我们合成了表3中两个表位在三种冠状病毒中的真实的表位肽，用单个的肽来刺激之前免疫后的小鼠的脾细胞，结果如图4所示。
结果表明用合成的各种冠状病毒自身的天然表位来刺激疫苗免疫后的小鼠脾细胞，也能够产生T细胞应答，这进一步验证了我们的T细胞疫苗确实能够针对多种冠状病毒有应答。
有针对冠状病毒的广谱T细胞应答能够表明其对冠状病毒的广谱预防和治疗效果。当病毒感染机体时，能够迅速激活抗原特异性的T细胞应答，启动细胞杀伤功能。并且我们识别的是病毒早期基因，在病毒还未能够形成完整的病毒颗粒时就可以将其通过CD8T细胞的杀伤作用杀死。领域中亦有单独的肽起到预防和治疗效果的文章。
实施例4：AdC68-panCoV/Flu腺病毒表达载体的构建及酶切鉴定
上述研究证明了CoV T作为一款T细胞疫苗的功能，后续为了将T细胞功能和B细胞功能联合起来，同时为了能够应对多种流感病毒，我们将CoV T 基因和RBD-HA2-CD8TM基因(融合表达SARS-CoV-2的RBD蛋白、H7N9的 HA2区域和CD8TM，其核苷酸序列和所编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 34和35所示)加载于载体质粒pAdC68XY3上，构建了腺病毒AdC68-panCoV/Flu，且进行了酶切鉴定。
首先，我们人工合成了panCoV/Flu基因(SEQ ID NO:36)，该基因包含(a) 编码SopE序列(使得T细胞免疫原翻译表达后能迅速转移至蛋白酶体中进入降解程序，更好地提呈T细胞表位)和CoV T的前端部分(SEQ ID NO:37)，(b)与其毗连的IRES和KOZAK序列，以及(c)包含编码HASP信号肽、末端Cys修饰RBD序列、HA2序列和CD8铰链区和CD8TM(RBD-HA2-CD8TM)的后端部分(SEQ ID NO:38)。
将合成片段直接加载于载体质粒pAdC68XY3上，得到panCoV/Flu的腺病毒表达载体pAdC68XY3-panCoV/Flu，质粒构建图谱如图5A所示。
我们进一步对重组腺病毒进行了包装及扩增。
将构建好的重组质粒pAdC68XY3-panCoV/Flu经限制性内切酶Pac 1在37℃水浴中线性化3.5h，65℃灭活内切酶。用293A细胞铺六孔板，将线性化后的重组质粒分别以2.5μg、2μg、1.5μg/孔的量转染至293A细胞(购自ATCC)，培养11天左右噬斑出现，14天左右至细胞均被病毒感染时收样，细胞上清一起收集，置于-80℃反复冻融三次后，取少量感染293A细胞，抽取基因组进行 Bgl II和Mfe I双酶切鉴定(图5B)。结果显示：酶切后条带正确。
将上述收集的腺病毒样品感染至1个T175培养瓶的293A细胞，24h后收样，置于-80℃反复冻融三次后，感染至6个T175培养瓶的293A细胞，以此类推进行大量扩增，扩增至36个T175培养瓶时，收集细胞沉淀，弃上清，用10mL左右无血清无抗性的DMED培养基重悬，-80℃反复冻融三次后，采用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，分装后，-80℃保存。
氯化铯密度梯度纯化腺病毒步骤同实施例1。
实施例5：AdC68-panCoV/Flu腺病毒在HFH4-hACE2小鼠体内的免疫原性及蝙蝠冠状病毒SHC014攻毒保护试验
小鼠：HFH4-hACE2小鼠
毒株：Bat-CoV SHC014株
免疫程序：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为AdC68组和 AdC68-panCoV/Flu组。具体免疫组合如表4所示，免疫方式为第一针肌肉注射，剂量为5E10vp/小鼠，第二针肌肉注射(5E10vp/小鼠)加滴鼻(5E10vp/小鼠)，总剂量为1E11vp/小鼠。
攻毒程序：免疫结束后3周对小鼠进行攻毒，攻毒后持续观察小鼠体重变化和生存。
免疫结束后两周检测了针对RBD的结合抗体滴度和针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度，如图6所示：AdC68-panCoV/Flu组结合抗体滴度均值为10,160，最高能到25,600，与AdC68组有显著区别(图6A，P<0.01)； AdC68-panCoV/Flu组中和抗体滴度均值为166，最高能到528，与AdC68组有显著区别(图6B，P<0.01)。随后检测了针对CoV T的T细胞应答，AdC68-panCoV/Flu组产生总的T细胞应答如图6C所示：每百万个脾细胞里面分泌IFN-γ的细胞数均值在1220左右，最高能到达4010，显著高于AdC68 (P<0.01)。因此该疫苗既能诱导T细胞应答，又能诱导抗体应答。
随后在免疫结束后三周对小鼠进行了攻毒，选择的毒株为蝙蝠冠状病毒S HC014，剂量为1E5 TCID50/小鼠，方式为滴鼻。持续观察小鼠体重和生存，发现，AdC68组小鼠体重在第五天出现明显下降，这种下降一直持续到它们全部死亡，第九天死亡的小鼠体重下降均超过20％。相比之下，AdC68-panCoV/Flu 接种后仅表现出轻微的体重下降，其特征是起始点较晚(第8天开始)，最低点较高(第九天时体重下降约8％)，并且第十天体重开始上升(图6D)。观察期结束时的生存数据也显示AdC68-panCoV/Flu组与AdC68组之间存在显著差异，前者的存活率为60％，后者均无存活(图6E)。这些数据为AdC68-panCoV/Flu 作为一种通用冠状病毒疫苗的潜力提供了初步证据。
表4.AdC68和AdC68-panCoV/Flu在HFH4-hACE2小鼠的体内免疫方案
Figure BDA0003227791150000321
实施例6:金黄地鼠新冠病毒攻毒试验
金黄地鼠：雄性，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司
毒株：SARS-CoV-2/human/CHN/Shanghai_CH-02/2020
委托第二军医大学进行攻毒试验。
免疫程序：将金黄地鼠随机分为5组，分别命名为组1、组2、组3、组4 和组5。具体免疫组合如表5所示，免疫方式为肌肉注射(i.m.)加滴鼻(i.n.)，具体见表。
攻毒程序：免疫结束后2周对小鼠进行攻毒试验，攻毒后持续观察，记录体重变化和生存；攻毒后第三天每组各取4只金黄地鼠处死，取肺组织，每只金黄地鼠的左半边肺组织(一个大叶)用4％多聚甲醛固定48小时后做病理切片 (HE染色和组化)；每只金黄地鼠的右半边肺组织(4个小叶)研磨测病毒载量 qPCR RNA拷贝或者病毒滴度PFU/ml。
结果显示：AdC68-panCoV/Flu在金黄地鼠体内对冠状病毒攻毒提供有效保护。
表5.AdC68和AdC68-panCoV/Flu在金黄地鼠体内免疫方案
Figure BDA0003227791150000322
实施例7:hACE2转基因小鼠新冠病毒攻毒试验
小鼠：南模生物ACE2-转基因小鼠(C57BL/6-Tgtn(CAG-human ACE2-IRES-Luciferase-WPRE-polyA)Smoc)，雌性。
毒株：SARS-CoV-2/human/CHN/Shanghai_CH-02/2020
委托第二军医大学进行攻毒试验。
免疫程序：将金黄地鼠随机分为3组，分别命名为组1、组2和组3。具体免疫组合如表6所示，免疫方式为肌肉注射加滴鼻，具体见表。
攻毒程序：免疫结束后2周对小鼠进行攻毒试验，攻毒后持续观察，记录体重变化和生存；攻毒后第三天每组各取4只小鼠处死，取肺组织，每只小鼠的左半边肺组织(一个大叶)用4％多聚甲醛固定48小时后做病理切片(HE染色和组化)；每只小鼠的右半边肺组织(4个小叶)研磨测病毒载量qPCR RNA拷贝或者病毒滴度PFU/ml。
结果显示：AdC68-panCoV/Flu在hACE2+C57BL/6小鼠体内对冠状病毒攻毒提供有效保护。
表6.AdC68和AdC68-panCoV/Flu在hACE2+C57BL/6小鼠体内免疫方案
Figure BDA0003227791150000331
序列表信息
SEQ ID NO: 序列名称 SEQ ID NO: 序列名称
1 ORF1ab共享氨基酸序列 20 表位肽10
2 ORF1ab共享编码序列 21 表位肽11
3 M蛋白共享氨基酸序列 22 表位肽12
4 M蛋白共享编码序列 23 表位肽13
5 N蛋白共享氨基酸序列 24 表位肽14
6 N蛋白共享编码序列 25 表位肽15
7 S蛋白共享氨基酸序列 26 表位肽16
8 S蛋白共享编码序列 27 表位肽17
9 CoV T共享氨基酸序列 28 表位肽18
10 CoV T共享编码序列 29 表位肽19
11 表位肽1 30 SARS-CoV/CoV-2的表位肽A对应序列
12 表位肽2 31 MERS-CoV的表位肽A对应序列
13 表位肽3 32 SARS-CoV的表位肽B对应序列
14 表位肽4 33 SARS-CoV-2的表位肽B对应序列
15 表位肽5 34 RBD-HA2-CD8TM核苷酸序列
16 表位肽6 35 RBD-HA2-CD8TM氨基酸序列
17 表位肽7 36 panCoV/Flu核苷酸序列
18 表位肽8 37 panCoV/Flu的前端部分氨基酸序列
19 表位肽9 38 panCoV/Flu的后端部分氨基酸序列
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种诱导广谱抗冠状病毒的T细胞疫苗免疫原及其应用
<130> 214939 1CNCN
<160> 38
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 945
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Pro Ile Ser Ala Tyr Ala Phe Leu Met Ala Lys Asp Gly Ile Thr
1 5 10 15
Lys Leu Ala Asp Val Glu Ala Asp Val Ala Ala Arg Ala Asp Asp Glu
20 25 30
Gly Phe Ile Thr Leu Lys Asn Asn Leu Tyr Arg Leu Val Trp Leu Thr
35 40 45
Gly Leu Gly Glu Ser Phe Lys Lys Val Ala Thr Ile Pro Tyr Lys Val
50 55 60
Cys Asn Ser Val Lys Asp Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala His Ser Val Leu
65 70 75 80
Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Asp Met Asp Ser Gly Val Ser Ser Phe Lys
85 90 95
Lys Val Ala Phe Gly Gly Asp Gln Val His Glu Val Ala Ala Val Arg
100 105 110
Ser Val Thr Val Glu Tyr Asn Ile His Ala Val Leu Asp Thr Leu Leu
115 120 125
Ala Ser Ser Ser Leu Arg Thr Phe Val Val Asp Lys Ser Leu Asp Val
130 135 140
Val Val Asn Ala Ala Asn Gly His Leu Lys His Gly Gly Gly Val Ala
145 150 155 160
Lys Ala Val Thr Pro Leu Ile Ser Ala Gly Ile Phe Gly Val Lys Pro
165 170 175
Asp Gly Cys Lys Lys Ser Gly Cys Leu Phe Cys Tyr Lys Arg Asn Arg
180 185 190
Leu Lys Lys His Asn Trp Asn Cys Val Asp Cys Asp Ser Tyr Gly Pro
195 200 205
Gly Asn Thr Phe Ile Thr Asp Glu Val Ala Arg Asp Leu Lys Glu Ser
210 215 220
Phe Ala Lys Asn Ala Cys Val Tyr Tyr Ser Gln Leu Leu Thr Asp Glu
225 230 235 240
Ser Cys Asn Asn Phe Val Pro Ser Tyr Val Lys Pro Asp Arg Asp Ala
245 250 255
Asp Gly Arg Pro Gln Pro Tyr Cys Tyr Asp Ser Phe Ile Met His Leu
260 265 270
Gln Trp Leu Val Met Tyr Gly Pro Ile Val Pro Ala Tyr Asn Arg Tyr
275 280 285
Leu Ser Leu Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr Tyr Ser Gly Ala Met Asp Thr
290 295 300
Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Ala Cys Ala His Leu Ala Lys Ala Leu Asp
305 310 315 320
Thr Phe Ser Asn Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Leu Val Lys Met Ala
325 330 335
Gln Pro Ser Gly Lys Val Glu Pro Cys Met Val Ser Val Thr Tyr Gly
340 345 350
Asn Met Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu Asp Gly His Gln Met Gln Gly
355 360 365
Cys Leu Leu Val Leu Thr Val Asp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Arg Pro
370 375 380
Gln Gly Val Phe His Val Thr Met Arg Ser Asn Tyr Thr Ile Lys Gly
385 390 395 400
Ser Phe Leu Cys Gly Ser Cys Gly Ser Val Gly Asn Phe Cys Tyr Met
405 410 415
His Gln Leu Glu Leu Ser Asn Gly Cys His Thr Gly Thr Asp Phe Gln
420 425 430
Val Val Gln Leu Glu Gly Thr Asp Tyr Tyr Gln Ser Val Asn Val Val
435 440 445
Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Ile Arg Leu Tyr Asn Gly Phe Gln Gly Lys
450 455 460
Gln Ile Leu Gly Ser Thr Ser Leu Glu Asp Glu Phe Thr Pro Glu Asp
465 470 475 480
Ala Asn Gly Leu Arg Pro Pro Lys Asn Ser Phe Glu Ala Leu Ala Leu
485 490 495
Asn Phe Lys Leu Leu Gly Ile Gly Gly Val Pro Cys Ile Lys Val Ser
500 505 510
Leu Ser Cys Leu Gln Gln Leu His Val Glu Ala Asn Ser Lys Leu Trp
515 520 525
