BR112021008904A2 - novo rotavírus porcino - Google Patents

Abstract

NOVO ROTAVÍRUS PORCINO. A presente invenção se refere a um novo rotavírus, especialmente um vírus isolado, que é um membro da subespécie de rotavírus porcino do grupo B (RVB porcino), causando doença diarreica em porcos, a fragmentos de DNA e proteínas correspondentes do referido vírus, a vacinas com base no referido vírus, DNA e/ou proteína e a anticorpos reativos ao referido vírus e/ou proteína e kits de teste de diagnóstico para a detecção do referido vírus.

Description

NOVO ROTAVÍRUS PORCINO

[001] A presente invenção se refere a um novo rotavírus causando doença diarreica em porcos, a fragmentos de ácido nucleico e proteínas correspondentes do referido vírus, a vacinas com base no referido vírus, ácido nucleico e/ou proteína e a anticorpos reativos com o referido vírus e/ou proteína e kits de teste de diagnóstico para a detecção do referido vírus.

ANTECEDENTES GERAIS

[002] Nas últimas décadas, observa-se um forte aumento no consumo de carne de porco em todo o mundo. Como consequência, observa-se um aumento no número e no tamanho das fazendas, a fim de atender as crescentes necessidades do mercado. Como é conhecido pela pecuária em geral, um grande número de animais que vivem juntos são vulneráveis a todos os tipos de doenças. Além disso, a criação de um grande número de animais aumenta o perigo de infecção por tais doenças. Uma dessas doenças que ocorrem especialmente em animais jovens, como porcos, é uma infecção por rotavírus.

[003] O rotavírus (RV) está bem estabelecido como uma das principais causas de gastroenterite aguda em crianças pequenas e animais, incluindo leitões amamentados e desmamados. A enterite rotaviral é uma doença leve a grave caracterizada por náuseas, vômitos, diarreia aquosa e febre baixa. Uma vez que um indivíduo é infectado pelo vírus, há um período de incubação de cerca de dois dias antes que os sintomas apareçam. O período de doença é agudo. Os sintomas geralmente começam com vômitos seguidos por quatro a oito dias de diarreia profusa. A desidratação é mais comum na infecção por rotavírus do que na maioria das causadas por patógenos bacterianos, e é a causa mais comum de morte relacionada à infecção por rotavírus. Além disso, esses rotavírus são um reservatório potencial para troca genética com rotavírus humanos. Como um patógeno de gado, principalmente em bezerros e leitões, os rotavírus causam perdas econômicas aos fazendeiros devido aos custos de tratamento associados a altas taxas de morbidade e mortalidade.

[004] Os RVs pertencem à família Reoviridae, possuem um genoma composto por 11 segmentos de RNA de fita dupla (dsRNA) e são atualmente classificados em oito grupos (A – H) com base em propriedades antigênicas e classificação baseada em sequência da proteína 6 de capsídeo viral interno (VP6). Embora RVA e RVC humanos tenham sido descritos ao redor do mundo, relatórios atuais indicam que cepas de RVB humanos foram descritas apenas na China. Os RVB porcinos foram identificados pela primeira vez na década de 1980.

[005] A caracterização sorológica e molecular das cepas de RVB é limitada devido à dificuldade de adaptação das cepas de RVB à cultura de células. A classificação de cepas de RVB porcinos com base nas identidades de pares dos genes que codificam a proteína VP7 de capsídeo externo foi proposta por Kuga et al., 2009 (Arch Virol. 2009; 154 (11): 1785-95) e Marthaler et al., 2012 (Virology. 10 de novembro de 2012; 433 (1): 85-96). Kuga et al. sequenciaram a VP7 de 38 cepas de RVB porcinos e construíram árvores filogenéticas e gráficos de frequência de identidade em pares para fins de classificação do genótipo G. Com base em suas análises, eles propuseram 5 genótipos que foram divididos adicionalmente em 12 agrupamentos, usando valores de corte de nucleotídeo de 67% e 76%. Marthaler et al. desenvolveu uma classificação VP7 adaptada (a seguir a “classificação de Marthaler”) usando cepas de RVB previamente publicadas e recentemente sequenciadas, resultando em 20 genótipos G com base em um valor de corte de identidade de nucleotídeo de 80%.

[006] As proteínas VP7 e VP4 de capsídeo externo de rotavírus foram bem estabelecidas para serem capazes de induzir anticorpos neutralizantes independentes (Greenberg et al., J. Virol., 1983, 47: 267-275; Hoshino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 8701-8704) e proteção associada contra doenças. Enquanto a VP4 está localizada na superfície do virion que se projeta como uma ponta, a VP7 é uma glicoproteína que forma a superfície externa do virion. Além de suas funções estruturais, ele determina o genótipo G da cepa e, junto com a VP4, está envolvido na imunidade à infecção.

[007] Recentemente, um surto de diarreia neonatal foi observado em leitões em uma fazenda na Espanha, embora as porcas tenham sido vacinadas contra RVA. Portanto, os anticorpos maternos contra RVA deveriam estar presentes no colostro devido à vacinação. Assim, amostras foram coletadas de indivíduos infectados e analisadas quanto à presença de vírus.

[008] Foi encontrada uma sequência de ácido nucleico pertencente a uma proteína VP7 de rotavírus B, que pode estar ligada à presença de RVB nas amostras. A presença de RVB nas amostras também poderia explicar as observações clínicas. A sequência de nucleotídeos quase completa que codifica a proteína VP7 é apresentada na SEQ ID NO: 1.

[009] Surpreendentemente foi descoberto por análises genéticas que a sequência de VP7 detectada nas amostras era geneticamente distinta das sequências de VP7 de genótipos RVB conhecidos. Assim, concluiu-se que os indivíduos sofriam de uma doença até então desconhecida causadora do tipo RVB.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[010] É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer um novo agente infeccioso associado à diarreia em porcos, bem como vacinas com o objetivo de proteger, ou seja, prevenir, melhorar e/ou tratar um porco contra a doença ou pelo menos reduzir os sintomas da doença e/ou diminuir a mortalidade da doença. Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer meios para detectar e identificar o agente infeccioso associado à doença.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção fornece um rotavírus isolado que é um membro da subespécie do genótipo G12 de rotavírus porcino do grupo B, que em sua forma de tipo selvagem causa diarreia (neonatal) em porcos, o referido vírus sendo caracterizado pelo fato de que tem um genoma viral compreendendo um quadro de leitura aberto tendo uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a mesma. Embora o presente vírus seja de fato um vírus de RNA, é comum expressar que um quadro de leitura aberto do genoma viral tem um nível de identidade correspondente a uma sequência de DNA particular. Como é comumente conhecido, isso expressa que a sequência de RNA real do genoma viral pode ser transcrita a partir dessa sequência de DNA.

[012] Além disso, a presente invenção fornece um fragmento de ácido nucleico (seja DNA ou RNA) compreendendo um quadro de leitura aberto compreendendo pelo menos 100 nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que referido fragmento de ácido nucleico tem um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO: 1, bem como uma proteína codificada pelo fragmento de ácido nucleico. Preferencialmente, o fragmento compreende mais de 100 nucleotídeos, como 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 730 até 740 nucleotídeos.

[013] A presente invenção fornece adicionalmente uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo, caracterizada pelo fato de ser codificada por um fragmento de ácido nucleico tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO: 1. Um exemplo de tal proteína é descrito na SEQ ID NO: 2.

[014] A presente invenção fornece adicionalmente uma vacina para proteger um porco contra uma infecção causada por RVB porcino, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vírus como descrito na presente invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[015] A presente invenção fornece adicionalmente uma vacina para proteger um porco contra uma infecção causada por RVB porcino, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo ou um fragmento de ácido nucleico como descrito na presente invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[016] A vacina pode ser usada em tratamento profilático de um animal.

[017] A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo ou antissoro reativo com um vírus ou com uma proteína ou com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo, como descrito na presente invenção.

[018] A presente invenção fornece adicionalmente um kit de teste de diagnóstico para a detecção de anticorpos reativos com um vírus ou com material antigênico do mesmo ou reativos com uma proteína ou reativos com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo como descrito na presente invenção.

[019] A presente invenção fornece adicionalmente um kit de teste de diagnóstico para a detecção de um vírus ou material antigênico do mesmo ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo, descrito na presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[020] Verificou-se que o agente causador dos sintomas da doença descritos acima pode estar ligado à presença de um novo rotavírus B (RVB), em particular uma doença que causa RVB do genótipo G12. Embora o RVB de genótipo G12 tenha sido isolado a partir de porcos doentes infectados com vários rotavírus (ver Marthaler 2012), esta é a primeira vez que um RVB de genótipo 12 é inequivocamente associado à doença em porcos. As análises genéticas revelaram que a sequência de nucleotídeos encontrada nas amostras pertence a um quadro de leitura aberto de uma proteína VP7 de capsídeo viral externo (em resumo: “proteína VP7 de capsídeo” ou “VP7”) de RVB. A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA está representada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos correspondente está representada na SEQ ID NO: 2.

[021] A identidade máxima do fragmento de DNA quase completo da SEQ ID NO: 1 com sequências de DNA conhecidas tem 87% de identidade com um gene VP7 porcino classificado como genótipo G12 incluído na proposta de classificação de Marthaler et al., 2012. A classificação VP7 proposta por Marthaler et al. resultou em 20 genótipos G com base em um valor de corte de identidade de nucleotídeo de 80%. No entanto, Marthaler et al. também relataram uma sobreposição entre identidades inter e intragenotípicas. Além disso, nenhum dos vírus RotaB de genótipo G12 já foi inequivocamente associado a doenças em porcos, muito menos à diarreia neonatal.

[022] Por esta razão, os inventores decidiram colocar provisoriamente a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 como pertencente a um novo vírus, especialmente um novo RVB porcino, em particular um RVB de um novo genótipo, o vírus contendo um gene que codifica VP7 com semelhanças mais altas com o genótipo G12 na classificação de Marthaler.

