CN111088283B - mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗 - Google Patents

mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗 Download PDF

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Abstract

mVSV病毒载体，即野生Indiana株VSV的M蛋白氨基酸位点发生多个修饰突变后得到的减毒mVSV，同时优选的异源抗原基因优先整合到mVSV包装核心质粒pmVSV‑Core的双克隆位点区域；一种mVSV病毒载体疫苗,包括在mVSV载体包膜G和L基因之间中融合或嵌合目的病毒的异源性抗原基因，抗原基因包含编码所述目的病毒包膜嵌合的抗原基因、嵌合的组合体抗原基因或融合的抗原基因；mVSV病毒载体嵌合或融合了COVID‑19病毒病原体的刺突蛋白S的优势抗原，所述优势抗原优选自刺突蛋白S的受体结合结构域即RBD，形成一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗，该疫苗对新冠肺炎病毒感染者有较好的预防或治疗作用。

Description

mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠 肺炎疫苗
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、冠状病毒科(family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组为单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。近几年来，又从白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。人冠状病毒目前已知有六种，分别是二十世纪60年代发现的人冠状病毒229E(HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年出现的SARS-CoV，2004年在荷兰分离的HCoV-NL63，2005年在香港鉴定的HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndromevirus，MERS)冠状病毒MERS-CoV。COVID-19病毒与 SARS（severe acute respiratorysyndrome）的基因具有高度的同源性。 在 2019-nCoV 侵染宿主细胞过程中，病毒的突刺蛋白（spike protein, S protein）首先识别细胞膜上受体蛋白ACE2（angiotensin-converting enzyme 2），进而介导并促使病毒包膜与细胞膜发生融合，最终使病毒侵入宿主细胞。冠状病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统，造成不同程度的病理性损伤，严重者甚至造成死亡。
冠状病毒按照核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会(ICTV，2012)在第九次报告中将冠状病毒属成员分成了α组、β组、γ组和δ组共四组。人冠状病毒主要分布于α组和β组。其中，HCoV-229E和HCoV-NL63位于α组，HCoV-OC43和HCoV-HKU1位于β组中的2a亚组，MERS-CoV属于β组中的2c亚组，而最新席卷全球的COVID-19病毒与SARS属于β组中的2b亚组。
新型冠状病毒（COVID-19）肺炎疫情暴发以来，截至目前已引起全国超过8万人被感染，近4000多人死亡；而在全球范围内已导致超过50000人感染，数千人死亡，是一种传播性极强的冠状病毒。COVID-19病毒冠状病毒与传统冠状病毒的区别在于对所有人都易感，既能感染上呼吸道，引起发热、咳嗽、喉炎等普通感冒症状，又能感染下呼吸道，引起支气管炎、肺炎等急性呼吸道症状。最新研究表明，该病毒的S刺突蛋白RBD段结合ACE2的能力是SARS的10倍之多，是目前已知主要的七种感染人的冠状病毒中传播能力最强的。COVID-19病毒与SARS冠状病毒的结构相似，是一种有包膜的单股正链RNA病毒，体现在病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形成了大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用。多项研究表明，SARS的S蛋白疫苗可以产生高效价的抗SARS-CoV病毒的中和抗体，可以有效预防SARS-CoV的感染，因此鉴于COVID-19病毒与SARS 的S蛋白三维结构高度相似，在研制新型冠状病毒疫苗时通常将新冠的S抗原作为主要靶点。
新冠疫情全球范围大爆发致使针对新冠肺炎的药物研制已刻不容缓，美国医学会杂志JAMA研究报道结果表明一部分康复患者仍是新冠病毒携带者，进而也引发了新型冠状病毒是否已成为一种全球流行病的讨论，新冠病毒可能像流感病毒一样，长期流行于人类社会，而疫苗已经被证实是最具成本效益、最有效和最持久的疾病预防和控制措施，因而全民接种新冠疫苗势在必行，短期内研发并投放新冠肺炎疫苗是阻止疫情蔓延的最有力手段。
研究表明，当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）等均通过粘膜表面（生殖道、呼吸道、胃肠道）入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体尤其是肺组织的损伤。
已知常规疫苗如灭活、蛋白疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗等，经常规途径免疫（肌肉注射、皮下等）通常不能诱导特异性粘膜免疫应答。无论疫苗的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通常需要将靶抗原从粘膜部位接种，才能被粘膜组织中的APC摄取并递呈，进一步激活粘膜免疫系统，诱导强烈的粘膜免疫应答。
已有的粘膜接种传统抗原的瓶颈在于：粘膜局部纤毛的频繁物理摆动可迅速清除外来抗原；粘膜局部存在大量的酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外来抗原。因此粘膜部位接种传统抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能诱导有效的粘膜免疫应答。即使诱导，其应答程度非常低下。
已知的疫苗载体水泡性口炎病毒（VSV）野毒株，在自然环境中可以感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛（羊）、猪，而人群中自然状态下几乎不存在水泡性口炎病毒主动感染，对人的感染不会引起明显的病症，因此将水泡性口炎病毒（VSV）作为病毒载体疫苗与其它载体相比，具备天然的优势，因此VSV作为病毒载体嵌合或者融合靶抗原，会增强机体的免疫应答强度，VSV病毒载体疫苗进一步采取粘膜部位接种的免疫方式，会诱导机体产生更强的特异性黏膜免疫应答，当外来病原体通过黏膜侵入时，黏膜组织的会被激活，迅速将病原清除,进一步已知VSV病毒载体还拥有其他工具载体不具备的特性，当设计的预防的疫苗是用来预防有包膜的病毒时，VSV病毒可以将目的病毒的包膜蛋白完全展示在自己的囊膜蛋白GP上，充分将抗原蛋白展露在重组病毒表面，该类型的病毒载体疫苗在体外灭活后，仍具备有效激活机体的特异性免疫应答，外源病毒包膜蛋白通过与GP的特定融合，进一步增强了抗原的免疫原性，充分激活宿主免疫应答，同时重组病毒疫苗不具备二次复制能力，安全性显著增强。