Ala Tyr Cys Val Lys Leu His Asn Val Ser Leu Leu Ala Val Leu Leu
530 535 540
Ser Phe Pro Gly Ala Val Asp Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Val Asn
545 550 555 560
Leu Ala Ser Phe Ala Glu Ser Gly Ala Ser Pro Gln Val Leu Lys Gln
565 570 575
Leu Lys Lys Ala Cys Asn Ile Ala Lys Ser Ala Asp Ala Ala Val Gln
580 585 590
Arg Lys Leu Glu Arg Met Ala Asp Gln Ala Met Thr Ser Met Tyr Lys
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Glu Asp Lys Lys Ser Lys Val Val Ser Ala Met Gln
610 615 620
Thr Met Leu Phe Gly Met Leu Arg Lys Leu Asn Ser Ile Leu Asp Asn
625 630 635 640
Ala Arg Asn Gly Cys Val Pro Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Val Val
645 650 655
Asp Asn Asn Ser Val Thr Tyr Ala Gly Ala Val Trp Asp Ile Gln Thr
660 665 670
Ile Gln Asp Leu Thr Trp Pro Leu Val Leu Glu Cys Thr Arg Ala Asn
675 680 685
Leu Ser Asp Asn Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Lys Trp Glu Lys Asp Asp
690 695 700
Gly Asn Gln Gly Pro Lys Gly Pro Lys Ile Lys Tyr Leu Tyr Phe Val
705 710 715 720
Lys Asn Leu Asn Thr Leu Arg Arg Gly Ala Val Leu Gly Thr Ile Ser
725 730 735
Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Lys Ala Thr Glu Tyr Ala Ser Asn
740 745 750
Ser Ser Ile Leu Ser Leu Cys Ala Phe Ala Val Asp Pro Ala Lys Ala
755 760 765
Tyr Leu Asp Phe Val Lys Gln Gly Gly Gln Pro Ile Thr Asn Cys Val
770 775 780
Lys Met Leu Cys Asn His Ala Gly Thr Gly Gln Ala Ile Thr Val Lys
785 790 795 800
Pro Glu Ala Thr Thr Asp Gln Asp Ser Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys
805 810 815
Leu Tyr Cys Arg Ala His Val Glu Lys Gly Lys Phe Val Gln Ile Pro
820 825 830
Thr Gly Ile Lys Asp Pro Val Gly Phe Cys Asn Val Cys Gly Cys Trp
835 840 845
Ile Gly Tyr Gly Cys Ser Cys Asp Thr Phe Gly Pro Leu Val Arg Lys
850 855 860
Ile Phe Val Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala
865 870 875 880
Arg Thr Val Ala Gly Val Leu Lys His Phe Ser Met Met Ile Leu Ser
885 890 895
Asp Asp Gly Val Val Ala Pro Pro Gly Glu Gln Phe Lys His Leu Pro
900 905 910
Leu Met Asp Tyr Val Pro Leu Lys Ser Ala Cys Ile Thr Arg Cys Asn
915 920 925
Leu His Leu Gly Ala Gly Ser Asp Lys Gly Val Ala Pro Gly Thr Ala
930 935 940
Val
945
<210> 2
<211> 2835
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagcccattt ccgcctacgc cttcctgatg gccaaggatg ggatcaccaa gctggctgac 60
gtggaggccg acgtggccgc tagagccgac gacgagggat tcatcaccct gaagaacaac 120
ctgtaccgcc tggtgtggct gaccggcctg ggcgaatcct ttaagaaggt ggccaccatt 180
ccctacaaag tgtgcaacag cgtgaaggac acactggcct actacgccca cagcgtgctg 240
tacagagtgt tcccctacga catggactct ggggtgagca gcttcaagaa ggtggctttc 300
ggcggcgatc aggtgcacga ggtggccgct gtgagatccg tgactgtgga gtataacatc 360
cacgctgtgc tggacaccct gctggccagt agcagcctgc gcacattcgt ggtggacaaa 420
agcctggacg tggtggtgaa tgctgccaat gggcacctga aacatggagg cggagtggcc 480
aaggctgtga cccccctgat cagcgccgga atcttcggag tgaagcctga tggatgcaag 540
aaatctggct gtctgttctg ctacaagaga aacagactga aaaagcacaa ctggaactgc 600
gtggattgcg acagctacgg acccggcaac acctttatta ccgacgaggt ggccagagac 660
ctgaaagaga gcttcgccaa gaacgcctgc gtgtattaca gccagctgct gaccgacgag 720
agctgcaaca acttcgtgcc cagctacgtg aagcccgaca gagacgccga cggcagaccc 780
cagccatact gctacgactc cttcatcatg cacctgcagt ggctggtgat gtacggaccc 840
atcgtgcccg cctataacag atacctgagc ctgtacaaca aatacaaata ctactccggc 900
gctatggata ccgccgccta cagggaggcc gcctgcgctc atctggccaa ggccctggac 960
accttttcca acagcagcgt gctgcagagc ggcctggtga aaatggccca gcccagcgga 1020
aaggtggagc cctgcatggt gagcgtgacc tacggcaaca tgaccctgaa cggcctgtgg 1080
ctggacggac accagatgca gggatgcctg ctggtgctga ccgtggacgt ggcctgctac 1140
aatggccgcc cccagggcgt gtttcacgtg acaatgagat ccaactacac aatcaagggc 1200
agctttctgt gcggcagctg cgggtccgtg ggcaacttct gctacatgca ccagctggag 1260
ctgagcaacg gctgccacac cggcaccgac ttccaggtgg tgcagctgga ggggacagac 1320
tactaccagt cagtgaacgt ggtggcttgg ctgtatgccg ccatcagact gtacaacggc 1380
ttccagggaa agcagatcct gggcagcacc agcctggagg acgaatttac acccgaggac 1440
gccaacggcc tgagacctcc caagaactcc tttgaagccc tggccctgaa cttcaagctg 1500
ctgggaatcg gcggcgtgcc ctgcatcaaa gtgagcctga gctgcctgca gcagctgcac 1560
gtggaggcca actccaagct gtgggcctac tgcgtgaaac tgcacaacgt gagcctgctg 1620
gccgtgctgc tgagtttccc cggcgccgtg gatctggacg tggcctcaga atttgtgaac 1680
ctggccagct tcgccgaaag cggagcctct ccccaggtgc tgaaacagct gaaaaaggcc 1740
tgcaacatcg ccaagagcgc tgacgctgcc gtgcagagga agctggaacg catggccgac 1800
caggctatga caagcatgta caaggaggcc agagctgaag acaaaaagag caaggtggtg 1860
agcgccatgc agaccatgct gttcggaatg ctgagaaagc tgaactccat cctggacaac 1920
gctaggaacg gatgcgtgcc cctgtccgtg atccccctgc aggtggtgga caataactcc 1980
gtgacctacg ccggggccgt gtgggacatc cagaccatcc aggacctgac ctggccactg 2040
gtgctggaat gtaccagagc caacctgagc gacaatgacg ggctgaaata cgccaagtgg 2100
gagaaggatg acggaaatca gggccccaaa ggaccaaaaa tcaaatacct gtacttcgtg 2160
aagaacctga acacactgag aagaggagcc gtgctgggaa ccatcagcgc caccgtgaga 2220
ctgcaggccg gaaaggccac cgagtacgcc agcaacagca gcatcctgag cctgtgcgcc 2280
ttcgccgtgg accccgctaa ggcctacctg gactttgtga agcagggagg ccagcccatc 2340
accaactgcg tgaagatgct gtgcaaccac gccggcaccg ggcaggctat caccgtgaag 2400
cccgaggcca ccaccgacca ggactcttac ggcggagcca gcgtgtgcct gtactgcaga 2460
gcccacgtgg agaagggcaa gttcgtgcag attccaaccg gcattaagga ccccgtgggc 2520
ttttgtaacg tgtgcggctg ttggattggc tatggatgct cttgtgacac ctttggccca 2580
ctggtgagaa agattttcgt ggatggactg aagtacgcta tcagcgccaa aaatagagcc 2640
aggaccgtgg ccggagtgct gaagcacttt agcatgatga tcctgagcga cgatggcgtg 2700
gtggccccac caggggagca gtttaaacac ctgcctctga tggattacgt gcccctgaag 2760
agcgcttgca ttacccggtg caacctgcac ctgggcgccg gaagcgacaa gggagtggcc 2820
cctggcaccg ctgtg 2835
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Arg Leu Phe Arg Arg Thr Arg Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr
1 5 10 15
Asn Ala Ile Leu Cys Ile Leu
20
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agactgttca gaagaacccg gagctggtgg tcattcaacc cagagaccaa cgccatcctg 60
tgcatcctg 69
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Pro Leu Pro Asp Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro
1 5 10 15
Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly
20
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagcccctgc ccgacagatg gtacttctac tacaccggaa ccggacccgc cgccgacctg 60
aactgggga 69
<210> 7
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp Lys Val Glu
1 5 10 15
Thr Ser Gly Leu Gly Ile Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr Tyr Asn
20 25 30
Gly Ile Lys Val Leu Pro Pro Leu Leu Asp Ala Gly Ile Thr Gln Asp
35 40 45
Val Leu Ser Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Ser Phe Asn Lys Ala
50 55 60
Gly Phe Arg Thr Thr Asn Ser Ala Leu Gln Lys Ile Gln Asp Val Val
65 70 75 80
Asn Lys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Ser Ser Ile Gln Asp Ile Tyr Ser
85 90 95
Arg Leu Asp Ala Leu Glu Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr
100 105 110
Gly Arg Leu Thr Ala Leu Asn Ala Tyr Val Ser Tyr Asp Thr Ile Lys
115 120 125
Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser Asp Arg