[023] Uma árvore filogenética que mostra a relação entre a sequência de DNA VP7 do novo vírus de acordo com a invenção com sequências VP7 conhecidas de RVB é fornecida na Figura 1, consistindo em duas subfiguras, a primeira denotada como "Figura B", a segunda denotada como “Figura A”. A árvore filogenética foi criada com o software MEGA-X usando o método de agrupamento de vizinhos, com deleção par a par em caso de lacunas ou inserções. Referência: Tamura K, et al., MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28: 2731–2739. O novo vírus é referido nesta árvore (primeira parte, seção inferior) como Novo RotaB VP7 Espanha.

[024] Assim, em uma modalidade, a presente invenção fornece a proteína VP7 codificada pelo fragmento de DNA de SEQ ID NO: 1 para uso como um antígeno em um método para proteger porcos contra uma infecção patogênica com RVB porcino e, em particular, contra uma infecção patogênica com RVB porcino do genótipo G12. A proteína VP7 é tipicamente compreendida em uma composição de vacina, ou seja, uma composição segura para ser administrada a porcos, e na qual VP7 é misturada com um carreador farmaceuticamente aceitável, como será descrito abaixo.

[025] Será entendido que, para esses genes e proteínas, podem existir variações naturais entre representantes individuais de rotavírus. Existem variações genéticas que levam a pequenas alterações, por exemplo, nas sequências de proteína de capsídeo, como VP7. Em primeiro lugar, há a chamada "oscilação na segunda e terceira bases" explicando que podem ocorrer alterações de nucleotídeos que permanecem despercebidas na sequência de aminoácidos que eles codificam: por exemplo, TTA, TTG, TCA, TCT, TCG e TCC tripletos todos codificam Leucina. Além disso, pequenas variações entre representantes do novo vírus de acordo com a invenção podem ser vistas na sequência de aminoácidos. Estas variações podem ser refletidas por (uma) diferença(s) de aminoácido(s) na sequência geral ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido(s) na referida sequência. As substituições de aminoácidos que não alteram essencialmente as atividades biológicas e imunológicas foram descritas, por exemplo, por Neurath et al. em “The Proteins” Academic Press New York (1979). As substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, MD, Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington DC, 1978, vol. 5, supl. 3). Outras substituições de aminoácidos incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val e Ala/Glu. Com base nestas informações, Lipman e Pearson desenvolveram um método para comparação rápida e sensível de proteínas (Science 227, 1435-1441, 1985) e determinação da similaridade funcional entre proteínas homólogas. Tais substituições de aminoácidos das modalidades exemplares desta invenção, bem como variações com deleções e/ou inserções estão dentro do escopo da invenção.

[026] Isso explica por que a proteína VP7, quando isolada a partir de diferentes representantes de um rotavírus porcino de acordo com a invenção, pode ter níveis de homologia que estão significativamente abaixo de 100%, embora adicionalmente representando a proteína VP7 do rotavírus porcino de acordo com a invenção.

[027] Isso é claramente refletido, por exemplo, na árvore filogenética na figura 3 do artigo de Marthaler et al., 2009 citado acima, onde é mostrado que mesmo dentro de um único clado as sequências de nucleotídeos que codificam VP7 não obstante têm sequências de nucleotídeos genômicos significativamente diferentes, de maneira geral.

[028] Assim, o vírus de acordo com a invenção é descrito, dentre outras coisas, como um vírus isolado sendo caracterizado pelo fato de que seu genoma compreende uma sequência de nucleotídeos que corresponde a uma sequência de nucleotídeos tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO: 1. Em particular, o vírus de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de ser um rotavírus, que é um membro da subespécie de rotavírus porcino do grupo B (RVB porcino), e em que a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO: 1 pertence a um quadro de leitura aberto que codifica uma VP7.

[029] Para o propósito desta invenção, um “nível de identidade” deve ser entendido como o nível de identidade da sequência de SEQ ID NO: 1 e/ou a região correspondente que codifica a VP7 de um rotavírus porcino e/ou a sequência de aminoácidos correspondente cujo nível de identidade deve ser determinado. Um programa adequado para a determinação de um nível de identidade é o programa blast de nucleotídeos (blastn) da Ferramenta Básica de Procura por Alinhamento Local de NCBFs, usando a opção "Alinhe duas ou mais sequências” e configurações padrão (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Nesse sentido, as identidades são baseadas no algoritmo Blastn (padrão) que é usado no BLAST (Stephen Altschul, Warren Gish, Webb Miller, Eugene Myers e David J. Lipmann no National Institutes of Health (NIH), Journal of Molecular Biology, 1990).

[030] O vírus de acordo com a invenção é tipicamente um vírus isolado. Para o propósito desta invenção, “isolado” significa: libertado do tecido com o qual o vírus está associado na natureza.

[031] Uma forma preferencial desta modalidade se refere a um vírus, como um vírus isolado, que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem um nível de identidade de pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo 100%, nessa ordem preferencialmente, com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1.

[032] O vírus de acordo com a invenção pode estar na forma viva, viva atenuada ou inativada. Como indicado acima, a sequência de DNA do gene que codifica a VP7 do vírus é caracterizada. A identificação da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como pertencente a uma ORF que codifica uma VP7 é altamente útil, uma vez que agora pode ser usada, dentre outras coisas, como uma base para vacinas de DNA ou RNA, para uso na preparação de vacinas de subunidade com base na proteína codificada, ou para fins de diagnóstico, como será explicado extensivamente abaixo.

[033] Portanto, em outra modalidade, a presente invenção se refere a um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) compreendendo um quadro de leitura aberto compreendendo pelo menos 100, preferencialmente pelo menos 200, mais preferencialmente pelo menos 300, 400 ou 500 nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que referido fragmento nucleico tem um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1, preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo 100%, nessa ordem preferencialmente, com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1.

[034] Em ainda outra modalidade, a presente invenção se refere a um fragmento de ácido nucleico como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o quadro de leitura aberto codifica uma VP7 ou um fragmento da mesma.

[035] O termo “fragmento do mesmo” como usado na presente invenção pode se referir a qualquer parte menor da proteína VP7 de comprimento total. Para uso na vacinação, tais partes devem ser adequadas para conferir propriedades imunogênicas, ou seja, o fragmento é funcional na indução de uma resposta imune no indivíduo vacinado, e isso pode ser designado como "fragmento imunogênico”.

[036] O fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser levado a uma forma adequada para a expressão heteróloga da proteína codificada. Tal forma pode ser um vetor ou outra forma adequada para a expressão heteróloga de ácido nucleico viral. Normalmente, o vetor contém um promotor adequado para expressão heteróloga. Assim, em uma modalidade preferencial, o fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está sob o controle de um promotor heterólogo ou é introduzido em um quadro de leitura aberto sob o controle de um promotor heterólogo.

[037] Portanto, em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma proteína, em particular uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo codificada pelo fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ou um fragmento do mesmo, produzido em um sistema de expressão heterólogo. Uma forma preferencial desta modalidade se refere a uma VP7 tendo a sequência de aminoácidos conforme representada na SEQ ID NO: 2.

[038] Tais VP7 do vírus de acordo com a invenção são adequadas para uso como um antígeno, em particular para uso como um antígeno em vacinas, mais especificamente em vacinas de subunidade. Adicionalmente, elas podem ser usadas para criar anticorpos. Além disso, possibilitam testes diagnósticos, conforme explicado a seguir.

[039] Adicionalmente, a presente invenção fornece as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos de todas as regiões codificantes das diferentes proteínas do novo vírus, confirmando que o novo vírus pertence a um rotavírus. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos fornecidas pela presente invenção são fornecidas pela SEQ ID NO. 1-22 da seguinte forma: Segmento, Nº Tipo Proteína Sequência, Nº 1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 3 1 Aminoácido VP1 Pol SEQ ID NO: 4 2 Nucleotídeo SEQ ID NO: 5

2 Aminoácido VP2 SEQ ID NO: 6 3 Nucleotídeo SEQ ID NO: 7 3 Aminoácido VP3 SEQ ID NO: 8 4 Nucleotídeo SEQ ID NO: 9 4 Aminoácido VP4 (VP8*, VP5*) SEQ ID NO: 10 5 Nucleotídeo SEQ ID NO: 11 5 Aminoácido NSp1 SEQ ID NO: 12 6 Nucleotídeo SEQ ID NO: 13 6 Aminoácido VP6 SEQ ID NO: 14 7 Nucleotídeo SEQ ID NO: 15 7 Aminoácido NSp3 SEQ ID NO: 16 8 Nucleotídeo SEQ ID NO: 17 8 Aminoácido NSp2 SEQ ID NO: 18 9 Nucleotídeo SEQ ID NO: 1 9 Aminoácido VP7 SEQ ID NO: 2 10 Nucleotídeo SEQ ID NO: 19 10 Aminoácido NSp4 SEQ ID NO: 20 11 Nucleotídeo SEQ ID NO: 21 11 Aminoácido NSp5 SEQ ID NO: 22 * VP4 é um quadro de leitura aberto que codifica uma pré-proteína que é subsequentemente clivada em VP5 e VP8.

[040] Assim, o vírus de acordo com a invenção pode adicionalmente ser descrito como um vírus isolado sendo caracterizado pelo fato de que seu genoma compreende sequências de nucleotídeos que correspondem a sequências de nucleotídeos, cada uma tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com as sequências de nucleotídeos descritas acima codificando as proteínas dos Segmentos 1-11, ou seja, as sequências de nucleotídeos da SEQ ID

NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21.

[041] É um dos méritos da presente invenção que agora seja possível, pela primeira vez, analisar a presença ou ausência do novo rotavírus nos vários órgãos e fluidos corporais de porcos que sofrem de diarreia viral, ou outros sinais e sintomas associados a infecção por rotavírus e para tratar a doença ou prevenir o surto da doença em animais saudáveis administrando ao animal uma vacina conforme descrito a seguir.

[042] Uma “vacina” de acordo com a presente invenção é uma composição farmacêutica que é segura para administrar a um indivíduo animal e é capaz de induzir imunidade protetora nesse animal contra um microrganismo patogênico, ou seja, induzir uma proteção contra o microrganismo.

