KR102472939B1 - 페스티바이러스 - Google Patents

페스티바이러스 Download PDF

Info

Publication number
KR102472939B1
KR102472939B1 KR1020177019567A KR20177019567A KR102472939B1 KR 102472939 B1 KR102472939 B1 KR 102472939B1 KR 1020177019567 A KR1020177019567 A KR 1020177019567A KR 20177019567 A KR20177019567 A KR 20177019567A KR 102472939 B1 KR102472939 B1 KR 102472939B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
gene
protein
ctapv
seq
Prior art date
Application number
KR1020177019567A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170098871A (ko
Inventor
아드 데 그루프
라르스 굴렌
카를라 크리스티나 슈라이어
마르틴 드아이스
코르넬리아 마리아 반 데르 후크
Original Assignee
인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인터벳 인터내셔널 비.브이. filed Critical 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Publication of KR20170098871A publication Critical patent/KR20170098871A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102472939B1 publication Critical patent/KR102472939B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

본 발명은 신규 돼지 페스티바이러스; 이러한 바이러스의 단백질; 및 상기 바이러스 및 그의 단백질에 근거한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 바이러스의 유전자를 포함하는 DNA 단편; 및 상기 바이러스의 유전자에 근거한 DNA 백신에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 신규 바이러스와 반응성인 항체; 및 상기 바이러스 또는 이러한 바이러스에 대항한 항체를 검출하기 위한 진단 시험에 관한 것이다.

Description

페스티바이러스 {PESTIVIRUS}
본 발명은 신규 페스티바이러스; 이러한 바이러스의 단백질; 및 상기 바이러스 및 그의 단백질에 근거한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 바이러스의 유전자를 포함하는 DNA 단편; 및 상기 바이러스의 유전자에 근거한 DNA 백신에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 신규 바이러스와 반응성인 항체; 및 상기 바이러스 또는 이러한 바이러스에 대항한 항체를 검출하기 위한 진단 시험에 관한 것이다.
지난 수십 년 동안, 전 세계적으로 돼지 고기의 소비가 크게 증가하였다. 그에 따른 결과로서, 시장의 증가하는 요구를 충족시키기 위해 농장의 수와 규모가 증가하였다. 축산업에서 일반적으로 공지된 바와 같이, 조밀하게 함께 사는 다수의 동물은 공지된 질병; 및 대규모 상업적 영농 시기 이전에는 거의 공지되지 않았거나, 거의 관찰되지 않았거나 심지어 전혀 공지되지 않은 질병에 취약하다.
원인 병원체의 신원 확인을 기다리는 질병 중 하나가 킨슬리(Kinsley)에 의해 "춤추는 돼지"로 언급된 (문헌 [Veterinary Medicine 1922;17]) 20세기 초반부터 이미 존재하는 것으로 공지되어 있다. 거의 1세기에 걸쳐 "전율하는 돼지 질병", 돼지의 떨림, 미오클로니아 콘제니타 (Myoclonia Congenita)(1) 또는 선천성 떨림 (CT)(2)을 포함한 다양한 이름으로 동일한 증상을 언급하는 여러 기사가 공개되었다. 이러한 질병은 추가로 CT로서 지칭될 것이다. CT의 증상은 신생아 돼지의 머리와 다리의 떨림이며, 그 중증도는 다양하지만 수면 중에는 없다. 이러한 떨림은 흥분과 감기에 의해 악화될 수 있다. 떨림은 몇 주에서 몇 달 동안 지속되지만 돼지가 성장함에 따라 감소된다. 전율 그 자체가 직접적으로 사망을 유발하지는 않지만, 떨림은 새끼 돼지가 젖을 흡인할 젖꼭지를 찾지 못하도록 할 수 있다. 이것은 기아에 의한 사망을 초래할 수 있다. 이러한 질병은 널리 퍼져 있으며 전세계 돼지 농장에서 정기적으로 발생하고 있다.
CT를 유발시키는 몇 가지 조건이 공지되어 있는데, 현재 이러한 조건은 다음 2개 군, 즉 A 및 B로 분류된다. 군 A는 조직학적 병변이 보이는 사례로 구성되는 반면, 군 B의 사례에는 명백한 병변이 나타나지 않는다. 군 A는 CT의 상이한 원인에 근거하여 5개의 하위군으로 추가로 나뉜다. CT의 군 A-I의 사례는 고전적 돼지 발열 (CSF) 바이러스에 의해 유발되는 것으로 공지된다. 군 A-III CT의 원인은 랜드레이스(Landrace) 품종에만 존재하는 유전적 (성 연관) 결함이지만, 새들백(Saddleback) 품종의 열성 유전적 (상염색체 연관) 결함은 유형 A-IV의 원인이다. 군 A-V 사례는 유기인 화합물로 처리되는 음식물과 종종 관련이 있는 중독인 트리클로르폰(trichlorfon) 중독증에 의해 유발된다(3, 4).