130 135 140
Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu Thr Phe
145 150 155 160
Gln Ser Arg Gln Leu Ala Thr Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser
165 170 175
Gln Ser Ser Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Asn Gly Thr His Ile Glu Leu
180 185 190
Gly Ile Tyr Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Ala
195 200 205
Ile Gly Phe Ala Leu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly
210 215 220
Val Gly Trp Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala
225 230 235 240
Gln Ser Ile Phe Tyr Arg
245
<210> 8
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccatctggcc gctccgccat cgaagacctg ctgttcgaca aggtggaaac cagcggcctg 60
ggcatcagag acctgatctg cgcccagtac tacaacggaa ttaaggtgct gcctcccctg 120
ctggacgccg gcatcaccca ggacgtgctg agcgagaacc agaaactgat cgctaactca 180
ttcaacaagg ccggctttag aaccaccaac tcagccctgc agaagatcca ggacgtggtg 240
aacaagcagt tcggcgccat ctccagcagc attcaggaca tctatagcag actggacgcc 300
ctggaagccg acgcccaggt ggacagactg atcaccggca gactgaccgc cctgaacgcc 360
tacgtgagct acgacaccat caaatactac agcatcatcc cccacagcat cagatcaatc 420
cagtcagaca gaaaggcctg ggccgccttc tacgtgtaca aactgcagcc cctgaccttc 480
cagtccaggc agctggccac ccagaaagtg aacgagtgcg tgaagagcca gtccagcaga 540
tacggcttct gcggaaacgg aacccacatc gagctgggca tttacgagac ctacatcaaa 600
tggccctggt acgtgtggct ggccattgga tttgccctga tcgccagcag cctgctgggc 660
agcatcgccg gagtggggtg gacagccgga ctgagcagct tcgccgccat ccctttcgcc 720
cagagcatct tctacaga 738
<210> 9
<211> 1238
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Arg Leu Phe Arg Arg Thr Arg Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro Glu
1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Leu Cys Ile Leu Lys Pro Leu Pro Asp Arg Trp Tyr
20 25 30
Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Pro
35 40 45
Ser Gly Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp Lys Val Glu Thr
50 55 60
Ser Gly Leu Gly Ile Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr Tyr Asn Gly
65 70 75 80
Ile Lys Val Leu Pro Pro Leu Leu Asp Ala Gly Ile Thr Gln Asp Val
85 90 95
Leu Ser Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Ser Phe Asn Lys Ala Gly
100 105 110
Phe Arg Thr Thr Asn Ser Ala Leu Gln Lys Ile Gln Asp Val Val Asn
115 120 125
Lys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Ser Ser Ile Gln Asp Ile Tyr Ser Arg
130 135 140
Leu Asp Ala Leu Glu Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly
145 150 155 160
Arg Leu Thr Ala Leu Asn Ala Tyr Val Ser Tyr Asp Thr Ile Lys Tyr
165 170 175
Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser Asp Arg Lys
180 185 190
Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu Thr Phe Gln
195 200 205
Ser Arg Gln Leu Ala Thr Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln
210 215 220
Ser Ser Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Asn Gly Thr His Ile Glu Leu Gly
225 230 235 240
Ile Tyr Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Ala Ile
245 250 255
Gly Phe Ala Leu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val
260 265 270
Gly Trp Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln
275 280 285
Ser Ile Phe Tyr Arg Lys Pro Ile Ser Ala Tyr Ala Phe Leu Met Ala
290 295 300
Lys Asp Gly Ile Thr Lys Leu Ala Asp Val Glu Ala Asp Val Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ala Asp Asp Glu Gly Phe Ile Thr Leu Lys Asn Asn Leu Tyr Arg
325 330 335
Leu Val Trp Leu Thr Gly Leu Gly Glu Ser Phe Lys Lys Val Ala Thr
340 345 350
Ile Pro Tyr Lys Val Cys Asn Ser Val Lys Asp Thr Leu Ala Tyr Tyr
355 360 365
Ala His Ser Val Leu Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Asp Met Asp Ser Gly
370 375 380
Val Ser Ser Phe Lys Lys Val Ala Phe Gly Gly Asp Gln Val His Glu
385 390 395 400
Val Ala Ala Val Arg Ser Val Thr Val Glu Tyr Asn Ile His Ala Val
405 410 415
Leu Asp Thr Leu Leu Ala Ser Ser Ser Leu Arg Thr Phe Val Val Asp
420 425 430
Lys Ser Leu Asp Val Val Val Asn Ala Ala Asn Gly His Leu Lys His
435 440 445
Gly Gly Gly Val Ala Lys Ala Val Thr Pro Leu Ile Ser Ala Gly Ile
450 455 460
Phe Gly Val Lys Pro Asp Gly Cys Lys Lys Ser Gly Cys Leu Phe Cys
465 470 475 480
Tyr Lys Arg Asn Arg Leu Lys Lys His Asn Trp Asn Cys Val Asp Cys
485 490 495
Asp Ser Tyr Gly Pro Gly Asn Thr Phe Ile Thr Asp Glu Val Ala Arg
500 505 510
Asp Leu Lys Glu Ser Phe Ala Lys Asn Ala Cys Val Tyr Tyr Ser Gln
515 520 525
Leu Leu Thr Asp Glu Ser Cys Asn Asn Phe Val Pro Ser Tyr Val Lys
530 535 540
Pro Asp Arg Asp Ala Asp Gly Arg Pro Gln Pro Tyr Cys Tyr Asp Ser
545 550 555 560
Phe Ile Met His Leu Gln Trp Leu Val Met Tyr Gly Pro Ile Val Pro
565 570 575
Ala Tyr Asn Arg Tyr Leu Ser Leu Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr Tyr Ser
580 585 590
Gly Ala Met Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Ala Cys Ala His Leu
595 600 605
Ala Lys Ala Leu Asp Thr Phe Ser Asn Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly
610 615 620
Leu Val Lys Met Ala Gln Pro Ser Gly Lys Val Glu Pro Cys Met Val
625 630 635 640
Ser Val Thr Tyr Gly Asn Met Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu Asp Gly
645 650 655
His Gln Met Gln Gly Cys Leu Leu Val Leu Thr Val Asp Val Ala Cys
660 665 670
Tyr Asn Gly Arg Pro Gln Gly Val Phe His Val Thr Met Arg Ser Asn
675 680 685
Tyr Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Cys Gly Ser Cys Gly Ser Val Gly
690 695 700
Asn Phe Cys Tyr Met His Gln Leu Glu Leu Ser Asn Gly Cys His Thr
705 710 715 720
Gly Thr Asp Phe Gln Val Val Gln Leu Glu Gly Thr Asp Tyr Tyr Gln
725 730 735
Ser Val Asn Val Val Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Ile Arg Leu Tyr Asn
740 745 750
Gly Phe Gln Gly Lys Gln Ile Leu Gly Ser Thr Ser Leu Glu Asp Glu
755 760 765
Phe Thr Pro Glu Asp Ala Asn Gly Leu Arg Pro Pro Lys Asn Ser Phe
770 775 780
Glu Ala Leu Ala Leu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Ile Gly Gly Val Pro
785 790 795 800
Cys Ile Lys Val Ser Leu Ser Cys Leu Gln Gln Leu His Val Glu Ala
805 810 815
Asn Ser Lys Leu Trp Ala Tyr Cys Val Lys Leu His Asn Val Ser Leu
820 825 830
Leu Ala Val Leu Leu Ser Phe Pro Gly Ala Val Asp Leu Asp Val Ala
835 840 845
Ser Glu Phe Val Asn Leu Ala Ser Phe Ala Glu Ser Gly Ala Ser Pro
850 855 860
Gln Val Leu Lys Gln Leu Lys Lys Ala Cys Asn Ile Ala Lys Ser Ala
865 870 875 880
Asp Ala Ala Val Gln Arg Lys Leu Glu Arg Met Ala Asp Gln Ala Met
885 890 895
Thr Ser Met Tyr Lys Glu Ala Arg Ala Glu Asp Lys Lys Ser Lys Val
900 905 910
Val Ser Ala Met Gln Thr Met Leu Phe Gly Met Leu Arg Lys Leu Asn
915 920 925
Ser Ile Leu Asp Asn Ala Arg Asn Gly Cys Val Pro Leu Ser Val Ile
930 935 940
Pro Leu Gln Val Val Asp Asn Asn Ser Val Thr Tyr Ala Gly Ala Val
945 950 955 960
Trp Asp Ile Gln Thr Ile Gln Asp Leu Thr Trp Pro Leu Val Leu Glu
965 970 975
Cys Thr Arg Ala Asn Leu Ser Asp Asn Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Lys
980 985 990
Trp Glu Lys Asp Asp Gly Asn Gln Gly Pro Lys Gly Pro Lys Ile Lys
995 1000 1005
Tyr Leu Tyr Phe Val Lys Asn Leu Asn Thr Leu Arg Arg Gly Ala
1010 1015 1020