[043] “Proteção” contra um microrganismo significa ajudar a prevenir, melhorar e/ou tratar (incluindo curar) uma infecção patogênica com esse microrganismo ou um distúrbio decorrente dessa infecção, por exemplo, para prevenir ou reduzir um ou mais sinais clínicos resultantes da infecção com o patógeno.

[044] Assim, outra modalidade da presente invenção se refere a uma vacina para proteger, ou seja, prevenir, melhorar e/ou tratar, contra uma infecção por rotavírus em porcos, em particular infecções causadas por RVB porcino, ainda mais particularmente infecções causadas por RVB porcino do genótipo G12, em que tais vacinas compreendem um vírus de acordo com a invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. Proteger a este respeito deve, portanto, ser interpretado como incluindo a vacinação, a fim de prevenir o aparecimento da doença, ou seja, diarreia (neonatal) ou gastroenterite causada por infecção viral, bem como vacinação para diminuir os sintomas da doença.

[045] Preferencialmente, a vacina de acordo com a invenção é usada para prevenir a doença dado o curto período de tempo entre a infecção e o aparecimento da doença de cerca de dois dias e dado que a diarreia viral é altamente contagiosa.

[046] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma vacina para proteção contra diarreia neonatal causada por infecção com RVB porcino. Portanto, a presente invenção é adicionalmente dirigida a uma vacina para vacinação de porcas.

[047] “Vacinação de porcas” na presente invenção significa imunização pré- parto de porcas para transmitir imunidade passiva aos leitões e fornecer proteção contra uma infecção com o RVB porcino, como descrito na presente invenção. Ao induzir anticorpos na fêmea, os leitões alcançam proteção adequada contra a infecção por meio da ingestão de colostro do animal vacinado. Portanto, um antígeno que mostrou ter um efeito protetor em leitões pode ser útil para vacinar porcas para chegar a um efeito protetor claro em leitões, tipicamente pelo menos na janela entre o dia 0 e o dia 21 após o nascimento.

[048] A presente invenção, portanto, também se refere ao uso de uma vacina como descrito na presente invenção para vacinação de uma porca fêmea e permitindo que o leitão tome colostro da porca fêmea vacinada. Para obter uma proteção ideal, o colostro é normalmente absorvido dentro de 48 horas, em particular nas 24 horas após o nascimento do leitão.

[049] Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para uso em uma vacina de acordo com a invenção são, por exemplo, água estéril, solução salina e tampões aquosos como PBS. Além disso, uma vacina de acordo com a invenção pode compreender outros aditivos, tais como adjuvantes, estabilizadores, antioxidantes e outros, conforme descrito abaixo.

[050] Uma vacina de acordo com a invenção pode compreender o vírus de acordo com a invenção na forma viva atenuada ou inativada.

[051] As vacinas de vírus vivos atenuados, ou seja, as vacinas que compreendem o vírus de acordo com a invenção em uma forma atenuada viva, têm a vantagem sobre as vacinas inativadas de que elas imitam melhor a forma natural de infecção. Além disso, suas habilidades de replicação permitem a vacinação com baixas quantidades de vírus; seu número aumentará automaticamente até atingir o nível de gatilho do sistema imunológico. A partir desse momento, o sistema imunológico será acionado e finalmente eliminará os vírus. Um vírus vivo atenuado é um vírus que apresenta um nível de virulência reduzido quando comparado a vírus isolados a partir do campo. Um vírus com um nível de virulência reduzido é considerado um vírus que não causa os sintomas típicos de infecção viral. Uma possível desvantagem do uso de vírus atenuados vivos, entretanto, pode ser que inerentemente existe um certo nível de virulência restante. Esta não é uma desvantagem real, desde que o nível de virulência seja aceitável, ou seja, desde que a vacina pelo menos evite que os porcos sofram de diarreia ou outros sintomas típicos da infecção. Obviamente, quanto menor for a virulência de repouso da vacina viva atenuada, menor será a influência da vacinação no ganho de peso durante/após a vacinação. Portanto, uma forma preferencial desta modalidade da invenção refere-se a uma vacina compreendendo um vírus de acordo com a invenção em que o referido vírus está em uma forma atenuada viva.

[052] Os vírus atenuados podem, por exemplo, ser obtidos cultivando os vírus de acordo com a invenção na presença de um agente mutagênico, seguido pela seleção do vírus que mostra uma diminuição no nível de progênie e/ou na velocidade de replicação. Muitos desses agentes são conhecidos na técnica.

[053] As vacinas inativadas são, em contraste com suas contrapartes vivas atenuadas, inerentemente seguras, porque não há virulência de repouso restante. Apesar de geralmente compreenderem uma dose um pouco maior de vírus em comparação com as vacinas atenuadas vivas, podem, por exemplo, ser a forma preferencial de vacina em porcos que já sofrem de outras doenças. Os porcos mantidos em condições abaixo do ideal, como nutrição incompleta ou alojamento abaixo do ideal, também se beneficiariam com as vacinas inativadas.

[054] Portanto, outra forma preferencial desta modalidade se refere a uma vacina compreendendo um vírus de acordo com a invenção em que o referido vírus está em uma forma inativada.

[055] A forma padrão de inativação é um tratamento clássico com formaldeído. Outros métodos bem conhecidos na técnica para inativação são radiação UV, radiação gama, tratamento com etilenoimina binária e timerosal. O técnico no assunto sabe como aplicar esses métodos. Preferencialmente, o vírus de acordo com a invenção é inativado com β-propiolactona, glutaraldeído, etilenoimina ou formaldeído. Nem é preciso dizer que outras maneiras de inativar o vírus também estão incorporadas na presente invenção.

[056] Embora o rotavírus inativado inteiro forneça uma boa base para vacinas, sua produção pode ser cara e trabalhosa. Em particular, a adaptação de cepas de RVB porcinos para cultura de células ainda é considerada difícil na técnica (Sanekata et al., J Clin Microbiol. Março de 1996; 34 (3): 759–761).

[057] Uma abordagem alternativa é desenvolver vacinas de subunidade ou recombinantes expressando uma ou mais proteínas de rotavírus ou partes imunogênicas das mesmas que retêm os epítopos neutralizantes necessários para o reconhecimento eficaz pela célula hospedeira. Tanto VP7 quanto VP4, os dois componentes proteicos do capsídeo externo, reagem com anticorpos neutralizantes, e os anticorpos monoclonais (MAbs) direcionados a qualquer uma dessas proteínas são capazes de neutralizar o rotavírus.

[058] VP7 é a principal proteína de capsídeo externo e é principalmente responsável por determinar as características antigênicas virais. É uma glicoproteína altamente imunogênica e, portanto, uma candidata primária para inclusão em uma vacina de subunidade. Assim, uma alternativa atraente para o uso de vírus inteiros é o uso de subunidades de rotavírus, mais preferencialmente o uso da subunidade formada por VP7. As subunidades formadas por VP7 têm a vantagem de não precisarem ser inativadas antes do uso em uma vacina e, portanto, têm a vantagem adicional de serem intrinsecamente seguras. Adicionalmente, sistemas de clonagem e expressão heteróloga para a produção heteróloga de tais subunidades estão disponíveis e estabelecidos na técnica, como descrito abaixo. Adicionalmente, foi demonstrado que VP7 recombinante medeia determinantes antigênicos nativos na ausência de outras proteínas de rotavírus (Khodabandehloo et al., Iran J Public Health. 2012; 41(5): 73–84.).

[059] As vacinas recombinantes também podem ser fornecidas como constructo de ácido nucleico contendo vacinas, tais como vacinas de DNA e RNA, incluindo RNA mensageiro sintético, replicons de RNA e vetores de DNA nus. Uma dessas estratégias de vacinação inclui o uso de partículas de RNA replicon (RP) derivadas de alfavírus [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13 (1): 1-9. (2012) doi: 10.1017/S1466252312000011; Kamrud et al., J Gen Virol. 91 (Pt 7): 1723-1727 (2010)] que foram desenvolvidos a partir de vários alfavírus diferentes, incluindo o vírus da encefalite equina venezuelana 25 (VEE) [Pushko et al., Virology 239: 389-401 (1997)], Sindbis (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67: 6439-6446 (1993)], e vírus da floresta Semlik (SFV) [Liljestrom e Garoff, Biotechnology (NY) 9: 1356- 1361 (1991)]. As vacinas RP liberam replicons de RNA de alfavírus com defeito de propagação nas células hospedeiras e resultam na expressão do(s) transgene(s) antigênico(s) desejado(s) in vivo [Pushko et al., Virology 30 239 (2): 389-401 (1997)]. As RPs têm um perfil atraente de segurança e eficácia quando comparadas a algumas formulações de vacinas tradicionais [Vander Veen, et al. Anim Health 6 Res Rev. 13 (1):1-9. (2012)]. A plataforma de RP tem sido usada para codificar antígenos patogênicos e é a base para várias vacinas licenciadas por USDA para suínos e aves.

[060] Assim, outra modalidade da presente invenção se refere a vacinas para proteger, ou seja, prevenir, melhorar ou tratar, um porco contra uma infecção por rotavírus, em particular infecções causadas por RVB porcino, ainda mais particularmente infecções causadas por RVB porcino do genótipo G12, em que tais vacinas compreendem uma quantidade imunogenicamente eficaz da proteína VP7 ou fragmentos imunogênicos da mesma, ou constructos de ácido nucleico correspondentes, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[061] A expressão do rotavírus VP7 foi relatada na técnica para E. coli, vírus da herpes, vírus vaccinia em células de mamíferos e baculovírus. No entanto, a maioria deles não era proteína VP7 de comprimento total. Técnica avançada para ancorar o rotavírus símio SA11 VP7 à superfície de células eucarióticas (VP7sc) foi feita usando vírus vaccinia recombinante e adenovírus. A proteína VP7 expressa parecia ser tanto antigênica quanto imunogênica e induzia proteção passiva contra doença por rotavírus em camundongos (ambos et al., Virology. 1993; 193:940–950).