군 A-II 사례는 가장 수수께끼인 경우였으며 여전히 그렇다. 그들은 공지되지 않은 감염체에 의해 유발되는 것으로 추정된다.
군 A-II CT는 과거에 PCV 감염과 연관이 있었지만(5), 각종 연구 결과, 지금은 그 반대의 사실이 입증되었다. 예를 들어, PCV는 CT를 동반한 돼지의 신경 조직에는 존재하지 않으며(6), 비-신경 조직에서는 PCV가 단지 작고 사소한 양으로 발견되었다(4). 결론적으로 군 A-II CT의 원인에 대한 결정적인 증거는 아직 없다. 그러나, 군 A-II CT가 감염체에 의해 유발된다고 여겨질 충분한 근거가 있다. 대부분의 군 A-II 전율 새끼 돼지는 최근에 새로운 환경으로 도입된 어린 암퇘지 (즉, 수정과 그의 첫 번째 한배 새끼 사이 연령의 암컷 돼지)의 한배 새끼로 태어난다. 놀랍게도, 전율하는 새끼 돼지를 수반한 첫 번째 한배 새끼 후, 그 동일한 암퇘지의 후속 한배 새끼는 CT의 징후를 거의 보이지 않는다. 이것은 그 암퇘지에서 어떤 종류의 면역이 발생하여, CT를 유발시키는 감염체에 대항하여 보호한다는 지표이다. 약 40년 전에, 패터슨(Patterson) 등(50)은 임신한 암퇘지를, 임상적으로 병에 걸린 돼지의 척수, 뇌 및 비장의 에멀션으로 실험적 감염시킴으로써 새끼 돼지에게서 군 A-II CT를 유도시켰다. 그러나 상기에 나타낸 바와 같이, CT 새끼 돼지나 임신한 암퇘지로부터는 원인 감염체를 결코 분리하지 못하였다.
본 발명의 목적은 군 A-II CT의 원인 감염체인 새로운 감염체를 제공할 뿐만 아니라 이러한 질병 퇴치를 목표로 하는 백신을 제공하는 것이다. 더욱이, 본 발명의 목적은 질병 관련 감염체를 검출 및 확인하기 위한 수단을 제공하는 것이다.
군 A-II CT의 원인 감염체를 최종적으로 검출 및 단리하기 위해, 군 A-II CT로 인해 고통받고 있는 새끼 돼지의 혈청 및 많은 경우에는, 이러한 새끼 돼지의 부가의 생물학적 물질을 네덜란드 내에 있는 8개의 상이한 농장에서 2012년 9월부터 2014년 초까지 수득하였다. 이들 8개 농장은 CT-새끼 돼지의 병력을 갖고 있었다 (전형적으로, 4마리의 한배 새끼 중 1마리의 새끼 돼지가, 특정의 한 농장에서 전염병 피크 동안 CT로 인해 고통받고 있는 것으로 밝혀졌다).
네덜란드 내의 한 돼지 농장은 2012년 초에 선천성 떨림 유형 A-II가 집단 발병한 것으로 진단되었다. 첫 번째 출산 경력 동물인 어린 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지가 주로 병에 걸렸지만, 출산 경력이 더 많은 암퇘지도 때때로 병에 걸렸다. 진단은 임상적 관찰과, 그 질병에 대한 가능한 원인으로서 선천성 떨림 유형 A-I, A-III, A-IV 및 A-V의 후속 배제에 근거하였다. 임상적으로 병에 걸린 새끼 돼지는 활동 중 과도한 근육 수축으로 인해 상이한 등급의 떨림을 나타냈다. 수면 중에서는 그 증상이 감소하였다. 새끼 돼지의 사망은, 특히 출생 후 첫 주 동안에 병에 걸린 동물이 스스로 먹을 수 없기 때문에 생기는 2차적인 영향이었다. 조직학적으로, 뇌와 척수는 저수초형성을 특징으로 하였다 (그러나 조직학적 이상이 병에 걸린 새끼 돼지에게서 항상 나타나는 것은 아니다. 문헌에서는, 저수초형성의 정도가 또한 가변적이라고 기재되어 있다). 다음에 추가로 기재되는 바와 같이, 병에 걸린 모든 돼지가 살아남은 것은 아니다. 살아 남은 돼지에서는, 떨림이 줄어들었고 돼지가 성장하면서 최종적으로 사라졌다. 2012년도 첫 20주에는, 어린 암퇘지로부터 태어난 총 231마리의 한배 새끼 중에서 총 48마리의 한배 새끼가 선천성 떨림 증상을 보였다. 이는 어린 암퇘지로부터 태어난 모든 한배 새끼의 21%에 달한다. 집단 발병의 개시 후 8주에 감염이 최고조로 될 때, 어린 암퇘지의 한배 새끼의 85%가 선천성 떨림 유형 A-II를 동반한 새끼 돼지를 나타냈다. 이유기 때까지의 새끼 돼지 사망 비율 (%)은, 병에 걸리지 않은 한배 새끼에서의 11%와 비교해서 병에 걸린 한배 새끼에서 26%였다. 병에 걸린 한배 새끼에서는, 새끼 돼지 사망의 60%가 선천성 떨림에 기인하였다. 한배당 태어난 새끼 돼지의 총수는 영향을 받지 않았다. 선천성 떨림은 신생아 수컷과 암컷 새끼 돼지 둘 다에 영향을 미쳤고, 한배 새끼 내에서의 유병률은 <10% 내지 100%로 다양하였다.
