KR100502008B1

KR100502008B1 - 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR100502008B1
Application number: KR10-2003-0027069A
Authority: KR
Inventors: 박봉균; 오진식; 송대섭
Original assignee: 녹십자수의약품(주); 박봉균
Priority date: 2003-04-29
Filing date: 2003-04-29
Publication date: 2005-07-18
Also published as: KR20040092760A

Abstract

본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주 (수탁번호 KCCM-10474) 및 치료학적으로 유효한 양의 상기 바이러스와 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주는 백신으로 사용하는 경우, 안전성, 안정성 및 면역원성이 우수하고, 용이하게 검출할 수 있으며, 경구투여에 의하여도 면역을 유발할 수 있다는 장점이 있다.

Description

약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법{A attenuated porcine epidemic diarrhrea virus, an immunogenic composition comprising the same and a method for detecting the virus}

본 발명은 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는 유행성설사병 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 유행성설사병 바이러스의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.

돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)(porcine epidemic diarrhea virus)는 코로나비리대 과(Coronaviridae family)의 일원으로서, 막(envelop)이 있는 단일가닥 RNA 바이러스이며, 돼지에 있어서 심한 장관 설사병(diarrhea)을 야기하여 아시아에서 심한 경제적 손실을 초래하고 있다. PEDV 관련 증상으로는, 설사(diarrhea), 거식증(anorexia) 및 피레미아(pyremia)가 있다.

PEDV는 스파이크(S), 막(M), 작은 막(sM), ORF3와 뉴클레오캡시드(N) 유전자로 이루어지고, 이들 모두는 서열분석되었다 (Bridgen A 등, J. Gen. Virol. 1993; 74: 1795∼1804; Duarte M 등, J. Gen. Virol. 1994; 75: 1195∼1200). 야생형 PEDV를 세포 배양에 적응시키면 야생형 바이러스의 독성이 감소하는데, 이는 ORF3 산물이 상실되는 것과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Bridgen A 등, Adv. Exp. Med. Biol. 1998; 101: 781∼786; Tobler K 등, Adv. Exp. Med. Biol. 1995; 86: 541∼542 ). 베로 세포에서 연속 계대배양된 PEDV를 자돈(piglet)에 접종하였을 때, 질병이 약화되는 것이 알려져 있다 (Kweon CH 등, Vaccine 1999; 17: 2546∼2553).

유행성설사병을 예방 또는 치료하기 위하여 PEDV 약독화주가 백신으로서 개발된 바 있다. 이러한 약독화 백신의 예로는 현재 시판중인 KPEDV9 주(KCTC 8641P) (예를 들면, 한국미생물(주))가 있다. 한국특허공개번호 특1996-023048호는 상기 KPEDV9에 대하여 개시하고 있다. 상기 특허문헌에 의하면, KPEDV9는 유행성 설사병으로 폐사한 6일령 자돈의 소장 및 장으로부터 바이러스를 분리하고, 이를 베로 세포(ATCC C1008)에서 증식시키고, 4∼5일 간격으로 약 90회 이상 연속 계대배양을 실시하여 약독화시킨 균주로서, 안전하면서도 이를 접종 받은 돼지에서 면역을 유도한다.

그러나, 상기 KPEDV9 균주를 실제 백신으로 사용하는 경우, 근육을 통하여 투여하여야 한다. 실제 시판중인 KPDEV9의 제품 사양에는 근육주사하도록 지시하고 있으며, 경구 투여에 대하여는 전혀 언급하지 않고 있다. 근육 투여 백신에 비하여, 경구투여 백신은 장내의 GALP(Gut Associated Lymphoid Tissue)를 자극하여 효과적인 면역을 유도하도록 하는 형태의 백신이다. 백신이 투여되었을 경우, 면역기관에서 항체 및 면역세포가 활성화되어 혈액을 통하여 목적 장기로 전달되는 근육투여 백신과는 달리, 상기 경구투여백신은 목적 장기에 곧바로 전달되어 작용한다는 장점이 있다. 그러나, 이러한 경구 투여 백신은 투여되었을 경우, 위산에 의하여 불활성화되지 않을 정도로 산에 강하여야 하고, 소화효소에 대한 저항성을 가지고 있어야 한다. 이러한 경구 투여 백신의 유효성은 투여된 개체로부터 배출되는 배설물 중에 바이러스가 배출이 되는 경우, 경구투여 백신으로서 사용가능성이 있다고 추정할 수 있다.

상기 KPEDV9 백신은 또한, 실제 모돈에 투여하였을 경우 자돈의 보호비율이 낮은 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 균주를 백신으로서 사용한 경우, 면역학적 분석 방법이외에 간단하게 검출할 수 있는 분석 방법이 없어, 면역화 과정의 분석이나 분자 생물학적 연구가 효율적이지 못한 점이 있었다.