本发明提出一种VSV修饰后的病毒载体mVSV、一种mVSV病毒载体及基于mVSV介导产生的新冠肺炎疫苗，该疫苗对新冠肺炎病毒感染者有较好的预防或治疗作用。
发明内容
本发明提供一种可广泛应用于多种肆虐于现今社会的多种病毒研制疫苗用载体mVSV 、病毒载苗及通过mVSV-Vac平台快速研制得到的基于mVSV病毒载体的新冠肺炎疫苗。
mVSV病毒载体，水泡性口炎病毒印第安纳株 Indiana VSV的基因M编码的氨基酸有多个位点的修饰突变，所述位点突变发生在VSV的M蛋白第51位甲硫氨酸M替换为苯丙氨酸F、第110位苯丙氨酸F替换为丙氨酸A、第225位异亮氨酸I替换为亮氨酸L,定义为mVSV。
一种mVSV病毒载体疫苗，包括上述所述mVSV病毒载体，所述mVSV中整合目的病毒的异源性抗原基因，所述异源性抗原基因融合或嵌合在mVSV包膜GP基因的N端或C端，融合或嵌合抗原后形成的目的病毒疫苗定义为减毒水泡性口炎病毒疫苗。
进一步的，所述异源性抗原基因嵌合在mVSV包膜GP基因的N端或C端情况下，所述异源性抗原基因的DNA是密码子优化的序列，所述抗原基因包含编码所述目的病毒包膜的刺突蛋白S基因的全长或部分截断体。
进一步的，所述目的病毒包膜的刺突蛋白S基因的全长包含SEQ ID NO:1或具有与编码SEQ ID NO:2至少98%同一性的氨基酸的基因序列，定义为嵌合的抗原基因A；所述目的病毒包膜的刺突蛋白S基因的部分截断体包含SEQ ID NO:3的碱基序列或具有与编码SEQID NO:4至少98%同一性的氨基酸的基因序列，定义为嵌合的组合体基因B。
进一步的，所述异源性抗原基因DNA被整合到mVSV载体基因片段内的包膜GP基因编码序列中或相邻的非编码序列中。
进一步的，所述异源性抗原基因融合在包膜GP基因的N端或C端情况下，所述包膜GP 基因5’端融合发生在包膜GP基因信号肽之后,所述包膜GP 基因的3’端融合是发生在包膜GP基因终止密码子前。
进一步的，mVSV包膜GP融合的抗原基因选自新冠病毒COVID-19病毒的刺突蛋白的RBD段，所述包膜GP基因存在于目的病毒对应的疫苗载体pmVSV-Core骨架载体中的任意位置，其中所述包膜GP融合的异源性抗原基因包含编码目的病毒的S蛋白的RBD基因或RBD截断体基因，所述异源性抗原基因包含SEQ ID NO：5或编码SEQ ID NO：6至少98%同一性的氨基酸的基因序列并定义为融合的抗原基因C。
一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗，其特征在于：上述所述目的病毒为新冠肺炎病毒,所述mVSV病毒载体嵌合或融合了COVID-19病毒的抗原基因，所述抗原基因选自COVID-19病毒病原体的刺突蛋白S的优势抗原表位，所述优势抗原表位包括嵌合的抗原基因A、嵌合的组合体基因B或融合的抗原基因C。
进一步的，所述抗原基因包含刺突蛋白S基因全长以及不同的S基因截断体中对应的优势抗原基因，所述优势抗原基因选自编码刺突蛋白S的受体结合结构域RBD对应的全长基因或对应的截断体基因截断体。
进一步的，COVID-19病毒 的抗原基因选自密码子优化的合成基因，所述合成基因编码包含人源新冠肺炎病毒的刺突蛋白的受体结合结构域RBD的一种或多种，其中所述受体结合域RBD包含一种或多种新冠肺炎病毒不同突变株的抗原基因。
一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗制备方法如下，首先在10cm培养皿中培养293T细胞，用10ul-100ul痘病毒(MOI=1-50)在无血清DMEM培养基中与293T细胞共孵育1-12h，使用特定转染试剂将mVSV的反向遗传重组质粒pmVSV-core-A/B/C(1-15ug),pP(0.1-5ug),pL(0.1-5ug),pN(0.1-5ug)和pVSVG(0.1-5ug)的五质粒系统按照特定的最佳转染比例(最佳比例需要依据具体的应用案例做进一步的优化)，待质粒基因转染到293T细胞中，48h-72h后收集细胞上清，25000rpm高速离心，所述的离心浓缩后的病毒进一步分装溶解在100ul的病毒保存液中，4℃或者-80℃保存；
1）采取肌注，静脉，滴鼻或口服等多种途径进行接种免疫
2）只需1次免疫
3）免疫剂量为106-108pfu的病毒载体疫苗（mVSV-A、B/C）。
技术效果：本发明和现有技术相比，选择活病毒作为疫苗载体，嵌合或融合特异性靶抗原基因，利用水泡性口炎病毒在细胞中的复制能力，高效快速的表达靶抗原，趋引T细胞到达疫苗给予的粘膜部位、促进CD8+T细胞应答等性质，特定给药方式（黏膜给药途径）可显著增强特异性粘膜免疫应答；再者本发明专利中提出的经过修饰的VSV（mVSV）相对于现有技术中的VSV，mVSV病毒的毒性更低、抗原荷载能力更高，病毒基因组更稳定。本发明涉及的新冠肺炎疫苗由于病毒本身的特异性，会引起很强的固有免疫应答，激活机体的免疫系统，类似于佐剂的作用，随着病毒被免疫系统发现识别以及清除的过程中，病毒携带的靶抗原会充分被发现，区别于普通疫苗的抗原不稳定，易被降解。
本发明的病毒载体的靶抗原会随着病毒的复制大量表达在胞浆中，充分被递呈给DC细胞，引起机体的特异性免疫应答，当采取的是粘膜部位接种该疫苗，会诱导机体产生局部获得性黏膜免疫应答。本发明的mVSV-Vac载体系统可用于多种经粘膜感染病原体的预防或治疗性疫苗的粘膜递送。本发明的疫苗可有效诱导针对COVID-19病毒的特异性粘膜SIgA和全身性IgG的产生。
本发明提供的由病毒载体(mVSV)介导的新冠肺炎疫苗可以通过肌注、静脉、滴鼻、口服等免疫途径给药，能解决现有技术中的传统疫苗无法诱导高强度的免疫应答（特别是中和抗体效价低）的缺陷，弥补了传统疫苗携带的抗原不能在粘膜局部有效停留、不能被APC充分递呈给免疫细胞，激活的免疫反应弱、抗体效价低等缺陷，同时本发明涉及到的mVSV新冠疫苗可以与其他载体疫苗进行联合使用，第一针使用mVSV新冠疫苗先免疫，第二针使用第二种病毒载体疫苗（腺病毒载体疫苗、痘病毒载体疫苗）进行二次刺激，会进一步激活针对新冠抗原的获得性免疫应答，极大的提高接种的应答率。
综上所述，本发明涉及到的mVSV载体介导的新冠肺炎疫苗，具有以下三大特性：
1）其核心是一种病毒疫苗介导的载体，编码冠状病毒刺突蛋白刺突蛋白S及不同截断体，优选抗原蛋白序列主要来源于COVID-19病毒 毒株；
2）通过特定的改造质粒（低拷贝）包装系统，即水泡性口炎病毒重组子系统包装出重组的减毒水泡性口炎病毒；
3）通过优化设计的免疫途径、免疫程序、免疫剂量、免疫部位，显著提高mVSV的疫苗的免疫效果，进一步在机体诱导增强的全身性IgG中和抗体和粘膜局部的sIgA抗体的数量，囊膜融合的候选疫苗mVSV-C在诱导特异性体液免疫反应的同时会进一步激活机体的抗病毒的T细胞免疫，形成永久记忆，产生终身保护作用。
需要说明的是，本发明涉及的mVSV病毒载体可用在现下猖獗的新冠病毒之外的目的病毒疫苗研究使用；再者，也可对新冠病毒患者施用免疫学有效量的所述重组新冠疫苗载体与不同免疫佐剂组合物，治愈和预防效果明显；所述免疫应答是抗S蛋白血清抗体的诱导且诱导了抗S蛋白特异性保护性免疫应答，所述诱导特异性中和抗体滴度超过1国际单位/ml。本发明根据患者临床表现提供一次或多次所述新冠肺炎疫苗及其佐剂组合物，甚至随后在第一次提供步骤的数周、数月或数年内向所述患者提供所述重组新冠疫苗或联合目的病毒载体的疫苗组合以及包含佐剂的组合物，被提供新冠疫苗重组新冠疫苗或其佐剂组合物的患者包括：所述个体表现出COVID-19病毒的一种或多种症状、所述个体缺乏COVID-19病毒的任何症状、所述个体已被暴露于COVID-19病毒、所述个体已与患有COVID-19病毒的个体接触、所述个体是儿童、老年人，暴露于生物武器或处于其风险中，是军队的成员，或是卫生保健工作者。