Val Leu Gly Thr Ile Ser Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Lys
1025 1030 1035
Ala Thr Glu Tyr Ala Ser Asn Ser Ser Ile Leu Ser Leu Cys Ala
1040 1045 1050
Phe Ala Val Asp Pro Ala Lys Ala Tyr Leu Asp Phe Val Lys Gln
1055 1060 1065
Gly Gly Gln Pro Ile Thr Asn Cys Val Lys Met Leu Cys Asn His
1070 1075 1080
Ala Gly Thr Gly Gln Ala Ile Thr Val Lys Pro Glu Ala Thr Thr
1085 1090 1095
Asp Gln Asp Ser Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg
1100 1105 1110
Ala His Val Glu Lys Gly Lys Phe Val Gln Ile Pro Thr Gly Ile
1115 1120 1125
Lys Asp Pro Val Gly Phe Cys Asn Val Cys Gly Cys Trp Ile Gly
1130 1135 1140
Tyr Gly Cys Ser Cys Asp Thr Phe Gly Pro Leu Val Arg Lys Ile
1145 1150 1155
Phe Val Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala
1160 1165 1170
Arg Thr Val Ala Gly Val Leu Lys His Phe Ser Met Met Ile Leu
1175 1180 1185
Ser Asp Asp Gly Val Val Ala Pro Pro Gly Glu Gln Phe Lys His
1190 1195 1200
Leu Pro Leu Met Asp Tyr Val Pro Leu Lys Ser Ala Cys Ile Thr
1205 1210 1215
Arg Cys Asn Leu His Leu Gly Ala Gly Ser Asp Lys Gly Val Ala
1220 1225 1230
Pro Gly Thr Ala Val
1235
<210> 10
<211> 3714
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgagactgt tcagaagaac ccggagctgg tggtcattca acccagagac caacgccatc 60
ctgtgcatcc tgaagcccct gcccgacaga tggtacttct actacaccgg aaccggaccc 120
gccgccgacc tgaactgggg accatctggc cgctccgcca tcgaagacct gctgttcgac 180
aaggtggaaa ccagcggcct gggcatcaga gacctgatct gcgcccagta ctacaacgga 240
attaaggtgc tgcctcccct gctggacgcc ggcatcaccc aggacgtgct gagcgagaac 300
cagaaactga tcgctaactc attcaacaag gccggcttta gaaccaccaa ctcagccctg 360
cagaagatcc aggacgtggt gaacaagcag ttcggcgcca tctccagcag cattcaggac 420
atctatagca gactggacgc cctggaagcc gacgcccagg tggacagact gatcaccggc 480
agactgaccg ccctgaacgc ctacgtgagc tacgacacca tcaaatacta cagcatcatc 540
ccccacagca tcagatcaat ccagtcagac agaaaggcct gggccgcctt ctacgtgtac 600
aaactgcagc ccctgacctt ccagtccagg cagctggcca cccagaaagt gaacgagtgc 660
gtgaagagcc agtccagcag atacggcttc tgcggaaacg gaacccacat cgagctgggc 720
atttacgaga cctacatcaa atggccctgg tacgtgtggc tggccattgg atttgccctg 780
atcgccagca gcctgctggg cagcatcgcc ggagtggggt ggacagccgg actgagcagc 840
ttcgccgcca tccctttcgc ccagagcatc ttctacagaa agcccatttc cgcctacgcc 900
ttcctgatgg ccaaggatgg gatcaccaag ctggctgacg tggaggccga cgtggccgct 960
agagccgacg acgagggatt catcaccctg aagaacaacc tgtaccgcct ggtgtggctg 1020
accggcctgg gcgaatcctt taagaaggtg gccaccattc cctacaaagt gtgcaacagc 1080
gtgaaggaca cactggccta ctacgcccac agcgtgctgt acagagtgtt cccctacgac 1140
atggactctg gggtgagcag cttcaagaag gtggctttcg gcggcgatca ggtgcacgag 1200
gtggccgctg tgagatccgt gactgtggag tataacatcc acgctgtgct ggacaccctg 1260
ctggccagta gcagcctgcg cacattcgtg gtggacaaaa gcctggacgt ggtggtgaat 1320
gctgccaatg ggcacctgaa acatggaggc ggagtggcca aggctgtgac ccccctgatc 1380
agcgccggaa tcttcggagt gaagcctgat ggatgcaaga aatctggctg tctgttctgc 1440
tacaagagaa acagactgaa aaagcacaac tggaactgcg tggattgcga cagctacgga 1500
cccggcaaca cctttattac cgacgaggtg gccagagacc tgaaagagag cttcgccaag 1560
aacgcctgcg tgtattacag ccagctgctg accgacgaga gctgcaacaa cttcgtgccc 1620
agctacgtga agcccgacag agacgccgac ggcagacccc agccatactg ctacgactcc 1680
ttcatcatgc acctgcagtg gctggtgatg tacggaccca tcgtgcccgc ctataacaga 1740
tacctgagcc tgtacaacaa atacaaatac tactccggcg ctatggatac cgccgcctac 1800
agggaggccg cctgcgctca tctggccaag gccctggaca ccttttccaa cagcagcgtg 1860
ctgcagagcg gcctggtgaa aatggcccag cccagcggaa aggtggagcc ctgcatggtg 1920
agcgtgacct acggcaacat gaccctgaac ggcctgtggc tggacggaca ccagatgcag 1980
ggatgcctgc tggtgctgac cgtggacgtg gcctgctaca atggccgccc ccagggcgtg 2040
tttcacgtga caatgagatc caactacaca atcaagggca gctttctgtg cggcagctgc 2100
gggtccgtgg gcaacttctg ctacatgcac cagctggagc tgagcaacgg ctgccacacc 2160
ggcaccgact tccaggtggt gcagctggag gggacagact actaccagtc agtgaacgtg 2220
gtggcttggc tgtatgccgc catcagactg tacaacggct tccagggaaa gcagatcctg 2280
ggcagcacca gcctggagga cgaatttaca cccgaggacg ccaacggcct gagacctccc 2340
aagaactcct ttgaagccct ggccctgaac ttcaagctgc tgggaatcgg cggcgtgccc 2400
tgcatcaaag tgagcctgag ctgcctgcag cagctgcacg tggaggccaa ctccaagctg 2460
tgggcctact gcgtgaaact gcacaacgtg agcctgctgg ccgtgctgct gagtttcccc 2520
ggcgccgtgg atctggacgt ggcctcagaa tttgtgaacc tggccagctt cgccgaaagc 2580
ggagcctctc cccaggtgct gaaacagctg aaaaaggcct gcaacatcgc caagagcgct 2640
gacgctgccg tgcagaggaa gctggaacgc atggccgacc aggctatgac aagcatgtac 2700
aaggaggcca gagctgaaga caaaaagagc aaggtggtga gcgccatgca gaccatgctg 2760
ttcggaatgc tgagaaagct gaactccatc ctggacaacg ctaggaacgg atgcgtgccc 2820
ctgtccgtga tccccctgca ggtggtggac aataactccg tgacctacgc cggggccgtg 2880
tgggacatcc agaccatcca ggacctgacc tggccactgg tgctggaatg taccagagcc 2940
aacctgagcg acaatgacgg gctgaaatac gccaagtggg agaaggatga cggaaatcag 3000
ggccccaaag gaccaaaaat caaatacctg tacttcgtga agaacctgaa cacactgaga 3060
agaggagccg tgctgggaac catcagcgcc accgtgagac tgcaggccgg aaaggccacc 3120
gagtacgcca gcaacagcag catcctgagc ctgtgcgcct tcgccgtgga ccccgctaag 3180
gcctacctgg actttgtgaa gcagggaggc cagcccatca ccaactgcgt gaagatgctg 3240
tgcaaccacg ccggcaccgg gcaggctatc accgtgaagc ccgaggccac caccgaccag 3300
gactcttacg gcggagccag cgtgtgcctg tactgcagag cccacgtgga gaagggcaag 3360
ttcgtgcaga ttccaaccgg cattaaggac cccgtgggct tttgtaacgt gtgcggctgt 3420
tggattggct atggatgctc ttgtgacacc tttggcccac tggtgagaaa gattttcgtg 3480
gatggactga agtacgctat cagcgccaaa aatagagcca ggaccgtggc cggagtgctg 3540
aagcacttta gcatgatgat cctgagcgac gatggcgtgg tggccccacc aggggagcag 3600
tttaaacacc tgcctctgat ggattacgtg cccctgaaga gcgcttgcat tacccggtgc 3660
aacctgcacc tgggcgccgg aagcgacaag ggagtggccc ctggcaccgc tgtg 3714
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Pro Leu Pro Asp Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Val Val Asn Lys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Lys Pro Ile Ser Ala Tyr Ala Phe Leu Met Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Ser Tyr Gly Pro Gly Asn Thr Phe Ile Thr Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp Lys Val Glu Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Ser Ala Leu Gln Lys Ile Gln Asp Val Val Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Ala Asp Asp Glu Gly Phe Ile Thr Leu Lys Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Asp Met Asp Ser Gly Val Ser Ser Phe
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Ser Val Thr Val Glu Tyr Asn Ile His Ala Val Leu Asp Thr Leu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Gln Trp Leu Val Met Tyr Gly Pro Ile
1 5
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gln Ser Gly Leu Val Lys Met Ala Gln Pro Ser Gly Lys Val Glu
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Asn Gly Arg Pro Gln Gly Val Phe His Val Thr Met Arg Ser Asn
1 5 10 15
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Val Thr Tyr Gly Asn Met Thr Leu Asn Gly Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Ser Val Gly Asn Phe Cys Tyr Met His Gln Leu
1 5 10
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Leu Ser Asp Asn Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Lys Trp Glu Lys Asp