이에 본 발명자들은 면역학적인 방법 뿐만 아니라, 보다 용이한 방법으로 검출할 수 있으면서도, 백신으로서 사용하는 경우 안전성, 안정성 및 면역원성이 향상되고, 경구 투여가 가능한 약독화 PEDV를 얻고자 집중적인 연구를 수행한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 안전성, 안정성 및 면역원성이 향상되고, 경구 투여에 의하여도 면역을 유도할 수 있고, 검출이 용이한 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 약독화된 유행성설사병 바이러스를 포함하는 유행성설사병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스를 용이하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주를 제공한다. 상기 바이러스는 PEDV DR13(수탁번호 KCCM-10474)인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 바이러스는 돼지 유행성 설사병(PED)(porcine epidemic diarrhea)에 걸린 포유돈으로부터 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)(porcine epidemic diarrhea virus) DR13 주를 분리하고, 이를 베로 세포(Vero cell)에서 최대 100회까지 연속 계대배양하여 얻었다. 상기 바이러스는 면역원성이 높으면서도, 병원성을 전혀 갖지 않는 특성을 갖는다. 또한, 돼지에 상기 바이러스를 경구 투여하였을 경우에도 면역을 유도할 수 있으며, 모돈에 투여한 경우 자돈이 80% 이상 보호되는 특성을 가지고 있다.

본 발명은 또한, 치료학적으로 유효한 양의 돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주 (수탁번호 KCCM-10474) 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 조성물를 제공한다. 상기 조성물의 투여량은 돼지 두당 10⁷∼10⁸ TCID₅₀, 바람직하기로는 10^6.5∼10 ^7.5TCID₅₀ 인 것이다. 상기 조성물은 액제, 주사제, 정제, 및 캅셀제의 형태가 될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 액제의 경우, 바람직하기로는 모돈에 백신 접종하는 경우 경구를 통하여 2회 투여하고, 그 시기는 분만 4주전 및 2주전에 투여할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체에는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있으며, 구체적으로는 부형제로서 미결정셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일 수소 칼슘 등, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(수탁번호 KCCM-10474)의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(수탁번호 KCCM-10474) 유래의 ORF3 DNA를 포함하는 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료를 제한 효소 Hind III과 Xho II로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제한효소로 처리하고 얻어지는 DNA 단편을 검출하여 RFLP 패턴을 얻는 단계; 및

(c) 상기 RFLP 패턴을 동일한 제한효소로 처리하고 얻어지는 DNA 단편을 검출하여 얻어진 표준 돼지 유행성 설사병 바이러스 유래의 ORF3 DNA의 RFLP 패턴과 비교하는 단계.

상기 방법은 예를 들면, 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 (수탁번호 KCCM-10474)의 RNA를 주형으로 RT-PCR을 통하여 ORF3 DNA를 얻고, 상기 DNA를 제한 효소 Hind III 또는 Xho II로 처리하여 전기영동하여 RFLP 패턴을 얻고, 얻어진 RFLP 패턴을 표준 돼지 유행성 설사병 바이러스의 RFLP 패턴과 비교하여 상기 바이러스의 존재를 검출하는 것이다. 여기서, 서열번호4의 ORF 3-2 리버스 프라이머를 이용하여 역전사 반응을 수행하고, 서열번호 3과 4의 ORF3-1 포워드 및 ORF 3-2 리버스 프라이머를 이용하여 PCR하여 얻어진 ORF3 DNA는 약 883bp 단편으로서, 바이러스의 RFLP 패턴은 Hind III로 처리하였을 경우, 표준 바이러스가 약 471, 183 및 179bp의 래더가 나타나지만, 본 발명의 약독화된 바이러스의 경우, 650 및 183bp의 두개의 단편만이 나타난다. 또한, Xho II로 처리하였을 경우, 표준 바이러스가 약 833bp의 하나의 래더가 나타나지만, 본 발명의 약독화된 바이러스의 경우, 563 및 270bp의 두개의 단편이 나타난다. 본 발명의 방법에 사용되는 "ORF3 DNA"는 단순히 ORF3 유전자에 해당하는 서열만을 의미하는 것이 아니고, 연속 계대배양에 의하여 상기 ORF3 유전자에서 제거된 Hind III 또는 새롭게 도입된 Xho II 제한부위를 포함하는 DNA 단편으로서, ORF3 유전자에 인접하는 서열도 포함할 수 있다. 제한 효소처리 및 전기영동에 의하여 얻어지는 RFLP 패턴은 프라이머 디자인에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 프라이머 디자인은 통상적인 DNA 조작 기술을 통하여 행하여질 수 있는 것이므로 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 단편의 검출은 통상적으로는 전기영동을 통하여 이루어지나, 다른 검출 수단에 의하여서도 행하여질 수 있다. 예를 들면, 상기 단편을 형광으로 표지한 다음, 형광 검출기로 검출함으로써 이루어질 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예에 사용된 연속 베로 세포 주(ATCC, CCL-8)는 5% 우태아 혈청, 페니실린(100 유니트/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 및 암포테리신 B(0.25㎍/ml)로 보충된α-MEM(α-minimum essential medium)에 규칙적으로 유지하였다. 세포 약독화된 PEDV인 KPEDV9주는 한국 녹십자 수의 약품사로부터 제공받았다.

