CN112996907A

CN112996907A - 新型猪轮状病毒

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Publication number: CN112996907A
Application number: CN201980073315.XA
Authority: CN
Inventors: A·德格罗夫; P·维尔梅吉; C·M·范德霍克; M·戴杰斯
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2021-06-18
Also published as: EP3880804A1; WO2020099293A1; BR112021008904A2; US20220220452A1; JP2022507053A

Abstract

本发明涉及一种新型轮状病毒，特别是一种分离的病毒，其是在猪中引起腹泻病的猪B组轮状病毒(猪RVB)亚种的成员，涉及所述病毒的DNA片段和相应蛋白，涉及基于所述病毒、DNA和/或蛋白的疫苗，以及涉及与所述病毒和/或蛋白反应的抗体和用于检测所述病毒的诊断检测试剂盒。

Description

新型猪轮状病毒

本发明涉及引起猪腹泻疾病的新型轮状病毒，涉及所述病毒的核酸片段和相应蛋白，涉及基于所述病毒、核酸和/或蛋白的疫苗以及涉及与所述病毒和/或所述蛋白具有反应性的抗体和用于检测所述病毒的诊断检测试剂盒。

背景技术

在过去几十年中，猪肉消费量在世界范围内呈强劲增长。结果，为了满足市场不断增长的需求，农场的数量和规模有所增加。从畜牧业普遍知晓，大量生活在一起的动物很容易受到各种疾病的侵害。此外，饲养大量动物增加了感染这种疾病的危险。轮状病毒感染是尤其在年幼动物(如猪)中发生的这些疾病之一。

轮状病毒(RV)已被公认是引起幼儿和动物(包括哺乳仔猪和断奶仔猪)急性肠胃炎的主要原因。轮状病毒性肠炎是一种以恶心、呕吐、水样腹泻和低烧为特征的轻度至重度疾病。一旦受试者被病毒感染，在出现症状之前大约有两天的潜伏期。患病期间是急性的。症状通常从呕吐开始，然后是四到八天的大量腹泻。轮状病毒感染的脱水比大多数细菌病原体导致的脱水更常见，并且是与轮状病毒感染相关的最常见死亡原因。此外，这些轮状病毒是与人轮状病毒进行基因交换的潜在库。作为家畜的病原体，特别是在年幼的牛和仔猪中，轮状病毒由于与高发病率和高死亡率相关的治疗费用而给农民造成经济损失。

RV属于呼肠(Reoviridae)病毒科，具有由11个区段的双链RNA(dsRNA)组成的基因组，基于内部病毒衣壳蛋白6(VP6)的抗原性质和基于序列的分类目前将其分成八组(A-H)。尽管已在世界范围内对人类RVA和RVC进行了描述，但是目前的报道表明，人类RVB毒株仅在中国得到了描述。猪RVB于1980年代首次被鉴定。

由于难以使RVB毒株适应细胞培养，因而RVB毒株的血清学和分子表征受到限制。Kuga等，2009(Arch Virol.2009；154(11):1785-95)和Marthaler等，2012(Virology.2012Nov 10；433(1):85-96)提出了基于编码外衣壳蛋白VP7的基因的成对标识对猪RVB毒株进行分类。Kuga等对38个猪RVB毒株的VP7进行了测序，并构建了用于G基因型分类目的的系统进化树和成对标识频率图。基于他们的分析，他们提出了5个基因型，使用67％和76％的核苷酸截止值将其进一步分为12个簇。Marthaler等使用此前发表的和新测序的RVB毒株，开发了一种改编的VP7分类(以下称为“Marthaler分类”)，基于80％的核苷酸同一性截止值得出20G基因型。

已经很好地建立了轮状病毒外衣壳蛋白VP7和VP4，以能够诱导独立的中和抗体(Greenberg等，J.Virol.,1983,47:267-275；Hoshino等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82:8701-8704)以及针对疾病进行相关的保护。VP4位于病毒颗粒(virion)的表面，其突出为棘突，而VP7是糖蛋白，可形成病毒颗粒的外表面。除了其结构功能外，其还决定了所述毒株的G基因型，并与VP4一起参与对感染的免疫力。

最近，尽管母猪接种了针对RVA的疫苗，但在西班牙的一个农场的仔猪中观察到新生儿腹泻爆发。因此，由于接种疫苗，初乳中应该已经存在针对RVA的母源抗体。因此，从被感染的受试者中收集样品并分析病毒的存在。

发现了属于轮状病毒B VP7蛋白的核酸序列，其可能与样品中RVB的存在有关。样品中RVB的存在也可以解释临床观察结果。在SEQ ID NO:1中给出了编码VP7蛋白的几乎全长核苷酸序列。

通过遗传分析令人吃惊的发现，样品中检测到的VP7序列与已知RVB基因型的VP7序列在遗传上是不同的。因此，可以得出结论，受试者患有此前未知的由RVB型引起的疾病。

发明目的

因此，本发明的目的是提供一种与猪腹泻相关的新的致病因子，以及旨在保护(即预防、改善和/或治疗)猪对抗疾病或至少减轻疾病的症状和/或降低疾病的死亡率的疫苗。此外，本发明的目的是提供检测和鉴定与疾病相关的致病因子的手段。

发明内容

本发明提供了一种分离的轮状病毒，其是猪B组轮状病毒基因型G12的亚种的成员，其以其野生型形式引起(新生)猪腹泻，所述病毒的特征在于其具有包含开放阅读框的病毒基因组，所述开放阅读框具有与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列对应的核苷酸序列或者与其具有至少90％同一性水平的核苷酸序列。尽管目前的病毒实际上是RNA病毒，但通常表达具有对应于特定DNA序列的一定同一性水平的病毒基因组的开放阅读框。众所周知，这表示可以从该DNA序列转录病毒基因组的实际RNA序列。

此外，本发明提供了一种包含开放阅读框的核酸片段(DNA或RNA)，所述开放阅读框包含至少100个核苷酸，其特征在于所述核酸片段与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平，以及由所述核酸片段编码的蛋白。优选地，所述片段包含超过100个核苷酸，如120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、730、至740个核苷酸。

本发明还提供了一种外病毒衣壳糖蛋白VP7，其特征在于其由与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的核酸片段编码。在SEQ ID NO:2中描述了此类蛋白的实例。

本发明还提供了一种用于保护猪对抗由猪RVB引起的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫原性有效量的如本文所述的病毒和药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种用于保护猪对抗由猪RVB引起的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫原性有效量的如本文所述的蛋白或外病毒衣壳糖蛋白VP7或核酸片段和药学上可接受的载体。

疫苗可以用于预防性治疗动物。

本发明还提供了一种抗体或抗血清，其与如本文所述的病毒或蛋白或外病毒衣壳糖蛋白VP7具有反应性。

本发明还提供了一种诊断检测试剂盒，其用于检测与本文所述的病毒或其抗原性物质具有反应性，与本文所述的蛋白具有反应性或与本文所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7具有反应性的抗体。

本发明还提供了一种诊断检测试剂盒，其用于检测如本文所述的病毒或其抗原物质或外病毒衣壳糖蛋白VP7。

具体实施方式

已经发现上述疾病症状的病因可能与新型轮状病毒B(RVB)的存在有关，特别是由G12基因型的RVB引起的疾病。尽管已从感染了多种轮状病毒的患病猪中分离出了基因型G12的RVB(参见Marthaler 2012)，但是这是基因型12的RVB首次与猪的疾病明确相关。遗传分析表明，样品中发现的核苷酸序列属于RVB的外病毒衣壳蛋白VP7(简称：“VP7衣壳蛋白”或“VP7”)的开放阅读框。在SEQ ID NO:1中描述了DNA片段的核苷酸序列。在SEQ ID NO:2中描述了相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1的几乎全长DNA片段与已知DNA序列的最大同一性与Marthaler等人在2012年分类建议中包括的被分类为基因型G12的猪VP7基因的同一性为87％。Marthaler等人提出的VP7分类基于80％的核苷酸同一性截止值产生了20G基因型。然而，Marthaler等人还报道了基因型之间和内部同一性的重叠。在此之后，没有一种G12基因型RotaB病毒与猪的疾病明确相关，更不用说与新生儿腹泻相关。