1 5 10 15
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Lys Ile Lys Tyr Leu Tyr Phe Val Lys Asn Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Gly Ala Val Leu Gly Thr Ile Ser Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Thr Gly Gln Ala Ile Thr Val Lys Pro Glu Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> SARS-CoV病毒和SARS-CoV-2病毒
<400> 30
Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> MERS-CoV病毒
<400> 31
Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> SARS-CoV病毒
<400> 32
Val Pro Ala Tyr Ser Phe Leu Pro Gly
1 5
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2病毒
<400> 33
Ala Pro Ile Ser Ala Met Val Arg Met Tyr Ile Phe Phe Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 1806
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
atgaaaacaa ttattgccct gtcttacatt ttctgcctcg tgttcgccga ctacaaggac 60
gacgacgaca agtccctgca ggtgtgccct accgagtcta tcgtgcgctt cccaaacatc 120
acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc 180
tggaaccgga agcggatttc taactgcgtg gccgactact ccgtgctgta caactctgcc 240
tctttctcca cattcaagtg ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc 300
accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt aggggcgacg aggtgagaca gattgcccct 360
ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac tacaagctcc ctgacgactt cacaggctgc 420
gtgattgcct ggaactctaa caacctggac tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg 480
tacagactgt tccggaagtc taacctcaag ccattcgagc gcgacattag caccgagatt 540
taccaggccg gcagcacccc atgcaacggc gtggagggct tcaactgcta cttcccactt 600
caatcttacg gcttccagcc aacaaacggc gtgggctacc agccataccg ggtggtggtg 660
ctgtccttcg agctactcca cgccccagcc acagtgtgcg gcccaaagaa gagcaccaac 720
ctcgtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tgacaggcac aggcgtgctc 780
accgagtcta acaagaagtt cctccctttc cagcagttcg gcagggacat cgccgacacc 840
accgacgccg tgcgcgaccc tcagacactc gaaattctgg acatcacccc ttgctctggc 900
ggcggcggct ctggcctgtt cggcgccatt gccggcttca tcgagaacgg ctgggagggc 960
ctcattgacg gctggtacgg cttcaggcac cagaacgccc agggcgaggg cacagccgcc 1020
gactacaagt ccacccagtc cgccattgac cagatcacag gcaagctgaa cagactcatt 1080
gaaaaaacaa accagcagtt cgagctgatt gacaacgagt tcaacgaggt ggagaagcag 1140
attggcaacg tgattaactg gacacgggac tctattacag aggtgtggtc ttacaacgcc 1200
gagttactcg tggcaatgga gaaccagcac acaattgacc tcgccgactc tgagatggac 1260
aagctgtacg agcgggtgaa gagacagctc agagagaacg ccgaggagga cggcacaggc 1320
tgcttcgaga tattccacaa gtgcgacgac gactgcatgg ccagcatccg gaacaacaca 1380
tacgaccact ctaagtaccg ggaggaggcc atgcagaacc gcatccagat tgacccagtg 1440
aagctgtcta gcggctacaa ggacgtggct agcaccacca cacccgcccc tagacctcct 1500
acccccgccc caacaattgc ctctcagcca ctgtctctca gacctgaggc gtgcaggccc 1560
gccgccggcg gcgccgtgca cacacggggc ctcgacttcg cctgcgacat ttacatttgg 1620
gccccactcg ccggcacatg cggcgtgctc ctcctgtctc tggtgatcac actgtactgc 1680
aagcggggca gaaagaagct cctgtacatt ttcaagcagc ctttcatgag acccgtgcag 1740
accacccagg aggaggacgg ctgctcttgc aggttccctg aggaggagga gggcggctgc 1800
gaacta 1806
<210> 35
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Leu Gln Val Cys Pro Thr Glu
20 25 30
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
35 40 45
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
50 55 60
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
65 70 75 80
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
85 90 95
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
100 105 110
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
115 120 125
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
130 135 140
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
165 170 175
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
180 185 190
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
195 200 205
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
210 215 220
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
225 230 235 240
Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly
245 250 255
Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln
260 265 270
Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln
275 280 285
Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
305 310 315 320
Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu
325 330 335
Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile
340 345 350
Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu
355 360 365
Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val
370 375 380
Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala
385 390 395 400
Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp
405 410 415
Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu
420 425 430
Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys
435 440 445
Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser
450 455 460
Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val
465 470 475 480
Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ala Ser Thr Thr Thr Pro Ala
485 490 495
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
500 505 510
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
515 520 525
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
530 535 540
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
545 550 555 560
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
565 570 575
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
580 585 590
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
595 600
<210> 36
<211> 6283
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atgaccaaga tcaccctgag cccccagaac ttccgcatcc agaagcagga gaccaccctg 60
ctgaaggaga agagcaccga gaagaacagc ctggccaaga gcatcctggc cgtgaagaac 120
cacttcatcg agctgcgcag caagctgagc gagcgcttca tcagccacaa gaacaccgag 180
agcagcgcca cccacttcca ccgcggcagc gccagcgagg gccgcgccgt gctgaccaac 240
aaggtggtga aggacttcat gctgcagacc ctgaacgaca tcgacatccg cggcagcgcc 300
agactgttca gaagaacccg gagctggtgg tcattcaacc cagagaccaa cgccatcctg 360
tgcatcctga agcccctgcc cgacagatgg tacttctact acaccggaac cggacccgcc 420
gccgacctga actggggacc atctggccgc tccgccatcg aagacctgct gttcgacaag 480
gtggaaacca gcggcctggg catcagagac ctgatctgcg cccagtacta caacggaatt 540
aaggtgctgc ctcccctgct ggacgccggc atcacccagg acgtgctgag cgagaaccag 600
aaactgatcg ctaactcatt caacaaggcc ggctttagaa ccaccaactc agccctgcag 660
aagatccagg acgtggtgaa caagcagttc ggcgccatct ccagcagcat tcaggacatc 720
tatagcagac tggacgccct ggaagccgac gcccaggtgg acagactgat caccggcaga 780
ctgaccgccc tgaacgccta cgtgagctac gacaccatca aatactacag catcatcccc 840
cacagcatca gatcaatcca gtcagacaga aaggcctggg ccgccttcta cgtgtacaaa 900
ctgcagcccc tgaccttcca gtccaggcag ctggccaccc agaaagtgaa cgagtgcgtg 960
aagagccagt ccagcagata cggcttctgc ggaaacggaa cccacatcga gctgggcatt 1020
tacgagacct acatcaaatg gccctggtac gtgtggctgg ccattggatt tgccctgatc 1080
gccagcagcc tgctgggcag catcgccgga gtggggtgga cagccggact gagcagcttc 1140
gccgccatcc ctttcgccca gagcatcttc tacagaaagc ccatttccgc ctacgccttc 1200