실시예1 : 세포 배양을 이용한 PEDV의 분리 및 계대

유행성설사병(PED)에 감염된 것으로 추정되는 포유자돈(suckling pig)으로부터 얻은 49개의 소화관 가검물 시료를 완충 용액(PBS; 0.1M, pH 7.2)에 균질화하여 10%(v/v) 유제액(suspension)으로 만들었다. 상기 유제액을 격렬하게 섞고, 4800xg에서 10분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. 0.2㎛ 시린지 필터(Acrodisk, Gelman)를 통과한 상등액을 베로 세포에서의 바이러스 분리에 사용하였다. 상기 상등액을 접종하기 전에, 25cm² 플라스크(Falcon, 미국)에서 자란 밀집(confluent) 세포의 성장 배지를 제거하고, PBS로 세번 세척하였다. 플라스크 당 상등액 1ml를 세포에 접종하였다. 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 후, 0.02% 효모 추출물, 0.3% 트립토우즈 포스페이트 브로쓰, 및 트립신 2㎍으로 보충된 α-MEM 에 상기 세포를 배양하였다. 그 결과, 49개의 시료 중에서 세포변성효과(CPE) (cytopahtic effec)를 일으키는 10개 시료를 1차로 선별하고, 이를 다시 베로 세포에 접종하여 연속적으로 약 70%∼80%의 세포변성효과를 나타내는 PEDV를 분리하고, 이를 PEDV DR13주로 명명하고, 연속 계대배양의 모주로 사용하였다.

또한, 상기 DR13 주는 세포변성효과 뿐만 아니라, PEDV 특이적인 프라이머(서열번호1 및 서열번호2)를 이용한 RT-PCR 분석법(Kim 등, J.Vet. Diagn. Invest. 2001; 13: 516∼520)을 통하여도 PEDV(약 651bp PCR 산물 생성)임을 확인하였다. 상기 프라이머는 병원성을 일으키는 것으로 알려진 PEDV의 S 유전자를 표적으로 하고, 설사병이 유행하는 양돈장에서 함께 진단되는 전염성위장염을 일으키고, PEDV와 동일한 코로나비리대 과에 속하는 TGEV (transmissible gastroenteritis virus)를 분별하여 검출할 수 있도록 고안된 것이다. 먼저, 서열번호2의 리버스 프라이머를 이용한 역전사 반응을 통하여, 상보적 DNA를 제조하였다. PCR 반응은 열순환기(thermal cycler)(Perkin-Elmer, Applied Biosystems 사, Foster city, 미국)에서 3-단계 과정에 의하여 이루어졌다. 시료는 다음으로 구성되는 프로그램에 의하여 증폭하였다: 94℃에서 5분동안 배양; 94℃에서 30초 변성; 55℃에서 30초 어닐링; 및 72℃에서 30초 연장을 5회; 그리고, 94℃에서 30초 변성; 53℃에서 30초 어닐링; 및 72℃에서 30초 연장을 30회 반복하되 각 회마다 1초씩 늘림. 마지막으로, 시료를 72℃에서 7분 동안 유지한 다음, 차갑게 하여 반응을 완료시켰다.

실시예2 : 분리된 PEDV의 연속 계대배양을 통한 약독화

실시예1에서 분리된 DR13 주를 실시예1과 동일하게 25cm²에서 베로 세포에서 100회까지 연속 계대배양하였다. 계대는 접종후 약 5일 간격으로 하였다. 접종 72시간 후, 세포 융합 및 합포체 형성(syncytial formation)이 일어난 다음, 세포 파괴가 일어나는 세포변성효과가 관찰되었다.