선천성 떨림의 집단 발병에 따른 문제점은 이러한 농장에서 2012년 이래로 지속되어 왔고, 2013년과 2014년에도 병에 걸린 새끼 돼지가 존재하였다 (하기 참조). 그러나, 그 발생률은 감소되었다.
혈장 샘플을 2012년 3월 (6개 샘플, 비-A-II 원인을 배제시킬 수 있는 CT 증상이 있는 모든 새끼 돼지)과 2012년 4월 (5개 샘플, 비-A-II 원인을 배제시킬 수 있는 CT 증상이 있는 모든 새끼 돼지)에 수득하였다. 11개 샘플 중 11개에서, 일시적으로 "마이클(Michael)" (M)이라고 불리는 새로운 바이러스가 검출되었다.
2012년 7월에는 동일한 농장으로부터 더 많은 혈장 샘플을 수득하였다. 2마리의 암퇘지와 1마리의 어린 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지로부터 총 16개의 혈청 샘플을 분석하였다. 이들 새끼 돼지 중 어느 것도 선천성 떨림을 보이지 않았다. 16개 샘플 중 1개에서 마이클 1이 발견되었다.
2013년 1월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 진단되었다. 부검을 위해 4마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데, 이들 모두는 비-A-II 원인을 배제시킬 수 있는 CT 증상을 보였다. 새로운 바이러스는 마이클 1A로 명명되었는데, 이는 비록 동일한 농장에서 유래되긴 하였지만 원래의 집단 발병과 새로운 임상 문제 발생 사이에 상당한 시간이 경과했기 때문이다. 이러한 새로운 바이러스 마이클 1A는 4마리의 새끼 돼지 중 4마리에게서 검출되었다.
2013년 3월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 다시 진단되었다. 부검을 위해 3마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데, 이들 모두는 비-A-II 원인을 배제시킬 수 있는 CT 증상을 보였다. 이러한 바이러스는 마이클 1B (M 1B)로 명명되었다. 새로운 바이러스 마이클 1B는 3개의 샘플 중 3개에서 검출되었다. 뇌와 척수는 탈수초화 징후를 나타냈다 (도 2 참조).
2014년 1월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 진단되었다. 4마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데, 이들 모두는 비-A-II 원인을 배제시킬 수 있는 CT 증상을 보였다. 이러한 바이러스는 마이클 1C (M 1C)로 명명되었다. 새로운 바이러스 마이클 1C는 4개의 샘플 중 4개에서 검출되었다. 2014년 2월에 부가의 3마리 새끼 돼지에 대한 부검을 수행하였는데, 이들 3마리 새끼 돼지 모두는 또한 군 A-II CT를 나타냈고, 마이클이 3개의 샘플 중 3개에서 검출되었다.
2013년 1월, 2013년 3월 및 2014년 2월에 집단 발병에 걸린 새끼 돼지를 대상으로 사후 검사를 수행하였다. 뇌와 척수는 탈수초화 징후를 보였다.
선천성 떨림 유형 A-II의 병력이 없는 특정 농장으로부터의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지로부터 수득된 총 7개의 혈청을, PCR 및 사후 검사를 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 혈장 샘플은 마이클 바이러스에 대해 음성이었고, 이들 새끼 돼지에게서 병리학적 이상은 전혀 관찰되지 않았다.
네덜란드 내의 다른 7개 농장에서 군 A-II CT 집단 발병에 관한 거의 동등한 수준의 분석을 수행하였다. CT-한배 새끼의 샘플을 분석하였고; 그로부터 초유 이전의 물질 (초유 또는 모유를 처음으로 섭취하기 이전에 취한 물질)을 취한 CT-새끼 돼지의 100%에서 신규 바이러스가 발견되었다.
본 발명에 따르는 신규 바이러스는 아직 공식적으로 분류되지 않았지만, 현재로서는 "군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스"로서 지칭된다. 이러한 바이러스는 또한, 다음에 CTAPV로서 지칭될 것이다.
