JP2000302692A - コロナウイルス感染症に対するｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 今まで実質的に有効なワクチンがなく、防御
が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイルス感染症に対
する有効な予防／治療手段を開発することであり、特に
は、防御が困難であったＦＩＰＶの予防、発症の防御、
及び治療ができるＤＮＡワクチン提供すること。 【解決手段】 ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌク
レオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターと生理食塩水とを含むコロナウイルス感染症に
対するＤＮＡワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ネコ伝染性腹膜炎
（Ｆｅｌｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｅｒｉｔｏ
ｎｉｔｉｓ； ＦＩＰ）を引き起こすウイルス（ＦＩＰ
Ｖ）等のコロナウイルス感染症に対する予防／治療に有
効なＤＮＡワクチンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】猫には、猫伝染性腹膜炎（Ｆｅｌｎｅ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ；以
下、「ＦＩＰ」という）という病気がある。ＦＩＰは、
コロナウイルス科コロナウイルス属に属するネコ伝染性
腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）によって引き起こされるネ
コの致死性疾患である。ＦＩＰは６ケ月齢から５歳まで
のネコあるいは純血種のネコで起こりやすいことが知ら
れている（Ｓｃｏｔｔ，１９９１，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８３）。罹患ネコの口腔及び気道の
分泌物、糞便並びに尿などからウイルスが排出され、経
口感染すると考えらている。経口的に感染したウイルス
は、咽頭や腸管上皮で増殖し、粘膜のバリヤーを通過
後、血中のマクロファージに感染して全身に広がる（Ｈ
ａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９８３：Ｓｃｏｔｔ，１
９８９）。ＦＩＰを発症したネコは、最初は発熱、食欲
不振、不活発、体重減少、嘔吐、下痢、脱水、貧血のよ
うな非特異的かつ非限局性の症状を呈する。症状が進行
するにつれて滲出型（ｗｅｔ ｔｙｐｅ）と非滲出型
（ｄｒｙ ｔｙｐｅ）、あるいはそれらの混合型のＦＩ
Ｐに典型的な症状を呈するようになる。

【０００３】滲出型は、腹腔、胸腔に浸出液が貯留し、
通常無痛性の腹部の膨満が確認できる。浸出液が胸腔に
著しく貯留した場合は呼吸困難を伴う。一方、非滲出型
は、肝臓、腎臓、脾臓などの腹部臓器、眼、中枢神経系
及び肺のような様々な器官に化膿性肉芽腫性炎と壊死性
血管炎を呈することを特徴とする。一般に滲出型ＦＩＰ
の場合は臨床経過が急性であるのに対して、非滲出型Ｆ
ＩＰにおいては慢性あるいは潜行性の経過をとりはっき
りしないことがある。しかし、いずれの場合も臨床症状
が発現した場合、ほとんど進行性かつ致死性である。

【０００４】ＦＩＰＶは大きさが約１００〜１５０ｎｍ
であり、エンペロープを有しその内側には螺旋状のヌク
レオカプシド構造を持っている。その主要な構造蛋白と
しては、エンペロープから突出した糖蛋白（スパイク
（Ｓ）蛋白）、膜蛋白であるＭ蛋白、ヌクレオカプシド
蛋白であるＮ蛋白などが拳げられる。それ以外にもＦＩ
ＰＶウイルスゲノム上にはＯＲＦ１ａ，１ｂ（ＲＮＡｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＯＲＦ３ａ，３ｂ，３ｃ，３
ｄ、ｓｍａｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ蛋白、ＯＲＦ７ａ，
７ｂなどの遺伝子が存在する。しかし、ＦＩＰＶ感染細
胞の抽出液をＦＩＰＶ感染ネコ血清を用いてｉｍｍｕｎ
ｏｂｌｏｔ解析を行うと、Ｓ蛋白（分子量１８０〜２０
５ｋＤａ）、Ｍ蛋白（分子量２５〜３０ｋＤａ）、Ｎ蛋
白（分子量４３〜５０ｋＤａ）の３種類が検出される。
そのため、これら３種類が免疫系による主要な標的とな
っていると考られている。

【０００５】ＦＩＰＶ感染の特徴として、抗体依存性感
染増強（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎ
ｈａｎｃｅｍｅｎｔ；ＡＤＥ）が挙げられる（Ｃｏｒａ
ｐｉｅｔ ａｌ，１９９２；Ｈｏｕｄａｔｓｕ ｅｔ
ａｌ．， １９９１；Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９２）。ＡＤＥとは本来、異物を排除するための生体の
防御機構である抗体が、逆にＦＩＰＶのマクロファージ
への感染を促進させ、症状を悪化させることである。こ
のため従来の抗体を誘導する不活化ワクチンや弱毒生ワ
クチンなどでは、逆に症状を悪化させることが知られて
いる。このＡＤＥ作用のため、致死性であるにも関わら
ずＦＩＰに対する有効なワクチンは未だ開発されていな
い。現在、ＦＩＰワクチンとして唯一存在するのは、弱
毒化生ウイルスの温度感受性株を用いた鼻腔内ワクチン
（Ｐｒｉｍｕｃｅｌｌ ＦＩＰ；Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎ
ｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）である。このワクチンは、温度感
受性なので鼻咽頭では増殖するが、全身的な増殖がな
く、鼻及び腸の局所粘膜免疫、唾液免疫グロブリンＡ
（ＩｇＡ）及び細胞性免疫を促進する。さらに、ＦＩＰ
Ｖの多くの株を交差防御するという特徴を持つ。

【０００６】鼻腔内ワクチンを用いた各種の治験におい
てワクチン接種後６ケ月若しくはそれ以前に感染攻撃し
た場合、生存率は接種群が７１〜８５％である。ワクチ
ン非接種群の生存率は１７〜２０％である。鼻腔内ワク
チンの効果は、ウイルス株とウイルス感染量によって異
なることが報告されている（Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２）。ウイルスの暴露量が少量であれば、
５０％のネコをＦＩＰＶから防御できるが、大量（１０
⁵ＴＣＩＤ₅₀以上）の暴露ではほとんど防御できず、却
ってＦＩＰの感染増強すら見られた。また、他のデータ
でも野外のネコでワクチン接種群と非接種群のＦＩＰ発
症と死亡率の有意差を示すことが出来なかったことが報
告されている（Ｆａｎｔｏｎ，１９９１）。また、生ワ
クチンの欠点である病原性復帰の可能性なども考えられ
る。結局、未だ有効なワクチンはないと言える。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、致死性でありながら今まで実質的に有効なワクチン
がなく、防御が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイル
スに対する有効な予防手段を開発することであり、具体
的には、防御が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイル
ス感染症の予防、発症の防御、及び発症後の治療ができ
るＤＮＡワクチンを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記諸特
性に留意し鋭意検討した結果、本発明の目的が以下の構
成によって達成されることを見出し、本発明に到達し
た。即ち、本発明は、下記構成である。 (１) ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカプ
シドタンパク質をコードするＤＮＡを含み、該タンパク
質を適用動物内で発現させることができる発現ベクター
と、生理食塩水とを含むことを特徴とするコロナウイル
ス感染症に対するＤＮＡワクチン。 (２) ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカプ
シドタンパク質をコードするＤＮＡが、配列表の配列番
号１に記載のＤＮＡ配列を有するか、あるいは配列表の
配列番号１に記載のＤＮＡ配列との相同性が９５％以上
であり、適用動物に対して免疫を付与できるヌクレオカ
プシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有すること
を特徴とする前記（１）に記載のコロナウイルス感染症
に対するＤＮＡワクチン。 （３） ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカ
プシドタンパク質をコードするＤＮＡが、配列表の配列
番号１に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする前
記（１）に記載のコロナウイルス感染症に対するＤＮＡ
ワクチン。

【０００９】特開平３−１６４１８２号公報には、ＦＩ
ＰＶの７９−１１４６株のＭ−タンパク質又はＮ−タン
パク質をコードするヌクレオチド配列が開示され、その
Ｍ−タンパク質又はＮ−タンパク質のいずれもワクチン
として使用できることが示唆されている。しかしなが
ら、該公報には、実質的には上記株のＭ−タンパク質又
はＮ−タンパク質をコードするヌクレオチド配列のみが
開示され、該タンパク質のワクチンとしての実際の効果
は示されていない。H.Vennema, et al., Virology, 18
1, 327-335には、ＦＩＰＶの７９−１１４６株のＭ−タ
ンパク質又はＮ−タンパク質をコードする遺伝子をワク
シニアウイルスに組み込んだ組み換えワクシニアウイル
スワクチンを作成し、ワクチンとしての効果を検討して
いる。この文献によると、Ｍ−タンパク質の遺伝子を組
み込んだ組み換えワクチンでは、強毒株の攻撃に対して
ある程度効果があり、Ｎ−タンパク質の遺伝子を組み込
んだ組み換えワクチンではその効果がないと記載されて
いる。

