CN111671890B - 一种新型冠状病毒疫苗及其应用 - Google Patents

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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒疫苗及其应用。本发明在Balb/c小鼠模型中，给予小鼠肌肉注射或者滴鼻新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov‑S，能够诱导小鼠产生抗新型冠状病毒刺突蛋白S的抗体，体外实验证明此抗体具有中和作用。本发明在开发预防新型冠状病毒疫苗方面有重要意义。本发明在预防新型冠状病毒疫苗研发及生产中，具有重要的应用和推广价值。

Description

一种新型冠状病毒疫苗及其应用
技术领域
本发明属于免疫学与病毒感染性疾病疫苗制备领域，具体涉及一种新型冠状病毒疫苗及其应用。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）主要经呼吸道飞沫或是密切接触传播，这一病毒从未在人群中流行，不存在人群免疫屏障，所以全年龄段人群普遍易感。目前，还未存在针对SARS-CoV-2抗病毒特效药物，也未有临床疫苗做预防之用，所以对SARS-CoV-2疫苗研究刻不容缓。
冠状病毒（Coronaviridae）是一类单股正链RNA病毒，基因组大小为27～32 kb。在所有已知的RNA病毒（例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV等）中，冠状病毒的基因组是最大的。因病毒囊膜上含有刺突（spike）状的包膜蛋白S，在电镜结构中类似于皇冠上镶嵌的珍珠的大凸起，病毒由此而得名。按照系统发育的不同，冠状病毒可以被分成α/β/γ/δ四个属，每个属有不同的毒株，α/β属冠状病毒感染哺乳动物，而γ/δ属冠状病毒感染鸟类。
最新序列研究分析表明，从临床病人分离的SARS-CoV-2和蝙蝠来源的冠状病毒RaTG13有96%的一致性，和SARS冠状病毒也有79.3%的同一性。冠状基因组结构较为保守，包含 11 了个功能性开放阅读框，依次为 ORF 1a、ORF 1b、S、ORF 3、ORF 4a、ORF 4b、ORF 5、E、M、ORF 8b 和 N。其中ORF1a 和 ORF1b 分别编码在所有冠状病毒中均保守的两种复制酶PL2pro 和3CLpro。ORF 3、4a、4b、5和8b分别编码了病毒的5种附属蛋白。ORFs S、E、M和N编码了的 4 种主要结构蛋白——刺突蛋白（Spike Protein, S）、包膜蛋白（EnvelopeProtein, E）、膜蛋白（Membrane Protein, M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid Protein, N）。其中，E蛋白为在病毒表面形成离子通道的一种跨膜蛋白，与病毒毒力相关。N蛋白是病毒基因组 RNA 复制复合物的主要组成部分，并与 M 蛋白的 C端结构域结合。M 蛋白是构成冠状病毒粒子形状的蛋白，参与病毒组分在病毒粒子中的整合。S 蛋白突出于病毒粒子表面，为I型跨膜糖蛋白，与病毒颗粒吸附和膜融合相关，有报道S蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要免疫原，已成为中东呼吸综合症病毒MERS疫苗和基因工程药物开发的重要靶点。
预防SARS-CoV-2大面积流行，最有效方法是疫苗接种免疫。目前相关疫苗均处于实验室研究阶段，没有一种预防疫苗可作为临床药物获得入市批准使用。
发明内容
本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗及其应用，其在预防新型冠状病毒感染中具有一定作用，且在开发预防新型冠状病毒疫苗方面有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
第一方面，提供一种新型冠状病毒疫苗，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成。
在一些较佳的实施方式中，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+、pCAGGS或p3xFlag中的一种。
第二方面，提供一种新型冠状病毒疫苗在制备预防新型冠状病毒的药物中的应用，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成。
在一些较佳的实施方式中，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+、pCAGGS或p3xFlag中的一种。
在一些较佳的实施方式中，所述新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列对应编码了与SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒刺突蛋白S全长蛋白序列。
在一些较佳的实施方式中，所述疫苗的免疫方式为肌肉注射或者壳聚糖包裹之后的滴鼻免疫。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗及其应用，该疫苗包括的新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，该质粒DNA免疫小鼠，能诱导新型冠状病毒刺突蛋白S特异性的抗体并能体外中和新型冠状病毒刺突蛋白S假病毒颗粒，阻止病毒感染细胞，起到保护作用。
附图说明
图1是实施例一中的pCov-S质粒构建图；
图2是实施例一中的pCov-S质粒转染293T细胞S蛋白免疫印迹图；
图3是实施例一中的pCov-S质粒转染293T 细胞流式检测图；
图4是实施例二中的pCov-S免疫小鼠血清S抗体ELISA检测图；
图5是实施例三中的SARS-Cov-2假病毒颗粒制备示意图；
图6是实施例三中的SARS-Cov-2假病毒颗粒验证图；
图7是实施例四中的小鼠免疫血清中和SARS-Cov-2假病毒颗粒实验图。