바이러스 게놈의 서열을 분석한 결과, 이러한 신규 바이러스가 예상치 못하게도, 플라비비리다에(Flaviviridae) 과, 보다 구체적으로 이러한 과 내의 페스티바이러스 속과 비교적 낮은 수준이긴 하지만 유사성을 일부 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 페스티바이러스 속의 공지된 구성원은 고전적 돼지 발열 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 및 보더병 바이러스이다.
페스티바이러스 비리온은 직경이 약 50 nm이고, 구형의 외막이 있으며, 길이가 약 12 킬로염기 (kb)인 단일 가닥 양성-센스 RNA를 포함한다.
대표적인 새로운 바이러스의 완전한 길이의 DNA 서열이 서열식별번호: 19에 제시된다.
신규 바이러스의 유전적 조직은 공지된 페스티바이러스의 유전적 조직과 밀접하게 유사하다 (도 1 참조). 페스티바이러스 게놈은 구조적 단백질 ["코어" 단백질 (C), 및 단백질 Erns, E1 및 E2]과 비-구조적 (NS) 단백질 둘 다 내로 번역과 동시에 및 번역 후에 프로세싱되는 단일 폴리프로테인 NH2-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH를 코딩한다. 이러한 폴리프로테인의 아미노-말단 부분은 숙주 세포 프로테아제에 의해 절단되고, 그의 절단 생성물, 코어 및 외막 (Erns, E1 및 E2) 단백질이 페스티바이러스 입자 (비리온)의 주요 구성 성분인 것으로 여겨진다.
E0 또는 gp44/48로서 공지되기도 하는 구조적 단백질 Erns은 RNase 활성을 갖는 독특한 특성을 지닌 외막 단백질 (envelope protein)이다 (12). 이는 감염된 세포로부터 비교적 다량으로 분비된다 (13). 그러나, 훨씬 더 많은 양이 막에 결합된 채로 있다 (14). Erns의 역할 중 하나는 그의 RNase 활성을 이용하여 인터페론 반응을 억제함으로써 숙주 면역 체계를 방해하는 데 있는 것으로 여겨진다 (15). 독력에 있어서의 그러한 역할은 Erns가 결핍된 바이러스 균주가 약화된다는 사실에 의해 추가로 뒷받침된다 (16). 이전에 gp33 및 gp55로서 공지된 (그리고, 이전에 혼란스럽게도 E1로서 공지된) E1 및 E2는 각각, 다른 2개의 외막 당단백질이다. 구조적 단백질 E2는 E1과 동종이량체 및 이종이량체를 형성한다 (17, 18). 페스티바이러스가 그의 숙주 내로 진입하기 위해서는, 특히 E1 및 E2 단백질의 이종이량체가 중요한 반면, Erns는 바이러스 진입을 위해 필요한 것으로 보이지 않는다 (19, 20). 중화 항체는 주로 Erns 및 E2를 표적으로 하고, 이보다 덜한 정도로 E1을 표적으로 한다 (17, 21).
216개의 아미노산으로 이루어진 외막 단백질 Erns를 코딩하는 유전자는 서열식별번호: 19의 위치 1258-1899에서 발견되고, 211개의 아미노산으로 이루어진 외막 단백질 E2를 코딩하는 유전자는 서열식별번호: 19의 위치 2479-3111에서 발견된다. 193개의 아미노산으로 이루어진 외막 단백질 E1을 코딩하는 유전자는 서열식별번호: 19의 위치 1900-2478에서 발견된다.
외막 단백질 Erns를 코딩하는 유전자의 DNA 서열의 한 예가 서열식별번호: 1에 제시된다. 서열식별번호: 2는 Erns 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
외막 단백질 E2를 코딩하는 유전자의 DNA 서열의 한 예가 서열식별번호: 3에 제시된다. 서열식별번호: 4는 E2 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
외막 단백질 E1을 코딩하는 유전자의 DNA 서열의 한 예가 서열식별번호: 5에 제시된다. 서열식별번호: 6은 E1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
완전한 서열의 신규 바이러스를 사용하여, 최대 우도 방법, 프와송(Poisson) 보정 모델 및 부트스트랩 분석에 근거한 계통수(phylogenetic tree)를 만들었다 (500회 복제물).
이들 계통수는 표준 환경을 이용하여, 프로그램 MEGA, 버전 5를 사용하여 만들었다 (MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson, Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol. Evol. 28(10):2731-2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121 Advance Access publication May 4, 2011).
신규 페스티바이러스의 전체 서열에 근거한 계통수가 도 3에 제시된다. 부트스트랩 지원 %는 노드에 지정된다. 거리 막대는 부위당 뉴클레오티드 치환 수를 표시한다.
페스티바이러스 보더병 바이러스, 순록(reindeer)의 페스티바이러스, 고전적 돼지 발열 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 기린(giraffe)의 페스티바이러스 및 분고와나(Bungowannah) 바이러스는 비교적 밀접하게 관련이 있는 반면, 본 발명에 따르는 신규 바이러스는 이들 바이러스 각각과 더 멀리 관련이 있다는 것이 도 3으로부터 명백하다.