【００１０】本発明においては、ＦＩＰＶにおいて免疫
を付与できるタンパク質を種々検討した結果、そのタン
パク質のうちＮ−タンパク質に着目し、それをＤＮＡワ
クチンという特有の構成とすることにより、従来感染予
防が困難であったＦＩＰを防御できるワクチンの開発に
成功した。後述するように、上記文献で効果があると記
載されたＭ−タンパク質では、意外なことに、ＤＮＡワ
クチンとしては効果がなく、逆にＡＤＥ様活性を誘発し
た。

【００１１】本発明のＤＮＡワクチンは、ＦＩＰＶ感染
症の予防／治療に最も有効であるが、このコロナウイル
ス感染症以外にも、豚伝染性胃腸炎ウイルス感染症、豚
流行性下痢ウイルス感染症、イヌコロナウイルス感染
症、ネコ腸内コロナウイルス感染症等のコロナウイルス
感染症にも、これらの原因ウイルスが抗原的に非常に近
似しているので有効である。本発明のＤＮＡワクチン
は、ネコ、イヌ、ヒト、ブタ等のコロナウイルスが感染
する哺乳動物に適用できるが、中でもネコに有効であ
る。本発明におけるＤＮＡワクチンは、感染症が発症し
ている場合でも該ＤＮＡワクチンを投与することで下記
の如く宿主免疫系、特に細胞性免疫を誘導することで病
気の回復が期待できることから治療にも有効である。

【００１２】尚、ＤＮＡワクチン、すなわちＤＮＡ接種
によってＤＮＡは細胞内に取り込まれ、コードする蛋白
（抗原）が細胞内で合成されるというワクチンは、１９
９０年代になって報告がなされた（Ｈａｓｓｅｔ ａｎ
ｄ Ｗｈｉｔｔｏｎ，１９９６；Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，１９９３，１９９６；Ｊｏｈｎｅｔ ａｌ．，１９
９７）。プラスミドＤＮＡから発現される蛋白は抗原プ
ロセッシングを受けた後、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ及び
ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性抗原提示により細胞性
免疫、液性免疫両方を誘導できることが報告されている
（Ｃｌｅｍｉｋｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２）。また、ＤＮＡワクチンは、従
来の生ワクチン、不活化ワクチンと比較して生物学的に
安全であると考えられており、感染症に対する新たなワ
クチン法として期待されているものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、発明の実施の形態を説明す
るが、本発明はこれに限定されない。本発明において、
ＦＩＰＶにおけるヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ−タ
ンパク質ともいう）をコードする遺伝子（ＤＮＡ）とし
ては、従来のＦＩＰＶの各種の株から分離、クローニン
グでき、そのＮ−タンパク質によりネコにおいてはＦＩ
ＰＶとネコ腸内コロナウイルス、豚においては豚伝染性
胃腸炎ウイルスと豚流行性下痢ウイルス、イヌにおいて
はイヌコロナウイルスに対する免疫を付与できるものが
使用できる。Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子は例え
ば以下の方法でクローニングすることができる。従来の
方法で増殖させたＦＩＰＶからＲＮＡを抽出し、そのＲ
ＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成し、そのｃＤ
ＮＡを鋳型として所定のプライマー（例えば、ＦＩＰＶ
ＮＦ、ＦＩＰＶ ＮＲ等）を用いてＰＣＲ法（詳しく
はＲＴ−ＰＣＲ法）により該遺伝子を増幅し、これを所
定のクローニングベクターに組み入れてクローニングす
ることができる。

【００１４】本発明においては、Ｎ−タンパク質をコー
ドする遺伝子は、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配
列を有するか、あるいは配列表の配列番号１に記載のＤ
ＮＡ配列との相同性が９５％以上であり、ネコ、イヌ、
豚に対して免疫を付与できるヌクレオカプシドタンパク
質をコードするＤＮＡ配列を有するものであることが好
ましい。より好ましくは配列表の配列番号１に記載のＤ
ＮＡ配列である。

【００１５】発現ベクターとしては、上記遺伝子が当該
動物体内で発現できるように、上記Ｎ−タンパク質をコ
ードするＤＮＡを挿入できる部位と、その上流にプロモ
ーターやＳＤ配列を有するものが使用できる。また、宿
主でその発現ベクターが増殖できないものがよく、例え
ば、複製開始点（ｏｒｉ）として原核細胞由来のものを
使用することで達成される。発現ベクターの具体例とし
ては、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＡＧＧＳ等の真核
細胞での発現プロモーターを有するプラスミドが挙げら
れる。

【００１６】上記遺伝子を有する発現ベクターの作成法
としては、上記クローニングしたＮ−タンパク質をコー
ドする遺伝子と、発現ベクターを各々制限酵素で切断
し、各々末端修飾したのち、ＤＮＡリガーゼで両者を結
合させて、Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子が導入さ
れた発現ベクターを得ることができる。上記Ｎ−タンパ
ク質をコードする遺伝子が導入された発現ベクターは、
生理食塩水中に添加されてワクチンとして使用する。そ
のベクターのワクチン中の添加量としては目安として１
００μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌが挙げられる。ま
た、添加剤としては、アジュバント、サイトカイン、サ
イトカイン発現プラスミド等が挙げられるが、副作用を
考えると、無添加が好ましい。

【００１７】本発明のＤＮＡワクチンの投与方法として
は、注射等の手段を用いて各種組織、例えば筋肉組織に
接種できる。また、上記発現ベクターを表面に覆った金
粒子を生理食塩水に溶解したものを接種することもでき
る。これにより、上記発現ベクターを取り込む細胞が非
選択的となる。また、接種回数としては、目安として１
回〜３回接種でき、その各接種間の間隔としては、１週
間〜３週間を挙げることができる。１回の接種での投与
量としては１００μｇ／１頭〜３００μｇ／１頭が挙げ
られる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明の内容がこれにより限定されるものでは
ない。 〈ワクチンの製造〉ＦＩＰＶ Ｍ９１−２６７株のＮ遺
伝子とＭ遺伝子をクローニングし、プラスミドＤＮＡと
インサートＤＮＡのライゲーション反応物を作成した。 １．遺伝子クローニング 実験には、ネコ由来培養細胞であるｆｅｌｉｎｅ ｍａ
ｃｒｏｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅ Ｆｅｌｉｎｅ ｃａｔｕ
ｓ ｗｈｏｌｅ ｆｅｔｕｓ（ｆｃｗｆ−４）細胞を用
いた。ｆｃｗｆ−４細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥ
Ｍ）（シグマ、ケミカル）に、１０％（ｖ／ｖ）非働化
牛胎児血清（ＦＣＳ）と抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニ
シリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン）を加えた
ものを増殖培地として、５％炭酸ガス培養器中で培養し
た。

【００１９】ｆｃｗｆ−４細胞にウイルス液を接種し、
３７℃で６０分間、１５分毎に優しく混和しながらイン
キユべートすることにより細胞へウィルスを吸着した。
ウイルスは、強毒ＦＩＰＶであるＭ９１−２６７株を用
いた〔Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．
Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５９（４）；２５３〜２５８（１９
９７）〕。その後、ウイルス液を吸引し、ＤＭＥＭでｆ
ｃｗｆ−４細胞を２回洗浄後、ＦＣＳ非添加のＤＭＥＭ
で維持した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞全体に見ら
れたときに上清を回収し、−８０℃でしばらく保存し
た。

【００２０】（感染価の測定）使用するウイルス液は、
以下の方法で感染価の測定を行った。プラークａｓｓａ
ｙを行ってウイルス感染価を求めた。簡単に述べると、
ｆｃｗｆ−４細胞を直径３５ｍｍシヤーレで９０％ｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｔになるまで増殖させ、ＤＭＥＭで１０倍
階段希釈したウイルス液を２００μｌずつ接種し、６０
分間１５分毎にやさしく混和しながら３７℃でインキユ
ベートした。ＤＭＥＭで２回細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ
と１％アガロース添加のＤＭＥＭを１シャーレ当たり２
ｍ１ずつ重層した。２日間３７℃のＣＯ₂インキユベー
ターで培養し、ホルマリン固定後、０．０５％クリスタ
ルバイオレットで染色し、ブラーク数を数え、ｐｌａｑ
ｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ＰＦＵ）値を算出し
た。

【００２１】ＦＩＰＶ Ｍ９１−２６７株のＮ遺伝子と
Ｍ遺伝子をクローニングするため、該ウイルス株を３５
ｍｍシャーレに感染後、ＣＰＥが全面に広がったところ
で細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑ
ＩＡＧＥＮ社製）によりＲＮＡを抽出した。得られた１
μｇのＲＮＡをＡＭＶ由来Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写して、ｃＤＮＡを作製し
た。このｃＤＮＡを鋳型として５’−ｇｇａｔｃｃａｔ
ｇｇｃｃａｃａｃａｇｇｇａｃａａ−３’（ＦＩＰＶＮ
Ｆ）と５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａｇｔｔｃｇｔａａｃｃ
ｔｃａｔｃ−３’（ＦＩＰＶＮＲ）を用いて、ＬＡ Ｔ
ａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲ（９２℃
１’、４５℃ １’、７２℃ ２’、３５ｃｙｃｌｅ
ｓ）を行ってＮ蛋白遺伝子を増幅した。