1. 계대별 PEDV 역가 분석

각 5회 계대 마다 Reed와 Muench 법을 이용하여 PEDV의 역가를 측정하였다 (Kusanagi K 등, J. Vet. Med. Sci. 1992; 54(2): 303∼318). 역가분석은 베로 세포를 가지고, 96웰 마이크로플레이트를 이용하였다. 바이러스 배양물을 트립신을 함유하는 바이러스 증식 배지로 10배씩 연속 희석하였다. 마이크로플레이트의 밀집 베로 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.1ml/웰로 5개의 웰에 접종하였다. 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 후, 접종물을 제거하고, PBS로 3회 세척하였다. 다음으로, 신선한 트립신 함유 바이러스 증식 배지 0.1ml를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 5일 동안 더 배양하였다. 50% 조직배양 감염량(50% tissue culture infective dose (TCID₅₀)은 세포변성효과를 나타내는 최대 바이러스 희석배수의 역수로 나타낸다.

도1은 5회 계대 간격으로 측정된 PEDV 역가를 나타내는 도면이다. 도1에 나타낸 바와 같이, DR13 모주의 TCID₅₀/0.1ml은 10^2.2이고, 바이러스의 역가는 55 회 계대에서 정점을 이룬후, 10^5.0내지 10^6.0에서 유지된다. 즉, 55 회 계대 이후에는 세포 적응(cell adaptation)이 이루어졌다는 것을 의미한다.

2. 계대별 RT-PCR에 의한 PEDV 확인

또한, 0, 1, 30, 60, 90 및 100회 계대에서 실시예1에서 나타낸 S 유전자 특이적인 RT-PCR과 ORF3 특이적인 RT-PCR를 통하여 PEDV를 확인하였다.

도2는 S 유전자 특이적인 RT-PCR를 통한 PEDV 확인 결과를 나타내는 도면이다. 도2에 나타낸 바와 같이, KPEDV9 뿐만 아니라, 약독화중인 DR13에 대하여도 S 유전자 특이적 PCR 산물(약 651bp) 밴드를 확인할 수 있었다. 도2에서, M : 분자 마커, 레인1: 양성 대조군(시판중인 KPEDV9), 레인2: 음성 대조군, 레인3-8: 0, 1, 30, 60, 90 및 100회 계대한 DR13주이다.

도3은 ORF3 유전자 특이적인 RT-PCR를 통한 PEDV 확인 결과를 나타내는 도면이다. 도3에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군(시판 KPEDV9) 뿐만 아니라, 약독화중인 DR13에 대하여도 ORF3 유전자 특이적 PCR 산물(약 833bp) 밴드를 확인할 수 있었다. 도3에서, M : 분자 마커, 레인1: 양성 대조군(시판 KPEDV9), 레인2: 음성 대조군, 레인3-11: 0, 1, 30, 60, 70, 75, 85, 90, 및 100회 계대한 DR13주이다.

여기서, ORF3 유전자 특이적인 RT-PCR은 ORF3 유전자를 포함하는 S 및 sM 유전자의 공개된 서열에 기초하여 디자인한 ORF3-1(포워드)과 ORF3-2(리버스)(서열번호3 및 서열번호4)를 프라이머로 사용하였다. 예상되는 PCR 산물의 크기는 약 833bp이다. 역전사 반응은 ORF3-2를 사용하여 이루어졌다. PCR 반응은 실시예1에 기재한 S 유전자 특이적인 PCR과 동일한 방법으로 수행하였다.

3. ORF3 서열분석 및 RFLP 분석

(1) ORF3 서열분석

상기2에서 기재한 방법에 따라 증폭된 ORF3 유전자 단편(각 3회 반복 증폭함)을 1.5% 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 분리하고, 각 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction 키트 (Qiagen 사, 독일)를 사용하여 매뉴얼에 따라 정제한 다음, PCR 프라이머 (ORF3-1과 ORF3-2)를 사용하여 FS Dye Primer 키트 (Perkin-Elmer, Applied Biosystem 사)로 양방향으로 서열분석하고, ABI 373 자동화 시퀀서(Perkin-Elmer, Applied Biosystem 사)로 확인하였다. 20, 40, 60, 80 및 100회 계대의 ORF3 유전자를 서열분석하였고, 이를 BCM search launcher Multiple Sequence Alignment Program(Human Genome Sequencing center, Houston, TX, 미국)을 사용하여 Genbank에 공지된 표준주 PEDV CV777의 ORF3 서열(accession 번호: Z24733)과 정렬하였다.