도 4에는, 본 발명에 따르는 바이러스의 10개의 상이한 단리물을 비교한 계통수가 제시된다.
동일한 농장에서 단리하긴 하였지만, 3년에 걸쳐 수거한 단리물 M1, M1A, M1B 및 M1C (서열식별번호: 19, 20, 21, 22)가 서로 가장 밀접하게 관련이 있다는 것을 알 수 있다. 다른 농장으로부터의 단리물은 다소 큰 변동을 나타낸다. M2, M4 및 M9 (서열식별번호: 23, 25, 29)는 M1 군과의 관련 보다 서로 더 관련이 있다. 이것은 M3, M6 및 M8 (서열식별번호: 24, 26, 28) 모두에 대해서도 적용된다. M7 (서열식별번호: 27)은 포함되지 않는다. 이는 단리물 간에 작은 유전적 변화가 있다는 것을 표시한다. 이는 RNA 바이러스에 대한 것으로 예상되며, 이러한 관찰은 다른 페스티바이러스에 대하여 관찰된 것과 일치한다.
서열식별번호: 1, 3 및 5는 본 발명에 따르는 바이러스의 Erns, E2 및 E1 각각을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 전형적인 예를 나타낸다.
서열식별번호: 2, 4 및 6은 본 발명에 따르는 바이러스의 Erns, E2 및 E1 단백질 각각의 아미노산 서열의 전형적인 예를 나타낸다.
이들 단백질에 대해서는, 군 A-II 선천성 떨림 관련 바이러스의 개별적 대표들 간에 자연적 변동이 존재할 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, Erns, E2 및 E1 아미노산 서열에 있어서 사소한 변화를 초래하는 유전적 변이가 존재한다. 우선, 그들이 코딩하는 아미노산 서열에서 주목받지 못하는 뉴클레오티드 변화가 발생할 수 있다고 설명하는, 소위 "제2 및 제3 염기에서의 워블(wobble)"이있다: 예를 들어, 삼중자 TTA, TTG, TCA, TCT, TCG 및 TCC는 모두 류신을 코딩한다. 또한, 본 발명에 따르는 신규 돼지 페스티바이러스의 대표 간의 작은 변이는 아미노산 서열에서 볼 수 있다. 이들 변이는 전체 서열 내의 아미노산 차이(들)에 의해 반영되거나 또는 상기 서열 내의 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역전 또는 부가에 의해 반영될 수 있다. 생물학적 및 면역학적 활성을 본질적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환이, 예를 들어 문헌 [Neurath et al in "The Proteins" Academic Press New York (1979)]에 기재되었다. 관련 아미노산 간의 아미노산 대체 또는 진화시 자주 발생하는 대체는 특히, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다 (문헌 [Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3] 참조). 다른 아미노산 치환은 Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val 및 Ala/Glu를 포함한다. 이러한 정보에 근거하여, 립만(Lipman)과 페어슨(Pearson)은 신속하고 민감한 단백질 비교를 위한 방법을 개발하였고 (문헌 [Science 227, 1435-1441, 1985]), 상동 단백질 간의 기능적 유사성을 결정하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 예시적인 실시양태의 상기 아미노산 치환뿐만 아니라 결실 및/또는 삽입을 갖는 변이가 본 발명의 범위 내에 있다.
이는 본 발명에 따르는 돼지 페스티바이러스의 상이한 대표로부터 단리될 때, Erns, E2 및 E1이 유의적으로 100% 아래의 상동성 수준을 가질 수 있지만, 여전히 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 Erns, E2 및 E1을 나타내는 이유를 설명해 준다.
이는 예를 들어, 문헌 [Becher, P. et al.]( 49)에서 페스티바이러스 유전자 Npro 에 대한 계통수에 명백하게 반영되는데, 여기서는 그럼에도 불구하고, 고도로 관련된 페스티바이러스가 유의적으로 상이한 Npro 유전자 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 유의적으로 상이한 전체 게놈 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제1 실시양태는 페스티바이러스의 구성원인 단리된 바이러스에 관한 것인데, 여기서 이러한 바이러스는 다음과 같은 것을 특징으로 한다:
a) 상기 바이러스는 돼지에서 군 A-II 선천성 떨림의 원인 감염체이고;
b) 상기 바이러스는 외막 단백질 Erns를 코딩하는 유전자, 외막 단백질 E2를 코딩하는 유전자 및 외막 단백질 E1을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖고/갖거나 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖고/갖거나 E1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖는다.
본 발명의 목적상, 동일성 수준은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 서열과, 그의 동일성 수준을 결정해야 하는 페스티바이러스의 Erns를 코딩하는 상응하는 영역 간의 동일성 비율 (%)로서 이해되어야 한다.