【００２２】同様に、５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｔ
ａｔｇａｔｇｃｃｔａｔａ−３’（ＦＩＰＶＭＦ）と
５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａｃａｃｃａｔａｔｇｔａａｔ
ａａ−３’（ＦＩＰＶＭＲ）を用いて、ＬＡ Ｔａｑ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲ（９２℃ １’、４
５℃ １’、７２℃ ２’；３５ｃｙｃｌｅｓ）を行っ
てＭ蛋白遺伝子を増幅した。

【００２３】これらの反応産物をフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノール中で沈殿させて精製し、その
後、ＰＣＲ産物のｄｉｒｅｃｔクローニング用のベクタ
ーｐＵＣ１１８ＴＡ（制限酵素ＸｃｍＩ切断部位を２つ
有する）に組み込んで、以下の実験に用いた。

【００２４】２．ＤＮＡワクチン用発現プラスミドの作
成 インサートフラグメントの調製 ＦＩＰＶのＮ蛋白をコードする遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＢａｍＨＩで切断し、ＦＩＰＶ
Ｎ遺伝子を含む１．２ｋｂｐ断片をＧｅｎｅＣｌｅａ
ｎ ＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収した。切断し
て得られた断片をＫｌｅｎｏｗ 酵素により平滑末端に
し、フェノール／クロロホルムで抽出した。その後、そ
の抽出物をエタノールで沈殿し、沈殿物を８０％エタノ
ールで洗浄し、乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。

【００２５】同様に、ＦＩＰＶのＭ蛋白をコードする遺
伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＭをＢａｍＨ
Ｉで切断し、ＦＩＰＶ−Ｍ遺伝子を含む０．９ｋｂｐを
Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）によ
り回収した。これをＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端に
し、フェノール／クロロホルム抽出し、その後、その抽
出物をエタノール沈殿し、沈殿物を８０％エタノールで
洗浄、乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。

【００２６】ベクターの調製 ここではＦＩＰＶ Ｎ遺伝子の予防・治療への有効性を
実証するために、一つの例として、ＳｉｍｉａｎＶｉｒ
ｕｓ４０のｏｒｉと、サイトメガロウイルスのエンハン
サーと、鶏ベーターアクチンプロモーターと、ウサギベ
ーターグロブリン３’フランキング配列とを、ｐＵＣ１
３に組み込んだプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ ｅ
ｔ．ａｌ．，１９９１）を用いてみた。本プラスミドを
ＥｃｏＲＩで切断し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（Ｂ
ＩＯ−１０１社）を使用して回収した。切断したプラス
ミドｐＣＡＧＧＳを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端
にし、フェノール／クロロホルム抽出した。その後、エ
タノール沈殿し、沈殿物を８０％エタノールで洗浄し、
乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。これをＣＩＡＰ
（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理し、その後、フェノ
ール−クロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行い、
その後、８０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥した
後、適当量の滅菌水に溶解した。

【００２７】プラスミドＤＮＡのライゲーション反応 上記で調製したプラスミドＤＮＡとインサートＤＮＡを
１：３−５のモル比で混ぜ、１０〜２０μｌとなるよう
に等量のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒｓｉ
ｏｎ ２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（宝酒造製）を加え、
混和後１６℃で１２〜１５時間反応させることにより、
Ｎ／ｐＣＡＧＧＳとＭ／ｐＣＡＧＧＳとを構築した。構
築したＮ／ｐＣＡＧＧＳとＭ／ｐＣＡＧＧＳとは、制限
酵素で切断されることで目的のプラスミドであることを
確認した（図３、図９）。

【００２８】強制感染実験〈動物実験〉 １３週齢のＳＰＦ猫（雄）を購入し、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ
接種群、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種群、ｐＣＡＧＧＳ接種群
（コントロール群）の３群に配分し、滅菌水と市販の餌
で飼育した。ＱＩＡＧＥＮメガキット（ＱＩＡＧＥＮ社
製）を用い、大量精製したＤＮＡを猫１頭あたり２００
μｇ右後肢の大腿二頭筋に筋肉接種し、２週間隔で３回
接種した。その最終接種から２週間後に、１頭あたり１
×１０⁶ＰＦＵのＦＩＰＶＭ９１−２６７株を腹腔内接
種した。

【００２９】ウイルス接種前には週１回、接種後には週
２回頚静脈から採血し、ＭＩＣＲＯＣＥＬＬ ＣＯＵＮ
ＴＥＲ Ｆ−８００（Ｓｙｓｍｅｘ）により赤血球数、
白血球数、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値を測定
し、ＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ５５００Ｓ（富士メデ
ィカルシステム株式会社）により血中の尿素窒素（ＢＵ
Ｎ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、アラニンアミノ転移酵
素（ＧＰＴ）、アスパレートアミノ転移酵素（ＧＯＴ）
を測定した。また、塗末標本より白血球百分比（分葉好
中球、桿状好中球、リンパ球好酸球、単球）を測定し
た。別に分注した血液を、室温、１５０００ｒｐｍ、１
５分間遠心して血漿を回収し、５６℃，３０分で非働化
後、中和抗体価の測定とウエスタンブロット（Ｗｅｓｔ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）解析を行った。

【００３０】また、ウイルス攻撃前には、週１回、攻撃
後は毎日、体温、体重、摂食量を測定し、便の状態、沈
鬱、神経症状を観察した（下記表２〜９）。臨床症状
は、表１に示した基準に従って、スコアリングを行っ
た。実験ネコは瀕死の状態になったとき、致死量のケタ
ミン投与と心採血により安楽死させ、剖検を行った。上
記結果を下記表−２〜９と、図４〜８、図１０〜１４に
示す。

【００３１】〈ウエスタンブロット解析〉調製した抗原
をサンプルバッファー（６．２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２．０％ＳＤＳ、５．０％メルカプトエタノール、
２０％グリセロール、０．００１％プロモフェノールプ
ルー）と混和し、１００℃で２分加熱し、１２％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ ｅｔ．ａ１．，１９
７０）で泳動した。ポリビニリデンジフルオライド（Ｐ
ｏｌｙ ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄ
ｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）膜をあらかじめ１００
％エタノールと転写バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）に浸してお
き、陽極側から、３ＭＭペーパー、膜、アクリルアミド
ゲル、３ＭＭぺーパーの順に並ベ、１０Ｖで１時間転写
した（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９７９）。

【００３２】その後、３％ゼラチン（ＥＩＡ ｇｒａｄ
ｅ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）添加ＴＢＳ（０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］）でブロッキ
ング後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ）で
三回洗浄した。次に、１０倍希釈になるようにネコ血漿
を加えた１％ゼラチンＴＴＢＳを加え、３７℃１時間反
応させ、その後ＴＴＢＳで三回洗浄した。二次抗体とし
てぺルオキシダーゼ標識山羊抗ネコＩｇＧを５００倍希
釈したものをもちいて、３７℃３０分反応させた。ＴＴ
ＢＳ、ＴＢＳでそれぞれ三回洗浄した後、ジアミノベン
ジン四酸塩錠（和光）を１錠（１０ｍｇ）とＨ₂Ｏ₂を３
３μｌのＴＢＳに加え、室温で反応させた。

【００３３】〈ウイルス中和試験〉 被検血漿をＤＭＥＭで２倍階段希釈し、５０μｌずつ９
６穴プレートに入れ、５０μｌのＦｌＰＶ Ｍ９１−２
６７株（１穴当たり１００ＰＦＵ）を加えた。３７℃で
６０分反応させた後、２４穴プレートで９０％ｃｏｎｆ
ｌｕｅｎｃｅになるまで増殖させたｆｃｗｆ−４細胞に
加え、１５分毎に穏やかに混和しながら、３７℃、１時
間反応させた。その後は、感染価の測定と同様の操作を
行い、プラーク数を算定した。７５％プラークが減少す
る血漿の最高希釈倍率の逆数を中和抗体価とした。