[062] Usar o sistema certo para a expressão do gene viral é muito importante na produção de proteína recombinante biologicamente ativa. O sistema de expressão de baculovírus tem algumas características únicas que o tornam o sistema de escolha para muitas expressões de proteínas, como solubilidade, dobramento correto, clivagem do peptídeo sinal, oligomerização, atividade funcional, fosforilação e glicosilação de proteínas recombinantes. O baculovírus tem sido usado com sucesso na técnica como um sistema de expressão para a produção de proteínas de rotavírus (McGonigal TP et al., Virus Res. 1992; 23 (1–2): 135–150; Redmont MJ et al., Vaccine. 1993; 11: 273–281.;

Fiore L. et al., J Gen Virol. 1995; 76 (Pt 8): 1981–1988). O sistema de baculovírus é, portanto, um candidato à expressão de VP7 na medida em que oferece a possibilidade de síntese de uma proteína recombinante em alto rendimento com os requisitos conformacionais necessários para permitir estudos imunológicos e funcionais (Fiore L et al., J Gen Virol. 1995; 76 (Pt 8): 1981–1988; Ishida SI et al. J clin Microbiol. 1996;34(7):1694–1700).

[063] De longe, a maioria dos sistemas de expressão atualmente em uso para fazer proteínas de capsídeo de rotavírus são sistemas de expressão baseados em baculovírus. Métodos para produção de proteínas de capsídeo de rotavírus altamente imunogênicas em sistemas de expressão baseados em baculovírus foram, por exemplo, descritos na técnica (McGonigal TP et al., Virus Res. 1992; 23 (1–2): 135-150).

[064] Além disso, os sistemas de expressão de baculovírus e vetores de expressão de baculovírus em geral foram descritos extensivamente em manuais (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual. Por David R. O'Reilly, Lois K. Miller e Verne A. Luckow. Editor: Oxford University Press, EUA, maio de 1994; e Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. In: Methods in Molecular Biology™, Volume 388 (2007). Editores: David W. Murhammer).

[065] Os sistemas de expressão baseados em baculovírus também estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir da Invitrogen Corporation, 1600 Avenida Faraday, Carlsbad, California 92008, EUA. Uma alternativa para sistemas de expressão baseados em baculovírus são os sistemas de expressão baseados em levedura. Os sistemas de expressão de levedura são, por exemplo, descritos em: Produção de proteínas recombinantes: novos sistemas de expressão microbiana e eucariótica por Gerd Gellissen, ISBN: 3-527-31036-3. Os sistemas de expressão prontos para usar, dentre outras coisas, estão disponíveis comercialmente na Research Corp. Technologies, 5210 East Williams Circle, Suite

240, Tucson, AZ 85711-4410 EUA. Os sistemas de expressão de leveduras e células de insetos também estão, por exemplo, comercialmente disponíveis em Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, Califórnia 94303-4607, EUA. Alternativamente, a expressão recombinante pode ser realizada usando a tecnologia de Sistema de Plataforma Alpha Vaccine AlphaVax® usando partículas de replicon viral (RP) com base em um alfavírus modificado.

[066] Portanto, VP7 ou fragmentos da mesma podem ser obtidos por expressão heteróloga de uma ORF compreendendo o gene que codifica VP7 ou um fragmento da mesma em um sistema de expressão adequado, tal como um sistema de expressão de baculovírus. VP7 recombinante ou fragmentos da mesma podem ser prontamente produzidos em grandes quantidades e são altamente imunogênicos.

[067] A expressão de VP7 recombinante ou fragmentos da mesma é, evidentemente, também possível em sistemas de expressão baseados em células de mamíferos como conhecido na técnica, mas esses sistemas seriam provavelmente mais caros de usar, quando comparados aos sistemas de expressão baseados em baculovírus.

[068] A quantidade de VP7 recombinante em uma vacina é tipicamente cerca de 1 a 10 vezes, preferencialmente 2 a 5 vezes, a quantidade usada para a vacina de vírus inteiro. Por exemplo, Khodabandehloo et al., Iran J Public Health. 2012; 41(5): 73–84 relataram um título de anticorpo para VP7 recombinante, que é cerca de quatro vezes menor em comparação com anticorpos contra o vírus inteiro, o que é explicado pela presença adicional da VP4 imunogênica no vírus inteiro. Normalmente, uma quantidade entre 1 e 100 μg da VP7 recombinante seria muito adequada como dose de vacina. Uma quantidade de até 500 µg pode ser necessária no caso de uso de fragmentos imunogênicos de VP7, em que a quantidade necessária para atingir a imunização depende do comprimento da proteína recombinante. Do ponto de vista dos custos, uma quantidade preferencial estaria na faixa de 1-50 μg de VP7 recombinante, mais preferencialmente na faixa de 1-25 μg. A via de administração seria comparável à de partículas de vírus inteiro inativado.

[069] Uma vacina de acordo com a invenção com base em vírus inteiro inativado ou VP7 recombinante ou um fragmento imunogênico da mesma compreende preferencialmente um adjuvante. Adjuvantes convencionais, bem conhecidos na técnica são, por exemplo, Adjuvante Completo e Incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloco não iônicos, dipeptídeos de muramil, Quill A®, óleo mineral, por exemplo, Bayol® ou Markol®, óleo vegetal e Carbopol® (um homopolímero) ou Diluvac® Forte. A vacina também pode compreender um denominado "veículo". Um veículo é um composto ao qual o polipeptídeo adere, sem estar covalentemente ligado a ele. Os compostos de veículo frequentemente usados são, por exemplo, hidróxido de alumínio, - fosfato ou -óxido, sílica, caulino e bentonita.

[070] Em princípio, uma vacina de acordo com a invenção pode ser administrada apenas uma vez. No entanto, especialmente no caso de vacinas inativadas, sejam vacinas de vírus inteiros, VP7 recombinante ou fragmentos imunogênicos, preferencialmente é dada uma primeira e talvez até uma segunda vacinação de reforço. Normalmente, um primeiro reforço seria administrado pelo menos duas semanas após a primeira vacinação. Um momento muito adequado para uma vacinação de reforço é entre 3 e 16 semanas após a primeira vacinação. Um segundo reforço, se necessário, seria normalmente administrado entre 4 e 50 semanas após o primeiro reforço.

[071] Uma alternativa para a abordagem de vacina de vírus inteiro inativado e a abordagem de VP7 recombinante é o uso de vetores de não rotavírus recombinantes vivos que têm porcos como seu animal hospedeiro,

como carreadores do novo gene RVB VP7 porcino ou um fragmento imunogênico do mesmo.

[072] Entre os vetores não rotavírus recombinantes adequados que têm porcos como seu animal hospedeiro, dois vetores são especialmente adequados como carreadores: Vírus da pseudoraiva (PRV) e Vírus da Peste Suína Clássica (CSFV). O uso de tais vírus recombinantes em vacinas tem a vantagem adicional de que os animais vacinados se tornam ao mesmo tempo vacinados contra PRV e RVB ou CSFV e RVB.

[073] Os vetores de CSFV vivos atenuados também são muito adequados como vetores recombinantes vivos. Apenas como exemplo; CSFV vivo atenuado a partir do qual o N<pro> gene foi deletado, foi descrito por Mayer et al. (Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1987). Tal vírus vivo atenuado permite, dentre outras coisas, no local da deleção do N<pro> gene, a inserção do gene VP7. Esse vetor CSFV recombinante vivo forma igualmente um carreador adequado para o gene VP7 da presente invenção.

[074] A expressão do gene VP7 ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção pode ser colocada sob o controle de qualquer promotor heterólogo adequado que é funcional em uma célula de mamífero (ver abaixo). Um promotor heterólogo é um promotor que não é o promotor responsável pela transcrição do gene VP7 na forma de tipo selvagem do novo rotavírus porcino de acordo com a invenção. Pode ser um promotor de rotavírus responsável pela transcrição de VP7 de outro rotavírus, que não pertence ao vírus de acordo com a invenção ou pode ser um promotor não rotavírus.

[075] Portanto, outra modalidade da presente invenção refere-se a um fragmento de DNA compreendendo um gene que codifica uma VP7 ou um fragmento da mesma de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que referido gene está sob o controle de um promotor heterólogo funcional. Um promotor que é funcional em uma célula de mamífero é um promotor que é capaz de conduzir a transcrição de um gene que está localizado a jusante do promotor em uma célula de mamífero.

[076] Exemplos de promotores adequados que são funcionais em uma célula de mamífero incluem promotores clássicos, tais como o promotor precoce imediato de citomegalovírus (humano) (Seed, B. et al., Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993), vírus do sarcoma de Rous LTR (RSV, Gorman, C.M. Et al., PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan et al., supra; Ulmer et al., Supra), o MPSV LTR (Stacey et al., J. Virology 50, 725-732, 1984), promotor precoce imediato SV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773, 1983), o promotor SV-40 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), o promotor da metalotioneína (Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), o promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), o principal promotor tardio de Ad2 e o promotor β-actina (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992). As sequências regulatórias também podem incluir sequências de terminação e poliadenilação. Entre as sequências que podem ser usadas estão a conhecida sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, a sequência de poliadenilação do SV40, as sequências de poliadenilação e terminador do citomegalovírus humano (hCMV).

[077] Assim, outra forma desta modalidade se refere a uma vacina para proteger um porco contra uma infecção causada por RVB, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende um vetor não RVB recombinante vivo compreendendo um fragmento de DNA compreendendo um gene que codifica uma VP7 ou um fragmento imunogênico da mesma de acordo com a invenção sob o controle de um promotor funcional e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[078] Adicionalmente, o vetor não RVB recombinante vivo deve expressar uma quantidade imunogenicamente eficaz de VP7 ou fragmento imunogênico da mesma.

[079] Uma alternativa para a vacinação com uma vacina de vírus inteiro inativado, uma vacina VP7 recombinante ou um vetor não RVB recombinante vivo, é o uso da vacinação de DNA.