根据专业技术人员领域公知，COVID-19病毒与SARS病毒的抗原S诱导的抗体具备交叉反应，但二者的同源性仅有78%，进一步佐证新冠抗原S基因及其截断体在同一性低于98%时也会诱导机体产生特异性的抗体，因此基于mVSV载体开发的新冠疫苗的抗原氨基酸的同源性不受98%的比例约束，基于mVSV疫苗载体嵌合或融合特异性抗原表位的候选疫苗都受本发明的约束，所述COVID-19病毒也是国内多个文章中提及的SARS-CoV-2。
附图说明：
图1.pmVSV-Core-A、pmVSV-Core-B质粒构建、病毒包装及鉴定示意图；
图2.mVSV-A、mVSV-B病毒载体疫苗免疫小鼠，血清特异性抗体的检测；
图3.pmVSV-Core-C质粒的构建、病毒包装及鉴定；
图4.mVSV-C新冠疫苗的多途径免疫后血清的抗体（IgG、IgA）检测；
图5.mVSV-A、mVSV-B以及mVSV-C候选新冠疫苗，多途径给药后小鼠血清里中和抗体含量的检测；
图6是VSV-刺突蛋白S重组病毒疫苗通过遗传重组质粒包装示意图；
图7涉及VSV不同点突变株与野毒株的毒性比较，包括MEF细胞中MTT法毒性检测(A)、不同突变株的复制情况（B）、不同突变株在小鼠模型中安全性比较（C）。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本公开做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而非限定，本公开主要通过将COVID-19病毒病毒保护性抗原表位构建到VSV病毒骨架载体（pCore）上，通过合成生物学技术，对减毒的弹状病毒VSV，设计出反向遗传操作快速拯救系统，获得可稳定表达候选抗原的病毒载体疫苗，并经过小鼠体内免疫后获得血清，并通过生物学实验鉴定后天免疫反应及抗病毒的中和抗体生成情况。
本公开采用的试剂及耗材如下：Q5 Hot start High-Fidelity DNA polymerase（NEB M0493L）,NheⅠ-HF(NEB R3131L),XhoⅠ(NEB R0146S),T4 DNA Ligase Enzyme(NEBM0202L),E.coli DB3.1 Competent Cells(Takara 9057),TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒(天根 DP118-02),Lipofectamine LTX（Invitrogen 15338100），PBS (HycloneSH30256.01)，DMEM高糖培养基 (Gibco C11995500)，双抗(Gibco 15140-122)，胎牛血清(Gibco 10091-148)，Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco 31985-070)，96孔细胞培养板 (Corning 3599)，6孔细胞培养板 (Corning 3516)，6cm细胞培养板（Corning430166），0.22um滤器 (Millipore SL GP033rb)，T175细胞瓶 （Corning 431080）。
细胞系：
将293T和293T-hACE2贴壁细胞培养在37℃、含5% CO2的特定培养环境中（ThermoBB150 细胞培养箱），采用DMEM高糖完全培养基进行培养。
减毒型mVSV病毒载体：
在一个技术方案中，减毒型mVSV病毒载体选择的重组水泡性口炎病毒Indiana株（基因序列NC_001560.1 ）的基质蛋白(M)的三位点突变体，突变氨基酸位置优选自第51位置、第110位置和第225位置同时具有氨基酸替换，所述氨基酸替换方式为：第51甲硫氨酸M替换为苯丙氨酸F，第110位苯丙氨酸F替换为丙氨酸A，第225位异亮氨酸I替换为亮氨酸L。
实施例1 针对VSV的Indiana株的M蛋白三位点突变后的毒性大大降低。
已知VSV野毒株的最主要的致病基因是M,同时M蛋白会诱导宿主细胞的凋亡，是VSV野毒株感染偶蹄类动物患病的主要因素，基于此通过合成生物学技术降低VSV野毒株的最佳方式是在M基因进行基因工程的突变，已有的研究表明M蛋白第51位氨基酸非同义突变后，会降低野生VSV的神经毒性，因此，在本发明技术实施中，首先进行了单位点的突变比较，在第51位将甲硫氨突变为苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸和精氨酸（对照），如图7A所示，部分结果可以发现mVSV-M51F与mVSV-M51R相比，在正常的成纤维的细胞毒性更弱一些，但是M51F仍具备一定的细胞毒性，基于此继续在M51F的基础上合成生物学突变的方法，得到2突变M51F-F110(A/R/L）,发现2突变株中，M51F-F110A的毒性得到了进一步的降低，但是在后续的（图7C）中给VSV野毒株敏感的Balb/c小鼠滴鼻给药（模拟神经系统感染），发现M51F-F110A的E9pfu高剂量给药仍会导致部分小鼠（1/4的比例）体重下降，尽管只是在接种后5天内发生一过性的现象，但还是表明针对M基因的减毒改造没有达到最佳方式，进一步本发明基于上述2突变的位置，找到了第三个会显著降低M蛋白毒性的突变位点，即第225位氨基酸，当225位氨基酸由亮氨酸I突变为亮氨酸L，减毒效果最显著（部分比较结果在附图7中未显示），进一步如图7B所示，在细胞水平上，经过M蛋白三个位点突变的mVSV（M51F-F110A-I225L）对MEF正常成纤维细胞没有检测到任何损伤（感染复数上升到10，也没有观察到显著的细胞病变），同理将不同的突变株在动物模型中进行攻毒实验如图7C,在8周龄小鼠Balb/c，分别滴鼻E9pfu突变株病毒,进行安全性的初步评估（静脉给药也进行了小鼠模型给药验证，相同剂量，每组6只，除了对照组VSV野毒株产生了显著不良反应，其他突变株给药的小鼠症状较轻），得到的统计结果表明，有且仅有3突变的病毒没有引起小鼠的体重下降，其他突变株都出现了体重的显著下降再恢复的现象，另外早期给药后，VSV野毒株出现体温异常升高的毒性反应，同时对照组VSV野毒株以及mVSV-M51R出现了小鼠后腿神经麻痹的现象，只有三突变株的给药小鼠没有产生任何不良反应，证明该减毒株对正常小鼠的安全性高，没有毒副作用，不具备潜在神经毒性。
实施例2 两种基于VSV病毒载体的嵌合型疫苗的构建及鉴定
根据NCBI发布的COVID-19病毒的S基因序列经过密码子优化以便于其在细胞内表达（命名为抗原基因A），另根据COVID-19病毒序列预测的多个潜在抗原表位组合成新的抗原基因（命名为抗原基因B），将抗原基因A和抗原基因B序列交由南京金斯瑞生物分别合成至pCDNA3.1和pUC57载体上，PCR扩增目的基因后，经过片段纯化试剂盒回收纯化目的条带，将该片段和pmVSV-GFP载体用限制性核酸内切酶，MCS1(Xhol)和MCS2(Nhel)于37℃酶切3h，胶回收载体和目的片段后进行连接反应，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆及酶切和测序验证鉴定质粒构建情况（并将构建的两个质粒分别命名为pmVSV-Core-A和pmVSV-Core-B），具体实施步骤如下：
1) 根据（图1A）构建两种基于VSV病毒载体嵌合型疫苗构建；
2) 引物合成及引物信息：引物由苏州金唯智生物生物科技有限公司合成，其中构建扩增A基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表1所示：
表1 A基因扩增与检测引物
Figure 1217DEST_PATH_IMAGE001
3) 其中扩增B基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表2所示：
表2 B基因扩增
Figure 590461DEST_PATH_IMAGE002