【００３４】〈塩基配列の決定〉 シークエンス用クローンの作成 ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＢｇ１ ＩＩで切断
し、０．６ｋｂｐ、０．５ｋｂｐの二つの断片をＧｅｎ
ｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収
した。ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子
は、Ｂｇ１ ＩＩにより二カ所が切断されるため、０．
６ｋｂｐと０．５ｋｂｐの中間部分の約２０ｂｐのシー
クエンスを行うために、別にｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＰ
ｓｔＩで切断し、３．９ｋｂｐを切り出して、セルフラ
イゲーションした。同様にＦＩＰＶのＭ−タンパク質を
コードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−
ＭをＢｇ１ ＩＩで切断し、０．５ｋｂｐ、０．４ｋｂ
ｐの二つの断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（ＢＩＯ
−１０１社）により回収した。ベクターに、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を用い、これをＢａｍＨＩで
切断し、フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタ
ノールで沈殿させ、得られた沈殿物を８０％エタノール
で洗浄し、乾燥後、適当量の滅菌水に溶解し、アルカリ
フオスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＣａｌｆＩｎｔｅｓｔｉ
ｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処
理後、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（ＢｌＯ−１０１
社）により回収した。調整したインサートＤＮＡとベク
ターは、ＤＮＡワクチン用プラスミド作成時と同様の手
技によりライゲーション反応を行い、シークエンス用ク
ローンを構築した。

【００３５】 サンプルの調整 サンプル調整は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉ
ｔ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥＲＫＩ
Ｎ−ＥＬＭＥＲ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）を用い
て行い、ＤＮＡ塩基配列の決定は、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ
３７７ ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ
−ＥＬＭＥＲ，Ｆｏｓｔｅｒ ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用
いて行った。

【００３６】〔実験例の結果〕 １．ＦＩＰＶ Ｎ遺伝子とＭ遺伝子のクローニングと塩
基配列の決定 日本で望月ら（１９９７）によりＦＩＰ症状を呈して死
亡したネコより分離され、腹腔内接種によりネコにＦＩ
Ｐを引き起こすことが知られているＭ９１−２６７株よ
りＲＮＡを抽出後、ＲＴ−ＰＣＲによりＮ遺伝子とＭ遺
伝子を増幅した結果、それぞれ１１４６ｂｐと８８２ｂ
ｐが検出された。これをＴＡベクター（制限酵素Ｘｃｍ
Ｉ切断ｐＵＣ１１８ＴＡ）にクローニングし、塩基配列
を決定した。Ｎ遺伝子は３７６アミノ酸残基をコードす
る１１３１塩基よりなっていた（配列表の配列番号
１）。Ｎ遺伝子の構造遺伝子は１〜１１２８番目であ
る。また、Ｍ遺伝子は２８９アミノ酸残基をコードする
８７０塩基よりなっていた（配列表の配列番号３）。Ｍ
遺伝子の構造遺伝子は１〜８６７番目である。

【００３７】アミノ酸配列をすでに報告されているコロ
ナウイルスのものと比較した結果、Ｎ蛋白においては７
９−１１４６株のものと９３．４％の最も高い相同性を
有しており、犬コロナウイルス（ＣＣＶ）とは７６．４
％、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）とは７５．９
％の相同性を有していた。Ｍ蛋白においては７９−１１
４６株のものと９０．５％の最も高い相同性を有してお
り、犬コロナウイルス（ＣＣＶ）とは８４．７％、豚伝
染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）とは８８．６％、豚流
行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）とは５２．３％、ヒトコ
ロナウイルス（ＨＣｏＶ）の２２９Ｅ株とは４５．７
％、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）とは４２．９％、
七面鳥コロナウイルス（ＴＣｏＶ）とは４２．３％、ヒ
トコロナウイルス（ＨＣｏＶ）のＯＣ４３株とは３９．
８％、マウス肝炎ウイルスとは３９．３％、鶏伝染性気
管支炎ウイルス（ＩＢＶ）とは２７．４％の相同性を有
していた。加えて、系統樹を作成した結果、従来の報告
通りネココロナウイルス間では他の動物種由来のコロナ
ウイルスよりも近縁であることが示された（図１、図
２）。

【００３８】２．各検体の臨床症状と各測定結果 以下に、臨床症状のスコアリング基準、臨床症状と各測
定結果を示した表−１〜９を示す。尚、表−２は、Ｍ群
の検体番号１の結果、表−３はＭ群の検体番号２の結
果、表−４はコントロール群の検体番号３の結果、表−
５はコントロール群の検体番号４の結果、表−６はコン
トロール群の検体番号５の結果、表−７はＮ群の検体番
号６の結果、表−８はＮ群の検体番号７の結果、表−９
はＮ群の検体番号８の結果を示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】

【表４】

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】

【表７】

【００４６】

【表８】

【００４７】

【表９】

【００４８】

【表１０】

【００４９】

【表１１】

【００５０】

【表１２】

【００５１】

【表１３】

【００５２】

【表１４】

【００５３】

【表１５】

【００５４】

【表１６】

【００５５】

【表１７】

【００５６】上記表において、ＢＷは体重、ＢＴは体
温、Ｈｔはヘモトクリット値、Ｈｂはヘモグロビンを各
々表す。 ２ ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子を用
いたＤＮＡワクチンの検討 ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＮ遺伝子を、ｐ
ＣＡＧＧＳに組み込んだ（Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ）。生理食
塩水に溶かしたプラスミドＤＮＡをＳＰＦネコの大腿二
頭筋に一匹当たり２００μｇ接種した。さらに２週間間
隔で計３回の免疫を行った。この間、臨床症状はみられ
なかった。最終免疫より２週間後に強毒ウイルス株であ
るＭ９１−２６７株を１×１０⁶ＰＦＵ／１ｍｌ／１匹
に腹腔内接種した。

【００５７】攻撃試験後の結果を項目別に以下に示す。 臨床症状 〔コントロール群（検体番号３〜５）〕コントロール群
では接種後１日目から体重が減少し始め、検体番号３
（表−４に示す）では８〜２２日目の間で、検体番号５
（表−６に示す）では５〜１０日目の間で１０％以上の
減少がみられた。２頭共その後いったん回復したが、検
体番号３で２５日目、検体番号５で２４日目以降、ふた
たび１０％以上の減少を示した（図５参照）。体温は検
体番号３で１５、１９〜２１、２２〜２６日目に、検体
番号４（表−５に示す）で１９、２０、２２、２５日目
に、検体番号５で１５〜１７、１９、２１日目に４０℃
以上の発熱を示した。

【００５８】ヘマトクリット値は、検体番号５、４、３
でそれぞれ攻撃後３、７、１０日目から２５％以下に減
少し、検体番号４と３はそれぞれ２４と２８日目に回復
したが、検体番号５では以後２５％以上に回復すること
はなかった（図７）。白血球数は、検体番号３で７、１
０、１８、２４日目に、検体番号４で３，１４〜２４日
目に、検体番号５で３、１８、２４日目に６０００／μ
ｌ以下であった（図６）。白血球百分比は、分葉好中球
が８０％以上となったのは、検体番号３で１４，２４〜
３１日目、検体番号４で３１〜４３日目、検体番号５で
１０〜２６日目であった。単球は３頭共７日目に１０％
以上に増加し、好酸球は検体番号３で１０，１４，２
８，３１日目に、検体番号４で３１〜４３日目に、検体
番号５で７，１８〜２６日目に１％以下に減少した（表
−４〜６）。

【００５９】下痢は、検体番号３で３，４日目に、検体
番号４で９日目に見られた。食欲不振は、検体番号３で
４日目以降ずっと続き、２８日目以降は摂食量がほぼ０
ｇとなった。検体番号４でも４日目以降食欲不振となっ
たが、１０〜２１日の間いったん食欲が回復していた。
しかし、２８日目以降の摂食量はほぼ０ｇになった。検
体番号５では接種後１日目からほぼ毎日食欲不振を示し
た。沈鬱は、検体番号３で５〜１９日、検体番号４で４
〜４３日、検体番号５で１９〜２６日の間でみられた。
神経症状は検体番号４ではみられなかったが、検体番号
３では１５〜１８，２０日目に後肢のふらつき、旋回運
動がみられ、検体番号５では２４〜２６日に後肢麻痺、
発作がみられた。

【００６０】〔Ｎ群（検体番号６〜８）〕Ｎ群では、接
種後１日目から３頭中２頭で、他の１頭は４日目から体
重の減少がみられた。その後は回復と減少を繰り返した
が、コントロール群で１０％以上の体重減少を示した日
がのべ３１日間あったのに対して、Ｎ群では最も大きい
減少を示した検体番号７でも最大９％の減少にとどま
り、１０％以上は減少しなかった（図５、表−８）。体
温は検体番号７（表−８に示す）で１５〜２０，２２，
２３日目に、検体番号８（表−９に示す）で１４，１６
〜１８，２１，２２，２５〜２８日目に４０℃以上に発
熱した。検体番号６（表−７に示す）では発熱はみられ
ず、他の２頭では発熱に関してコントロール群との差は
なかった。