出于这个原因，发明人决定将SEQ ID NO:1的核苷酸序列暂定为属于新型病毒，特别是新型猪RVB，特别是新基因型的RVB，该病毒包含与Marthaler分类中的G12基因型具有最高相似性的VP7编码基因。

在图1中提供了系统进化树(phylogenetic tree)，其显示了根据本发明的新型病毒的VP7 DNA序列与RVB的已知VP7序列之间的关系，该系统进化树由两个子图组成，第一个子图表示为“图B”，第二个子图表示为“图A”。该系统进化树是使用MEGA-X软件利用邻居加入方法创建的，如果存在缺口或插入，则成对删除。参考文献：Tamura K等，MEGA6:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods.Mol.Biol.Evol.2011；28:2731–2739。在该树(第一部分，下部)中将新病毒称为New RotaB VP7 Spain。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了由SEQ ID NO:1的DNA片段编码的VP7蛋白，其在保护猪对抗猪RVB的致病性感染，以及特别是对抗G12基因型的猪RVB的致病性感染的方法中作为抗原。VP7蛋白通常包含在疫苗组合物中，即可以安全施用于猪的组合物，并且在其中VP7与药学上可接受的载体混合，如将在下文中所述的。

应当理解的是，对于这些基因和蛋白，轮状病毒的各个代表之间可以存在自然变异。遗传变异导致例如衣壳蛋白序列(如VP7)的微小改变确实存在。首先，有所谓的“在第二和第三碱基中的摆动”解释了可能会发生在它们编码的氨基酸序列中仍然未被注意的核苷酸变化：例如，三联体TTA，TTG，TCA，TCT，TCG和TCC均编码亮氨酸。另外，在氨基酸序列中可以看到根据本发明的新型病毒的代表之间的微小变异。这些变异可以通过整个序列中的一个或多个氨基酸差异或通过在所述序列中的一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入、倒置或添加来反映。例如，Neurath等在“The Proteins”Academic Press New York(1979)中已经描述了基本上不改变生物学和免疫性活性的氨基酸替代。相关氨基酸之间的氨基酸置换或进化中经常发生的置换尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(参见Dayhof,M.D.,Atlas of protein sequence and structure,Nat.Biomed.Res.Found.,WashingtonD.C.,1978,第5卷，增刊3)。其他氨基酸替换包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson开发了一种快速且灵敏的蛋白比较方法(Science 227,1435-1441,1985)，并且确定同源蛋白之间的功能相似性。本发明示例性实施方式的这种氨基酸置换以及具有缺失和/或插入的变体在本发明的范围内。

这解释了为什么当从根据本发明的猪轮状病毒的不同代表中分离出VP7蛋白时，其同源性水平可以显著低于100％，而仍然代表根据本发明的猪轮状病毒的VP7蛋白。

这清楚地反映在例如上文中引用的Marthaler等，2009的论文图3的系统进化树中，其表明即使在单个进化枝中，编码VP7的核苷酸序列仍然具有显著不同的整体基因组核苷酸序列。

因此，即作为分离的病毒描述了根据本发明的病毒，其特征在于：其基因组包含对应于与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的核苷酸序列的核苷酸序列。特别地，根据本发明的病毒的特征在于其是轮状病毒，其是猪B组轮状病毒(猪RVB)的亚种成员，并且其中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列属于编码VP7的开放阅读框。

出于本发明的目的，“同一性水平”应理解为SEQ ID NO:1的序列和/或编码猪轮状病毒VP7的相应区域和/或其同一性水平必需被确定的相应氨基酸序列的同一性水平。用于确定同一性水平的适宜程序是NCBF基本本地比对检索工具的核苷酸blast程序(blastn)，使用“比对两个或更多个序列”选项和标准设置(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。其中，同一性是基于在BLAST中使用的(标准)Blastn算法(Stephen Altschul,Warren Gish,Webb Miller,Eugene Myers和David J.Lipmann at National Institutesof Health(NIH),Journal of Molecular Biology,1990)。

根据本发明的病毒通常是分离的病毒。出于本发明的目的，“分离的”是指：从自然界中与病毒相关的组织中分离出来。

该实施方式的优选形式涉及一种病毒(如一种分离的病毒)，其包含以以下优先级与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少91％，更优选地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性水平的核苷酸序列。

根据本发明的病毒可以是活的、活减毒的或灭活形式。如上文所示，表征了编码病毒VP7的基因的DNA序列。将SEQ ID NO:1的核苷酸序列鉴定为属于编码VP7的ORF是非常有用的，因为目前可以将其作为DNA或RNA疫苗的基础，用于基于编码的蛋白制备亚单位疫苗或用于诊断目的,如以下将广泛解释的。

因此，在另一个实施方式中，本发明涉及核酸片段(例如，DNA或RNA)，其包含开放阅读框，所述开放阅读框包含至少100个，优选地至少200个，更优选地至少300、400或500个核苷酸，其特征在于所述核酸片段与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％，以以下优先级与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列优选地具有至少91％，更优选地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性水平。

在又一个实施方式中，本发明涉及如上文所述的核酸片段，其特征在于所述开放阅读框编码VP7或其片段。

在本发明中使用的术语“其片段”可以涉及全长VP7蛋白的任何更短部分。为了用于疫苗接种，这些部分应当适于赋予免疫原性性质，即，所述片段在被接种的受试者中具有诱导免疫应答的功能，并且可以将其称为“免疫原性片段”。

可将本发明的核酸片段制成适合于异源表达所编码蛋白质的形式。此类形式可以是载体或适于病毒核酸异源表达的其他形式。通常，载体含有适于异源表达的启动子。因此，在一个优选的实施方式中，根据本发明的核酸片段在异源启动子的控制下或在异源启动子的控制下被引入开放阅读框。

因此，在另一个实施方式中，本发明涉及在异源表达系统中产生的蛋白，特别是由根据本发明的核酸片段编码的外病毒衣壳糖蛋白VP7或其片段。该实施方式的优选形式涉及具有在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的VP7。

根据本发明的此类病毒的VP7适于用作抗原，特别是用作疫苗中的抗原，更特别地是用作亚单位疫苗中的抗原。此外，其可以用于产生抗体。此外，如下所述，其使诊断测试成为可能。

此外，本发明提供了新病毒不同蛋白的整个编码区的核苷酸和氨基酸序列，证实了该新病毒属于轮状病毒。由本发明提供的核苷酸和氨基酸序列通过如下所述的SEQ IDNO.1-22给出：

区段，Nr	类型	蛋白	序列，Nr.
				1	核苷酸	SEQ ID NO:3
1	氨基酸	VP1 Pol	SEQ ID NO:4
				2	核苷酸	SEQ ID NO:5
2	氨基酸	VP2	SEQ ID NO:6
				3	核苷酸	SEQ ID NO:7
3	氨基酸	VP3	SEQ ID NO:8
				4	核苷酸	SEQ ID NO:9
4	氨基酸	VP4(VP8，VP5)	SEQ ID NO:10
				5	核苷酸	SEQ ID NO:11
5	氨基酸	NSp1	SEQ ID NO:12
				6	核苷酸	SEQ ID NO:13
6	氨基酸	VP6	SEQ ID NO:14
				7	核苷酸	SEQ ID NO:15
7	氨基酸	NSp3	SEQ ID NO:16
				8	核苷酸	SEQ ID NO:17
8	氨基酸	NSp2	SEQ ID NO:18
				9	核苷酸	SEQ ID NO:1
9	氨基酸	VP7	SEQ ID NO:2
				10	核苷酸	SEQ ID NO:19
10	氨基酸	NSp4	SEQ ID NO:20
				11	核苷酸	SEQ ID NO:21
11	氨基酸	NSp5	SEQ ID NO:22