目的基因的获取：以带目的基因序列的pCDNA3.1质粒为模板以表1引物进行PCR扩增A基因；以带目的基因序列的pUC57质粒为模板以表2引物进行PCR扩增B基因。
参照AxyPrepTM PCR Cleanup kit 说明书纯化上述酶切产物，用Nano-300测定产物浓度。
将上述纯化产物以及载体进行双酶切（37℃酶切3h）。
用1% Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度。
将上述纯化产物与载体进行连接（16℃连接过夜，连接比按1:5进行）。
参照E.coli DB3.1 Competent Cells (TaKaRa)说明书转化连接产物。
挑取LB（Kana）平板上的单克隆到事先加有200μL LB（Kana）培养基的无菌1.5 mL管中，37℃，250 rpm，培养3h后，进行Colony PCR筛选阳性克隆。
经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆按1：500比例转接到15mL摇瓶中，37℃、250rpm摇床培养14～16h。
按照TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒说明书进行质粒提取。
将筛选的阳性质粒进行双酶切鉴定（Xho I和Nhe I在37℃酶切3 h）。
酶切鉴定后，选取其中鉴定正确的质粒进行质粒测序。
将测序正确的质粒按标准方法进行VSV病毒包装，同时取pmVSV-GFP质粒做阳性包装对照；48h和72h各收取一次病毒上清液并取300uL感染预先铺在6孔板的293T细胞的将包装,包装出的病毒分别命名为mVSV-GFP、mVSV-A、mVSV-B；待细胞病变后收取细胞进行WB检测抗原表达水平。
上述质粒构建结果及WB检测结果如图1所示。
根据实验结果可知，抗原基因A和抗原基因B进行PCR扩增后在相应位置处均出现特异性条带且条带分子大小均正确，表明成功扩增出目的条带（图1B）；病毒包装感染后mVSV-GFP阳性对照荧光表达强度较好，mVSV-A和mVSV-B病毒感染细胞后也出现病变情况（图1C）；Western Blot也在相应位置检测到A和B基因的表达（图1D）。
实施例3 两种基于VSV病毒载体的嵌合型疫苗不同免疫方案下的免疫应答效果。
通过间接ELISA检测不同免疫方案后小鼠体内特异性IgA、IgG抗体水平：用COVID-19病毒 S病毒的重组RBD蛋白包被酶标板后，将通过肌肉、静脉、滴鼻三种免疫方式免疫一次后21d时的小鼠血清按1:200稀释后加入对应的孔中，孵育2h后将不同类型的（IgA、IgG）二抗按1:10000稀释检测特异性抗体水平（图2），具体操作步骤如下：
1)取包被抗原（S-RBD）用包被缓冲液稀释至最终浓度为5μg/ml，取酶标板，依次往孔中加样（100μl/孔），然后放置于4摄氏度下包被过夜；
2)次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干样品孔中的残留液体；
3)然后往每孔中加入200μl、5%BSA封闭液进行封闭，于37摄氏度下放置1 h（板子放置在密封袋中）。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔1次；
4)用抗体血清稀释液(1%BSA)将待测血清和阴性血清按合适比例（1：100）稀释，加入孔板中，每孔100ul，37摄氏度孵育2h；
5)倒掉样品孔中的反应液，用洗涤液洗涤1~3min， 洗板5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
6) 用稀释液将酶标二抗（Goat anti-mouse IgG HRP）按1：10000稀释后每孔加入100μl，然后于37℃反应1 h；
7)倒掉未结合的酶标抗体，加入洗涤液洗涤，每次1~3min，共5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
8) 每孔加入新鲜配制的显色液（A液与B液等比例混合后即成显色液）100μl，置室温，避光反应20min；
9)每孔加入100μl的ELISA终止液终止反应；
10) 将96孔板放入酶标仪中，读取OD450nm。比较同等稀释比例下的待测样品和阴性样本OD450nm值，判定阳性情况可暂定以阴性样本OD值的2.1倍作为阳性测试标准即：OD（阳性>2.1*OD（阴性样本）。
结果表明mVSV-A病毒、mVSV-B病毒、mVSV-GFP病毒不同免疫方式免疫21d时，血清中特异性IgA和IgG抗体水平上升到显著水平，并且不同免疫途径下各抗体表达水平有较大差异，其中滴鼻方法免疫主要激活IgA粘膜免疫（图2A），静脉和肌肉主要引起IgG类型免疫应答（图2B）。
实施例4 基于VSV病毒载体的融合型疫苗构建及鉴定。
通过重叠延伸PCR将C片段融合至pVSV-GFP载体上的VSV-G囊膜基因的C端(产物编号为GP-C)、或融合至VSV-G囊膜基因的N端（产物编号为(C-GP）。
第一轮PCR分别扩增两条目的基因后，用胶回收试剂盒回收目的条带，第二轮PCR分别取第一轮PCR的两种目的片段为模板，分别以片段1的上游引物和片段2的下游引物进行融合片段的扩增，将该片段和pVSV-GFP载体用限制性核酸内切酶（MCS1(MluI)和MCS2(XhoI)）于37℃酶切3h，胶回收载体和目的片段后进行连接反应，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆及酶切和测序验证鉴定质粒构建情况，具体实施步骤如下：
1)根据（图4A）进行囊膜融合型VSV病毒载体疫苗构建；
2) 引物合成及引物信息：引物由苏州金唯智生物生物科技有限公司合成，具体引物信息见下表：
表3 两种形式的融合型C基因扩增
Figure 570531DEST_PATH_IMAGE003
3) 目的基因的获取：以带目的基因序列的pVSV-GFP（扩增VSV-G）和含有目的基因的pCDNA3.1质粒为模板扩增目的片段；
4)用1% Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度；
5)将上述PCR胶回收产物按引物表中克隆顺序各取一定量进行第二轮PCR扩增出最终的融合囊膜基因片段；
6)用1% Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度，纯化产物以及载体进行双酶切（Mlul和Xhol，37℃酶切3h）；
7) 酶切完毕后参照AxyPrepTM PCR Cleanup kit 说明书纯化上述酶切产物，用Nano-300测定产物浓度；
8) 将上述纯化产物与载体进行连接（16℃连接过夜，连接比按1:5进行）；
9)参照E.coli DB3.1 Competent Cells (TaKaRa)说明书转化连接产物；
10) 挑取LB（Kana）平板上的单克隆到事先加有200μL LB（Kana）培养基的无菌1.5mL管中，37℃，250 rpm，培养3h后，进行Colony PCR筛选阳性克隆；
11) 经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆按1：1000比例转接到15mL摇瓶中，37℃、250rpm摇床培养14-16h；
12) 按照TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒说明书进行质粒提取；
13) 将筛选的阳性质粒进行双酶切鉴定（MluI和XhoI在37℃酶切3 h）。
14) 酶切鉴定后，选取其中鉴定正确的质粒进行质粒测序；
15) 将测序正确的质粒按标准方法进行VSV病毒包装，同时取pVSV-GFP质粒做阳性包装对照；