[080] Tal vacinação de DNA é baseada na introdução de um fragmento de DNA portador do gene que codifica a VP7 de acordo com a invenção sob o controle de um promotor adequado, no animal hospedeiro. Uma vez que o DNA é absorvido pelas células do hospedeiro, o gene que codifica a VP7 ou fragmento da mesma é transcrito e o transcrito é traduzido em VP7 nas células do hospedeiro. Isso imita de perto o processo natural de infecção do rotavírus. Os promotores adequados são promotores que são funcionais em células de mamíferos, como exemplificado acima.

[081] Um fragmento de DNA contendo o gene que codifica a VP7 ou fragmento da mesma sob o controle de um promotor adequado poderia ser, por exemplo, um plasmídeo. Este plasmídeo pode ter uma forma circular ou linear.

[082] Exemplos de vacinação bem-sucedida de DNA de porcos são, dentre outras coisas, a vacinação bem-sucedida contra a doença de Aujeszky, como descrito em Gerdts et al., Journal of General Virology 78: 2139-2146 (1997). Eles descrevem uma vacina de DNA em que é usado um fragmento de DNA que carreia a glicoproteína C sob o controle do principal promotor precoce imediato de citomegalovírus humano. A vacinação foi realizada quatro vezes com intervalo de duas semanas com quantidade de 50 μg de DNA. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos séricos que reconheceram o respectivo antígeno em um imunoblot e que exibiram atividade neutralizante.

[083] Outro exemplo de vacinação de DNA de porcos bem-sucedida é dado por Gorres et al., Clinical Vaccine Immunology 18: 1987-1995 (2011). Eles descreveram a vacinação de DNA bem-sucedida de porcos contra a gripe suína H1N1 pandêmica e clássica. Eles vacinaram com uma vacinação inicial e 2 reforços homólogos 3 e 6 semanas após a iniciação, de uma vacina de DNA compreendendo o gene HA de influenza H1N1 sob o controle de um promotor funcional. Portanto, novamente outra forma desta modalidade se refere a uma vacina para proteger um porco contra uma infecção causada por RVB, caracterizada pelo fato de que referida vacina compreende um fragmento de DNA compreendendo um gene VP7 ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção sob o controle de um gene funcional promotor e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[084] Adicionalmente, o fragmento de DNA compreendendo um gene que codifica VP7 ou fragmento da mesma de acordo com a invenção deve expressar uma quantidade imunogenicamente eficaz de VP7 ou fragmento imunogênico da mesma.

[085] O que constitui uma “quantidade imunogenicamente eficaz” de uma vacina de acordo com a invenção que é baseada em um vírus completo de acordo com a invenção, VP7 recombinante de acordo com a invenção ou fragmento imunogênico da mesma, um vetor recombinante vivo ou uma vacina de DNA de acordo com a invenção depende do efeito desejado e no organismo alvo. O termo “quantidade imunogenicamente eficaz” tal como usado na presente invenção refere-se à quantidade de vírus, proteína recombinante, vetor recombinante vivo ou vacina de DNA que é necessária para induzir uma resposta imune em porcos na medida em que diminui os efeitos patológicos causados pela infecção com um rotavírus de tipo selvagem, quando em comparação com os efeitos patológicos causados pela infecção com um rotavírus de tipo selvagem em porcos não imunizados.

[086] A determinação de se um tratamento é "imunologicamente eficaz" pode ser alcançada, por exemplo, administrando uma infecção de inoculação experimental a animais vacinados e em seguida determinando os sinais clínicos de doença de um animal alvo, parâmetros sorológicos ou medindo o reisolamento do patógeno, seguido pela comparação desses achados com aqueles observados em porcos infectados em campo.

[087] A quantidade de vírus administrada dependerá da via de administração, da presença de um adjuvante e do momento da administração.

[088] Uma quantidade preferencial de uma vacina viva compreendendo vírus de acordo com a invenção é expressa, por exemplo, como Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos (TCID50). Por exemplo, para um vírus vivo, uma faixa de dose entre 10 e 109 de TCID50 por animal pode ser vantajosamente usada, dependendo da virulência de repouso do vírus. Preferencialmente, uma faixa entre 102 e 106 de TCID50 é usada.

[089] Muitas maneiras de administração podem ser aplicadas, todas conhecidas na técnica. As vacinas de acordo com a invenção são preferencialmente administradas ao animal por injeção (intramuscular ou por via intraperitoneal) ou per os.

[090] O protocolo de administração pode ser otimizado de acordo com a prática de vacinação padrão. Em todos os casos, a administração por meio de um injetor intradérmico (IDAL) é uma maneira de administração. Se uma vacina compreende vírus inativado ou proteína recombinante de acordo com a invenção, a dose também seria expressa como o número de partículas de vírus a serem administradas. A dose normalmente seria um pouco mais alta quando comparada à administração de partículas de vírus vivos, porque as partículas de vírus vivos se replicam até certo ponto no animal alvo, antes de serem removidas pelo sistema imunológico. Para vacinas com base em vírus inativado, uma quantidade de partículas de vírus na faixa de cerca de 104 a 109 partículas normalmente seriam adequadas. A quantidade pode depender do adjuvante usado, mas normalmente está dentro da faixa definida.

[091] Se uma vacina compreender proteína recombinante de acordo com a invenção, a dose também pode ser expressa em microgramas de proteína. Para vacinas com base em proteína recombinante, uma dose adequada estaria geralmente na faixa entre 1 e 500 microgramas de proteína. A dose, novamente, pode depender do adjuvante usado.

[092] Se uma vacina compreende um fragmento de DNA compreendendo um gene que codifica VP7, a dose seria expressa em microgramas de DNA. Uma dose adequada normalmente estaria na faixa entre 5 e 500 microgramas de DNA. A dose pode depender, dentre outras coisas, da eficiência do plasmídeo de expressão utilizado. Normalmente, uma quantidade entre 20 e 50 microgramas de plasmídeo por animal seria suficiente para uma vacinação eficaz.

[093] Uma vacina de acordo com a invenção pode assumir qualquer forma que seja adequada para administração no contexto de criação de porcos, e que corresponda à via de aplicação desejada e ao efeito desejado. A preparação de uma vacina de acordo com a invenção é carreada por meios convencionais para o técnico no assunto.

[094] Para administração oral, a vacina é preferencialmente misturada com um carreador adequado para administração oral, ou seja, celulose, alimento ou uma substância metabolizável como alfa-celulose ou diferentes óleos de origem vegetal ou animal.

[095] Na prática, os suínos são vacinados contra vários vírus ou microrganismos patogênicos.

[096] Portanto, é altamente atraente, tanto por razões práticas quanto econômicas, combinar uma vacina de acordo com a invenção para porcos com, por exemplo, um imunógeno adicional de um vírus ou microrganismo patogênico para porcos, ou informações genéticas que codificam um imunógeno do referido vírus ou microrganismo.

[097] Assim, uma forma preferencial desta modalidade se refere a uma vacina de acordo com a invenção, em que essa vacina compreende pelo menos um outro microrganismo patogênico de porco ou vírus patogênico de porco e/ou pelo menos um outro componente imunogênico e/ou material genético que codifica o referido outro componente imunogênico, do referido microrganismo patogênico de porcos ou vírus patogênico de porcos. Um imunógeno ou componente imunogênico é um composto que induz uma resposta imune em um animal. Pode ser, por exemplo, um vírus ou bactéria inteira, ou uma proteína ou uma fração de açúcar desse vírus ou bactéria.

[098] Os vírus e microrganismos patogênicos mais comuns que são patogênicos para suínos são Brachyspira hyodysenteriae, vírus da Febre Suína Africana, vírus Nipah, circovírus porcino, Torque Teno vírus porcino, vírus da pseudoraiva, vírus da influenza porcina, parvovírus porcino, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRS), vírus da diarreia epidêmica porcina (PEDV), vírus da febre aftosa, vírus da gastroenterite transmissível, Rotavírus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae e Actinobacillus pleuropneumoniae.

[099] Portanto, uma forma mais preferencial da invenção se refere a uma vacina de acordo com a invenção, em que o vírus ou microrganismo patogênico para suínos é selecionado a partir do grupo de Brachyspira hyodysenteriae, Vírus da Febre Suína Africana, vírus Nipah, circovírus porcino, Torque Teno vírus porcino, vírus da pseudoraiva, vírus da influenza porcina, parvovírus porcino,

vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRS), vírus da diarreia epidêmica porcina (PEDV), vírus da febre aftosa, vírus da gastroenterite transmissível, Rotavírus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae e Actinobacillus pleuropneumoniae.

[100] Ainda outra modalidade se refere a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, em que o método compreende a mistura de um vírus de acordo com a invenção e/ou uma proteína recombinante de acordo com a invenção e/ou um fragmento de DNA que codifica uma VP7 ou um fragmento da mesma de acordo com a invenção e/ou um vetor não rotavírus recombinante vivo que codifica uma VP7 ou um fragmento da mesma de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[101] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um vírus de acordo com a invenção e/ou uma proteína recombinante e/ou uma VP7 ou um fragmento imunogênico da mesma de acordo com a invenção e/ou um fragmento de DNA que codifica uma VP7 ou um fragmento imunogênico da mesma de acordo com a invenção e/ou um vetor não rotavírus recombinante vivo que codifica uma VP7 ou um fragmento imunogênico da mesma de acordo com a invenção, para uso em uma vacina.

[102] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para a preparação de uma vacina como definido na presente invenção, caracterizado pelo fato de que referido método compreende a mistura de um vírus, ou uma quantidade imunogeneticamente eficaz de uma VP7 ou de um fragmento imunogênico da mesma ou de um vetor recombinante que codifica a VP7 ou o fragmento imunogênico da mesma, conforme definido na presente invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[103] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um vírus, um fragmento de DNA, uma VP7 ou um fragmento imunogênico da mesma, ou um vetor recombinante que codifica a VP7 ou fragmento imunogênico da mesma, como definido na presente invenção, para uso na fabricação de uma vacina para proteger um porco contra uma infecção causada por RVB porcino.