SEQ ID NO:1为新型冠状病毒刺突蛋白S的基因序列；
SEQ ID NO:2为新型冠状病毒刺突蛋白S全长蛋白序列；
SEQ ID NO:3为新型冠状病毒刺突蛋白S的关键氨基酸序列。
具体实施方式
实施例中采用的质粒、试剂及设备如下：
质粒：pcDNA3.1+、pCAGGS及p3xFlag（本实验室保存）；SARS-Cov-2病毒的S基因序列：南京金斯瑞生物技术有限公司基因合成；脂质体lipofectamine 2000：购自Invitrogen公司；S亚基S1蛋白：购自北京义翘神州。
ACB-4A1型单人超净工作台：购自ESCO公司；自动酶标仪：购自Bio-TEK；T琼脂糖凝胶电泳仪：购自akara公司；Amersham Image Quant 600 化学发光成像仪：购自美国GE；Bio-Rad 凝胶分离和转膜系统：购自Bio-Rad； canto II流式细胞仪器；购自BD 公司。
本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗及其应用，其在预防新型冠状病毒感染中具有一定作用，且在开发预防新型冠状病毒疫苗方面有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
第一方面，提供一种新型冠状病毒疫苗，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成。
在一些较佳的实施方式中，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+、pCAGGS或p3xFlag中的一种。
第二方面，提供一种新型冠状病毒疫苗在制备预防新型冠状病毒的药物中的应用，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成。
在一些较佳的实施方式中，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+、pCAGGS或p3xFlag中的一种。
在一些较佳的实施方式中，所述新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列对应编码了与SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒刺突蛋白S全长蛋白序列。
在一些较佳的实施方式中，所述疫苗的免疫方式为肌肉注射或者壳聚糖包裹之后的滴鼻免疫。
下面将结合具体实施例对本发明技术方案作进一步阐述。
实施例一
本实施例提供一种新型冠状病毒疫苗，其包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S。其中的pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成，真核表达质粒为pcDNA3.1+、pCAGGS或p3xFlag中的一种。
该pCov-S表达质粒的构建方法具体包括如下步骤：
(1)首先，通过pubmed 网站获取到SARS-Cov-2病毒的S基因序列（NM908947.3），委托南京金斯瑞生物技术有限公司做基因合成。
(2)把S基因序列通过kpn I and Not I 酶切位点克隆到pcDNA3.1+真核表达质粒中，并且在TAA终止密码子前加上DYKDDDDK蛋白Flag标签，完成新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S的构建，如图1为pCov-S质粒构建示意图。需要说明的是，本实施例中，编码所述新型冠状病毒刺突蛋白S的真核表达质粒为pcDNA3.1+，还可以是其他真核表达质粒，如pCAGGS或p3xFlag中的一种，本实施例中对此并不加以限制。
还需要说明的是：该真核表达质粒装载了与SEQ ID NO:1所示新型冠状病毒刺突蛋白S全长基因序列同源性至少为95%的基因序列，因其无法穷举，本实施例以装载全长基因序列为例。该基因序列对应编码了与SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒刺突蛋白S全长蛋白序列同源性至少为95%的蛋白序列，其中，SEQ ID NO:3为其关键序列。
(3)在6孔板的293T细胞中，利用脂质体lipofectamine 2000包裹3.0ug的pCov-S质粒转染细胞，对照为空质粒对照，在细胞转染48小时后收取细胞样品，进行SDS-PAGE胶分离细胞裂解液，并用Flag标签抗体进行免疫印迹实验。结果表明，转染了pCov-S的细胞表达了Flag抗体标签蛋白，大小约为170kDa，和预测的刺突蛋白大小一致，而转了空载体的细胞，没有看到相对应的条带，说明pCov-S转染293T细胞，确实能够表达全长S蛋白，如图2所示。
(4)通过流式细胞仪检测的方式，对转染后的细胞用Flag抗体进行表面染色，然后用FITC的荧光二抗标记一抗，通过流式细胞的检测，我们发现有20%多的转染细胞，在细胞表面表达了S蛋白，用不同的方法确证了pCov-S在细胞的表达，而且S蛋白能够展示在细胞膜的表面，如图3所示。
实施例二
pCov-S DNA疫苗免疫小鼠及S特异性抗体的检测
(1) 为了验证pCov-S是否可以作为DNA疫苗，诱导小鼠产生特异性的抗体，我们把pCov-S质粒通过肌肉注射（50ug/只）免疫老鼠，或者质粒与壳聚糖混合之后，通过滴鼻免疫（50ug/只）的方式免疫小鼠，对照为健康组非免疫老鼠，一共3组，每周免疫一次，4周后收取小鼠血清，检测血清中S特异性的抗体。
(2) 通过北京义翘神州购买S亚基S1蛋白，以2ug/ml的浓度过夜4℃包被96孔ELISA板。加入100μl稀释血清（0.5%BSA-PBST按1:40稀释），37℃，2小时后PBST洗5遍，每遍2min；分别加入100μl HRP-羊抗小鼠IgG（1:5000），1.5小时后洗5遍，加入100μl TMB底物室温避光显色，加50μl 2M H2SO4中止，在OD 450nm读数。结果表明，非免疫组老鼠的OD450读值，远远小于肌肉注射或者滴鼻免疫组老鼠，有统计学显著差异，说明pCov-S 质粒疫苗免疫小鼠，可以产生针对S特异性的抗体，如图4所示。
实施例三
含有S刺突蛋白假病毒颗粒的包装