동일성 수준을 결정하는 데 적합한 프로그램은 "2개 이상의 서열을 정렬하는" 옵션과 표준 환경을 이용하여, NCBI의 기본 로컬 정렬 검색 도구의 뉴클레오티드 블라스트 프로그램 (blastn)이다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
본 발명의 목적상, "단리된"은 자연에서 상기 바이러스와 연합되는 조직이 없는 세트를 의미한다. 단리된 바이러스의 한 예는 세포 배양물에 존재하는 바와 같은 바이러스이다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 Erns의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 Erns 유전자를 갖는 상기 바이러스에 관한 것이다.
상기 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 E2 유전자를 갖는 상기 바이러스에 관한 것이다.
또한 상기 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 E1 유전자의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 E1 유전자를 갖는 상기 바이러스에 관한 것이다.
이러한 실시양태의 보다 바람직한 형태는 페스티바이러스의 구성원인 단리된 바이러스에 관한 것인데, 여기서 이러한 바이러스는 다음과 같은 것을 특징으로 한다:
a) 상기 바이러스는 돼지에서 군 A-II 선천성 떨림의 원인 감염체이고;
b) 상기 바이러스는 외막 단백질 Erns를 코딩하는 유전자, 외막 단백질 E2를 코딩하는 유전자 및 외막 단백질 E1을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖고, E2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 가지며, E1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖는다.
본 발명에 따르는 바이러스를 명확히 규명하기 위한 또 다른 대안 방식은 본 발명에 따르는 바이러스의 5'UTR 서열 또는 NS5B 유전자 서열에 대해 특이적인 프라이머 세트를 이용하는 PCR-시험에 좌우된다.
각종 프라이머 및 이들 프라이머를 사용하여 만들어진 PCR 생성물의 크기에 관한 개요를 표 a 및 b에 나타낸다.
그의 서열이 서열식별번호: 7-8, 서열식별번호: 9-10, 서열식별번호: 11-12 및 서열식별번호: 13-14에 제시되는 4개의 상이한 프라이머 세트를, 상기 바이러스의 NS5B 영역에 대한 그들의 특이성을 알아보기 위해 선택하였다.
제1 프라이머 세트 (서열식별번호: 7-8), 제2 프라이머 세트 (서열식별번호: 9-10), 및 상기 바이러스의 NS5B 유전자와 특이적으로 반응하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 조합물을 이용하는 PCR-시험은 다음 2개의 프라이머 쌍 F1-R1, F2-R2, F1-R2 및 F2-R1을 각각 사용한다.
프라이머 세트 서열식별번호: 11-12 (PAN-FW 및 PAN-REV) 및 서열식별번호: 13-14 (PANdeg-FW 및 PANdeg-REV)는 또한, NS5B와 특이적으로 반응한다. 변성 프라이머 서열식별번호: 13-14를 수반한 세트는 약간 변경된 RNA 서열을 수반한 CTAPV 변이체를 발견할 기회를 증가시키도록 설계되었다.
프라이머 세트 (서열식별번호: 15-16)를 이용하는 PCR-시험은 상기 바이러스의 5' UTR과 특이적으로 반응하고 2개의 프라이머 F3-R3을 사용한다.
프라이머 세트 (서열식별번호: 17-18)를 이용하는 PCR-시험은 또한, 상기 바이러스의 5' UTR과 특이적으로 반응하고 2개의 프라이머 F4-R4를 사용한다.
실시예 섹션에 보다 상세히 기재되는 상기 시험은 cDNA 상에서의 표준 PCR 시험이다. (바이러스가 RNA 게놈을 가지고 있기 때문에, 바이러스 RNA가 역전사효소 반응에서 cDNA로 먼저 전사된다는 것은 말할 나위도 없다. cDNA를 PCR 반응에 사용하였다).
<표 a>
Figure 112017067358382-pct00001
<표 b>
Figure 112017067358382-pct00002
상기 언급된 프라이머 세트를 이용하여 바이러스를 명확히 규명하는 경우에는, 다음과 같이 언급될 수 있다: 예를 들어, F1-R1 프라이머 세트의 PCR-생성물을 분석한 결과, 대략 156개 염기쌍의 PCR 생성물이 밝혀진 경우 또는 예를 들어, 프라이머 F2-R2 세트의 PCR-생성물을 분석한 결과, 대략 335개 염기쌍의 PCR 생성물이 밝혀진 경우, 이는 분석된 바이러스가 본 발명에 따르는 바이러스에 속한다는 것을 명백하게 입증해 준다.
한 예로서만: 대략 156개 염기쌍의 PCR 생성물은 156 + 10개 내지 156 - 10개 염기쌍의 길이를 갖는 PCR 생성물이다. 대략 335개 염기쌍의 PCR 생성물은 335 + 10개 내지 335 - 10개 염기쌍의 길이를 갖는 PCR 생성물이다.