【００６１】白血球数は、検体番号６で３日目に、検体
番号８で７日目に６０００／μｌ以下に減少したが、す
ぐに回復し、検体番号８では１８日目に再び減少した
が、２１日目には回復した。検体番号７は７，１０，１
８〜２４日目に６０００／μｌ以下の値を示した。Ｎ群
ではコントロール群と比較して、白血球数が６０００／
μｌ以下に減少し始める時期は同じであったが、一時的
に回復するのが早かった（図６，表−７〜９）。ヘマト
クリット値では、２５％以下に減少したのは検体番号６
で１０日目、検体番号７で７〜２４日目、検体番号８で
７〜１８日目であった。Ｎ群とコントロール群でヘマト
クリット値が２５％以下に減少する時期はほぼ等しく、
差はみられなかったが、Ｎ群の１頭では明らかに回復が
早かった（図７）。白血球百分比では、検体番号７，８
ではコントロールとの差がみられなかったが、検体番号
６ではほとんど異常値がみられなかった。下痢は検体番
号６もしくは検体番号７で５，６，１０，１９日目にみ
られた。検体番号６，７は２２日目まで同ケージに収容
していたため下痢がどちらにおこっていたのかは不明で
ある。１８，２０〜２２日目は検体番号６，７共に下痢
をしていた。検体番号８では１０，２０〜２２日目に下
痢を起こした。下痢はＮ接種群でコントロール群よりも
頻繁にみられた（表−７〜９）。

【００６２】食欲不振は検体番号６で２１日目、検体番
号７で２１，２２〜２６日にみられたが、先に述べた理
由により検体番号７で食欲不振が正確にはいつからおこ
っていたのか不明である。検体番号８では６，７日目に
いったん摂食量が減少したが、すぐに回復した。検体番
号８が再び食欲不振を起こすのは１８日目以降で特に２
６日目以降は摂食量がほぼ０ｇとなった。沈鬱は検体番
号７で１６日目以降、検体番号８で２０日目以降、死亡
するまで続いた。神経症状は、検体番号７のみでみら
れ、１６〜１８日目、２２〜２５日目に後肢麻痺がみら
れ、２６日目には横臥して動けない状態であった。上記
の臨床症状を表−１に従ってスコア化した結果（図
４）、接種後３，７，１０，１４日目でＮ群のポイント
は、コントロール群の平均より低く、このうち１０日目
では、有意差が見られた（ｐ＜０．０５）。コントロー
ル群でスコアが上昇し始める３日目にはＮ群のスコアは
０ポイントで臨床症状の発現が遅くなった。１４日目以
降は、Ｎ群の検体番号７でコントロール群と同じか、若
しくはそれ以上に高いポイントとなったが、他の２頭で
はコントロール群の平均より低かった。Ｎ群の検体番号
７は２６日目に、検体番号８は３２日目に瀕死となり、
そのため２８日と３５日のＮ群のスコアが高くなってい
る。検体番号６は常に１ポイント以内の低い値を示して
おり、２５日以降は０ポイントとなった。以上より、Ｎ
群ではコントロール群よりもスコアが上昇し始めるのが
遅く、また臨床スコアが低いという結果になった。

【００６３】体重（図５） コントロール群、Ｎ群共に接種後（ＰＩＤ）１日目に１
〜２％の減少が見られた。コントロール群では、いった
ん回復したが、再び減少し始め、８日目までに接種前と
比べて１０．７％減少した。その後、検体番号３（表−
４）では接種後１７日目までにさらに５％減少したがそ
の後、増加を始め、２１日目には接種前と比べて４％の
減少となった。検体番号４，５は９日目以降増加した
が、検体番号５は１８日目を境に減少し始め、その後回
復は見られなかった。検体番号４は２１日目までに８％
回復した。コントロール群全体では、接種前と比べて接
種後２１日目に平均７％減少した。Ｎ群では２日目以降
検体番号７が２％以内で増減を繰り返しながらも一定の
値を保ち、さらに検体番号６，８では増加を示し、Ｎ群
全体の平均では接種後２１日目に接種前と比べて８．７
％の増加をしめした。６〜１９日の間コントロール群と
の間に有意差があった（ｐ＜０．０５）。結果として、
Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ群はコントロール群よりも体重の減少
が有意に軽減されていることが示された。

【００６４】白血球数（図６） コントロール群では検体番号４，５が接種後３日目に６
０００／μｌ以下に減少し、検体番号３は７日目に３０
００／μｌ以下に減少した。検体番号４，５は７日目に
は１００００／μｌ以上に回復したが、検体番号４は１
４日目、検体番号５は１８日目にふたたび５０００／μ
ｌ以下に減少した。Ｎ群では検体番号６で３日目に６０
００／μｌ以下に減少し、検体番号７，８では７日目に
減少した。しかし３頭共に１４日目には１００００／μ
ｌ以上に回復し、検体番号６では以後６０００／μｌ以
下に減少することはなかった。検体番号７，８はふたた
び１８日目に５０００／μｌ以下に減少し、検体番号７
では以後回復は見られなかった。検体番号８は２１日目
に、１００００／μｌ以上に回復し、以後６０００／μ
１以下に減少することはなかった。このようにコントロ
ール群で１００００／μｌ以下であった１４日目にＮ接
種群で平均して１７６００／μｌに増加しており、Ｎ／
ｐＣＡＧＧＳ接種により白血球数の回復が早まる結果と
なった。

【００６５】ヘマトクリット値（図７） コントロール群では接種後３日目には、接種前と比べて
平均５％減少した。その後も減少を続け、検体番号５で
は３日目、検体番号３は１０日目に２５％以下となっ
た。検体番号４は１４日目にさらに１８％に減少した
が、１８日目以降は２０％以上に増加した。検体番号５
と検体番号３は７日目と１４日目にそれぞれ２０％以下
に減少し、２１日目までに２０％以上に回復することは
なかった。これに対し、Ｎ群では３日目にはほとんど減
少が見られず、２５％以下となったのは、検体番号７，
８が７日目、検体番号６が１０日目であったが、検体番
号６では１４日目には２７％に回復し、その後も増加し
て２１日目には３５％となった。検体番号７は１０日目
に１９％に減少したが、１４日目には２２％に回復し、
２１日目までに２０％以下に再び減少することはなかっ
た。検体番号８は、２１日目に２５％に回復した。Ｎ群
ではコントロール群と比ぺてヘマトクリット値の減少が
遅く、その程度も低く、かつ回復が早い結果となった。

【００６６】赤血球数（図８） コントロール群では接種後３日目に２頭が２００×１０
⁴／μｌの減少を示した。このうち検体番号５は７日目
９９０×１０⁴／μｌ、検体番号４は１０日目に１３４
８×１０⁴／μｌに回復したが、１４日目には再び検体
番号４で６５０×１０⁴／ｌ以下、検体番号５で５００
×１０⁴／ｌ以下に減少した。検体番号３は７日目から
減少を始め、２１日目には５５０×１０⁴／μｌ以下と
なった。Ｎ群では接種後３日目にはコントロール群ほど
の著しい減少はみられなかったが、検体番号７が７日目
に、検体番号６が１０日目に、検体番号８が１４日目に
大きく減少し、５５０×１０⁴／μ１以下となった。し
かし３頭共にその後回復を示した。このようにＮ群は３
日目から減少したが、減少の程度はコントロール群より
も小さいものであり、１４日目以降著しく減少するコン
トロール群に対し、Ｎ群では増加がみられた。

【００６７】生存期間 コントロール群では検体番号３が接種後３１日目、検体
番号４が４３日目、検体番号５が２６日目に死亡してお
り、生存期間の平均は３３．３日である。これに対し、
Ｎ群では検体番号７が２６日、検体番号８が３１日目と
コントロール群との差はみられないが、検体番号６は１
５０日以上生存しており、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種により
発症防御に成功した。

【００６８】ウイルス中和試験（図１５）及びウェス
タンプロット解析 採取した血漿を用いてウイルス中和試験を行った。ｐＣ
ＡＧＧＳ接種群（コントロール群）ではウイルス接種後
１４日目から上昇し始めたが、Ｎ接種群では１８日目か
らウイルス中和抗体価が上昇し始めた。両群とも接種前
には中和抗体は存在しなかった（図１５）。接種前の抗
体価はウエスタンプロットでも検出できなかった。

【００６９】３．ＦＩＰＶ Ｍ遺伝子を用いたＤＮＡワ
クチン（比較例） Ｎ遺伝子と同様にＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされ
たＭ遺伝子を、ｐＣＡＧＧＳに組み込んだ（Ｍ／ｐＣＡ
ＧＧＳ）（図９）。生理食塩水に溶かしたプラスミドＤ
ＮＡをＳＰＦネコの大腿二頭筋に一匹当たり２００μｇ
接種した。さらに２週間間隔で計３回の免疫を行った。
この間、臨床症状はみられなかった。最終免疫より２週
間後に強毒ウイルス株であるＭ９１−２６７株を１×１
０⁶ＰＦＵ／１ｍｌ／１匹に腹腔内接種した。攻撃試験
後の結果を項目別に以下に示す。