(1)如图5为HIV-luc质粒，此质粒编码了HIV全基因组，在病毒囊膜蛋白env位置，被荧光素酶报告基因luc基因替换，导致病毒囊膜蛋白缺失，所以病毒必须在外来囊膜蛋白的回补下，才能获取感染性。利用HIV-luc质粒和pCoC-S质粒共转染293T细胞，在转染细胞72小时之后，收取上清病毒液，包装出来的假病毒HIV-S是病毒囊膜含有SARS-Cov-2 的S刺突蛋白，但是病毒内部是HIV的核衣壳，并带有荧光素酶报告基因。
(2)已知Vero细胞表达血管紧张素2分子(ACE2)，ACE2是新型冠状病毒的受体，与S蛋白相互作用，介导病毒进入细胞。为了验证包装的HIV-Sero是否具有感染性，所以我们用病毒感染Vero细胞，对照病毒是没有囊膜蛋白的假病毒HIV-∆env。Vero细胞感染3天之后，在细胞裂解液中荧光素酶底物测荧光值，以此来评价病毒在细胞的感染效率。结果表明，HIV-∆env假病毒感染的细胞只有背景水平的荧光读值，而HIV-S假病毒感染细胞，荧光读值超过10000，说明我们构建的含有S蛋白的假病毒颗粒符合预期，能感染ACE2的细胞 (图6)。
实施例四
免疫小鼠血清抗体中和病毒能力检测
抗体中和实验：取小鼠免疫血清20uL, 和相同体积的HIV-S病毒液37℃混合1小时，然后加入12孔板培养的Vero细胞，感染2小时后，去感染细胞培养液，换新鲜细胞培养液并37℃培养。3天之后，收取细胞并检测细胞裂解液之中的荧光素酶活性。通过实验，我们发现肌注组和滴鼻组来源的血清，能够极大地降低病毒感染的效率，在抗体中和后，病毒感染细胞的能力显著降低，说明血清中的S特异性抗体能阻断S蛋白介导的HIV-S病毒颗粒进入细胞，此抗体在实际病毒感染中具有中和保护作用(如图7所示)。
因此，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗及其应用，该疫苗包括表达SARS-Cov-2刺突S蛋白质粒pCov-S，该质粒DNA免疫小鼠，能诱导新型冠状病毒刺突蛋白S特异性的抗体并能体外中和新型冠状病毒刺突蛋白S假病毒颗粒，阻止病毒感染细胞，起到保护作用，可以作为防止新型冠状病毒的疫苗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
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acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
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aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
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agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
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ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
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acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
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tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 2
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 3
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
35 40 45
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
50 55 60
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
85 90 95
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
115 120 125
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
130 135 140
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
165 170 175
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
180 185 190
Pro Ala

Claims (4)

1.一种新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+。
2.一种新型冠状病毒疫苗在制备预防新型冠状病毒的药物中的应用，其特征在于，所述疫苗包括新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S，所述新型冠状病毒刺突蛋白S表达质粒pCov-S通过真核表达质粒载体承载如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列形成，所述真核表达质粒为pcDNA3.1+。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒刺突蛋白S基因序列对应编码了与SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒刺突蛋白S全长蛋白序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗的免疫方式为肌肉注射或者壳聚糖包裹之后的滴鼻免疫。
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