*VP4是一个开放阅读框，其编码一种前蛋白，该前蛋白随后被切割成VP5和VP8因此，可以将根据本发明的病毒进一步描述为一种分离的病毒，其特征在于其基因组包含核苷酸序列，所述核苷酸序列对应于与上述编码区段1-11所述的核苷酸序列(即，与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21所述的核苷酸序列)分别具有至少90％的同一性水平的核苷酸序列。

本发明的优点之一是，现在首次使在患有病毒性腹泻或与轮状病毒感染相关的其他体征和症状的猪的各种器官和体液中分析存在或不存在新型轮状病毒，以及通过向动物施用如下所述的疫苗治疗所述疾病或在健康动物中预防所述疾病的爆发成为可能。

根据本发明的“疫苗”是一种药物组合物，其可以安全地施用于受试动物，并且能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫力，即诱导针对微生物的保护。

针对微生物的“保护”指预防、改善和/或治疗(包括治愈)由该微生物引起的致病性感染或由该感染引起的病症，例如预防或减少由病原体的感染导致的一种或多种临床症状。

因此，本发明的另一个实施方式涉及一种疫苗，其用于保护，即预防、改善和/或治疗，以对抗猪中的轮状病毒感染，特别是由猪RVB导致的感染，尤其是由G12基因型的猪RVB导致的感染，其中此类疫苗包含根据本发明的病毒和药学上可接受的载体。因此，在这方面的保护应解释为包括疫苗接种以防止疾病(即，由病毒感染导致的(新生儿)腹泻或胃肠炎)爆发，以及接种疫苗以减轻所述疾病的症状。

优选地，考虑到从感染到疾病爆发之间的时间较短约两天，并且考虑到该病毒性腹泻具有高度传染性，将根据本发明的疫苗用于预防所述疾病。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于对抗由猪RVB感染引起的新生儿腹泻的疫苗。因此，本发明还涉及一种用于母猪接种的疫苗。

本发明中的“母猪接种”指母猪的产前免疫，以将被动免疫传递给仔猪，并提供保护以对抗如本文所述的猪RVB的感染。通过在雌性动物中诱导抗体，仔猪可以通过摄入已接种动物的初乳获得足够的保护以对抗感染。因此，可以将在仔猪中显示出保护作用的抗原用于接种母猪，以达到对仔猪的明显保护作用，通常至少在出生后第0天至第21天之间。

因此，本发明还涉及如本文所述的疫苗在雌性猪的疫苗接种中的用途，并允许仔猪从已接种的雌性猪中摄取初乳。为了获得最佳保护，初乳通常在仔猪出生后48小时内摄取，特别是在仔猪出生后24小时内摄取。

适用于根据本发明的疫苗的药学上可接受的载体的实例是例如无菌水、盐水和水性缓冲液(如PBS)。此外，根据本发明的疫苗可以包含其他添加剂，如佐剂、稳定剂、抗氧剂等，如下文所述。

根据本发明的疫苗可以包含减毒活或灭活形式的根据本发明的病毒。

减毒活病毒疫苗(即，包含活减毒形式的根据本发明的病毒的疫苗)与灭活疫苗相比具有优势，即其最能模仿自然感染方式。此外，其复制能力使得可以接种少量病毒；其数量将自动增加，直至达到免疫系统的触发水平。从那一刻起，免疫系统将被触发并最终消除病毒。与从野外(field)分离的病毒相比，减毒活病毒是一种具有降低的毒力水平的病毒。具有降低的毒力水平的病毒被认为是不会引起病毒感染的典型症状的病毒。然而，施用减毒活病毒的可能缺点是可能固有地留下一定程度的毒力。只要毒力水平是可以接受的，即只要疫苗至少能防止猪出现腹泻或其他典型的感染症状，这并不是真正的缺点。当然，减毒活疫苗的剩余毒力越低，疫苗接种期间/之后，疫苗接种对体重增加的影响就越小。因此，本发明该实施方式的一个优选形式涉及包含根据本发明的病毒的一种疫苗，其中所述病毒是活减毒形式。

减毒病毒可以例如通过在诱变剂的存在下生长根据本发明的病毒，然后选择显示出后代水平和/或复制速度降低的病毒而获得。很多此类试剂是本领域公知的。

与其减毒活疫苗对应物相比，灭活疫苗本质上是安全的，因为没有剩余的毒力。尽管与减毒活疫苗相比，其通常包含更高剂量的病毒，但其可能例如是已经患有其他疾病的猪中优选的疫苗形式。处于不理想状况(如营养不完全或不理想的房舍)下的猪，也会从灭活疫苗中获益。

因此，该实施方式的另一个优选形式涉及包含根据本发明的病毒的一种疫苗，其中所述病毒是灭活形式。

灭活的标准方法是用甲醛进行的经典处理。本领域公知的用于灭活的其他方法是UV辐射、γ辐射、用二元亚乙基亚胺和硫柳汞处理。本领域技术人员知晓如何应用这些方法。优选地，根据本发明的病毒是用β-丙内酯、戊二醛、乙烯-亚胺或甲醛灭活的。不言而喻的是使病毒灭活的其他方式也包含在本发明中。

尽管完全灭活的轮状病毒为疫苗提供了良好的基础，但其生产可能昂贵且费力。特别地，在本领域中还发现使猪RVB毒株适应细胞培养是困难的(Sanekata等，J ClinMicrobiol.1996Mar；34(3):759–761)。

一种替代方法是通过表达一种或多种轮状病毒蛋白或其免疫原性部分来开发亚单位或重组疫苗，所述轮状病毒蛋白或其免疫原性部分保留了被宿主细胞有效识别所必需的中和表位。VP7和VP4是外衣壳的两个蛋白组分，其均与中和抗体反应，针对这些蛋白中任一个的单克隆抗体(Mab)都可以中和轮状病毒。

VP7是主要的外衣壳蛋白，主要负责确定病毒的抗原性特征。其是一种高度免疫原性的糖蛋白，因此是包含在亚单位疫苗中的主要候选物。因此，使用完整病毒的有吸引力的替代方法是使用轮状病毒亚单元，更优选使用由VP7形成的亚单元。由VP7形成的亚单元的优势在于，在用于疫苗之前不必将其灭活，因此，其还具有本质上安全的优势。此外，如下文所述，用于异源生产这种亚单元的克隆和异源表达系统是本领域可获得和建立的。此外，已显示重组VP7在不存在其他轮状病毒蛋白的情况下介导天然抗原决定簇(Khodabandehloo等，Iran J Public Health.2012；41(5):73–84.)。

重组疫苗也可以作为包含疫苗的核酸构建体形式提供，如DNA和RNA疫苗，包括合成信使RNA、RNA复制子和裸DNA载体。一种此类疫苗接种策略包括使用来源于甲病毒复制子的RNA颗粒(RP)[Vander Veen等，Anim Health Res Rev.13(1):1-9.(2012)doi:10.1017/S1466252312000011；Kamrud等，J Gen Virol.91(Pt7):1723-1727(2010)]，其是由几种不同甲病毒开发而成的，包括委内瑞拉马脑炎病毒25(VEE)[Pushko等，Virology 239:389-401(1997)]、辛德毕斯(SIN)[Bredenbeek等，Journal of Virology 67:6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(SFV)[Liljestrom和Garoff,Biotechnology(NY)9:1356-1361(1991)]。RP疫苗可将繁殖缺陷的甲病毒RNA复制子递送到宿主细胞中，并在体内表达一种或多种所需的抗原转基因[Pushko等，Virology 30 239(2):389-401(1997)]。与一些传统疫苗制剂相比，RP具有吸引人的安全性和有效性[Vander Veen等，Anim Health6ResRev.13(1):1-9.(2012)]。已将RP平台用于编码致病性抗原，并且其是几种USDA许可的猪和家禽疫苗的基础。