[104] Como mencionado acima, a infecção por rotavírus é altamente contagiosa. Isso significa que é importante saber se o rotavírus está presente em uma determinada população de porcinos muito antes de os primeiros sinais clínicos se manifestarem. Assim, para uma proteção eficiente contra doenças, uma detecção rápida e correta da presença de rotavírus é importante.

[105] Portanto, é outro objetivo desta invenção fornecer ferramentas de diagnóstico adequadas para a detecção de uma infecção de um vírus de acordo com a invenção.

[106] Essas ferramentas dependem parcialmente da disponibilidade de anticorpos contra o vírus. Esses anticorpos podem, por exemplo, ser usados em testes de diagnóstico de infecção por rotavírus. Os anticorpos ou antissoro compreendendo anticorpos contra o vírus de acordo com a invenção podem ser rápida e facilmente obtidos através da vacinação de, por exemplo, porcos, aves ou, por exemplo, coelhos com o vírus de acordo com a invenção seguido, após cerca de quatro semanas, por sangramento, centrifugação do sangue coagulado e decantação do soro. Tais métodos são bem conhecidos na técnica.

[107] Outros métodos para a preparação de anticorpos criados contra o vírus de acordo com a invenção, que podem ser policlonais, monoespecíficos ou monoclonais (ou derivados dos mesmos) são também bem conhecidos na técnica. Se forem desejados anticorpos policlonais, as técnicas para a produção e processamento de soros policlonais são bem conhecidas na técnica há décadas. Os anticorpos monoclonais, reativos contra o vírus de acordo com a invenção podem ser preparados imunizando camundongos consanguíneos por técnicas também conhecidas há muito tempo na técnica.

[108] Assim, outra modalidade da presente invenção refere-se a anticorpos ou antissoros que são reativos com o vírus de acordo com a invenção.

[109] Um kit de teste de diagnóstico baseado na detecção de um vírus de acordo com a invenção ou material antigênico desse vírus e, portanto, adequado para a detecção de infecção por RVB pode, por exemplo, compreender um teste ELISA padrão. Em um exemplo de tal teste, as paredes dos poços de uma placa de ELISA são revestidas com anticorpos dirigidos contra o vírus. Após a incubação com o material a ser testado, anticorpos marcados reativos com o vírus são adicionados aos poços. Se o material a ser testado compreenderia de fato o novo vírus de acordo com a invenção, este vírus ligaria-se aos anticorpos revestidos nas cavidades do ELISA. Os anticorpos marcados reativos com o vírus que seriam subsequentemente adicionados aos poços, por sua vez, se ligariam ao vírus e uma reação de cor revelaria a presença de material antigênico do vírus.

[110] Portanto, ainda outra modalidade da presente invenção se refere a kits de teste de diagnóstico para a detecção de um vírus de acordo com a invenção ou material antigênico do vírus, que compreende anticorpos reativos com um vírus de acordo com a invenção ou com material antigênico dos mesmos. O material antigênico do vírus deve ser interpretado em um sentido amplo. Pode ser, por exemplo, o vírus em uma forma desintegrada ou o material do envelope viral compreendendo proteínas da membrana externa viral. Desde que o material do vírus reaja com o antissoro criado contra o vírus, o material é considerado material antigênico.

[111] Um kit de teste de diagnóstico baseado na detecção no soro de anticorpos reativos com o vírus de acordo com a invenção ou material antigênico do vírus e, portanto, adequado para a detecção de infecção por RVB pode também compreender, por exemplo, um teste ELISA padrão. Nesse teste, as paredes dos poços de uma placa ELISA podem, por exemplo, ser revestidas com o vírus de acordo com a invenção ou material antigênico do mesmo. Após incubação com o material a ser testado, por exemplo, soro de um animal suspeito de estar infectado com o novo vírus de acordo com a invenção, anticorpos marcados reativos com o vírus de acordo com a invenção são adicionados aos poços. Se os anticorpos contra o novo vírus de acordo com a invenção estiverem presentes no soro testado, esses anticorpos se ligarão aos vírus que revestem os poços do ELISA. Como uma consequência, os anticorpos marcados posteriormente adicionados, reativos com o vírus, não se ligariam e nenhuma reação colorida seria encontrada. A falta de reação de cor revelaria assim a presença de anticorpos reativos com o vírus de acordo com a invenção.

[112] Portanto, ainda outra modalidade da presente invenção se refere a kits de teste de diagnóstico para a detecção de anticorpos reativos com o vírus de acordo com a invenção ou com material antigênico do vírus que compreende o vírus de acordo com a invenção ou material antigênico do mesmo.

[113] O projeto do imunoensaio pode variar. Por exemplo, o imunoensaio pode ser baseado em competição ou reação direta. Além disso, os protocolos podem usar suportes sólidos ou podem usar material celular. A detecção do complexo antígeno de anticorpo pode envolver o uso de anticorpos marcados; os marcadores podem ser, por exemplo, enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminescentes, radioativas ou corantes.

[114] Métodos adequados para a detecção de anticorpos reativos com um vírus de acordo com a presente invenção na amostra incluem, além do ELISA mencionado acima, teste de imunofluorescência (IFT) e análise de Western blot.

[115] Um teste de diagnóstico alternativo, mas rápido e fácil para diagnosticar a presença ou ausência de um vírus de acordo com a invenção é um teste de PCR como referido acima, compreendendo um conjunto de iniciadores de PCR reativo com uma região específica do fragmento de DNA VP7 do novo vírus de acordo com à invenção. Específico neste contexto significa único para, por exemplo, o gene VP7 do novo vírus, ou seja, não está presente em outros membros da família de Reoviridae.

[116] Por análise de computador simples da nova sequência do gene VP7 fornecida pela presente invenção com o gene VP7 conhecido de outros rotavírus, o técnico no assunto é capaz de desenvolver iniciadores de PCR específicos para testes de diagnóstico para a detecção do novo vírus e/ou a discriminação entre o novo vírus e outros patógenos virais (porcinos).

[117] Assim, outra modalidade se refere a um kit de teste de diagnóstico para a detecção de um vírus de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que referido kit de teste compreende um conjunto de iniciadores de PCR que é especificamente reativo com uma região da sequência do gene VP7 do fragmento de DNA do vírus de acordo com a invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE UM NOVO ROTAVÍRUS EM LEITÕES

[118] Recentemente, um surto de diarreia neonatal com sinais clínicos claros de infecção por rotavírus foi observado em leitões em uma fazenda de um grande produtor de porcinos na Espanha, embora as porcas tenham sido vacinadas contra RVA.

[119] Os sintomas clínicos observados em porcos infectados foram diarreia na primeira semana de vida, com fezes amarelas de diferentes consistências, ora líquidas ora espessas. Leitões de porcas primíparas e multíparas foram afetados. A morbidade foi muito alta (40% das ninhadas em alguns lotes), mortalidade de 5-6%.

[120] Devido aos sintomas de diarreia, os porcos foram vacinados com

Coliclos Prosystem® RCE (Merck Animal Health), uma vacina para uso em suínos como um auxílio na prevenção da diarreia rotaviral, enterotoxemia e colibacilose em leitões amamentados, a vacina contendo dois principais genótipos do Rotavírus A (G4, G5), quatro principais antígenos E. coli pilus e toxoide C. perfringens tipo C. A vacinação, entretanto, não resultou no desaparecimento dos sintomas.

[121] Em particular, suspeitou-se do envolvimento de um vírus porque “realimentação” de material infectado resultou em imunidade e desaparecimento dos sintomas.

[122] Os anticorpos maternos contra RVA deveriam estar presentes no colostro devido à vacinação. As amostras foram enviadas para análise laboratorial, sem explicação plausível dos sinais do rotavírus, apesar do regime de vacinação.

[123] As amostras foram coletadas por zaragatoas retais de indivíduos incluindo 6 grupos de porcas com claros sinais clínicos de rota (os “grupos de rota”), e de 3 grupos sem sinais (“grupos de controle”). De cada grupo, foram retiradas zaragatoas retais da porca e de três leitões. As amostras foram analisadas quanto à presença de vírus por VIDISCA (descoberta de vírus baseada em cDNA-AFLP (polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado), um método originalmente descrito por van der Hoek et al., (Nat Med. 2004; 10:368– 373). A descoberta de vírus baseada em VIDISCA é uma nova abordagem que fornece uma ferramenta rápida e eficaz para a amplificação de genomas desconhecidos, por exemplo, de vírus patogênicos humanos. O método VIDISCA é baseado no processamento de enzima de restrição dupla de uma sequência alvo e ligação de adaptadores de oligonucleotídeo que posteriormente servem como locais de iniciação para amplificação. Como o método é baseado na presença comum de sítios de restrição, ele resulta na geração de padrões de amplificação específicos para espécies, reproduzíveis. O método permite a amplificação e identificação de RNA/DNA viral, com menor valor de corte de 10(5) cópias/ml para os vírus de DNA e 10(6) cópias/ml para os vírus de RNA.

[124] Usando o método VIDISCA, a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 1 e tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 pertencentes a uma proteína VP7 de um rotavírus desconhecido foram detectados em 5 das 6 porcas dos “grupos de rota” em alto nível. Destas porcas, cada um dos 3 leitões também apresentava altos níveis de presença de vírus indicativos de viremia. Nos leitões da 6ª porca, apenas níveis baixos do vírus podiam ser detectados, próximo ao nível de detecção. Em 2 dos “grupos de controle” o vírus não foi encontrado. No outro grupo de controle, o vírus pode ser encontrado em um nível muito baixo em 2 dos 3 leitões testados, próximo ao nível de detecção. Os outros animais (porca e leitão) deste grupo foram considerados negativos para o vírus. Todos as zaragatoas retais de todos os animais testados estavam livres de qualquer outro vírus rota. Isso significa que o vírus rota recém-encontrado deve ter sido responsável pela indução da doença induzida por rota. A análise filogenética revelou que este novo vírus pertence a um rotavírus B dentro do genótipo G12 do rotavírus B (ver Figura 1; o novo vírus indicado como “Novo RotaB VP7 Espanha”). Os rotavírus deste genótipo não foram inequivocamente encontrados como causadores de doenças na técnica. Acredita-se que a nova cepa seja representativa de um novo subgênero patogênico dentro do gênero G12.