도4a, 4b와 4c는 계대별 PEDV ORF3 부분의 서열분석 결과를 표준주 및 모주의 서열과 정열하여 나타낸 것이다. 도4a, 4b와 4c에서 나타낸 바와 같이, 100회 계대 PEDV DR13의 ORF3 서열 (서열번호5)은 모주에 비하여 여러 개의 결실 또는 치환과 같은 돌연변이를 가지고 있다. 구체적으로는, 7개의 뉴클레오티드 서열 변이와 2개의 결실이 발견되었다. 또한, 모주 DR13의 경우, 2개의 제한 효소 Hind III (밑줄로 표시) 인지부위가 있는 반면, 100회 계대 PEDV DR13 ORF3 서열에는 하나만 존재하고, 모주 DR13에는 없는 Xho II (상자로 표시) 인지 부위가 새로 도입되었다. 이는 RFLP 법을 이용하여 본 발명의 약독화 PEDV를 다른 PEDV주로부터 용이하게 분별할 수 있다는 것을 암시한다. 도4a, 4b와 4c에서, CV777: 표준 균주, 필드(Field): 모주인 DR13 주, P(20),P(40), P(60),P(80),P(100); 각각 20, 40, 60, 80 및 100회 계대를 거친 PEDV DR13을 나타낸다.

(2) ORF3의 RFLP 분석

계대별 PEDV DR13, 100회 계대 PEDV DR13와 이전에 RT-PCR에 의하여 알려진 12개 PEDV 주에 대하여, ORF3 유전자를 RT-PCR을 통하여 증폭하고, 증폭된 ORF3 단편(약 833bp)에 대하여 RFLP분석을 하였다.

각 계대별 PEDV DR13을 Hind III과 Xho II를 이용하여 RFLP 분석을 수행한 결과, Hind III의 경우 75회 계대부터 Hind III의 RFLP 패턴이 달라지기 시작하였으며, Xho II의 경우 90회 계대부터 RFLP 패턴이 달리지기 시작하였다. 도5는 Hind III를 이용한 계대별 PEDV DR13 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다. 도5에 나타낸 바와 같이, 낮은 계대수에서는 471, 183 및 179bp 단편이 생성되었으나, 75회 계대 이후에서는 650과 183bp의 두개의 단편이 생성되었다. 상기 183 및 179bp 단편은 아가로즈 겔 전기영동에서는 겹쳐 있다. 도5에서, M: 분자량 마커, 레인1: 시판중인 KPEDV9, 레인2: 음성 대조군(mock-infected), 레인3-10: 0, 1, 30, 60, 70, 75, 85, 및 100회 계대한 DR13주이다.

도6은 Xho II를 이용한 계대별 PEDV DR13 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다. 도6에 나타낸 바와 같이, 90 회 계대 이전에는 833bp 단편이 생성되었으나, 90회 계대 이후에서는 563과 270bp의 두개의 단편이 생성되었다. 도6에서, M: 분자량 마커, 레인1: 시판중인 KPEDV9, 레인2: 음성 대조군(mock-infected), 레인3-11: 0, 1, 30, 60, 70, 75, 85, 90, 및 100회 계대한 DR13주이다.

다음으로, 도7은 Hind III를 이용한 여러 PEDV 주 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이고, 도8는 Xho II를 이용한 여러 PEDV 주 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다. 그 결과, 종래 알려진 12개의 PEDV 분리주는 도5 및 6에 나타낸 바와 같은 낮은 계대수의 PEDV DR13와 동일한 RFLP 패턴을 나타내었다. 도7 및 도8에서, M: 분자량 마커(100bp 래더), 레인1: 100회 계대의 DR13, 레인2: DR13 모주, 레인3: 음성 대조군, 레인4-15: PEDV 분리주로서 각각 DR11, B409, DR183, B640, DR195, GC2, B719, 1101, KJY1, KJY2, B720, 및 DH1이다. 그 결과, RFLP 패턴 분석을 통하여 본 발명의 약독화된 PEDV DR13을 분별할 수 있음을 확인하였다.

실시예3 : 약독화 PEDV DR13의 특성 분석

1. 초유를 먹지 않은 자돈에서의 병원성 유발여부의 검사

초유를 먹지 않은 1일령 돼지에 DR13, 75와 100회 계대의 DR13을 각각 접종하여 병원성을 검사하였다. 사용된 자돈의 수는 그룹별로 각각 5마리이고, 5ml(10^5.8 TCID₅₀/0.1ml)의 바이러스를 구강을 통하여 1회 투여하였다. 음성 대조군에는, 초유를 먹지 않은 1일령 돼지 1마리에 α-MEM 배지(minimal essential media) 5ml를 접종하였다. 바이러스 투여후 24시간 간격으로 분변을 채취하고, 실시예1에 기재한 S 유전자 특이적 RT-PCR을 실시하여, 바이러스의 배출유무를 확인하고, 매일 임상증상을 모니터링하였다.