因此，本发明的另一个实施方式涉及疫苗，其用于保护，即预防、改善或治疗猪以对抗轮状病毒感染，特别是由猪RVB导致的感染，尤其是由G12基因型的猪RVB导致的感染，其中此类疫苗包含免疫原性有效量的VP7蛋白或其免疫原性片段，或相应的核酸构建体，以及药学上可接受的载体。

在哺乳动物细胞和杆状病毒中针对大肠杆菌、疱疹病毒、牛痘病毒的现有技术中已报道了轮状病毒VP7的表达。然而，其中的大部分不是全长VP7蛋白。已使用重组痘苗病毒和腺病毒进行了将猿猴轮状病毒SA11 VP7锚定在真核细胞表面(VP7sc)的先进技术。表达的VP7蛋白似乎具有抗原性和免疫原性，并在小鼠中诱导出针对轮状病毒疾病的被动保护作用(Both等，Virology.1993；193:940–950)。

使用正确的系统进行病毒基因表达在生产具有生物活性的重组蛋白中非常重要。杆状病毒表达系统具有一些独特的性质，使其成为很多蛋白表达选择的系统，如重组蛋白的溶解性、正确折叠、信号肽切割、寡聚化、功能活性、磷酸化和糖基化。杆状病毒已在本领域中成功作为表达系统，用于生产轮状病毒蛋白(McGonigal TP等，Virus Res.1992；23(1–2):135–150；Redmont MJ等，Vaccine.1993；11:273–281；Fiore L等，J Gen Virol.1995；76(Pt 8):1981–1988)。因此，杆状病毒系统是表达VP7的候选者，因为其提供了以高产量合成重组蛋白的可能性，并具有允许进行免疫学和功能研究所需的构象要求(Fiore L等，J GenVirol.1995；76(Pt 8):1981–1988；Ishida SI等，J clin Microbiol.1996；34(7):1694–1700)。

到目前为止，目前用于制备轮状病毒衣壳蛋白的大多数表达系统是基于杆状病毒的表达系统。例如，本领域中已经描述了在基于杆状病毒的表达系统中生产高免疫原性轮状病毒衣壳蛋白的方法(McGonigal TP等，Virus Res.1992；23(1–2):135–150)。

此外，杆状病毒表达系统和杆状病毒表达载体通常已在教科书中广泛描述(Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual.David R.O'Reilly,LoisK.Miller和Verne A.Luckow.Publisher:Oxford University Press,USA,1994年5月；和Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols.Methods in MolecularBiology^TM,第388卷(2007).编辑：David W.Murhammer)。

基于杆状病毒的表达系统也是可商购的，例如，来自Invitrogen Corporation,1600Faraday Avenue,Carlsbad,California 92008,USA。基于杆状病毒的表达系统的替代品是基于酵母的表达系统。酵母表达系统是例如描述于：Gerd Gellissen的Production ofrecombinant proteins:novel microbial and eukaryotic expression systems，ISBN:3-527-31036-3。即用型表达系统是可以从Research Corp.Technologies,5210EastWilliams Circle,Suite 240,Tucson,AZ 85711-4410USA购得。酵母和昆虫细胞表达系统也可以例如从Clontech Laboratories,Inc.4030Fabian Way,Palo Alto,California94303-4607,USA购得。或者，重组表达可以使用

Alphavaccine平台系统技术进行，该技术使用基于修饰的甲病毒的病毒复制子颗粒(RP)。

因此，VP7或其片段可以通过在合适的表达系统(如杆状病毒表达系统)中异源表达包含编码VP7或其片段的基因的ORF而获得。重组VP7或其片段可以容易地大量制备，并且其是高度免疫原性的。

重组VP7或其片段的表达当然在本领域已知的基于哺乳动物细胞的表达系统中也是可能的，但是与基于杆状病毒的表达系统相比，这些系统使用起来更昂贵。

在疫苗中重组VP7的量通常是使用完整病毒疫苗的量的约1至10倍，优选2至5倍。例如，Khodabandehloo等，Iran J Public Health.2012；41(5):73–84报道了重组VP7的抗体效价，其比针对完整病毒的抗体效价低约四倍，这可以解释为在完整病毒中还存在具有免疫原性的VP4。通常，介于1和100μg之间的重组VP7的量将非常适合作为疫苗剂量。在使用VP7的免疫原性片段的情况下，最多可能需要500μg的量，其中实现免疫所需的量取决于重组蛋白的长度。从成本的角度来看，优选的量将在1-50μg重组VP7的范围内，更优选在1-25μg范围内。施用途径将与灭活的完整病毒颗粒的途径相当。

基于灭活完整病毒或重组VP7或其免疫原性片段的根据本发明的疫苗优选地包含佐剂。本领域熟知的常规佐剂是例如弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段共聚物、胞壁酰二肽、Quill

矿物油，例如

或

植物油和

(均聚物)或

Forte。疫苗还可以包含所谓的“载剂”。载剂是多肽所附着但不与之共价结合的化合物。通常使用的载剂化合物是例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、二氧化硅、高岭土和膨润土。

原则上，根据本发明的疫苗可以仅给予一次。然而，特别是在灭活疫苗的情况下，无论是全病毒疫苗、重组VP7还是免疫原性片段，优选均进行第一次可能甚至第二次强化免疫。初次强化免疫通常应在初次接种疫苗后至少两周。强化免疫非常适宜的时机是在初次免疫后的3至16周之间。如有必要，通常会在第一次强化免疫后的4至50周之间给予第二次强化免疫。

灭活完整病毒疫苗方法和重组VP7方法的替代方法是使用以猪为宿主动物的活重组非轮状病毒载体作为新型猪RVB VP7基因或其免疫原性片段的载体。

在以猪为宿主动物的适宜重组非轮状病毒载体中，两种载体特别适合作为载体：伪狂犬病毒(PRV)和经典猪瘟病毒(CSFV)。这种重组病毒在疫苗中的使用具有额外的优势，即，接种疫苗的动物同时接种了PRV和RVB或CSFV和RVB的疫苗。

减毒活CSF载体也非常适合作为活重组载体。仅作为一个例子；Mayer等(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology,Academic Press,London,1987)已描述了其中N<pro>基因已缺失的减毒活CSFV。此类减毒活病毒允许在N<pro>基因的缺失位点插入VP7基因。此类活重组CSFV载体同样形成本发明的VP7基因的适宜载体。

可以使根据本发明的VP7基因或其片段的表达在哺乳动物细胞中起作用的任何适宜异源启动子的控制下(见下文)。异源启动子是并非负责以本发明的新型猪轮状病毒的野生型形式转录VP7基因的启动子的启动子。其可以是负责不属于根据本发明的病毒的另一种轮状病毒的VP7转录的轮状病毒启动子，或者其可以是非轮状病毒启动子。

因此，本发明的另一个实施方式涉及一种DNA片段，其包含编码根据本发明的VP7或其片段的基因，其特征在于所述基因是在功能性异源启动子的控制下。在哺乳动物细胞中起作用的启动子是能够驱动位于哺乳动物细胞中位于该启动子下游的基因转录的启动子。

在哺乳动物细胞中起作用的适宜启动子的实例包括经典启动子如(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Seed,B.等，Nature 329,840-842,1987；Fynan,E.F.等，PNAS 90,11478-11482,1993；Ulmer,J.B.等，Science 259,1745-1748,1993)、劳斯肉瘤病毒LTR(RSV,Gorman,CM.等，PNAS 79,6777-6781,1982；Fynan等，同上；Ulmer等，同上)、MPSV LTR(Stacey等，J.Virology 50,725-732,1984)、SV40立即早期启动子(Sprague J.等，J.Virology 45,773,1983)、SV-40启动子(Berman,P.W.等，Science,222,524-527,1983)、金属硫蛋白(Brinster,R.L.等，Nature 296,39-42,1982)、热休克启动子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4949-53,1985)、Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等，Nature 356,152-154,1992)。调控序列还可以包括终止子和多聚腺苷酸化序列。可以使用的序列是众所周知的牛生长激素多聚腺苷酸化序列，SV40多聚腺苷酸化序列，人巨细胞病毒(hCMV)终止子和多聚腺苷酸化序列。