[125] Além disso, todas as regiões codificantes das onze proteínas diferentes (1 proteína por segmento) foram obtidas por sequenciamento Illumina, revelando as sequências de SEQ ID NO. 1-22 do novo rotavírus. Para as proteínas dos segmentos 2-11, foram obtidas sequências das regiões codificantes de comprimento total, ou seja, do início ao fim. Para a proteína do segmento 1, foi obtida a sequência da região codificadora parcial.

[126] A montagem do genoma foi a partir de informações de sequenciamento obtidas de amostras de soro. O sequenciamento Illumina foi realizado da seguinte forma: A amostra “I18-45_Serum-nr-49 Sow D3004 Spain” foi usada para a preparação da biblioteca e sequenciamento dos segmentos. Cento e dez µl de material foram centrifugados durante 10 minutos a 10.000 xg e tratados com TurboDNase (Thermofisher) como descrito (de Vries M, et al. PLoS One. 2011; 6 (1): e16118.doi:10.1371/journal.pone.0016118), após o qual os ácidos nucleicos foram extraídos pelo método de extração Boom (Boom R, et al. J Clin Microbiol. 1990;28(3):495-503). As amostras foram cortadas usando dsDNA Fragmentase (New England Biolabs). As amostras cortadas foram purificadas com esferas AMPure XP (agencourt AMPure XP PCR, Beckman Coulter) na razão de 1:1,8 (amostra:esferas) para remover as enzimas. Após a purificação, as amostras foram reparadas nas extremidades com DNA polimerase I, Grande (Klenow) Fragmento (New England Biolabs). As amostras reparadas nas extremidades foram purificadas com esferas AMPure XP em uma razão de 1:1,8 (amostra:esferas) para remover as enzimas, após o que as amostras foram submetidas a tratamento A-tailed usando Fragmento de Klenow (3'-5 'Exo-) (New England Biolabs). As amostras foram purificadas com esferas AMPure XP na razão de 1:1,8 (amostra:esferas) para remover as polimerases. Adaptadores de bolha do NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs) foram ligados às amostras submetidas a tratamento A-tailed, pelo uso de T4 ligase. Uma seleção de tamanho foi realizada pelo uso de esferas AMPure XP primeiro em uma razão de 1:0,5 (amostra:esferas) para garantir que a maioria dos fragmentos com um tamanho maior que 400 bp fossem removidos, seguido pela adição de esferas AMPure XP adicionais ao sobrenadante para obter para uma razão final de 1:0,85 (amostra:esferas) para ligar fragmentos de DNA entre 200- 400 bp e para remover fragmentos menores que 200 bp. Após a seleção do tamanho, os adaptadores de bolhas foram abertos usando a enzima USER do NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs). Em seguida, um PCR de 28 ciclos foi realizado com iniciadores específicos de adaptador do NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs) e mastermix Q5 hotstart (New England Biolabs); 30 s a 98 °C e ciclos de 10 s a 98 °C e 75 s a 65 °C, seguidos por 5 min a 65 °C. Após a PCR, as amostras foram submetidas a seleções de tamanho pelo uso de esferas AMPure XP em uma razão de 1:0,5 (amostra:esferas) para remover fragmentos com um tamanho maior do que 400 bp, e ao sobrenadante foram adicionadas esferas AMPure XP adicionais para chegar a uma razão final de 1:0,85 (amostra:esferas) para ligar fragmentos de DNA entre 200-400 bp e remover fragmentos menores que 200 bp. Em seguida, a concentração do DNA foi medida através do kit de ensaio Qubit dsDNA HS (Thermofisher), o tamanho foi verificado no bioanalisador com um kit de análise de DNA de alta sensibilidade. A biblioteca foi sequenciada pelo uso do MiSeq (Illumina) usando sequenciamento de extremidades emparelhadas e o kit v2 (Illumina). O controle de qualidade e corte são feitos com Trimmomatic 0,35 com as seguintes configurações (phred 33, LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36) e a montagem é feita com SPAdes versão

3.5.0-Darwin, com as seguintes configurações (- “careful” – “only-assembler” - “paired reads”). Para ter as sequências terminais dos segmentos (5 'e 3'), os contigs montados de de novo foram alinhados aos segmentos 1 a 11 de KR052709.1, KR052710.1, KR052711.1, KR052712.1, KR052713.1, KR052714. 1, KR052715.1, KR052716.1, KR052717.1, KR052718.1, KR052719.1 respectivamente. Todas as sequências montadas foram verificadas a olho nu quanto à qualidade, alinhando-se aos parentes mais próximos de cada segmento: AB673232.1; KF882541.1; KR052716.1; KR052717.1; KX869737.1; KX362400.1; KX869732.1; KX869733.1; KX869735.1; MG272043.1; MG272114.1. EXEMPLO 2: ISOLAMENTO DO NOVO ROTAVÍRUS E REINFECÇÃO DE

LEITÕES COM O NOVO ROTAVÍRUS INTRODUÇÃO

[127] O objetivo deste estudo foi propagar o novo isolado de campo de rotavírus de grupo B (novo RVB) do exemplo 1 em leitões privados de colostro (CD/CD) derivados de cesariana.

[128] O estudo foi realizado para confirmar a infectividade do vírus recém- descoberto. Uma passagem animal do vírus infeccioso deve resultar em vírus com virulência mantida e altos títulos no conteúdo intestinal. Além disso, os sintomas clínicos observados na fazenda de origem do vírus, a diarreia, devem ser reproduzidos.

[129] O parto cesáreo e a privação de colostro são necessários para evitar que os leitões adquiram anticorpos maternos interferentes contra os rotavírus ou sejam infectados com rotavírus ou qualquer outro vírus durante o parto. O parto natural ou outro com auxílio de humanos tem maiores chances de infecção não intencional dos leitões, o que interfere no estudo.

[130] Os leitões foram infectados aos 3 dias de idade, pois os leitões mais velhos são menos suscetíveis à infecção por rotavírus. Uma infecção precoce provavelmente resulta em viremia sistêmica e infecção do trato gastrointestinal, em vez de apenas uma infecção do trato gastrointestinal.

MATERIAIS E MÉTODOS

[131] Para este estudo foram usados 5 leitões CD/CD. Os leitões foram numerados e transportados para a instalação experimental. Para o transporte, os leitões foram colocados em containers de transporte livres de patógenos específicos e, posteriormente, transportados em um veículo de transporte de animais em clima controlado. Após a chegada na instalação experimental, os leitões foram alojados em uma sala de isolamento.

[132] Aos 3 dias de idade (dia de estudo 0), os leitões foram infectados intragastricamente com 5 mL de inóculo por leitão do novo isolado de RVB composto de vírus derivado de fezes obtido no Exemplo 1.

[133] Para a preparação do material infeccioso, os conteúdos fecais de 7 leitões (de 3 porcas diferentes) portadores do novo RVB idêntico foram agrupados (volume total 12 mL). Para ativar o vírus, a tripsina foi adicionada a uma concentração final de 2 U/mL. O material foi incubado por 30 minutos a 37 °C, após o que o volume foi aumentado para 30 mL usando meio EMEM.

[134] A quantidade de RVB na amostra combinada foi de 2,26*107 cópias/µl com base em uma série de titulação de um plasmídeo contendo o amplicon com concentrações conhecidas. O inóculo também continha um astrovírus, para o qual foi criado um ensaio de diagnóstico qPCR, mas sem uma curva padrão. O valor Ct da amostra de inóculo foi de 32,75.

[135] Cinco (5) mLs do inóculo foram administrados por via intragástrica por leitão usando uma seringa e tubo de alimentação/cateter uretral. Após a aplicação do inóculo, 2 mL de ar foram gentilmente introduzidos no tubo gástrico com uma seringa para esvaziar completamente o conteúdo do tubo. Se necessário, a boca do leitão era enxugada com toalha de papel contendo etanol 70% após a inoculação.

[136] Desde o dia da inoculação até 3 dias após a infecção, todos os leitões foram observados quanto a sinais clínicos de diarreia. Antes e após a infecção, amostras de fezes individuais foram coletadas de todos os leitões uma vez por dia diretamente da abertura retal. Caso não obtivesse sucesso, eram coletadas amostras de zaragatoa retal. Todas as amostras de fezes/zaragatoas retais foram armazenadas imediatamente a -70 °C. No dia 3 pós infecção (72h), os leitões foram necropsiados. Durante a necropsia, o conteúdo dos intestinos e raspagem dos tecidos do jejuno, íleo, cólon e ceco foram recolhidos como duas amostras agrupadas por leitão. Além disso, uma pequena amostra de tecido foi retirada do jejuno, íleo, ceco e cólon para (imune-)histoquímica.

[137] Os leitões foram alimentados com leite Swinco opticare 2100 até o dia 0 do estudo. Desde o dia 0 do estudo até ao final da experiência (dia 3 do estudo), os leitões foram alimentados com leite Swinco opticare Silver. qPCR

[138] PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) foi realizado nas amostras fecais. Os ácidos nucléicos (NA) foram extraídos usando a metodologia Magnapure (Roche).

[139] Um RT-qPCR específico para o novo vírus Rota B foi realizado nos extratos de NA.

[140] Iniciador senso: 5’-CAGACGATCTGATAGGGATGTATTG-3’ (SEQ ID NO: 23).

[141] Iniciador antissenso: 5’-ATGTCCGTGACGTAGTATCTTC-3’ (SEQ ID NO: 24).

[142] protocolo qPCR: 5 min 55 °C, 5 min 95 °C, [10 seg 94 °C, 25 seg 58 °C] x39.

[143] O kit usado para realizar o qPCR foi o kit Invitrogen SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR. A quantificação foi realizada com base em uma série de titulação de um plasmídeo contendo o amplicon com concentrações conhecidas.