ctgatggcca aggatgggat caccaagctg gctgacgtgg aggccgacgt ggccgctaga 1260
gccgacgacg agggattcat caccctgaag aacaacctgt accgcctggt gtggctgacc 1320
ggcctgggcg aatcctttaa gaaggtggcc accattccct acaaagtgtg caacagcgtg 1380
aaggacacac tggcctacta cgcccacagc gtgctgtaca gagtgttccc ctacgacatg 1440
gactctgggg tgagcagctt caagaaggtg gctttcggcg gcgatcaggt gcacgaggtg 1500
gccgctgtga gatccgtgac tgtggagtat aacatccacg ctgtgctgga caccctgctg 1560
gccagtagca gcctgcgcac attcgtggtg gacaaaagcc tggacgtggt ggtgaatgct 1620
gccaatgggc acctgaaaca tggaggcgga gtggccaagg ctgtgacccc cctgatcagc 1680
gccggaatct tcggagtgaa gcctgatgga tgcaagaaat ctggctgtct gttctgctac 1740
aagagaaaca gactgaaaaa gcacaactgg aactgcgtgg attgcgacag ctacggaccc 1800
ggcaacacct ttattaccga cgaggtggcc agagacctga aagagagctt cgccaagaac 1860
gcctgcgtgt attacagcca gctgctgacc gacgagagct gcaacaactt cgtgcccagc 1920
tacgtgaagc ccgacagaga cgccgacggc agaccccagc catactgcta cgactccttc 1980
atcatgcacc tgcagtggct ggtgatgtac ggacccatcg tgcccgccta taacagatac 2040
ctgagcctgt acaacaaata caaatactac tccggcgcta tggataccgc cgcctacagg 2100
gaggccgcct gcgctcatct ggccaaggcc ctggacacct tttccaacag cagcgtgctg 2160
cagagcggcc tggtgaaaat ggcccagccc agcggaaagg tggagccctg catggtgagc 2220
gtgacctacg gcaacatgac cctgaacggc ctgtggctgg acggacacca gatgcaggga 2280
tgcctgctgg tgctgaccgt ggacgtggcc tgctacaatg gccgccccca gggcgtgttt 2340
cacgtgacaa tgagatccaa ctacacaatc aagggcagct ttctgtgcgg cagctgcggg 2400
tccgtgggca acttctgcta catgcaccag ctggagctga gcaacggctg ccacaccggc 2460
accgacttcc aggtggtgca gctggagggg acagactact accagtcagt gaacgtggtg 2520
gcttggctgt atgccgccat cagactgtac aacggcttcc agggaaagca gatcctgggc 2580
agcaccagcc tggaggacga atttacaccc gaggacgcca acggcctgag acctcccaag 2640
aactcctttg aagccctggc cctgaacttc aagctgctgg gaatcggcgg cgtgccctgc 2700
atcaaagtga gcctgagctg cctgcagcag ctgcacgtgg aggccaactc caagctgtgg 2760
gcctactgcg tgaaactgca caacgtgagc ctgctggccg tgctgctgag tttccccggc 2820
gccgtggatc tggacgtggc ctcagaattt gtgaacctgg ccagcttcgc cgaaagcgga 2880
gcctctcccc aggtgctgaa acagctgaaa aaggcctgca acatcgccaa gagcgctgac 2940
gctgccgtgc agaggaagct ggaacgcatg gccgaccagg ctatgacaag catgtacaag 3000
gaggccagag ctgaagacaa aaagagcaag gtggtgagcg ccatgcagac catgctgttc 3060
ggaatgctga gaaagctgaa ctccatcctg gacaacgcta ggaacggatg cgtgcccctg 3120
tccgtgatcc ccctgcaggt ggtggacaat aactccgtga cctacgccgg ggccgtgtgg 3180
gacatccaga ccatccagga cctgacctgg ccactggtgc tggaatgtac cagagccaac 3240
ctgagcgaca atgacgggct gaaatacgcc aagtgggaga aggatgacgg aaatcagggc 3300
cccaaaggac caaaaatcaa atacctgtac ttcgtgaaga acctgaacac actgagaaga 3360
ggagccgtgc tgggaaccat cagcgccacc gtgagactgc aggccggaaa ggccaccgag 3420
tacgccagca acagcagcat cctgagcctg tgcgccttcg ccgtggaccc cgctaaggcc 3480
tacctggact ttgtgaagca gggaggccag cccatcacca actgcgtgaa gatgctgtgc 3540
aaccacgccg gcaccgggca ggctatcacc gtgaagcccg aggccaccac cgaccaggac 3600
tcttacggcg gagccagcgt gtgcctgtac tgcagagccc acgtggagaa gggcaagttc 3660
gtgcagattc caaccggcat taaggacccc gtgggctttt gtaacgtgtg cggctgttgg 3720
attggctatg gatgctcttg tgacaccttt ggcccactgg tgagaaagat tttcgtggat 3780
ggactgaagt acgctatcag cgccaaaaat agagccagga ccgtggccgg agtgctgaag 3840
cactttagca tgatgatcct gagcgacgat ggcgtggtgg ccccaccagg ggagcagttt 3900
aaacacctgc ctctgatgga ttacgtgccc ctgaagagcg cttgcattac ccggtgcaac 3960
ctgcacctgg gcgccggaag cgacaaggga gtggcccctg gcaccgctgt gtaacccccc 4020
ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg 4080
ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc 4140
ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg 4200
aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg 4260
accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca 4320
cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata 4380
gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc 4440
cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt 4500
gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 4560
tgaaaaacac gatgataata tggccacaac cgccgccacc atgaaaacaa ttattgccct 4620
gtcttacatt ttctgcctcg tgttcgccga ctacaaggac gacgacgaca agtccctgca 4680
ggtgtgccct accgagtcta tcgtgcgctt cccaaacatc acaaacctgt gccctttcgg 4740
cgaggtgttc aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatttc 4800
taactgcgtg gccgactact ccgtgctgta caactctgcc tctttctcca cattcaagtg 4860
ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc 4920
tttcgtgatt aggggcgacg aggtgagaca gattgcccct ggccagacag gcaagatcgc 4980
cgactacaac tacaagctcc ctgacgactt cacaggctgc gtgattgcct ggaactctaa 5040
caacctggac tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg tacagactgt tccggaagtc 5100
taacctcaag ccattcgagc gcgacattag caccgagatt taccaggccg gcagcacccc 5160
atgcaacggc gtggagggct tcaactgcta cttcccactt caatcttacg gcttccagcc 5220
aacaaacggc gtgggctacc agccataccg ggtggtggtg ctgtccttcg agctactcca 5280
cgccccagcc acagtgtgcg gcccaaagaa gagcaccaac ctcgtgaaga acaagtgcgt 5340
gaacttcaac ttcaacggcc tgacaggcac aggcgtgctc accgagtcta acaagaagtt 5400
cctccctttc cagcagttcg gcagggacat cgccgacacc accgacgccg tgcgcgaccc 5460
tcagacactc gaaattctgg acatcacccc ttgctctggc ggcggcggct ctggcctgtt 5520
cggcgccatt gccggcttca tcgagaacgg ctgggagggc ctcattgacg gctggtacgg 5580
cttcaggcac cagaacgccc agggcgaggg cacagccgcc gactacaagt ccacccagtc 5640
cgccattgac cagatcacag gcaagctgaa cagactcatt gaaaaaacaa accagcagtt 5700
cgagctgatt gacaacgagt tcaacgaggt ggagaagcag attggcaacg tgattaactg 5760
gacacgggac tctattacag aggtgtggtc ttacaacgcc gagttactcg tggcaatgga 5820
gaaccagcac acaattgacc tcgccgactc tgagatggac aagctgtacg agcgggtgaa 5880
gagacagctc agagagaacg ccgaggagga cggcacaggc tgcttcgaga tattccacaa 5940
gtgcgacgac gactgcatgg ccagcatccg gaacaacaca tacgaccact ctaagtaccg 6000
ggaggaggcc atgcagaacc gcatccagat tgacccagtg aagctgtcta gcggctacaa 6060
ggacgtggct agcaccacca cacccgcccc tagacctcct acccccgccc caacaattgc 6120
ctctcagcca ctgtctctca gacctgaggc gtgcaggccc gccgccggcg gcgccgtgca 6180
cacacggggc ctcgacttcg cctgcgacat ttacatttgg gccccactcg ccggcacatg 6240
cggcgtgctc ctcctgtctc tggtgatcac actgtactgc tag 6283
<210> 37
<211> 1337
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Met Thr Lys Ile Thr Leu Ser Pro Gln Asn Phe Arg Ile Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Thr Thr Leu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Ser Ile Leu Ala Val Lys Asn His Phe Ile Glu Leu Arg Ser Lys
35 40 45
Leu Ser Glu Arg Phe Ile Ser His Lys Asn Thr Glu Ser Ser Ala Thr
50 55 60
His Phe His Arg Gly Ser Ala Ser Glu Gly Arg Ala Val Leu Thr Asn
65 70 75 80
Lys Val Val Lys Asp Phe Met Leu Gln Thr Leu Asn Asp Ile Asp Ile
85 90 95
Arg Gly Ser Ala Arg Leu Phe Arg Arg Thr Arg Ser Trp Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Ile Leu Lys Pro Leu Pro Asp
115 120 125
Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn
130 135 140
Trp Gly Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp Lys
145 150 155 160
Val Glu Thr Ser Gly Leu Gly Ile Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr
165 170 175
Tyr Asn Gly Ile Lys Val Leu Pro Pro Leu Leu Asp Ala Gly Ile Thr
180 185 190