그 결과를 표1에 나타내었다. 표1에 나타낸 바와 같이, DR13을 투여한 그룹에서는 3일이내에 심한 설사와 탈수로 모든 돼지가 폐사하였으나, 75와 100회 계대의 DR13을 투여한 그룹에서는 여전히 생존하였다. 따라서, 자돈이 우연히 상기 약독화 DR13 바이러스에 노출되더라도 안전하게 생존할 수 있다.

표1. 초유를 먹지 않은 돼지에서 DR13 배출 검사 결과

PEDV주	돼지번호	감염 후 경과일수에 따른RT-PCR을 통한 PEDV 검출
PEDV주	돼지번호	1	2	3	4	5
P100	P100-1	+	+	+	+	-
	P100-2	+	+	+	±	-
	P100-3	+	+	+	±	NT
	P100-4	+	+	+	-	-
	P100-5	+	+	+	+	NT
P75	P75-1	+	+	+	+	NT
	P75-2	+	+	+	+	NT
	P75-3	+	+	+	+	NT
	P75-4	+	+	+	+	+
	P75-5	+	+	+	+	NT
P0	P0-1	+	+	+^*	폐사
	P0-2	+	+	+^*	폐사
	P0-3	+	+^*	폐사
	P0-4	+	+^*	페사
	P0-5	+	+^*	폐사
대조군		-	-

2. 14일령 및 임신 모돈에서의 약독화 DR13의 병원성과 면역원성

(1) 병원성의 검사

약독화 여부를 확인하기 위하여, 100회 계대 DR13주를 14일령 자돈과 임신 모돈에 대하여 시험하였다. 시험은 다음 표2와 같이 디자인하였다.

표2. 14일령 및 임신 모돈에서의 약독화 DR13의 병원성과 면역원성

그룹	바이러스		돼지의 수량	투여
그룹	명칭	역가^a	돼지의 수량	경로	양(ml)
14일령자돈	P100^b	10^5.8	4	경구	5
	P75^c	10^6.0	4	경구	5
	모주^d	10% 유제액^e	4	경구	5
	대조군	α-MEM	4	경구	5
임신 모돈	P100^b	10^5.8	2520	경구	1

^a TCID₅₀/0.1ml ^b 약독화 DR13(100회 계대)

^c 약독화 DR13(75회 계대) ^d 모주 DR13(0회 계대)

^e 소장의 10% 유제액 (바이러스 역가는 측정되지 않음.)

^f α-Minimum essential media

병원성(pathogenicity) 비교를 위하여, 세포 적응(cell adaptation) 이전의 야외 분리주 DR13을 자돈의 소장으로부터 준비하였다. 상기 소장을 PBS로 균질화하였다. 다음으로, 10% 소장 유제액을 0.8㎛와 0.2㎛ 마이크로필터(Satorius, 독일)를 사용하여 여과하였다. 10^5.8 TCID₅₀/0.1ml를 함유하는 바이러스(100회 계대) 1ml를 4개의 상업적 농장 (각각 300, 500, 1200 및 1300 마리)의 총 2520 마리의 임신 모돈에 대하여 경구를 통하여 1회 투여하였다. 자돈과 임신 모돈에 대하여 각각 10일과 5일 동안 투여된 시험 동물의 설사와 폐사의 임상증상을 관찰하였다. 또한, 태어난 새끼 돼지를 동일 기간 동안에 해당 농장에서 대조군 임신 모돈에서 태어난 새끼 돼지와 평균 크기를 비교하였다.

그 결과, 약독화 DR13을 투여한 자돈과 임신 모돈에서는 설사와 PEDV 감염과 관련되는 거식증, 피레미아 증상은 나타나지 않았다. 그러나, 모주인 DR13을 투여한 자돈의 경우, 모든 자돈에서 심한 수성 설사와 탈수 증상이 3일 동안 발생하였다. 바이러스 배출은 약독화 DR13과 모주인 DR13을 투여한 군에서 각각 7일과 8일 동안 지속되었다. 약독화 DR13(100회 계대)을 투여한 임신 모돈에서는 설사, 거식증 및 피레미아와 같은 임상 증상은 전혀 나타나지 않았다. 약독화 DR13(100회 계대)를 투여한 임신 모돈과 대조군 모돈에서 태어난 새끼 돼지(평균 10.4 마리)의 평균 크기에는 차이가 없었다.