16) 48h和72h各收取一次病毒上清液并取300uL感染预先铺在6孔板的293T细胞的将包装,病毒分别命名为mVSV-(GP-C)和mVSV-(C-GP)；
17) 待细胞病变后收取细胞进行WB检测抗原表达水平。
上述质粒构建结果及WB检测结果如图3所示。
根据实验结果可知，一轮PCR扩增后在相应位置处均出现特异性条带且条带分子大小均正确，二轮融合PCR后成功将两种片段融合在一起（图3B）；病毒包装感染后mVSV-GFP阳性对照荧光表达强度较好，mVSV-(GP-C)基因和mVSV-(C-GP)病毒感染细胞后也出现病变情况（图3C）；Western Blot也在相应位置检测到VSVG的表达（图3D）。
实施例5 基于VSV病毒载体的融合型疫苗不同免疫方案下的免疫应答效果。
通过间接ELISA检测不同免疫方案后小鼠体内特异性IgA、IgG抗体水平：用COVID-19病毒 S病毒的重组RBD蛋白包被酶标板后，将通过肌肉、静脉、滴鼻三种免疫方式免疫一次，21d时的小鼠血清按1:200稀释后加入对应的孔中，孵育2h后将不同类型的（IgA、IgG）二抗按1:10000稀释检测特异性抗体水平（图4），具体操作步骤如下：
1)取包被抗原（S-RBD）用包被缓冲液稀释至最终浓度为5μg/ml，取酶标板，依次往孔中加样（100μl/孔），然后放置于4摄氏度下包被过夜；
2) 次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干样品孔中的残留液体；
3) 然后往每孔中加入200μl、5%BSA封闭液进行封闭，于37摄氏度下放置1 h（板子放置在密封袋中）。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔1次；
4) 用抗体血清稀释液(1%BSA)将待测血清和阴性血清按合适比例（1：100）稀释，加入孔板中，每孔100ul，37摄氏度孵育2h；
5)倒掉样品孔中的反应液，用洗涤液洗涤1~3min， 洗板5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
6)用稀释液将酶标二抗（Goat anti-mouse IgG HRP）按1：10000稀释后每孔加入100μl，然后于37℃反应1 h；
7)倒掉未结合的酶标抗体，加入洗涤液洗涤，每次1~3min，共5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
8)每孔加入新鲜配制的显色液（A液与B液等比例混合后即成显色液）100μl，置室温，避光反应20min；
9)每孔加入100μl的ELISA终止液终止反应；
10) 将96孔板放入酶标仪中，读取OD450nm。比较同等稀释比例下的待测样品和阴性样本OD450nm值，判定阳性情况可暂定以阴性样本OD值的2.1倍作为阳性测试标准即：OD（阳性>2.1*OD（阴性样本）。
结果表明含mVSV-(GP-C)病毒、mVSV-(GP-C)病毒、mVSV-GFP不同免疫方式免疫21d时，血清中特异性IgA和IgG抗体水平上升到显著水平，并且不同免疫途径下各抗体表达水平有较大差异，其中滴鼻方法免疫主要激活IgA粘膜免疫（图4B），静脉和肌肉主要引起IgG类型免疫应答（图4B）。
实施例6 基于假病毒体系的免疫血清中和抗体检测。
通过体外病毒中和实验确定产生的中和抗体滴度，用以评估抗原选择差异，筛选出高效的保护性免疫原，对比不同组别产生的特异性针对SARS–CoV-2的中和抗体滴度，确定最优的疫苗制备策略及接种方式，具体操作步骤如下：
1) 将待测血清于56℃灭火30min，6000g离心3min，取上清备用；
2) 293T-hACE2细胞进行传代操作，细胞计数后按2E4 cells/孔加入到96孔板中（200 μL/孔，包含8 μg/mL polybrene）；
3)h后，抗体用Opti-MEM系列稀释（1:2）10 μL/管，同时做不加抗体的阳性对照（20μL病毒液，病毒终浓度4E5 TU/mL）和不加病毒的阴性对照（20 μL Opti-MEM）；
4) 假病毒也进行系列稀释至8E5 TU/mL；
5) 取10 μL稀释的病毒液（8E5 TU/mL）加入到步骤2中含有10 μL系列稀释的抗体中（1:1吹打混匀）（此时病毒终浓度4E5 pfu/mL）；
6) 于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h后，加入到293T-hACE2细胞中感染24h-48h后进行观察荧光及病变情况；
7) 根据最后出现绿色荧光的孔所对应的抗体血清稀释倍数作为血清中和效价；
结果表明如图5所示，mVSV-A、mVSV-B和mVSV-C新冠疫苗在给予不同的给药方式，免疫21d时，血清中中和抗体水平与对照组相比显著上升，不同免疫途径下中和抗体的表达水平有一定差异，其中静脉免疫小鼠血清诱导产生的中和抗体水平最高，肌肉注射与滴鼻给药差异不显著，在三种不同的病毒载体疫苗中，mVSV-C静脉给药组，诱导产生的中和抗体最多，间接表明，将特异性的优选新冠抗原RBD通过与VSVG（高免疫原性）融合（N端融合）会产生针对新冠的中和抗体，间接佐证了将外源优势抗原融合在mVSV载体基因GP的N端，可以通过增强优势抗原在重组病毒的包膜展示来提高机体对抗原的识别，诱导产生中和抗体及抗病毒的免疫记忆。
进一步如图6所示，mVSV介导的COVID-19病毒疫苗系列产品包括mVSV-A/B,mVSV-C，本发明中公开了两种不同的设计策略，其中mVSV-A/B是将新冠病毒的抗原基因整合到病毒非包膜的核心区域中，优选嵌合位置在囊膜GP和聚合酶L的编码区位置，此病毒载体候选疫苗接种时一定是活毒株，原因在于抗原基因需要在机体内感染宿主细胞转录翻译成蛋白，才可以被免疫细胞DC进行抗原递呈，抗原基因随着病毒的复制才可以将外源抗原在机体内表达，激活机体产生抗新冠的特异性免疫应答，而如图所示另外一种mVSV-C候选疫苗的设计策略截然不同，技术方案是将新冠病毒的截短的抗原基因整合到mVSV的囊膜GP基因中，优选整合在GP基因的N端，从实施例3和4的结果中，可以发现整合在N端的RBD蛋白跟GP蛋白融合表达，在蛋白水平证明了mVSV-C-GP疫苗的候选抗原蛋白是展示在包膜表面，因此该类型疫苗可以采取灭活（辐照或者高温）后接种，与减毒活病毒载体疫苗相比安全性更好，尽管在实施例中没有进一步阐述这类候选疫苗在灭活接种后是否会因为灭活的操作降低抗原诱导的特异性免疫应答，然而免疫原性的降低在临床接种疫苗时，可以通过提高接种剂量来提高应答效率，弥补因灭活导致的免疫原性弱的缺点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州奥特铭医药科技有限公司
<120> mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗
<130> 2020
<141> 2020-03-20
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 1
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cggacacagc tgccccctgc ctacaccaac agcttcacaa ggggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttta gatctagcgt gctgcactcc acacaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180
aacgtgacct ggttccacgc tatccacgtg tccggcacca acggaacaaa gaggttcgac 240
aacccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg aaccacactg gacagcaaga cacagtccct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa cgatccattc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agagcgagtt tcgcgtgtac 480
tcctctgcca acaactgtac atttgagtac gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gaaacttcaa gaacctgcgg gagttcgtgt ttaagaacat cgatggctac 600
tttaagatct actccaagca caccccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660
tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggaatca acatcaccag gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca ccaggcgaca gctcctctgg atggaccgct 780
ggagctgctg cctactacgt gggctacctg cagccccgga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaacggaa ccatcacaga cgctgtggat tgcgccctgg accccctgtc tgagaccaag 900
tgtacactga agagctttac cgtggagaag ggcatctacc agacaagcaa cttccgggtg 960
cagcctaccg agtccatcgt gcgctttccc aacatcacaa acctgtgccc ttttggagag 1020
gtgttcaacg ctacccgctt cgcctccgtg tacgcttgga accggaagcg catctccaac 1080
tgcgtggccg actactctgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggcgtgagcc caacaaagct gaacgacctg tgctttacca acgtgtacgc tgattccttc 1200
gtgatcaggg gagacgaggt gcgccagatc gctcccggcc agacaggaaa gatcgctgac 1260
tacaactaca agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320
ctggatagca aagtgggcgg aaactacaac tacctgtaca ggctgtttag aaagtctaac 1380
ctgaagccat tcgagcggga catctccaca gagatctacc aggctggctc taccccatgc 1440
aacggagtgg agggcttcaa ctgttacttc cctctgcaga gctacggatt ccagccaaca 1500
aacggcgtgg gataccagcc ctaccgcgtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgct 1560
cctgctacag tgtgcggacc aaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttta acggactgac cggcacagga gtgctgaccg agtctaacaa gaagttcctg 1680
ccttttcagc agttcggccg ggacatcgcc gataccacag acgctgtgcg cgaccctcag 1740
accctggaga tcctggatat cacaccatgc tccttcggcg gagtgtctgt gatcacacca 1800
ggaaccaaca caagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg taccgaggtg 1860
cccgtggcta tccacgccga tcagctgacc cctacatgga gggtgtactc taccggcagc 1920
aacgtgttcc agacaagagc cggctgtctg atcggagctg agcacgtgaa caacagctac 1980
gagtgcgaca tccctatcgg cgccggaatc tgtgcttcct accagaccca gacaaactcc 2040
ccaaggagag ccaggtctgt ggctagccag tccatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100
gccgagaact ccgtggctta ctccaacaac tctatcgcta tccctaccaa cttcacaatc 2160
tccgtgacca cagagatcct gccagtgagc atgaccaaga catccgtgga ctgcacaatg 2220
tacatctgtg gagattccac cgagtgctct aacctgctgc tgcagtacgg ctctttctgt 2280
acccagctga acagagccct gacaggaatc gctgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag accccaccca tcaaggactt tggcggattc 2400
aactttagcc agatcctgcc cgatcctagc aagccatcca agaggtcttt tatcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctggctgat gccggcttca tcaagcagta cggcgattgc 2520
ctgggagaca tcgctgccag agacctgatc tgtgcccaga agtttaacgg actgaccgtg 2580
ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gctcagtaca catctgctct gctggccggc 2640
accatcacaa gcggatggac cttcggcgct ggagctgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700
cagatggctt acagattcaa cggcatcgga gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt taactccgct atcggcaaga tccaggactc tctgagctcc 2820
acagctagcg ccctgggaaa gctgcaggat gtggtgaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtga agcagctgtc tagcaacttc ggcgccatct cctctgtgct gaacgatatc 2940
ctgagcaggc tggacaaggt ggaggctgag gtgcagatcg acaggctgat cacaggaaga 3000
ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggctgctga gatcagggct 3060
tctgccaacc tggctgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagtc caagagagtg 3120
gacttttgtg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agtccgcccc tcacggagtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagct caggagaaga acttcaccac agctcccgcc 3240
atctgccacg atggcaaggc ccactttcct cgggagggcg tgttcgtgag caacggaacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caacttctac gagccacaga tcatcaccac agacaacaca 3360
ttcgtgtccg gcaactgtga cgtggtcatc ggaatcgtga acaacaccgt gtacgatcct 3420
ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaaccacacc 3480
agccctgacg tggatctggg cgacatctct ggaatcaacg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg accggctgaa cgaggtggct aagaacctga acgagtccct gatcgatctg 3600
caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggac tgatcgctat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720
tgttcctgcc tgaagggctg ctgttcttgt ggaagctgct gtaagtttga cgaggacgat 3780
agcgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct aa 3822
<210> 2
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 3
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgagctccc agtgcaactc taacaatctg 60
gacagcaaag tgggcggcaa ctacaattat ctgtacaggc tgttccgcaa gtccaatctg 120
aagccctttg agcgggatat ctccaccgag atctatcagg ccggctctac accttgcaac 180
ggcgtggagg gcttcaattg ttattttcct ctgcagtctt acggcttcca gccaaccaac 240
ggcgtgggct atcagccata cccaaggaga gccagaggcg gaggaggaag catctacaag 300
acacccccta tcaaggactt tggcggcttc aacttcagcc agatcctggg aggaggagga 360
tccggagccg ccctgcagat ccccttcgcc atgcagatgg cctataggtt taacggcatc 420
ggcgtgaccc agaatgtgct gtactga 447
<210> 4
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Asn
1 5 10 15
Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr
20 25 30
Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser
35 40 45
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
50 55 60
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn
65 70 75 80
Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Pro Arg Arg Ala Arg Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe
100 105 110
Ser Gln Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro
115 120 125
Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln
130 135 140
Asn Val Leu Tyr
145
<210> 5
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcaacat cacaaacctg 60
tgcccttttg gagaggtgtt caacgctacc cgcttcgcct ccgtgtacgc ttggaaccgg 120
aagcgcatct ccaactgcgt ggccgactac tctgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc 180
accttcaagt gctacggcgt gagcccaaca aagctgaacg acctgtgctt taccaacgtg 240
tacgctgatt ccttcgtgat caggggagac gaggtgcgcc agatcgctcc cggccagaca 300
ggaaagatcg ctgactacaa ctacaagctg cctgacgatt tcaccggctg cgtgatcgcc 360
tggaactcta acaacctgga tagcaaagtg ggcggaaact acaactacct gtacaggctg 420
tttagaaagt ctaacctgaa gccattcgag cgggacatct ccacagagat ctaccaggct 480
ggctctaccc catgcaacgg agtggagggc ttcaactgtt acttccctct gcagagctac 540
ggattccagc caacaaacgg cgtgggatac cagccctacc gcgtggtggt gctgtctttt 600
gagctgctgc acgctcctgc tacagtgtgc ggaccaaaga agagcaccaa cctggtgaag 660
aacaagtgcg tgaacttcaa ctttaacgga ctgaccggca caggataa 708
<210> 6
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Asn
1 5 10 15
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
20 25 30
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
35 40 45