因此，该实施方式的另一种形式涉及一种用于保护猪对抗由RVB导致的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含活重组非RVB载体和药学上可接受的载体，所述活重组非RVB载体包含DNA片段，所述DNA片段包含在功能性启动子的控制下编码VP7或其免疫原性片段的基因。

此外，活重组非RVB载体应表达免疫原性有效量的VP7或其免疫原性片段。

用灭活的全病毒疫苗，重组VP7疫苗或活的重组非RVB载体进行疫苗接种的替代方法是使用DNA疫苗接种。

此类DNA疫苗接种基于在合适的启动子的控制下将携带根据本发明的编码VP7基因的DNA片段引入宿主动物中。一旦DNA被宿主细胞摄取，则编码VP7或其片段的基因被转录，并且转录物在宿主细胞中被翻译成VP7。这紧密模拟了轮状病毒的自然感染过程。适宜的启动子是如上所示例的在哺乳动物中有功能的启动子。

在适宜启动子的控制下携带编码VP7或其片段的基因的DNA片段例如可以是质粒。这种质粒可以是环状或线形形式。

猪成功进行DNA疫苗接种的实例是针对奥叶基氏病的成功疫苗接种，如在Gerdts等，Journal of General Virology 78:2139-2146(1997)中所述的。其描述了一种DNA疫苗，其中使用的DNA片段在人巨细胞病毒主要立即早期启动子的控制下携带糖蛋白C。疫苗接种进行4次，间隔两周，接种量为50μg DNA。接种过的动物产生了血清抗体，所述抗体可识别免疫印迹中的相应抗原并具有中和活性。

猪成功进行DNA疫苗接种的另一个实例由Gorres等，Clinical VaccineImmunology 18:1987-1995(2011)给出。其描述了成功针对大流行和经典猪H1N1流感对猪进行的DNA疫苗接种。其使用DNA疫苗进行初免接种以及在初免后3周和6周进行了2次同源强化，所述DNA疫苗包含在功能性启动子控制下的流感H1N1的HA基因。因此，该实施方式的另一种形式涉及一种保护猪以对抗由RVB引起的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含DNA片段和药学上可接受的载体，所述DNA片段包含在功能性启动子控制下的根据本发明的VP7基因或其片段。

此外，包含编码根据本发明的VP7或其片段的基因的DNA片段应表达免疫原性有效量的VP7或其免疫原性片段。

当构成根据本发明的疫苗的“免疫原性有效量”是基于根据本发明的全病毒、根据本发明的重组VP7或其免疫原性片段、根据本发明的活重组载体或DNA疫苗时，其取决于所需作用和靶生物体。如本文所用，术语“免疫原性有效量”是指在猪中诱导免疫应答至某种程度所需的病毒、重组蛋白、活重组载体或DNA疫苗的量，所述程度是与未免疫的猪中由野生型轮状病毒感染引起的病理作用相比，其降低了由野生型轮状病毒感染引起的病理作用的程度。

例如，可以通过对疫苗接种的动物进行实验性攻击感染，然后确定目标动物的疾病临床症状、血清学参数或通过测量病原体的分离，然后将这些结果与在野外感染的猪中观察到的那些进行比较，来确定治疗是否具有“免疫学有效”。

施用的病毒量将取决于施用途径，佐剂的存在情况和施用时机。

包含根据本发明的病毒的活疫苗的优选量例如以组织培养感染剂量(TCID50)表示。例如，对于活病毒，取决于病毒的剩余毒力，可以有利地使用每只动物10至10⁹TCID50的剂量范围。优选地，使用10²至10⁶TCID50之间的范围。

可以采用本领域公知的很多施用方式。根据本发明的疫苗优选通过注射(肌内或通过腹腔内途径)或经口施用于动物。

可以根据标准疫苗接种实践优化施用方案。在所有情况下，通过皮内注射器(IDAL)施用是一种施用方式。如果疫苗包含根据本发明的灭活病毒或重组蛋白，则还将剂量表示为要施用的病毒颗粒的数量。与施用活病毒颗粒相比，该剂量通常会更高一些，因为在被免疫系统清除之前，活病毒颗粒会在目标动物中复制到一定程度。对于基于灭活病毒的疫苗，通常约10⁴至10⁹个颗粒的病毒颗粒量是合适的。该量可能取决于所使用的佐剂，但是通常在限定的范围内。

如果疫苗包含根据本发明的重组蛋白，则剂量也可以以微克蛋白表示。对于基于重组蛋白的疫苗，适宜剂量将通常在1至500微克蛋白范围内。该剂量也可能取决于所使用的佐剂。

如果疫苗包含含有编码VP7的基因的DNA片段，则剂量将以微克DNA表示。适宜的剂量通常将在5至500微克DNA之间的范围内。剂量可以取决于，即，取决于所使用的表达质粒的效率。通常，每只动物20至50微克质粒的量足以进行有效的疫苗接种。

根据本发明的疫苗可以采取适于在养猪场中施用并且与所需的施用途径和所需的效果相匹配的任何形式。根据本发明的疫苗的制备通过本领域技术人员常规的方法进行。

对于口服施用，疫苗优选与适于口服施用的载体混合，即纤维素、食物或可代谢物质，如α纤维素或者植物或动物来源的不同油。

实际上，针对多种致病性病毒或微生物对猪进行接种。

因此，出于实践和经济原因，将根据本发明的用于猪的疫苗与例如对猪有致病性的病毒或微生物的其他免疫原，或编码所述病毒或微生物的免疫原的遗传信息组合这是非常有吸引力的。

因此，该实施方式的一个优选形式涉及一种根据本发明的疫苗，其中所述疫苗包含至少一种其他猪致病性微生物或猪致病性病毒和/或所述猪致病性微生物或猪致病性病毒的至少一种其他免疫原性组分和/或编码所述其他免疫原性组分的遗传物质。免疫原或免疫原性组分是在动物中诱导免疫应答的化合物。例如，其可以是完整病毒或细菌，或者该病毒或细菌的蛋白或糖部分。

对猪具有致病性的最常见的致病病毒和微生物是猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒，猪细环病毒、假狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道和生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、可传播的肠胃炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌、猪丹毒杆菌(Erysipelorhusiopathiae)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。

因此，本发明的一个更优选形式涉及一种根据本发明的疫苗，其中针对猪的致病性病毒或微生物选自以下：猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒，猪细环病毒、假狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道和生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、可传播的肠胃炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌、猪丹毒杆菌(Erysipelo rhusiopathiae)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。

又一个实施方式涉及一种用于制备根据本发明的疫苗的方法，其中所述方法包括将根据本发明的病毒和/或根据本发明的重组蛋白和/或根据本发明的编码VP7或其片段的DNA片段和/或根据本发明的编码VP7或其片段的活重组非轮状病毒载体与药学上可接受的载体混合。

在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒和/或根据本发明的重组蛋白和/或VP7或其免疫原性片段和/或根据本发明的编码VP7或其免疫原性片段的DNA片段和/或根据本发明的编码VP7或其免疫原性片段的活重组非轮状病毒载体，其用于疫苗。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于制备如本文所定义的疫苗的方法，其特征在于所述方法包括将如本文所定义的病毒，或免疫原性有效量的VP7或其免疫原性片段或者编码VP7或其免疫原性片段的重组载体与药学上可接受的载体混合。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所定义的病毒、DNA片段、VP7或其免疫原性片段或者编码VP7或其免疫原性片段的重组载体，其用于制备保护猪对抗由猪RVB引起的感染的疫苗。