(2) 면역원성의 검사

또한, 면역 반응을 비교하기 위하여, 14일령 자돈에서 수집된 혈청과 초유(colostrum at delivery)에 대하여 간접 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 측정하였다 (Kweon CH 등, Vaccine 1999; 17: 2546∼2553). 또한, 약독화 DR13(100회 계대) 접종전, 접종후 2주 및 초유에서의 항체가를 측정하였다. 또한, 대조군 돼지로부터 10개의 초유를 수집하였다. 상기 간접 효소면역측정법은 구체적으로, 세포 순화된 PEDV를 폴리에틸렌글리콜(PEG)(분자량 6,000)에 용해시키고, 이를 다시 TEN 완충용액(0.01 M Tris, 0.001M EDTA, 0.1M NaCl )에 녹이고 정제하여 항원으로 사용하였다. 카보네이트 버퍼를 96웰 플레이트에 첨가하고, 항원을 1∼2㎍ 코팅하고, 1% 탈지유(skimmed milk)로 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 다음, 5℃에서 밤새 방치하였다. 돼지 가검 혈청은 인산완충용액에 1:400으로 희석하여 30분 동안 반응시키고, 2차 항체(goat HRP conjugated anti-swine IgG)(KPN 사)는 1:2,000으로 희석하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 발색은 ABTS를 이용하였다.

그 결과, 접종된 모든 자돈과 모돈에서 보호성 ELISA 역가를 나타내었다 (도9). 도9는 14일령 자돈에서 1주일 간격으로 6주 동안의 항체가 변화를 나타낸 도면이다. 도9에 나타낸 바와 같이, 모주 DR13를 접종한 경우, 2주일째에 피크를 나타내었고, 약독화주를 접종한 경우 3주일째에 피크를 나타내었다. 대조군 자돈과 모돈에서는 PEDV에 대한 항체는 검출되지 않았다. 또한, 분만시의 모돈의 초유에서는 높은 수준의 항 PEDV 항체가 검출되었다. ELISA에서, 약독화 DR13(100회 계대)을 투여한 임신 모돈의 초유에 대한 OD₄₀₅ 값은 0.479 내지 0.718로서, 대조군의 0168 내지 0.231에 비하여 높았다.

실시예4 : 현재 시판중인 백신(KPEDV9)과 본 발명의 약독화 PEDV DR13(100회 계대) 백신의 경구 투여에 의한 공격접종에 대한 방어 능력 비교 실험.

본 실시예에서는 현재 시판중인 KPEDV9 백신과 본 발명의 약독화 PEDV DR13(100회 계대) 백신의 공격접종에 대한 방어능력을 비교하기 위하여, 임신 모돈에 각각의 백신을 접종하고, 그로부터 태어난 자돈에 1회 공격접종하여 그 생존율을 확인하였다.

분만 4주전과 2주전에 임신모돈(각 3마리)에 KPEDV9 백신과 약독화 PEDV DR13(100회 계대)을 10^5.5 TCID50/0.1ml의 역가로 2회 경구 투여하였다. 다음으로, 분만후 모돈으로부터 태어난 각각 5마리의 자돈에 병원성 돼지 유행성 설사병 바이러스 야외주를 1ml 씩 공격접종하였다. 야외 바이러스는 돼지 유행성 설사병이 발생한 농장에서 수집된 자돈의 소장을 유제화하여 10% 유제액을 만들고, 0.2㎛ 필터를 이용하여 여과하여 사용하였다(실시예1 참조). 공격 접종은 3일령의 자돈에 대하여 실시한 후, 7일 동안 자돈의 임상증상 및 폐사율을 기록하였다. 그 결과를 표3에 나타내었다.

표3. 백신을 모돈에 경구 투여한 후, 자돈에 대한 공격 접종에 자돈의 생존율

주	투여 경로	투여량	바이러스 역가	투여 시기 및 회수(모돈)	공격접종자돈의 수	10일령까지의 생존율(%)
약독화 DR13	경구	1ml	10^5.5TCID₅₀/0.1ml	분만 4주전 및 2주전, 2회	5	80
KPEDV9	경구	1ml	10^5.5 TCID₅₀/0.1ml	분만 4주전 및 2주전, 2회	5	20
대조군	경구	1ml	α-MEM 배지	분만 4주전 및 2주전, 2회	5	100
야외 PEDV	경구	1ml	유제액	-	5	0

그 결과, KPEDV9 백신을 접종한 모돈에서 태어난 자돈의 경우, 공격접종에 대하여 심한 수양성 설사로 인하여 4마리가 폐사하였다. 즉, 생존율은 20%이었다. 반면, 본 발명의 약독화 PEDV DR13(100회 계대) 백신을 접종한 모돈에서 태어난 자돈의 경우, 1마리만이 폐사하였다. 즉, 생존율은 80%이었다.