【００７０】臨床症状（図１０〜１４，表−２、３） Ｍ群では体重の減少が１０％以上になるのがコントロー
ル群より遅かったが、コントロール群でみられた回復が
Ｍ群ではみられず、またコントロール群での減少が最大
１８％であったのに対し、Ｍ群では最大２２％の減少を
示した（図１１，表−２、３）。体温は検体番号１で
３，５，１０〜２０日目、検体番号２で１０〜１６日目
に４０℃以上の発熱をおこし、コントロール群よりも早
い時期に発熱がおこった（表−２、３参照）。白血球数
はコントロール群で６０００／μｌ以下に減少したのが
３日目であったのに対し、Ｍ群では１０日目以降と遅か
ったが、コントロールでみられた回復がＭ群ではみられ
なかった（図１２、表−２、３）。ヘマトクリット値で
は検体番号１，２共に７〜２１日目に２５％以下に減少
し、コントロールとの差はみられず（図１３，表−２、
３）、また白血球百分比でも、コントロールとの差はみ
られなかった。下痢はみられなかったが、食欲不振は５
日目以降続き、回復することはなかった。沈鬱は検体番
号１で１２日目以降、検体番号２で４日目以降続いた
（表−２、３）。

【００７１】神経症状が初めにおこったのはＭ群の検体
番号２で、１４〜１６日目に後肢のふらつきが、１７，
１９〜２１日目にはそれに加えて発作もみられた。２２
日目には横臥、痙撃し全く動けない状態であった。検体
番号１では１７日目に後肢麻痺、旋回、発作がおこっ
た。以上の臨床症状を表−１に従ってスコア化した結果
（図１０）、接種後３〜７日間はコントロール群よりも
Ｍ群のポイントの方が低いが、１０日目ではＭ群の方が
高くなった。その後、Ｍ群ではコントロール群の平均を
常に上回り、２１日目では有意にコントロール群より高
いポイントを示した（Ｐ＜０．０５）。接種後、２２日
目に検体番号２が、２３日目に検体番号１が死亡したた
め、２４日目のＭ群のポイントが著しく上昇している。
このようにＭ接種群では７日目まで臨床症状の発症が抑
制されているが、その後の上昇はコントロール群より早
かった。

【００７２】 白血球数（図１２） コントロール群で３日目から減少が始まったのに対し
て、Ｍ群では、接種後７日目までは１００００／μｌ以
上を示していた。Ｍ群で減少し始めたのは、１０日目以
降であった。検体番号１では１０日目に４２００／μｌ
まで減少し、その後回復することはなかった。検体番号
２では１０日目に７６００／μｌに減少し、４日目にい
ったん１２５００／μｌに回復したが１８日目には４２
００／μｌに減少した。このようにごく初期の段階では
Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種により白血球数の減少が抑えられ
ている可能性が示されたが、減少し始めてからの減少の
程度はＭ群の方が大きく、またコントロール群では２１
日目に３頭中２頭で６０００／μｌ以上に回復している
のに対してＭ群では回復がみられなかった。

【００７３】 ヘマトクリット値（図１３） コントロール群では接種後３日目に接種前と比べて５％
の減少がみられたが、Ｍ群でも同様に４．５％の減少が
みられた。Ｍ群では７日目に検体番号１，２ともに２５
％以下に減少し、さらに検体番号１が１０日目に、検体
番号２が１４日目に２０％以下となった。検体番号２は
２１日目に２０％に回復したが、検体番号１はさらに減
少が続き、２１日目には１５％まで減少した。Ｍ群では
ヘマトクリット値の減少がコントロール群と同程度にお
こっている。

【００７４】 赤血球数（図１４） コントロール群では接種後３日目から大きく減少した
が、Ｍ群でも同様に接種後３日目には接種前と比較して
１５０×１０⁴／μｌ減少した。コントロール群ではそ
の後一度回復がみられたが、Ｍ群ではその後も減少が続
き、検体番号１では１０日目に４７４×１０⁴／μｌと
なり、２１日目には２５７×１０⁴／μｌに減少した。
検体番号２では１４日目に５５２×１０⁴／μｌに減少
し、その後も６００×１０⁴／μｌ以上に回復すること
はなかった。このように、Ｍ群ではコントロール群でみ
られた一時的な回復がみられなかった。

【００７５】生存期間（表−２，３） コントロール群での生存期間の平均が３３．３日である
のに対して、Ｍ群では検体番号１が２３日、検体番号２
が２２日と１０日も短くなった。これは、Ｍ／ｐＣＡＧ
ＧＳ接種による生存期間の延長はおこらず、かえって死
期を早めたことを示している。 ウイルス中和試験（図１５）及びウエスタンプロッ
ト解析 Ｍ及びコントロール群においては攻撃試験後１４日目か
ら中和抗体の上昇がみられ、コントロール群と比較して
Ｍ群の方がより高い中和抗体価の上昇を示した（図１
５）。またＭ群においては４倍希釈した血清を用いても
攻撃試験前の中和抗体を検出できなかった。接種前の抗
体価はウエスタンプロットでも同様に検出できなかっ
た。なお一連の実験に用いたネコ（検体番号１〜８）
は、病理解剖され、その病理所見より典型的なＦｌＰ症
状を呈して死亡したことを確認した。

【００７６】〔考察〕ＦＩＰＶは、抗体と結合した結
果、感染を増強するＡＤＥ活性を有するため、既存のワ
クチンによる液性免疫の誘導は、かえって感染を増強す
ることになる。このため、ＦＩＰＶに対する防御には細
胞性免疫の誘導が重要となるが、従来のワクチン法で
は、強い細胞性免疫を誘導することは困難であった。そ
こで今回、新しいワクチン法としてＤＮＡワクチンによ
るＦＩＰ発症防御試験を試みた。Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種
群では、臨床スコアの値がコントロール群より低く、体
重変化、白血球数、赤血球数、ヘマトクリット値は、い
ったんは減少したものの３頭中２頭で回復した。

【００７７】また、Ｎ群３頭中１頭は半年以上生存して
おり、体重、体温、血液検査値、食欲等も正常で、ＦＩ
Ｐの発症防御に成功したといえる。さらに、最終的には
死亡したものの、Ｎ群のうちの他の１頭は発症後いった
んは、体重、血液検査値が回復している。これは、今回
のＮ／ｐＣＡＧＧＳ接種によりＦＩＰＶの初期感染が防
御できていたことを示している。一方、Ｎ／ｐＣＡＧＧ
Ｓ接種群での結果とは対照的に、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種
群では臨床スコア、体重、白血球数、赤血球数、ヘマト
クリット値など全てのデータにおいてコントロール群と
有意な差がない、若しくはコントロール群よりも悪化を
示す結果となった。この理由としてＦＩＰＶ構造蛋白Ｍ
がＡＤＥを起こすウイルス側の因子の一つであり、今回
Ｍ／ｐＣＡＧＧＳを接種することによりＦＩＰＶの感染
が増強した可能性が考えられる。しかし、ワクシニアウ
イルスを用いたＭ蛋白の免疫実験では感染防御に成功し
ていることから、Ｍ蛋自に関してはＤＮＡワクチンとし
ては使用できない。

【００７８】ウイルス中和試験の結果より、Ｎ／ｐＣＡ
ＧＧＳ接種群における抗体価の上昇が他の群と比較して
遅かったことは、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種により初期の感
染防御には成功したが、１×１０⁶ＰＦＵという大量の
ウイルスで攻撃したため宿主免疫系によって排除しきれ
なかったウイルスが増殖したために、抗体価の上昇が遅
れたと考えられる。Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群より攻撃前
に回収された血清を用いたウエスタンプロット解析でも
検出できなかったことは、液性免疫より細胞性免疫が主
に感染防御に関与していると考えられる。一方、Ｍ／ｐ
ＣＡＧＧＳ接種群ではウイルス中和抗体価の上昇がコン
トロール群と比較して急激であった。中和抗体価として
は検出できなかったものの、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種によ
り若干の中和抗体の誘導があり、記億免疫が成立してい
たことが示唆される。また、ＤＮＡワクチン接種による
抗体の誘導がＡＤＥ様感染を引き起こした可能性も考え
られる。

【００７９】今回の感染実験において、Ｎ／ｐＣＡＧＧ
Ｓ接種群で完全にはＦＩＰＶ防御が出来なかった理由と
して、１×１０⁶ＰＦＵという大量のウイルスでの攻
撃、腹腔内投与により、生体内への直接的なウイルス
の感染、が挙げられる。これらの結果、ウイルスに対す
る免疫が生じていても、免疫系によるウイルスの排除が
ウイルスの増殖速度に追いつかなかった可能性がある。
しかし、自然界においてはこれほど大量のウイルスが一
度に生体内に感染することは考えにくく、初期感染の防
御に効果があるＦＩＰＶのＮタンパクをコードする遺伝
子を組み込んだＤＮＡワクチンは、自然感染に似た最適
な接種量、接種方法とすることにより、十分効果がある
と考えられる。