如上所述，轮状病毒感染具有高度传染性。这意味着重要的是要在首个临床症状出现之前就早已知道轮状病毒是否存在于特定的猪群中。因此，为了有效对抗疾病，快速且正确地检测轮状病毒的存在是重要的。

因此，本发明的另一个目的是提供适于检测根据本发明的病毒感染的诊断工具。

这些工具部分依赖于针对病毒的抗体的可用性。例如，这些抗体可以是用于轮状病毒感染诊断检测的。针对根据本发明病毒的抗体或包含抗体的抗血清可以快速而容易地通过使用根据本发明的病毒接种例如猪、家禽或例如家兔，然后在大约四周后，通过取血、离心凝血和倾析血清获得。此类方法是本领域众所周知的。

用于制备针对根据本发明病毒的抗体(其可以是多克隆的、单特异性的或单克隆的(或其衍生物))的其他方法也是本领域众所周知的。如果需要多克隆抗体，则数十年来生产和处理多克隆血清的技术是本领域众所周知的。对于本发明的病毒具有反应性的单克隆抗体可以通过用本领域中长期已知的技术对近交系小鼠进行免疫来制备。

因此，本发明的另一个实施方式涉及与根据本发明的病毒具有反应性的抗体或抗血清。

基于检测根据本发明的病毒或该病毒的抗原性物质，并且因此适于检测RVB感染的诊断检测试剂盒例如可以包括标准ELISA检测。在此类检测的一个实例中，ELISA板的孔壁用针对病毒的抗体包被。在与待检测的物质孵育后，将与病毒反应的标记抗体添加到孔中。如果待检测的物质确实包含根据本发明的新型病毒，则该病毒将与包被在ELISA孔中的抗体结合。与病毒反应的标记抗体随后将被添加到孔中，进而与病毒结合，然后显色反应将揭示病毒抗原物质的存在。

因此，本发明的又一个实施方式涉及用于检测根据本发明的病毒或病毒的抗原性物质的诊断检测试剂盒，其包含与根据本发明的病毒或其抗原性物质反应的抗体。病毒的抗原性物质应在广义上解释。其可以是例如呈分解形式的病毒，或包含病毒外膜蛋白的病毒包膜物质。只要病毒的物质与针对所述病毒的抗血清反应，就认为该物质是抗原性物质。

基于在血清中检测与根据本发明的病毒或所述病毒的抗原性物质反应的抗体并因此适于检测RVB感染的诊断检测试剂盒还可以例如包括标准ELISA检测。在此类检测中，ELISA板的孔壁可以例如包被根据本发明的病毒或其抗原性物质。在与所检测的物质(例如，疑似被根据本发明的新型病毒感染的动物血清)一起孵育后，将与本发明的病毒反应的标记抗体添加到孔中。如果在检测的血清中存在针对根据本发明的新型病毒的抗体，则这些抗体将与包被在ELISA孔中的病毒结合。结果，后来添加的与病毒反应的标记抗体将不会结合，也不会发生显色反应。因此，缺乏显色反应将揭示与本发明病毒具有反应性的抗体的存在。

因此，本发明的又一个实施方式涉及用于检测与根据本发明的病毒或所述病毒的抗原性物质具有反应性的抗体的诊断检测试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明的病毒或其抗原性物质。

免疫测定的设计可能会有所不同。例如，免疫测定可以基于竞争或直接反应。此外，方案可以使用固体支持物或可以使用多孔材料。抗体-抗原复合物的检测可以涉及使用标记的抗体；标记可以是例如酶、荧光分子、化学发光分子、放射活性分子或染料分子。

除了上文提及的ELISA外，用于检测样品中与根据本发明的病毒反应的抗体的适宜方法还包括免疫荧光检测(IFT)和Western印迹分析。

用于诊断根据本发明的病毒的存在或不存在的替代但快速且容易的诊断检测是如上文所述的PCR检测，其包含与根据本发明的新病毒的VP7 DNA片段的特定区域具有反应性的PCR引物组。在此上下文中，特定是指例如新病毒的VP基因所特有的，即在弧肠病毒科的其他成员中不存在。

通过本发明提供的新VP7基因序列与其他轮状病毒的已知VP7基因的简单计算机分析，本领域技术人员能够开发出用于诊断检测的特异性PCR引物，以检测新病毒和/或在新病毒与其他病毒(猪)病原体之间作出鉴别。

因此，另一个实施方式涉及用于检测根据本发明的病毒的诊断检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含PCR引物组，所述PCR引物组与根据本发明病毒的DNA片段的VP7基因序列的区域特异性反应。

实施例

实施例1：鉴定仔猪中的新轮状病毒

最近，尽管母猪已接种抗RVA疫苗，但在西班牙一家大型猪肉生产商的农场的仔猪中观察到了新生腹泻爆发，并出现明显的轮状病毒感染的临床体征。

在感染猪中观察到的临床症状是在出生第一周出现腹泻，具有不同粘稠度的黄色粪便，有时粪便呈液体，有时粪便较稠。初产母猪和多胎母猪的仔猪均受到影响。发病率很高(在一些批次中占整窝的40％)，死亡率为5-6％。

由于腹泻症状，使用Coliclos

RCE(Merck Animal Health)疫苗对猪进行免疫接种，该疫苗是用于猪的疫苗，可以预防哺乳仔猪的轮状腹泻、肠毒素血症和大肠杆菌病，该疫苗含有两种主要的轮状病毒A基因型(G4、G5)、四种主要的大肠杆菌菌毛抗原和产气荚膜梭菌C型类毒素。然而，接种疫苗并未导致症状消失。

特别是，怀疑感染了病毒，因为被感染物质的“反馈”导致免疫力和症状消失。

由于接种疫苗，初乳中应该已经存在针对RVA的母源抗体。将样品送至实验室分析，尽管进行了疫苗接种，但是没有对轮状病毒迹象的合理解释。

通过采集直肠拭子收集样品，受试者包括6组具有明显轮状临床体征的母猪(“轮状组”)和3组无体征的母猪(“对照组”)。从每组中，从母猪和三只仔猪中采集直肠拭子。通过VIDISCA(基于cDNA-AFLP的病毒发现(扩增的片段长度多态性))分析了样品中是否存在病毒，该方法最初由van der Hoek等，(Nat Med.2004；10:368–373)描述。基于VIDISCA的病毒发现是一种新方法，其提供了一种快速有效的工具，用于扩增未知基因组，例如人类致病性病毒。VIDISCA方法基于靶序列的双重限制酶处理和寡核苷酸接头的连接，该寡核苷酸接头随后充当扩增的引发位点。由于该方法基于限制性酶切位点的普遍存在，因此可产生可重现的物种特异性扩增模式。该方法可以扩增和鉴定病毒RNA/DNA，对于DNA病毒具有10(5)拷贝/ml的较低截止值，对于RNA病毒具有10(6)拷贝/ml的较低截止值。

使用VIDISCA方法，在6个“轮状组”母猪中的5个检测到高水平的属于未知轮状病毒VP7蛋白的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列以及具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。在这些母猪中，3只仔猪中的每只也均具有提示病毒血症的高水平的病毒存在。在第6组母猪的仔猪中，只能检测到低水平的病毒，在检测水平附近。在两个“对照组”中未检测到病毒。在另一个对照组中，在3只检测仔猪的2只中检测到了在检测水平附近非常低水平的病毒。发现该组中的其他动物(母猪和仔猪)对该病毒呈阴性。所有检测动物的所有直肠拭子均不存在任何其他轮状病毒。这表明新发现的轮状病毒一定是导致轮状病毒诱发的疾病的原因。系统发育分析表明，该新型病毒属于轮状病毒B，G12基因型内的轮状病毒B(见图1；新病毒表示为“New RotaB VP7 Spain”)。在本领域中尚未明确发现这种基因型的轮状病毒是引起疾病的。据信，该新毒株是G12属中新的致病性亚属的代表。