상기 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약독화 PEDV DR13은 모돈과 자돈에 경구투여하여 안전하게 면역을 유도할 수 있었다. 또한, 본 발명의 약독화 PEDV는 모돈에 경구를 통하여 투여하였을 때, 80%이상의 자돈을 보호할 수 있었으나, 종래 시판되고 있는 KPEDV9을 모돈에 근육을 통하여 투여하였을 때, 20%이하의 자돈만이 보호되었다. 종래 KPEDV9은 주로 근육을 통하여 투여되었으나, 본 발명의 약독화 PEDV DR13은 경구 투여를 통하여도 종래 시판 중인 KPEDV9보다 우수한 면역효과를 유도할 수 있었다. 본 발명의 약독화 PEDV DR13은 경구 투여 후 동일한 형태의 바이러스가 배출되는 것으로 보아 체내에서 안전하면서도, 안정하게 유지되고, 표준 균주들과는 분별될 수 있는 제한효소 마커(예를 들면, Hind III과 Xho II)를 가지고 있어 상기 약독화 PEDV DR13을 포함하는 백신을 모돈 또는 자돈에 투여한 후 RFLP 분석을 통하여 용이하게 면역화 과정을 모니터링할 수 있고, PEDV 백신 관련 분자 생물학적 연구를 용이하게 할 수 있다. 이상과 같은 장점을 갖는 본 발명의 약독화 PEDV DR13 중, 100회까지 연속 계대배양된 PEDV DR13 주를 한국미생물보존센터에 2003년 3월 12일 기탁하였다 (수탁번호 KCCM-10474).

본 발명의 약독화 PEDV DR13은 안전성, 안정성, 면역원성 및 모돈에 투여하였을 때 자돈의 보호 효율이 높은, 약독화 PEDV DR13을 함유하는 백신을 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있으며, 제한 효소 마커를 가지고 있어 백신 접종후 이를 모니터링하는데에도 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 약독화 PEDV DR13을 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 투여를 통하여도 모돈 또는 자돈에서 돼지 유행성설사병을 효과적으로 예방 또는 치료를 할 수 있다.

본 발명의 약독화 PEDV DR13을 검출하는 방법에 의하면, 백신에 의한 면역화 과정 분석 및 관련 분자생물학적 연구를 용이하게 할 수 있다.

도1은 5회 계대 간격으로 측정된 PEDV DR13 역가를 나타내는 도면이다.

도2는 S 유전자 특이적인 RT-PCR를 통한 PEDV DR13 확인 결과를 나타내는 도면이다.

도3은 ORF3 유전자 특이적인 RT-PCR를 통한 PEDV DR13 확인 결과를 나타내는 도면이다.

도4a, 4b와 4c는 계대별 PEDV DR13 ORF3 부분의 서열분석 결과를 표준주 및 모주의 서열과 정열하여 나타낸 것이다.

도5는 Hind III를 이용한 계대별 PEDV DR13 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다.

도6은 Xho II를 이용한 계대별 PEDV DR13 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다.

도7은 Hind III를 이용한 여러 PEDV 주 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다.

도8는 Xho II를 이용한 여러 PEDV 주 ORF3 부분의 RFLP 분석 결과이다.

도9는 14일령 자돈에서 1주일 간격으로 6주 동안의 항체가 변화를 나타낸 도면이다.

<110> PARK, BONGKYUN <120> A attenuated porcine epidemic diarrhrea virus, a immunogenic composition comprising the same and a method for detecting the virus <130> GN14098 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PEDV S gene <400> 1 ttctgagtca cgaacagcca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PEDV S gene <400> 2 catatgcagc ctgctctgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF3-1 forward primer for ORF3 amplification <400> 3 tcctagactt caaccttacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF3-2 reverse primer for ORF3 amplification <400> 4 ggtgacaagt gaagcacaga 20

Claims

돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주 (수탁번호 KCCM-10474).
치료학적으로 유효한 양의 돼지 유행성설사병 바이러스 약독화주 (수탁번호 KCCM-10474) 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 조성물.
다음 단계를 포함하는 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(수탁번호 KCCM-10474)의 존재를 검출하는 방법:

(a) 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(수탁번호 KCCM-10474) 유래의 ORF3 DNA를 포함하는 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료를 제한 효소 Hind III과 Xho II로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제한효소로 처리하고 얻어지는 DNA 단편을 검출하여 RFLP 패턴을 얻는 단계; 및

(c) 상기 RFLP 패턴을 동일한 제한효소로 처리하고 얻어지는 DNA 단편을 검출하여 얻어진 표준 돼지 유행성 설사병 바이러스 유래의 ORF3 DNA의 RFLP 패턴과 비교하는 단계.