따라서, 본 발명의 상기 실시양태의 또 다른 형태는 다음과 같은 것을 특징으로 하는, 페스티바이러스의 구성원인 단리된 바이러스에 관한 것이다:
a) 상기 바이러스는 돼지에서 군 A-II 선천성 떨림의 원인 감염체이고;
b) 바이러스 RNA 게놈으로부터 역전사된 cDNA는 PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 156 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고/하거나 PCR 반응에서 서열식별번호: 9 및 10에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 335 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고/하거나 PCR 반응에서 서열식별번호: 11 및 12에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고/하거나 PCR 반응에서 서열식별번호: 13 및 14에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고/하거나 PCR 반응에서 서열식별번호: 15 및 16에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고/하거나 PCR 반응에서 서열식별번호: 17 및 18에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공한다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 바이러스에 관한 것인데, 여기서 바이러스 RNA 게놈으로부터 역전사된 cDNA는, PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 156 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고; PCR 반응에서 서열식별번호: 9 및 10에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 335 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하며; PCR 반응에서 서열식별번호: 11 및 12에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고; PCR 반응에서 서열식별번호: 13 및 14에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하며; PCR 반응에서 서열식별번호: 15 및 16에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고; PCR 반응에서 서열식별번호: 17 및 18에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공한다.
이러한 실시양태의 보다 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 바이러스에 관한 것인데, 여기서 이러한 바이러스는 Erns를 코딩하는 유전자, E2를 코딩하는 유전자 및 E1을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 갖고; Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 가지며, E2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖고, E1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 가지며; 바이러스 게놈의 cDNA는, PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 156 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고, PCR 반응에서 서열식별번호: 9 및 10에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 335 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하며, PCR 반응에서 서열식별번호: 11 및 12에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고, PCR 반응에서 서열식별번호: 13 및 14에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 896 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하며, PCR 반응에서 서열식별번호: 15 및 16에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공하고, PCR 반응에서 서열식별번호: 17 및 18에 제시된 바와 같은 프라이머 세트와 반응되어 182 +/- 10개 염기쌍의 PCR 생성물을 제공한다.
본 발명에 따르는 바이러스는 생, 생 약독화 또는 불활성화 형태일 수 있다.
상기 표시된 바와 같이, 상기 바이러스의 Erns, E2 및 E1 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열이 본 발명에 의해 명확하게 규명되었다. 이들 유전자를 확인하는 것이 상당히 유용한데, 이는 이들 유전자가 다음에 광범위하게 설명되는 바와 같이, 특히 DNA-백신을 위한 기준으로서 사용되거나, 이들 단백질을 기준으로 하여 서브유닛 백신을 제조하는 데 사용하기 위하여, 또는 진단 목적을 위하여 사용될 수 있기 때문이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 Erns 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것인데, 이러한 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖는 것을 특징으로 한다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 상기 유전자에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 E2 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것인데, 이러한 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖는 것을 특징으로 한다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 상기 유전자에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 E1 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것인데, 이러한 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 E1 유전자의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성 수준을 갖는 것을 특징으로 한다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 E1 유전자의 뉴클레오티드 서열과 우선 순위의 순서대로, 적어도 82%, 보다 바람직하게 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%의 동일성 수준을 갖는 상기 유전자에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 Erns 단백질에 관한 것인데, 이러한 Erns 단백질은 본 발명에 따르는 Erns 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 바이러스의 상기 Erns 단백질은 고도로 적합한데, 이는 이들 단백질이 다음에 설명되는 바와 같이, 백신, 보다 구체적으로 서브유닛 백신에 사용하기 특히 적합하고, 이들 단백질을 사용하여 항체를 생성시킬 수 있으며 진단 시험을 가능하게 만들기 때문이다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 Erns 단백질에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 E2 단백질에 관한 것인데, 이러한 E2 단백질은 본 발명에 따르는 E2 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 바이러스의 상기 E2 단백질은 고도로 적합한데, 이는 이들 단백질이 다음에 설명되는 바와 같이, 백신, 보다 구체적으로 서브유닛 백신에 사용하기 특히 적합하고, 이들 단백질을 사용하여 항체를 생성시킬 수 있으며 진단 시험을 가능하게 만들기 때문이다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 E2 단백질에 관한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 E1 단백질에 관한 것인데, 이러한 E1 단백질은 본 발명에 따르는 E1 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 바이러스의 상기 E1 단백질은 고도로 적합한데, 이는 이들 단백질이 다음에 설명되는 바와 같이, 백신, 보다 구체적으로 가성-입자 및 이러한 가성-입자를 포함하는 백신에 사용하기 특히 적합하기 때문이다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 E1 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 이점 중 하나는, 바이러스 감염의 과정을 추적하고 본 발명에 따르는 신규 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 돼지의 각종 기관 및 체액에서의 신규 바이러스의 존재 또는 부재를 분석하는 것이 본 발명에 의해 처음으로 가능하다는 것이다.