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
85 90 95
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
100 105 110
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
115 120 125
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
130 135 140
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
145 150 155 160
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
165 170 175
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
180 185 190
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
195 200 205
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
210 215 220
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly
225 230 235
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccgctcgaga tgtttgtttt tcttgtttta ttg 33
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ctagctagct tatgtgtaat gtaatttg 28
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ctagctagct cagtggtggt ggtggtggtg 30
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tttacgcgtc actatgaagt gccttttgta ctt 33
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
tgtgatgttc tttccaagtc ggttcatctc 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
cttggaaaga acatcacaaa cctgtgccct 30
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ccgctcgagc gtgatatctg ttagtttttt tcatacctag caggatttga gttatcctgt 60
gccggtcagt cc 72
<210> 15
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
tttacgcgtc actatgaagt gccttttgta cttagccttt ttattcattg gggtgaattg 60
caacatcaca aacctgtgcc ct 82
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ggtgaacttt cctgtgccgg tcagtccgtt 30
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ggcacaggaa agttcaccat agtttttcc 29
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ccgctcgagc gtgatatctg ttagtttttt tcatacctag caggatttga gttactttcc 60
aagtcggttc atc 73

Claims (11)

1.mVSV病毒载体，其特征在于:所述mVSV病毒载体包括mVSV病毒，所述mVSV病毒是水泡性口炎病毒印第安纳株的基质蛋白M的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述突变发生在基质蛋白M第51位甲硫氨酸突变为苯丙氨酸、第110位苯丙氨酸突变为丙氨酸和第225位异亮氨酸突变为亮氨酸。
2.一种包含权利要求1所述mVSV病毒载体的疫苗，其特征在于：所述mVSV病毒载体的基因中整合了目的病毒的异源性抗原基因。
3.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述异源性抗原基因嵌合或融合在mVSV病毒载体的基因中，所述嵌合或融合的位置为mVSV病毒载体包膜G和L基因之间。
4.如权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于：所述目的病毒为新冠肺炎病毒COVID-19病毒。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因嵌合在mVSV病毒载体包膜GP基因的N端或C端，所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因是密码子优化后的序列，所述COVID-19病毒抗原基因包含新冠肺炎病毒COVID-19病毒刺突蛋白S基因的全长或包含RBD段基因在内的部分截断体。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒刺突蛋白S基因的全长包含SEQ ID NO:1所示的序列或包含编码与SEQ ID NO:2至少98%同一性的氨基酸的基因序列；所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒刺突蛋白S基因包含RBD段基因在内的部分截断体包含SEQ ID NO:3所示的序列或包含编码与SEQ ID NO:4至少98%同一性的氨基酸的基因序列。
7.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因嵌合到mVSV病毒载体包膜GP基因编码序列的N端或C端。
8.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因融合在mVSV病毒载体包膜GP基因的N端或C端，所述包膜GP 基因5’端融合发生在包膜GP基因信号肽之后，所述包膜GP 基因的3’端融合发生在包膜GP基因终止密码子前。
9.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述融合的新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因包含新冠肺炎病毒COVID-19病毒刺突蛋白S的RBD段对应的基因。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述融合的新冠肺炎病毒COVID-19病毒抗原基因包含SEQ ID NO:5所示的序列或包含编码与SEQ ID NO:6至少98%同一性的氨基酸的基因序列。
11.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述新冠肺炎病毒COVID-19病毒刺突蛋白S的RBD段来自新冠肺炎病毒COVID-19病毒的不同突变株。
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