[144] Um RT-qPCR específico para astrovírus foi realizado nos extratos de NA.

[145] Iniciador senso: 5’-GTGCAGATGTGTTGGCGTATAAG-3’ (SEQ ID NO: 25)

[146] Inicador antissenso: 5’-TGAAGCGTACAAACCAGGATGAG-3’ (SEQ ID NO: 26)

[147] protocolo qPCR: 3 min 55 °C, 5 min 95 °C, [15 seg 95 °C, 30 seg 60 °C] x39

[148] O kit usado para realizar o qPCR foi o Invitrogen SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit, catálogo no 11732020. Nenhuma quantificação com base em uma série de titulação foi realizada.

RESULTADOS

[149] O estado de saúde de todos os animais foi monitorado ao longo do estudo animal. Às 21h após a infecção, os leitões foram primeiro diagnosticados com sintomas de diarreia e diminuição do apetite. Todos os leitões desenvolveram sintomas clínicos semelhantes aos observados na fazenda índice. Tabela 1: Progressão dos sintomas clínicos em horas diferentes após a infecção (pi): Leitão, 21h pi 33h pi 45h pi 48h pi 58 pi 68h Nº. Diarreia, diminuição Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, do apetite, diminuição diminuição 1 diminuição Diarreia diminuição lentidão, do apetite, do apetite, do apetite do apetite ligeiramente lentidão, lentidão, desidratado Diarreia, diminuição Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, do apetite, diminuição diminuição 2 diminuição Diarreia diminuição lentidão, do apetite, do apetite, do apetite do apetite ligeiramente lentidão lentidão desidratado

Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, diminuição diminuição diminuição 3 diminuição Diarreia diminuição do apetite, do apetite, do apetite, do apetite do apetite lentidão, lentidão, lentidão desidratado desidratado Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, 4 diminuição Diarreia diminuição diminuição diminuição diminuição do apetite do apetite do apetite do apetite do apetite Diarreia, diminuição Diarreia, Diarreia, Diarreia, Diarreia, do apetite, diminuição diminuição 5 diminuição Diarreia diminuição lentidão, do apetite, do apetite, do apetite do apetite ligeiramente lentidão lentidão desidratado QUANTIFICAÇÃO QPCR DE RVB:

[150] Os ácidos nucléicos foram extraídos de todas as amostras fecais coletadas durante o estudo e rastreados para a presença de RVB com um qPCR específico para RVB. Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo: Leitão Nº Tipo de amostra Inóculo fecal 0 hpi 24 hpi 48 hpi 72 hpi 1 Zaragatoa retal 2,26E+07 0,00E+00 1,79E+06 2,71E+04 6,43E+05 2 Zaragatoa retal 2,26E+07 0,00E+00 1,71E+07 8,23E+05 9,80E+05 3 Zaragatoa retal 2,26E+07 0,00E+00 6,30E+05 5,52E+05 1,09E+04 4 Zaragatoa retal 2,26E+07 0,00E+00 2,95E+05 8,50E+04 5 Zaragatoa retal 2,26E+07 0,00E+00 1,58E+06 2,65E+05 5,05E+04

[151] Nenhum RVB estava presente nas amostras fecais dos leitões no início do estudo. Às 24 horas após a infecção, RVB pode ser detectado nas fezes dos leitões infectados. O RVB permaneceu presente nas coletas dos dias seguintes. A amostra do leitão 4 retirada às 48 horas não estava disponível para análise.

[152] A análise de fezes ou zaragatoas fecais durante o estudo foi semiquantitativa. As fezes tornam-se mais aquosas durante a progressão dos sintomas clínicos. As fezes não foram coletadas em quantidades quantificadas.

[153] Posteriormente, uma quantificação qPCR de astrovírus foi realizada em todas as amostras para garantir que esse vírus, que estava presente no inóculo em baixas concentrações, diagnosticado com Sequenciamento de Próxima Geração e verificado usando qPCR, não tivesse efeito nos animais durante o estudo animal.

[154] Todas as amostras fecais coletadas durante o estudo foram analisadas quanto à presença de astrovírus usando qPCR, mas nenhuma das amostras fecais foi considerada positiva para astrovírus. Assim, nenhuma replicação deste vírus pode ser mostrada.

[155] Em conclusão, a infecciosidade, replicação e patogenicidade in vivo do novo vírus Rota B foram confirmadas neste estudo.

[156] Desse modo, a presente invenção se refere às seguintes modalidades:

[157] 1. Um rotavírus isolado que é um membro da subespécie do genótipo G12 de rotavírus porcino do grupo B, que em sua forma de tipo selvagem causa diarreia em porcos, referido vírus sendo caracterizado pelo fato de que tem um genoma viral compreendendo um quadro de leitura aberto tendo uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a mesma.

[158] 2. O vírus isolado de acordo com a modalidade 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1 codifica uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo.

[159] 3. Um fragmento de ácido nucleico compreendendo um quadro de leitura aberto compreendendo pelo menos 100 nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que referido fragmento nucleico tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde a uma sequência tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1.

[160] 4. O fragmento de ácido nucleico de acordo com a modalidade 3, caracterizado pelo fato de que o quadro de leitura aberto codifica uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo.

[161] 5. O fragmento de ácido nucleico de acordo com a modalidade 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que quadro de leitura aberto está sob o controle de um promotor heterólogo.

[162] 6. Uma proteína recombinante codificada pelo fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 5.

[163] 7. Uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo ou um fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de ser codificada por um fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 5.

[164] 8. Uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo ou um fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de ser uma proteína de acordo com SEQ ID NO:2, ou uma proteína tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a mesma.

[165] 9. Uma vacina para uso na proteção contra uma infecção causada por rotavírus porcino do grupo B, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2, ou uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6, ou uma quantidade imunologicamente eficaz de uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com a modalidade 7 ou 8, ou um fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 5, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[166] 10. A vacina de acordo com a modalidade 9 para uso no tratamento profilático de um animal.

[167] 11. Um anticorpo ou antissoro reativo com um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2 ou com uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6 ou com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com a modalidade 7 ou 8.

[168] 12. Um kit de teste de diagnóstico para a detecção de anticorpos reativos com um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2, ou com material antigênico do mesmo, ou reativo com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com a modalidade 7, caracterizado pelo fato de que o referido kit de teste compreende um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2 ou material antigênico do mesmo ou uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6, uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com as modalidades 7 ou 8.

[169] 13. Um kit de teste de diagnóstico para a detecção de um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2, ou material antigênico do mesmo, ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com as modalidades 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o referido kit de teste compreende anticorpos reativos com um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2 ou material antigênico do mesmo ou reativo com uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6 ou reativo com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com a modalidade 7 ou 8.

[170] 14. Um método para proteger um animal contra uma infecção causada por rotavírus porcino do grupo B por administrar sistemicamente de uma vacina de acordo com a modalidade 9 ou 10 ao animal.

[171] 15. O método de acordo com a modalidade 14, caracterizado pelo fato de que referido método compreende a mistura de um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2, ou uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6, ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com as modalidades 7 ou 8, ou um fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 5, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[172] 16. Um vírus de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2, ou uma proteína recombinante de acordo com a modalidade 6, ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com as modalidades 7 ou 8, ou um fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 5, para uso na fabricação de uma vacina para proteger um animal contra uma infecção causada por rotavírus porcino do grupo B.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Rotavírus isolado, que é um membro da subespécie do genótipo G12 de rotavírus porcino do grupo B, que em sua forma de tipo selvagem causa diarreia em porcos, o referido vírus sendo caracterizado pelo fato de que tem um genoma viral que compreende um quadro de leitura aberto que tem uma sequência de nucleotídeos correspondente à sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos tendo um nível de identidade de pelo menos 90% com a mesma.

2. Vírus isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos, que tem um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1, codifica uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo.

3. Fragmento de ácido nucleico compreendendo um quadro de leitura aberto, o referido quadro de leitura aberto compreendendo pelo menos 200 nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento de ácido nucleico tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde a uma sequência que tem um nível de identidade de pelo menos 90% com a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: 1.

4. Fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o quadro de leitura aberto codifica uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo.

5. Fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o quadro de leitura aberto está sob o controle de um promotor heterólogo.

6. Proteína recombinante, caracterizada pelo fato de ser codificada pelo quadro de leitura aberto do fragmento de ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5.

7. Glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo ou um fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de ser uma proteína como representada pela SEQ ID NO: 2, ou uma proteína que tem um nível de identidade de pelo menos 93% com a mesma.

8. Vacina para uso na proteção contra uma infecção causada por rotavírus porcino do grupo B, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, ou uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína recombinante definida na reivindicação 6, ou uma quantidade imunologicamente eficaz de uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7, ou um fragmento de ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento profilático de um animal.

10. Anticorpo ou antissoro, caracterizado pelo fato de ser reativo com um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, com uma proteína recombinante definida na reivindicação 6 ou com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7.

11. Kit de teste de diagnóstico para a detecção de anticorpos reativos com um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, ou com material antigênico do mesmo, ou reativo com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido kit de teste compreende um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, ou material antigênico do mesmo, uma proteína recombinante definida na reivindicação 6, ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7.

12. Kit de teste de diagnóstico para a detecção de um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, ou material antigênico do mesmo, ou uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido kit de teste compreende anticorpos reativos com um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, ou material antigênico do mesmo, ou reativos com uma proteína recombinante definida na reivindicação 6, ou reativos com uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7.

13. Uso de um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, de uma proteína recombinante definida na reivindicação 6, de uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7 ou de um fragmento de ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para proteger um animal contra uma infecção causada por rotavírus porcino do grupo B.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende a mistura de um vírus definido na reivindicação 1 ou 2, de uma proteína recombinante definida na reivindicação 6, de uma glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo definida na reivindicação 7 ou de um fragmento de ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. Vírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, proteína recombinante de acordo com a reivindicação 6, glicoproteína VP7 de capsídeo viral externo de acordo com a reivindicação 7 ou fragmento de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso na fabricação de uma vacina para proteger um animal contra uma infecção causada pelo rotavírus porcino do grupo B.

16. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.