【００８０】

【発明の効果】以上に示したことから明らかな様に、本
発明のＤＮＡワクチンは、防御が困難であったＦＩＰＶ
等のコロナウイルス感染症に対して有効に予防／治療で
きる。

【００８１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kyoritsu Shoji Company <120> DNA vaccine against coronavirus infectious disease <130> P-31200 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００８２】 <210> 1 <211> 1131 <212> DNA <213> Feline infectious peritonitis virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1128) <400> 1 atg gcc aca cag gga caa cgc gtc aac tgg gga gat gaa cct acc aaa 48 Met Ala Thr Gln Gly Gln Arg Val Asn Trp Gly Asp Glu Pro Thr Lys 1 5 10 15 aga cgt ggt cgt tct tac tct cgt ggt cgg aag aat aat gat ata cct 96 Arg Arg Gly Arg Ser Tyr Ser Arg Gly Arg Lys Asn Asn Asp Ile Pro 20 25 30 ttg tca ttc tat aac ccc att acc ctt gaa cca gga tca aaa ttt tgg 144 Leu Ser Phe Tyr Asn Pro Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Lys Phe Trp 35 40 45 aac tta tgt ccg aga gat ttt ggt ccc aag gga ata agt aat aag gat 192 Asn Leu Cys Pro Arg Asp Phe Gly Pro Lys Gly Ile Ser Asn Lys Asp 50 55 60 caa caa att ggt tat tgg aac aga caa gcg cgt tac cgc att gtc aaa 240 Gln Gln Ile Gly Tyr Trp Asn Arg Gln Ala Arg Tyr Arg Ile Val Lys 65 70 75 80 ggt cag cgt aag gaa ctt cct gag aga tgg ttc ttc tat ttc tta ggt 288 Gly Gln Arg Lys Glu Leu Pro Glu Arg Trp Phe Phe Tyr Phe Leu Gly 85 90 95 aca gga cct cat gct gat gct aaa ttt aaa gac aaa att gat gga gtc 336 Thr Gly Pro His Ala Asp Ala Lys Phe Lys Asp Lys Ile Asp Gly Val 100 105 110 ttc tgg gtt gca agg gat ggt gcc atg aat aag cca aca aca tta ggc 384 Phe Trp Val Ala Arg Asp Gly Ala Met Asn Lys Pro Thr Thr Leu Gly 115 120 125 act cgt gga acc aac aat gaa tcc aaa cct ttg aaa ttt gat ggt aag 432 Thr Arg Gly Thr Asn Asn Glu Ser Lys Pro Leu Lys Phe Asp Gly Lys 130 135 140 ata cca cct caa ttt caa ctt gaa gtg aat cgg tct aga aac aat tca 480 Ile Pro Pro Gln Phe Gln Leu Glu Val Asn Arg Ser Arg Asn Asn Ser 145 150 155 160 aga act ggt tgt caa tct aga tct gtc tca aga aac agg tct caa tcc 528 Arg Thr Gly Cys Gln Ser Arg Ser Val Ser Arg Asn Arg Ser Gln Ser 165 170 175 aga gga aga caa caa tcc aat gac caa aat aat gtt gag gat aca att 576 Arg Gly Arg Gln Gln Ser Asn Asp Gln Asn Asn Val Glu Asp Thr Ile 180 185 190 gta gct gtg ctt caa aaa tta ggt gtt act gat aag caa agg tca cgt 624 Val Ala Val Leu Gln Lys Leu Gly Val Thr Asp Lys Gln Arg Ser Arg 195 200 205 tct aaa tca aga gac cgt agt gat tcc aag tcc agg gat aca aca cct 672 Ser Lys Ser Arg Asp Arg Ser Asp Ser Lys Ser Arg Asp Thr Thr Pro 210 215 220 aag aac gcc aac aaa cac acc tgg aag aaa act gca ggt aag gga gat 720 Lys Asn Ala Asn Lys His Thr Trp Lys Lys Thr Ala Gly Lys Gly Asp 225 230 235 240 gtg aca aat ttc tat ggt gct aga agt gct tca gct aac ttt ggt gat 768 Val Thr Asn Phe Tyr Gly Ala Arg Ser Ala Ser Ala Asn Phe Gly Asp 245 250 255 agt gat ctc gtt gcc aat ggt aac gct gcc aaa tgc tac cct cag ata 816 Ser Asp Leu Val Ala Asn Gly Asn Ala Ala Lys Cys Tyr Pro Gln Ile 260 265 270 gct gag tgt gtt cca tca gtg tct agc atg ctc ttt ggc agt caa tgg 864 Ala Glu Cys Val Pro Ser Val Ser Ser Met Leu Phe Gly Ser Gln Trp 275 280 285 tct gct gaa gag gct ggt gat caa gtg aaa gtc aca ctt act cac acc 912 Ser Ala Glu Glu Ala Gly Asp Gln Val Lys Val Thr Leu Thr His Thr 290 295 300 tac tac ctg cca aaa gat gat gcc aaa acc agc caa ttc cta gaa cag 960 Tyr Tyr Leu Pro Lys Asp Asp Ala Lys Thr Ser Gln Phe Leu Glu Gln 305 310 315 320 att gac gct tac aag cga cct tct cag gtg gct aag gat cag agg caa 1008 Ile Asp Ala Tyr Lys Arg Pro Ser Gln Val Ala Lys Asp Gln Arg Gln 325 330 335 aga aaa tct cgt tct aag tct gct gat aag aag cct gag gaa ttg tct 1056 Arg Lys Ser Arg Ser Lys Ser Ala Asp Lys Lys Pro Glu Glu Leu Ser 340 345 350 gta act ctt gtt gag gca tac aca gat gtg ttc gat gac aca cag gtt 1104 Val Thr Leu Val Glu Ala Tyr Thr Asp Val Phe Asp Asp Thr Gln Val 355 360 365 gag atg att gat gag gtt acg aac taa 1131 Glu Met Ile Asp Glu Val Thr Asn 370 375

【００８３】 <210> 2 <211> 376 <212> PRT <213> Feline infectious peritonitis virus <400> 2 Met Ala Thr Gln Gly Gln Arg Val Asn Trp Gly Asp Glu Pro Thr Lys 1 5 10 15 Arg Arg Gly Arg Ser Tyr Ser Arg Gly Arg Lys Asn Asn Asp Ile Pro 20 25 30 Leu Ser Phe Tyr Asn Pro Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Lys Phe Trp 35 40 45 Asn Leu Cys Pro Arg Asp Phe Gly Pro Lys Gly Ile Ser Asn Lys Asp 50 55 60 Gln Gln Ile Gly Tyr Trp Asn Arg Gln Ala Arg Tyr Arg Ile Val Lys 65 70 75 80 Gly Gln Arg Lys Glu Leu Pro Glu Arg Trp Phe Phe Tyr Phe Leu Gly 85 90 95 Thr Gly Pro His Ala Asp Ala Lys Phe Lys Asp Lys Ile Asp Gly Val 100 105 110 Phe Trp Val Ala Arg Asp Gly Ala Met Asn Lys Pro Thr Thr Leu Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Thr Asn Asn Glu Ser Lys Pro Leu Lys Phe Asp Gly Lys 130 135 140 Ile Pro Pro Gln Phe Gln Leu Glu Val Asn Arg Ser Arg Asn Asn Ser 145 150 155 160 Arg Thr Gly Cys Gln Ser Arg Ser Val Ser Arg Asn Arg Ser Gln Ser 165 170 175 Arg Gly Arg Gln Gln Ser Asn Asp Gln Asn Asn Val Glu Asp Thr Ile 180 185 190 Val Ala Val Leu Gln Lys Leu Gly Val Thr Asp Lys Gln Arg Ser Arg 195 200 205 Ser Lys Ser Arg Asp Arg Ser Asp Ser Lys Ser Arg Asp Thr Thr Pro 210 215 220 Lys Asn Ala Asn Lys His Thr Trp Lys Lys Thr Ala Gly Lys Gly Asp 225 230 235 240 Val Thr Asn Phe Tyr Gly Ala Arg Ser Ala Ser Ala Asn Phe Gly Asp 245 250 255 Ser Asp Leu Val Ala Asn Gly Asn Ala Ala Lys Cys Tyr Pro Gln Ile 260 265 270 Ala Glu Cys Val Pro Ser Val Ser Ser Met Leu Phe Gly Ser Gln Trp 275 280 285 Ser Ala Glu Glu Ala Gly Asp Gln Val Lys Val Thr Leu Thr His Thr 290 295 300 Tyr Tyr Leu Pro Lys Asp Asp Ala Lys Thr Ser Gln Phe Leu Glu Gln 305 310 315 320 Ile Asp Ala Tyr Lys Arg Pro Ser Gln Val Ala Lys Asp Gln Arg Gln 325 330 335 Arg Lys Ser Arg Ser Lys Ser Ala Asp Lys Lys Pro Glu Glu Leu Ser 340 345 350 Val Thr Leu Val Glu Ala Tyr Thr Asp Val Phe Asp Asp Thr Gln Val 355 360 365 Glu Met Ile Asp Glu Val Thr Asn 370 375