此外，通过Illumina测序获得了11种不同蛋白的整个编码区(每个区段1个蛋白)，揭示了新轮状病毒的序列SEQ ID NO.1-22。对于区段2-11的蛋白，获得了全长编码区序列，即从起始到终止。对于区段1的蛋白，获得了部分编码区的序列。

基因组组装是从血清样品中获得的测序信息。按照如下所述进行Illumina测序：

将样品“I18-45_Serum-nr-49Sow D3004 Spain”用于文库制备和区段测序。如所示的(de Vries M等，PLoS One.2011；6(1):e16118.doi:10.1371/journal.pone.0016118)，以10,000x g将110μl材料离心10分钟，并用TurboDNase(Thermofisher)处理，随后通过Boom提取法(Boom R等，J Clin Microbiol.1990；28(3):495-503)提取核酸。使用dsDNA片段酶(New England Biolabs)剪切样品。用AMPure XP小珠(agencourt AMPure XP PCR,Beckman Coulter)以1:1.8比例(样品：小珠)纯化剪切后的样品，以除去酶。纯化后，将样品用DNA聚合酶I大(Klenow)片段(New England Biolabs)进行末端修复。用AMPure XP小珠以1:1.8比例(样品：小珠)纯化末端修复的样品以除去酶，随后使用Klenow片段(3’-5’Exo-)(New England Biolabs)对样品进行A加尾处理。使用AMPureXP小珠以1:1.8比例(样品：小珠)对样品进行纯化以除去聚合酶。使用T4连接酶将用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸(New England Biolabs)的Bubble接头连接至A加尾样品。尺寸选择是通过首先以1:0.5比例(样品：小珠)使用AMPure XP小珠，以确保除去尺寸大于400bp的大部分片段，随后通过向上清液中添加另外的AMPure XP小珠，使得最终比例为1:0.85(样品：小珠)，以结合200-400bp之间的DNA片段并除去小于200bp的片段进行的。尺寸选择后，使用用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸(New England Biolabs)的USER酶打开Bubble接头。接下来，使用来自用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸(New EnglandBiolabs)和Q5 hotstart mastermix(New England Biolabs)的接头特异性引物进行28个循环的PCR；在98℃下30秒，循环进行98℃下10秒和65℃下75秒，随后65℃下5min。PCR之后，通过使用AMPure XP小珠以1:0.5的比例(样品：小珠)对样品进行尺寸选择，以除去尺寸大于400bp的片段，并向上清液中添加AMPure XP小珠以达到最终比率为1:0.85(样品：小珠)以结合200-400bp之间的DNA片段并除去小于200bp的片段。接下来，通过Qubit dsDNA HSAssay Kit(Thermofisher)测量DNA浓度，使用高灵敏度DNA分析试剂盒在生物分析仪上确认尺寸。使用MiSeq(Illumina)，使用配对末端测序和v2试剂盒(Illumina)对文库进行测序。使用Trimmomatic0.35在以下设置下进行质量控制和修整(phred 33,LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36)并使用SPAdes3.5.0版-Darwin进行组装，使用以下设置(-“careful”–“only-assembler”-“paired reads”)。为了具有区段的末端序列(5’和3’)，从头组装的重叠群分别与KR052709.1、KR052710.1、KR052711.1、KR052712.1、KR052713.1、KR052714.1、KR052715.1、KR052716.1、KR052717.1、KR052718.1、KR052719.1的区段1至11比对。通过与每个区段最接近亲属进行比对，通过目测检查所有组装的序列的质量：AB673232.1；KF882541.1；KR052716.1；KR052717.1；KX869737.1；KX362400.1；KX869732.1；KX869733.1；KX869735.1；MG272043.1；MG272114.1。

实施例2：分离新型轮状病毒并使用新型轮状病毒再感染仔猪

简单介绍

本研究的目的是剖腹产、剥夺初乳(CD/CD)仔猪中繁殖实施例1中的新型B组轮状病毒(新RVB)的野外分离株。

进行该研究以确认新发现病毒的传染性。感染性病毒在动物中传播时，应导致病毒具有持续的毒力和在肠道内容物中的高滴度。除此之外，应再现在病毒起源的农场观察到的临床症状，即腹泻。

需要剖腹产和剥夺初乳，以防

止仔猪获得抗轮状病毒的母源干扰抗体，或者在分娩过程中被轮状病毒或任何其他病毒感染。自然或其他人工辅助的分娩方式可能会意外感染仔猪，这会干扰研究。

由于年龄较大的仔猪不易感染轮状病毒，因而在3日龄时感染仔猪。早期感染可能会导致全身病毒血症和胃肠道感染，而不是仅导致胃肠道感染。

材料和方法

对于这项研究，使用5只CD/CD仔猪。将仔猪编号并运输到实验室。为了进行运输，将仔猪放在特定的无病原体运输容器中，然后在气候受控的动物运输工具中运输。到达实验室后，将仔猪放在隔离室中。

在3日龄时(研究第0天)，使用每只仔猪5mL新型RVB分离株的接种物胃内感染仔猪，新型RVB分离物由在实施例1中获得的来源于粪便的病毒组成。

为了制备感染性物质，将携带相同新型RVB的7只仔猪(来自3只不同母猪)的粪便内容物混合(总体积12mL)。为了活化病毒，添加胰蛋白酶至最终浓度为2U/mL。将所述物质在37℃下孵育30min，随后使用EMEM培养基将体积增加至30mL。

基于包含已知浓度扩增子的质粒的滴定系列，合并样品中RVB的量为2.26*10⁷个拷贝/μl。接种物还含有星状病毒，已为其建立了qPCR诊断测定，但是没有标准曲线。接种物样品的Ct值为32.75。

使用注射器和饲管/尿道导管，每只小猪在胃内施用五(5)mL接种物。应用接种物后，使用注射器将2mL空气缓慢地推入经过胃管，以完全排空管中的内容物。如有必要，接种后用含70％乙醇的纸巾擦拭仔猪的嘴。

从攻击当天到感染后3天，观察所有仔猪的腹泻临床症状。感染之前和之后，每天一次从直肠开口处从所有仔猪收集个体粪便样品。如果不成功，则收集直肠拭子样品。将所有粪便样品/直肠拭子立即贮存在-70℃。感染后第3天(72h)，对仔猪进行尸检。尸检时，每只仔猪的肠内容物以及空肠、回肠、结肠和盲肠组织碎片收集为两个混合样品。另外，从空肠，回肠，盲肠和结肠中取出少量组织样品用于(免疫)组织化学。

给仔猪饲喂Swinco opticare 2100milk直至研究第0天。从研究第0天直至实验结束(研究第3天)，给仔猪饲喂Swinco opticare milk Silver。

qPCR

在粪便样品上进行逆转录定量PCR(RT-qPCR)。

使用Magnapure方法(Roche)提取核酸(NA)。

在NA提取物上针对新型Rota B病毒进行特异性RT-qPCR。

正向引物：5’-CAGACGATCTGATAGGGATGTATTG-3’(SEQ ID NO:23)。

反向引物：5’-ATGTCCGTGACGTAGTATCTTC-3’(SEQ ID NO:24)。

qPCR方案：5min 55℃，5min 95℃[10sec 94℃，25sec 58℃]x39

用于进行qPCR的试剂盒是Invitrogen SuperScript^TMIII Platinum^TMOne StepqRT-PCR试剂盒。基于含有已知浓度的扩增子的质粒的滴定系列进行定量。

在NA提取物上进行星状病毒特异性RT-qPCR。

正向引物：5’-GTGCAGATGTGTTGGCGTATAAG-3’(SEQ ID NO:25)