Gln Asp Val Leu Ser Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Ser Phe Asn
195 200 205
Lys Ala Gly Phe Arg Thr Thr Asn Ser Ala Leu Gln Lys Ile Gln Asp
210 215 220
Val Val Asn Lys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Ser Ser Ile Gln Asp Ile
225 230 235 240
Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Leu Glu Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu
245 250 255
Ile Thr Gly Arg Leu Thr Ala Leu Asn Ala Tyr Val Ser Tyr Asp Thr
260 265 270
Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser
275 280 285
Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu
290 295 300
Thr Phe Gln Ser Arg Gln Leu Ala Thr Gln Lys Val Asn Glu Cys Val
305 310 315 320
Lys Ser Gln Ser Ser Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Asn Gly Thr His Ile
325 330 335
Glu Leu Gly Ile Tyr Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp
340 345 350
Leu Ala Ile Gly Phe Ala Leu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile
355 360 365
Ala Gly Val Gly Trp Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro
370 375 380
Phe Ala Gln Ser Ile Phe Tyr Arg Lys Pro Ile Ser Ala Tyr Ala Phe
385 390 395 400
Leu Met Ala Lys Asp Gly Ile Thr Lys Leu Ala Asp Val Glu Ala Asp
405 410 415
Val Ala Ala Arg Ala Asp Asp Glu Gly Phe Ile Thr Leu Lys Asn Asn
420 425 430
Leu Tyr Arg Leu Val Trp Leu Thr Gly Leu Gly Glu Ser Phe Lys Lys
435 440 445
Val Ala Thr Ile Pro Tyr Lys Val Cys Asn Ser Val Lys Asp Thr Leu
450 455 460
Ala Tyr Tyr Ala His Ser Val Leu Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Asp Met
465 470 475 480
Asp Ser Gly Val Ser Ser Phe Lys Lys Val Ala Phe Gly Gly Asp Gln
485 490 495
Val His Glu Val Ala Ala Val Arg Ser Val Thr Val Glu Tyr Asn Ile
500 505 510
His Ala Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Ser Ser Ser Leu Arg Thr Phe
515 520 525
Val Val Asp Lys Ser Leu Asp Val Val Val Asn Ala Ala Asn Gly His
530 535 540
Leu Lys His Gly Gly Gly Val Ala Lys Ala Val Thr Pro Leu Ile Ser
545 550 555 560
Ala Gly Ile Phe Gly Val Lys Pro Asp Gly Cys Lys Lys Ser Gly Cys
565 570 575
Leu Phe Cys Tyr Lys Arg Asn Arg Leu Lys Lys His Asn Trp Asn Cys
580 585 590
Val Asp Cys Asp Ser Tyr Gly Pro Gly Asn Thr Phe Ile Thr Asp Glu
595 600 605
Val Ala Arg Asp Leu Lys Glu Ser Phe Ala Lys Asn Ala Cys Val Tyr
610 615 620
Tyr Ser Gln Leu Leu Thr Asp Glu Ser Cys Asn Asn Phe Val Pro Ser
625 630 635 640
Tyr Val Lys Pro Asp Arg Asp Ala Asp Gly Arg Pro Gln Pro Tyr Cys
645 650 655
Tyr Asp Ser Phe Ile Met His Leu Gln Trp Leu Val Met Tyr Gly Pro
660 665 670
Ile Val Pro Ala Tyr Asn Arg Tyr Leu Ser Leu Tyr Asn Lys Tyr Lys
675 680 685
Tyr Tyr Ser Gly Ala Met Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Ala Cys
690 695 700
Ala His Leu Ala Lys Ala Leu Asp Thr Phe Ser Asn Ser Ser Val Leu
705 710 715 720
Gln Ser Gly Leu Val Lys Met Ala Gln Pro Ser Gly Lys Val Glu Pro
725 730 735
Cys Met Val Ser Val Thr Tyr Gly Asn Met Thr Leu Asn Gly Leu Trp
740 745 750
Leu Asp Gly His Gln Met Gln Gly Cys Leu Leu Val Leu Thr Val Asp
755 760 765
Val Ala Cys Tyr Asn Gly Arg Pro Gln Gly Val Phe His Val Thr Met
770 775 780
Arg Ser Asn Tyr Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Cys Gly Ser Cys Gly
785 790 795 800
Ser Val Gly Asn Phe Cys Tyr Met His Gln Leu Glu Leu Ser Asn Gly
805 810 815
Cys His Thr Gly Thr Asp Phe Gln Val Val Gln Leu Glu Gly Thr Asp
820 825 830
Tyr Tyr Gln Ser Val Asn Val Val Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Ile Arg
835 840 845
Leu Tyr Asn Gly Phe Gln Gly Lys Gln Ile Leu Gly Ser Thr Ser Leu
850 855 860
Glu Asp Glu Phe Thr Pro Glu Asp Ala Asn Gly Leu Arg Pro Pro Lys
865 870 875 880
Asn Ser Phe Glu Ala Leu Ala Leu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Ile Gly
885 890 895
Gly Val Pro Cys Ile Lys Val Ser Leu Ser Cys Leu Gln Gln Leu His
900 905 910
Val Glu Ala Asn Ser Lys Leu Trp Ala Tyr Cys Val Lys Leu His Asn
915 920 925
Val Ser Leu Leu Ala Val Leu Leu Ser Phe Pro Gly Ala Val Asp Leu
930 935 940
Asp Val Ala Ser Glu Phe Val Asn Leu Ala Ser Phe Ala Glu Ser Gly
945 950 955 960
Ala Ser Pro Gln Val Leu Lys Gln Leu Lys Lys Ala Cys Asn Ile Ala
965 970 975
Lys Ser Ala Asp Ala Ala Val Gln Arg Lys Leu Glu Arg Met Ala Asp
980 985 990
Gln Ala Met Thr Ser Met Tyr Lys Glu Ala Arg Ala Glu Asp Lys Lys
995 1000 1005
Ser Lys Val Val Ser Ala Met Gln Thr Met Leu Phe Gly Met Leu
1010 1015 1020
Arg Lys Leu Asn Ser Ile Leu Asp Asn Ala Arg Asn Gly Cys Val
1025 1030 1035
Pro Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Val Val Asp Asn Asn Ser Val
1040 1045 1050
Thr Tyr Ala Gly Ala Val Trp Asp Ile Gln Thr Ile Gln Asp Leu
1055 1060 1065
Thr Trp Pro Leu Val Leu Glu Cys Thr Arg Ala Asn Leu Ser Asp
1070 1075 1080
Asn Asp Gly Leu Lys Tyr Ala Lys Trp Glu Lys Asp Asp Gly Asn
1085 1090 1095
Gln Gly Pro Lys Gly Pro Lys Ile Lys Tyr Leu Tyr Phe Val Lys
1100 1105 1110
Asn Leu Asn Thr Leu Arg Arg Gly Ala Val Leu Gly Thr Ile Ser
1115 1120 1125
Ala Thr Val Arg Leu Gln Ala Gly Lys Ala Thr Glu Tyr Ala Ser
1130 1135 1140
Asn Ser Ser Ile Leu Ser Leu Cys Ala Phe Ala Val Asp Pro Ala
1145 1150 1155
Lys Ala Tyr Leu Asp Phe Val Lys Gln Gly Gly Gln Pro Ile Thr
1160 1165 1170
Asn Cys Val Lys Met Leu Cys Asn His Ala Gly Thr Gly Gln Ala
1175 1180 1185
Ile Thr Val Lys Pro Glu Ala Thr Thr Asp Gln Asp Ser Tyr Gly
1190 1195 1200
Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala His Val Glu Lys Gly
1205 1210 1215
Lys Phe Val Gln Ile Pro Thr Gly Ile Lys Asp Pro Val Gly Phe
1220 1225 1230
Cys Asn Val Cys Gly Cys Trp Ile Gly Tyr Gly Cys Ser Cys Asp
1235 1240 1245
Thr Phe Gly Pro Leu Val Arg Lys Ile Phe Val Asp Gly Leu Lys
1250 1255 1260
Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly Val
1265 1270 1275
Leu Lys His Phe Ser Met Met Ile Leu Ser Asp Asp Gly Val Val
1280 1285 1290
Ala Pro Pro Gly Glu Gln Phe Lys His Leu Pro Leu Met Asp Tyr
1295 1300 1305
Val Pro Leu Lys Ser Ala Cys Ile Thr Arg Cys Asn Leu His Leu
1310 1315 1320
Gly Ala Gly Ser Asp Lys Gly Val Ala Pro Gly Thr Ala Val
1325 1330 1335
<210> 38
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Ala Ala Thr Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu
1 5 10 15
Val Phe Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Leu Gln Val Cys
20 25 30
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
35 40 45
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
50 55 60
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
85 90 95
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
100 105 110
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
115 120 125
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
130 135 140
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
145 150 155 160
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
165 170 175
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
180 185 190
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
195 200 205
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
210 215 220
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
225 230 235 240
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
245 250 255