【００８４】 <210> 3 <211> 870 <212> DNA <213> Feline infectious peritonitis virus <220> <221> CDS <222> (1)..(867) <400> 3 atg cat atg atg cct ata aga att tca tgc gaa tta aag cat aca acc 48 Met His Met Met Pro Ile Arg Ile Ser Cys Glu Leu Lys His Thr Thr 1 5 10 15 ccg acg aag cac tcc ttg ttt gaa cta aac aaa atg aag att ttg tta 96 Pro Thr Lys His Ser Leu Phe Glu Leu Asn Lys Met Lys Ile Leu Leu 20 25 30 gtg tta gcg tgt gca att gca tgc gca tgt ggt gaa cgt tat tgc gct 144 Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Cys Ala Cys Gly Glu Arg Tyr Cys Ala 35 40 45 atg aaa tct gat tca gat act tca tgt cgc aat agt act act aat gat 192 Met Lys Ser Asp Ser Asp Thr Ser Cys Arg Asn Ser Thr Thr Asn Asp 50 55 60 tgt gat tca tgc ttc aac gga ggt gac ctt att tgg cat ctt gct aac 240 Cys Asp Ser Cys Phe Asn Gly Gly Asp Leu Ile Trp His Leu Ala Asn 65 70 75 80 tgg aac ttc agc tgg tct gta ata ttg att gtt ttt ata aca gtg tta 288 Trp Asn Phe Ser Trp Ser Val Ile Leu Ile Val Phe Ile Thr Val Leu 85 90 95 caa tat gga aga ccg caa ttt agc tgg ttc gtt tat ggc att aaa atg 336 Gln Tyr Gly Arg Pro Gln Phe Ser Trp Phe Val Tyr Gly Ile Lys Met 100 105 110 ctg atc atg tgg cta tta tgg cct att gtt cta gcg ctt acg att ttt 384 Leu Ile Met Trp Leu Leu Trp Pro Ile Val Leu Ala Leu Thr Ile Phe 115 120 125 gat gca tac tct gag tac cag gtt tcc aga tat gta atg ttc ggc ttt 432 Asp Ala Tyr Ser Glu Tyr Gln Val Ser Arg Tyr Val Met Phe Gly Phe 130 135 140 agt gtt gca ggt gca gtt gta acg ttt gca ctt tgg atg atg tat ttt 480 Ser Val Ala Gly Ala Val Val Thr Phe Ala Leu Trp Met Met Tyr Phe 145 150 155 160 gtg aga tct att cag tta tat aga agg acc aaa tca tgg tgg tct ttt 528 Val Arg Ser Ile Gln Leu Tyr Arg Arg Thr Lys Ser Trp Trp Ser Phe 165 170 175 aat cct gag act aat gca att ctt tgt gtt aat gta ttg ggt aga agc 576 Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Val Asn Val Leu Gly Arg Ser 180 185 190 tat gtt ctt cct ctt gat ggt aca cct acg ggt gtt act ctt act cta 624 Tyr Val Leu Pro Leu Asp Gly Thr Pro Thr Gly Val Thr Leu Thr Leu 195 200 205 ctc tca gga aat tta tat gct gaa ggc ttt aaa atg tct ggt ggc ctt 672 Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Glu Gly Phe Lys Met Ser Gly Gly Leu 210 215 220 acc atc gat cat ttg cct aaa tat gtc atg att gct aca cct agt aga 720 Thr Ile Asp His Leu Pro Lys Tyr Val Met Ile Ala Thr Pro Ser Arg 225 230 235 240 acc atc gtc tac aca tta gtt ggg aaa caa tta aaa gca act act gct 768 Thr Ile Val Tyr Thr Leu Val Gly Lys Gln Leu Lys Ala Thr Thr Ala 245 250 255 aca gga tgg gct tac tat gta aaa tct aaa gct ggt gat tac tca aca 816 Thr Gly Trp Ala Tyr Tyr Val Lys Ser Lys Ala Gly Asp Tyr Ser Thr 260 265 270 gaa gca cgt act gat aat ttg agt gaa cat gaa aaa tta tta cat atg 864 Glu Ala Arg Thr Asp Asn Leu Ser Glu His Glu Lys Leu Leu His Met 275 280 285 gtg taa 870 Val

【００８５】 <210> 4 <211> 289 <212> PRT <213> Feline infectious peritonitis virus <400> 4 Met His Met Met Pro Ile Arg Ile Ser Cys Glu Leu Lys His Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Lys His Ser Leu Phe Glu Leu Asn Lys Met Lys Ile Leu Leu 20 25 30 Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Cys Ala Cys Gly Glu Arg Tyr Cys Ala 35 40 45 Met Lys Ser Asp Ser Asp Thr Ser Cys Arg Asn Ser Thr Thr Asn Asp 50 55 60 Cys Asp Ser Cys Phe Asn Gly Gly Asp Leu Ile Trp His Leu Ala Asn 65 70 75 80 Trp Asn Phe Ser Trp Ser Val Ile Leu Ile Val Phe Ile Thr Val Leu 85 90 95 Gln Tyr Gly Arg Pro Gln Phe Ser Trp Phe Val Tyr Gly Ile Lys Met 100 105 110 Leu Ile Met Trp Leu Leu Trp Pro Ile Val Leu Ala Leu Thr Ile Phe 115 120 125 Asp Ala Tyr Ser Glu Tyr Gln Val Ser Arg Tyr Val Met Phe Gly Phe 130 135 140 Ser Val Ala Gly Ala Val Val Thr Phe Ala Leu Trp Met Met Tyr Phe 145 150 155 160 Val Arg Ser Ile Gln Leu Tyr Arg Arg Thr Lys Ser Trp Trp Ser Phe 165 170 175 Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Val Asn Val Leu Gly Arg Ser 180 185 190 Tyr Val Leu Pro Leu Asp Gly Thr Pro Thr Gly Val Thr Leu Thr Leu 195 200 205 Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Glu Gly Phe Lys Met Ser Gly Gly Leu 210 215 220 Thr Ile Asp His Leu Pro Lys Tyr Val Met Ile Ala Thr Pro Ser Arg 225 230 235 240 Thr Ile Val Tyr Thr Leu Val Gly Lys Gln Leu Lys Ala Thr Thr Ala 245 250 255 Thr Gly Trp Ala Tyr Tyr Val Lys Ser Lys Ala Gly Asp Tyr Ser Thr 260 265 270 Glu Ala Arg Thr Asp Asn Leu Ser Glu His Glu Lys Leu Leu His Met 275 280 285 Val

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎ遺伝子のアミノ酸配列を基にした系統樹を示
す図である。

【図２】Ｍ遺伝子のアミノ酸配列を基にした系統樹を示
す図である。

【図３】Ｎ／ｐＣＡＧＧＳの制限酵素切断電気泳動写真
を示す図である。

【図４】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の臨床スコアの変化を示
す図である。

【図５】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の体重変化を示す図であ
る。

【図６】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の白血球数変化を示す図
である。

【図７】ＦＩＰＶ接種後のＮ群のヘマトクリット値変化
を示す図である。

【図８】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の赤血球数変化を示す図
である。

【図９】Ｍ／ｐＣＡＧＧＳの制限酵素切断電気泳動写真
を示す図である。

【図１０】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の臨床症状スコアの変
化を示す図である。

【図１１】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の体重変化を示す図で
ある。

【図１２】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の白血球数変化を示す
図である。

【図１３】ＦＩＰＶ接種後のＭ群のヘマトクリット値変
化を示す図である。

【図１４】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の赤血球数変化を示す
図である。

【図１５】ウイルス中和抗体価を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA20 DA02 EA04 FA02 GA11 GA18 HA17 4C084 AA13 NA01 ZC611 ZC612 4C085 AA03 BA71 GG03

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌク
   レオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡを含み、該
   タンパク質を適用動物内で発現させることができる発現
   ベクターと、生理食塩水とを含むことを特徴とするコロ
   ナウイルス感染症に対するＤＮＡワクチン。
2. 【請求項２】 ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌク
   レオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡが、 配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有するか、あ
   るいは配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列との相同
   性が９５％以上であり、適用動物に対して免疫を付与で
   きるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配
   列を有することを特徴とする請求項１に記載のコロナウ
   イルス感染症に対するＤＮＡワクチン。
3. 【請求項３】 ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌク
   レオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡが、配列表
   の配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴と
   する請求項１に記載のコロナウイルス感染症に対するＤ
   ＮＡワクチン。