反向引物：5’-TGAAGCGTACAAACCAGGATGAG-3’(SEQ ID NO:26)

qPCR方案：3min 55℃，5min 95℃[15sec 95℃，30sec 60℃]x39

用于进行qPCR的试剂盒是Invitrogen SuperScript^TMIII Platinum^TMOne StepqRT-PCR试剂盒，目录号11732020。没有进行基于滴定系列的定量。

结果

在整个动物研究期间监测所有动物的健康状况。在感染后21h，首次诊断出仔猪有腹泻和食欲下降的症状。所有仔猪出现的临床症状均与在标准(index)猪场观察到的相似。

表1：在感染后不同小时(pi)的临床症状进展：

RVB的qPCR定量：

从研究期间收集的所有粪便样品中提取核酸，并通过RVB特异性qPCR筛选RVB的存在情况。结果列于下表1：

仔猪#

样品类型

粪便接种物

0hpi

24hpi

48hpi

72hpi

1

直肠拭子

2,26E+07

0,00E+00

1,79E+06

2,71E+04

6,43E+05

2

直肠拭子

2,26E+07

0,00E+00

1,71E+07

8,23E+05

9,80E+05

3

直肠拭子

2,26E+07

0,00E+00

6,30E+05

5,52E+05

1,09E+04

4

直肠拭子

2,26E+07

0,00E+00

2,95E+05

8,50E+04

5

直肠拭子

2,26E+07

0,00E+00

1,58E+06

2,65E+05

5,05E+04

在研究开始时，仔猪的粪便样品中不存在RVB。在感染后24h，在感染仔猪的粪便中能够检测到RVB。在接下来几天采集的样品中，仍存在RVB。在48h采集的仔猪4的样品无法进行分析。

研究期间粪便或粪便拭子的分析是半定量的。在临床症状进展期间，粪便变得更加水样。没有收集到定量的量的粪便。

随后，对所有样品进行了星状病毒的qPCR定量，以确保这种病毒(通过下一代测序诊断并通过qPCR验证，以低浓度存在于接种物中)在动物研究过程中对动物没有影响。

使用qPCR分析了研究期间收集的所有粪便样品中是否存在星状病毒，但是没有发现粪便样品中星状病毒阳性。因此，没有显示出该病毒的复制。

总而言之，这项研究证实了新型Rota B病毒的体内感染性、复制性和致病性。

因此，本发明涉及下述实施方式：

1.一种分离的轮状病毒，其是猪B组轮状病毒基因型G12亚种的成员，其以其野生型形式引起猪腹泻，所述病毒的特征在于其具有包含开放阅读框的病毒基因组，所述开放阅读框具有与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列对应的核苷酸序列或者与其具有至少90％同一性水平的核苷酸序列。

2.根据实施方式1所述的分离的病毒，其特征在于与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的核苷酸序列编码外病毒衣壳糖蛋白VP7。

3.一种核酸片段，其包含开放阅读框，所述开放阅读框包含至少100个核苷酸，其特征在于：所述核酸片段具有核苷酸序列，所述核苷酸序列对应于与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的序列。

4.根据实施方式3所述的核酸片段，其特征在于所述开放阅读框编码外病毒衣壳糖蛋白VP7。

5.根据实施方式3或实施方式4所述的核酸片段，其特征在于所述开放阅读框在异源启动子的控制下。

6.一种重组蛋白，其由根据实施方式3至5中任一项所述的核酸片段编码。

7.一种外病毒衣壳糖蛋白VP7或其片段，其特征在于其由根据实施方式3至5中任一项所述的核酸片段编码。

8.一种外病毒衣壳糖蛋白VP7或其片段，其特征在于其是根据SEQ ID NO:2的蛋白，或者与其具有至少90％同一性水平的蛋白。

9.一种用于对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫原性有效量的根据实施方式1和2中任一项所述的病毒，或者免疫原性有效量的根据实施方式6所述的重组蛋白，或者免疫原性有效量的根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据实施方式3至5中任一项所述的核酸片段，以及药学上可接受的载体。

10.根据实施方式9所述的疫苗，其用于预防性治疗动物。

11.一种抗体或抗血清，其与根据实施方式1至2中任一项所述的病毒，或者与根据实施方式6所述的重组蛋白，或者与根据实施方式7或8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应。

12.一种用于检测抗体的诊断检测试剂盒，所述抗体与根据实施方式1至2中任一项所述的病毒或与其抗原性物质反应，或者与根据实施方式7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应，其特征在于所述检测试剂盒包含根据实施方式1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质，或者根据实施方式6所述的重组蛋白，或者根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7。

13.一种诊断检测试剂盒，其用于检测根据实施方式1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质，或者根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，其特征在于所述检测试剂盒包含与根据实施方式1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质反应，或者与根据实施方式6所述的重组蛋白反应，或者与根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应的抗体。

14.一种用于保护动物对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的方法，其通过对动物全身施用根据实施方式9或实施方式10所述的疫苗。

15.根据实施方式14所述的方法，其特征在于所述方法包括将根据实施方式1和2中任一项所述的病毒，或者根据实施方式6所述的重组蛋白，或者根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据实施方式3至5中任一项所述的核酸片段与药学上可接受的载体混合。

16.根据实施方式1和2中任一项所述的病毒，或者根据实施方式6所述的重组蛋白，或者根据实施方式7或实施方式8所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据实施方式3至5中任一项所述的核酸片段，其用于制备保护动物对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的疫苗。

Claims

2.根据权利要求1所述的分离的病毒，其特征在于与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的核苷酸序列编码外病毒衣壳糖蛋白VP7。

3.一种核酸片段，其包含开放阅读框，所述开放阅读框包含至少200个核苷酸，其特征在于所述核酸片段具有核苷酸序列，所述核苷酸序列对应于与SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列具有至少90％同一性水平的序列。

4.根据权利要求3所述的核酸片段，其特征在于所述开放阅读框编码外病毒衣壳糖蛋白VP7。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的核酸片段，其特征在于所述开放阅读框在异源启动子的控制下。

6.一种重组蛋白，其由根据权利要求3至5中任一项所述的核酸片段的所述开放阅读框编码。

7.一种外病毒衣壳糖蛋白VP7或其片段，其特征在于其是根据SEQ ID NO:2的蛋白，或者与其具有至少93％同一性水平的蛋白。

8.一种用于对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求1和2中任一项所述的病毒，或者免疫原性有效量的根据权利要求6所述的重组蛋白，或者免疫原性有效量的根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据权利要求3至5中任一项所述的核酸片段，以及药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其用于预防性治疗动物。

10.一种抗体或抗血清，其与根据权利要求1或权利要求2所述的病毒，或者与根据权利要求6所述的重组蛋白，或者与根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应。

11.一种用于检测抗体的诊断检测试剂盒，所述抗体与根据权利要求1至2中任一项所述的病毒或与其抗原性物质反应，或者与根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应，其特征在于所述检测试剂盒包含根据权利要求1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质，或者根据权利要求6所述的重组蛋白，或者根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7。

12.一种用于检测根据权利要求1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质，或者根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7的诊断检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含与根据权利要求1至2中任一项所述的病毒或其抗原性物质反应，或者与根据权利要求6所述的重组蛋白反应，或者与根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7反应的抗体。

13.一种用于保护动物对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的方法，其通过对动物全身施用根据权利要求8或根据权利要求9所述的疫苗。

14.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求1和2中任一项所述的病毒，或者根据权利要求6所述的重组蛋白，或者根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据权利要求3至5中任一项所述的核酸片段与药学上可接受的载体混合。

15.根据权利要求1和2中任一项所述的病毒，或者根据权利要求6所述的重组蛋白，或者根据权利要求7所述的外病毒衣壳糖蛋白VP7，或者根据权利要求3至5中任一项所述的核酸片段，其用于制备保护动物对抗由猪B组轮状病毒引起的感染的疫苗。