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
260 265 270
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
275 280 285
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly
305 310 315 320
Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala
325 330 335
Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile
340 345 350
Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln
355 360 365
Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile
370 375 380
Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser
385 390 395 400
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
405 410 415
Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln
420 425 430
Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe
435 440 445
His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr
450 455 460
Asp His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile
465 470 475 480
Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ala Ser Thr Thr
485 490 495
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
500 505 510
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
515 520 525
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
530 535 540
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
545 550 555 560
Leu Tyr Cys

Claims (16)

1.一种分离的免疫原性肽，其包含选自下组的一种或多种冠状病毒蛋白共享肽：
(a)冠状病毒早期表达蛋白多聚蛋白(ORF1ab)的共享肽；
(b)冠状病毒膜蛋白(M)的共享肽；
(c)冠状病毒核衣壳(N)蛋白的共享肽；
(d)冠状病毒囊膜蛋白(E)蛋白的共享肽；和
(e)冠状病毒刺突蛋白(S)蛋白的共享肽。
2.如权利要求1所述的免疫原性肽，其包含选自下组中的一个或多个肽段：
PLPDRWYFYYT(SEQ ID NO:11)；
VVNKQFGAISS(SEQ ID NO:12)；
KPISAYAFLMA(SEQ ID NO:13)；
SYGPGNTFITD(SEQ ID NO:14)；
IKYYSIIPHSI(SEQ ID NO:15)；
IEDLLFDKVET(SEQ ID NO:16)；
SALQKIQDVVN(SEQ ID NO:17)；
ADDEGFITLKN(SEQ ID NO:18)；
YRVFPYDMDSGVSSF(SEQ ID NO:19)；
SVTVEYNIHAVLDTL(SEQ ID NO:20)；
QWLVMYGPI(SEQ ID NO:21)；
QSGLVKMAQPSGKVE(SEQ ID NO:22)；
NGRPQGVFHVTMRSN(SEQ ID NO:23)；
VTYGNMTLNGL(SEQ ID NO:24)；
SVGNFCYMHQL(SEQ ID NO:25)；
LSDNDGLKYAKWEKD(SEQ ID NO:26)；
KIKYLYFVKNL(SEQ ID NO:27)；
GAVLGTISATVRLQA(SEQ ID NO:28)；和
TGQAITVKPEA(SEQ ID NO:29)。
3.如权利要求1所述的免疫原性肽，由所述免疫原性肽激活的T细胞特异性结合于选自下组的冠状病毒表位：PLPDRWYFYYT(SEQ ID NO:11)；KPISAYAFLMA(SEQ ID NO:13)；LSPRWYFYYL(SEQ ID NO:30)；LAPRWYFYYTG(SEQ ID NO:31)；VPAYSFLPG(SEQ ID NO:32)；和/或APISAMVRMYIFFA(SEQ ID NO:33)；和/或
所述共享肽来源于选自下组的冠状病毒：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV。
4.如权利要求1所述的免疫原性肽，其中，
所述ORF1ab的共享肽包含SEQ ID NO:1所述氨基酸序列，例如，所述ORF1ab的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或
所述M蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:3所述氨基酸序列，例如，所述M蛋白的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或
所述N蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:5所述氨基酸序列，例如，所述N蛋白的共享序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或
所述S蛋白的共享肽包含SEQ ID NO:7所述氨基酸序列，例如，所述M蛋白的共享肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5.如权利要求1所述的免疫原性肽，其还包含：
两种或以上所述共享肽的连接肽，所述共享肽之间包含或不包含接头序列，例如所述接头序列选自下组：(G4S)n(n＝1～8，例如(G4S)3、G4S)、GSAGSAAGSGEF、(Gly)6、EFPKPSTPPGSSGGAP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、(Gly)8、EGKSSGSGSESKST、IRES、P2A、T2A；和/或
与共有序列共表达(例如融合表达或单独阅读框表达)的其他序列，所述其他序列用于例如扩大抗病毒谱、提高免疫应答诱导能力，所述其他序列选自例如针对如下病毒的免疫原：冠状病毒(例如RBD或其修饰序列(如末端Cys修饰RBD氨基酸序列))、流感病毒(例如HA2)、艾滋病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒)，尤其是与活化B细胞应答的免疫原，制备能够同时激活中和抗体与T细胞应答的复合疫苗；
例如所述共表达的序列为选自下组的免疫调节序列：IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、GM-CSF、CD40L、CD40刺激抗体、PD-1与PD-L1抗体、CTLA4抗体、趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL3、XCL1、CCL4、CCL20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、FimH及SopE。
6.如权利要求1所述的免疫原性肽，其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，例如，所述免疫原性肽的序列如SEQ ID NO:9所示；或者，其包含SEQ ID NO:37和/或38所示的氨基酸序列，例如，所述免疫原性肽的序列如SEQ ID NO:37和38所示。
7.如权利要求1～6中任一项所述免疫原性肽的编码分子，包含所述编码分子的载体和/或包含所述编码分子或载体的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的编码分子、载体或宿主细胞，其中，所述编码分子包含选自下组中的一个或多个核苷酸分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:36；
可任选地，所述核苷酸分子之间包含或不包含接头序列，所述编码分子包含或不包含前导序列，所述核苷酸分子包含或不包含标签，例如His-tag、AviTag、Calmodulin tag、polyglutamate tag、E-tag、FLAG tag、HA-tag、Myc-tag、S-tag、SBP-tag、Sof-tag 1、Sof-tag3、Strep-tag、TC tag、V5 tag、T7 tag、VSV tag、Xpress tag、3X FLAG tag、Isopeptag、Spytag、Snoop tag和PNE tag。
9.一种产品，其包含：
如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽和/或如权利要求7～8中任一项所述的编码分子、载体或细胞；和
可任选的，药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂和/或佐剂(例如选自下组的一种或多种佐剂：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21)。
10.如权利要求9所述的产品，所述产品为例如抗冠状病毒感染的T细胞疫苗或药物，尤其是针对冠状病毒的广谱T细胞疫苗或药物，所述冠状病毒选自下组：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV，尤其是SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒；和/或
所述产品包含：含如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽的缀合物或偶联物。
11.如权利要求9所述的产品，所述产品选自：核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒(例如痘病毒(如选自天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株的痘病毒)、腺病毒(如选自Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、AdC68的腺病毒)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒)载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。
12.如权利要求9所述的产品，所述产品的形式适于选自下组的给予方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合；和/或
所述产品适于与冠状病毒S或S1所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的S或S1：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV；和/或
所述产品适于与流感病毒HA或HA2所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的HA或HA2：H1-H18。
13.一种获得如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽的方法，所述方法包括：
i)对各种冠状病毒(例如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒)的一种或多种选自下组的蛋白质进行大数据分析，提取出其共享肽序列信息：冠状病毒早期表达蛋白多聚蛋白(ORF1ab)、冠状病毒膜蛋白(M)、冠状病毒核衣壳(N)蛋白、冠状病毒囊膜蛋白(E)蛋白和冠状病毒刺突蛋白(S)蛋白；
ii)对所得共享肽序列信息进行T细胞表位预测，获得具有免疫原性的保守区域信息；
iii)根据所述保守区域信息设计并制备免疫原性肽或其编码序列；
iv)可任选地，对所得免疫原性肽或其编码序列进行组合或将其与共表达(例如融合表达或单独阅读框表达)的其他序列进行组合，所述其他序列用于例如扩大抗病毒谱、提高免疫应答诱导能力。
14.如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽和/或如权利要求7～8中任一项所述的编码分子、载体或细胞在制备抗冠状病毒感染的产品中的应用。
15.如权利要求14所述的应用，其中，所述产品为抗冠状病毒感染的T细胞疫苗或药物，尤其是针对冠状病毒的广谱T细胞疫苗或药物；和/或
所述冠状病毒选自下组：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV，尤其是SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒；和/或
所述产品包含：含如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽的缀合物或偶联物；和/或
所述产品包含：药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂和/或佐剂(例如选自下组的一种或多种佐剂：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21；和/或
所述产品选自：核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒(例如痘病毒(如选自天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株的痘病毒)、腺病毒(如选自Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、AdC68的腺病毒)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒)载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗；和/或
所述产品的形式适于选自下组的给予方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合；和/或
所述产品适于与冠状病毒S或S1所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的S或S1：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV；和/或
所述产品适于与流感病毒HA或HA2所制备的疫苗进行前后序贯接种，例如来源选自下组的HA或HA2：H1-H18。
16.如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性肽在制备检测冠状病毒感染的产品中的应用，例如，所述免疫原性肽单独或与MHC形成的肽-MHC复合物单聚体或多聚体(如二聚体、四聚体)。
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