군 A-II 선천성 떨림으로 인해 고통받고 있는 돼지로부터의 많은 조직 및 기관을 대상으로 하여 본 발명에 의해 신규 바이러스의 존재 또는 부재 및 양에 관하여 시험할 수 있다는 것이 실시예 섹션에 기재되어 있다.
군 A-II 선천성 떨림으로 인해 고통받고 있는 돼지로부터 단리된 혈청, 혈장, PBL, 심장, 소장 및 대장, 뇌, 흉부 척수, 요추 척수, 간, 사타구니 림프절, 폐, 담낭, 방광, 신장, 편도 및 비장이 신규 바이러스를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 질병의 발달에 더 많은 통찰력을 얻는 데 도움이 되었다.
본 발명의 또 다른 이점은 건강한 돼지를 신규 바이러스로 감염시키고 바이러스 감염의 경로를 조사하는 것이 본 발명에 의해 가능하다는 것이다. 이러한 목적으로, 군 A-II 선천성 떨림-동물로부터 기관 물질을 단리하고 정제하는 방법이 본 실시예에 기재되어 있다. 이러한 물질은 패터슨에 의해 적용된 방법 [각종 투여 경로, 경구, 비강, 근육내, 피하 주사를 통해 주입된 10 내지 20% (w/v) 균질물]에 따라 생체 내에서 바이러스의 복제를 연구하기 위해 건강한 이유 후 새끼 돼지에 후속 주입되었다.
또한 본 발명의 또 다른 이점은 신규 바이러스가 임신한 어린 암퇘지의 새끼 돼지에서 군 A-II 선천성 떨림을 유발시킬 수 있음을 보여주기 위한 목적으로 임신한 어린 암퇘지를 신규 바이러스로 감염시키는 것이 본 발명에 의해 가능하다는 것이다. 이들 실험의 결과가 본 실시예에 기재되어 있다.
또한, 이러한 물질은 다음에 기재되는 바와 같은 백신 접종/시험감염에서 시험감염 물질로서 사용되어 왔다.
또한 본 발명의 이점 중 하나는, 신규 돼지 페스티바이러스가 본 발명에 의해 단리되었기 때문에, 이러한 바이러스 및/또는 바이러스의 보호성 서브유닛이 백신 접종 목적용 출발 물질로서 사용될 수 있다는 것이다.
한 예로서만: 실시예 섹션에는 특히, 바쿨로-발현된 E2 단백질을 포함하는 백신의 제조, 전체 세포 백신 및 정제된 E2-백신의 투여 및 상기 언급된 독성 시험감염 물질을 이용한 후속 시험감염이 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것인데, 이러한 백신은 본 발명에 따르는 바이러스의 면역원성으로 유효한 양 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
이러한 관점에서의 퇴치한다는 것은 넓은 의미로 해석되어야 한다: 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하는 것은 상기 설명된 바와 같이 질병의 징후를 방지하기 위해 백신 접종하는 것을 포함할 뿐만 아니라 질병의 징후를 감소시키도록 백신 접종하는 것을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따르는 백신에 사용하기 적합한 제약상 허용되는 담체의 예는 멸균성 물, 식염수, 수성 완충제, 예컨대 PBS 등이다. 또한, 본 발명에 따르는 백신은 다른 부가제, 예컨대 아주반트, 안정화제, 항산화제 및 다음에 논의되는 바와 같은 기타 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 백신은 특히, 약독화 생 또는 불활성화 형태의 본 발명에 따르는 바이러스를 포함할 수 있다. 약독화 생 바이러스 백신, 즉 생 약독화 형태의 본 발명에 따르는 바이러스를 포함하는 백신은 불활성화 백신에 비해, 감염의 자연적인 방식을 가장 잘 모방한다는 이점을 갖고 있다. 또한, 그들의 복제 능력은 적은 양의 바이러스로도 백신 접종을 허용하는데; 그것의 수는 면역 체계의 트리거(trigger) 수준에 도달할 때까지 자동으로 증가될 것이다. 그 순간부터, 면역 체계가 촉발되어 결국 바이러스를 제거하게 될 것이다.
생 약독화 바이러스는 현장으로부터 단리된 바이러스와 비교한 경우에 독력 수준이 감소된 바이러스이다. 독력 수준이 감소된 바이러스는 군 A-II CT에 대항한 보호를 유도시키거나 또는 본 발명에 따르는 야생형 페스티바이러스에 의해 유발된 CT의 증상과 비교해서 CT의 증상을 적어도 감소시켜 주는 바이러스로 간주된다.
따라서, 본 발명의 상기 실시양태의 하나의 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것인데, 이러한 바이러스는 생 약독화 형태이다.
약독화 바이러스는 관련 기술분야에 공지된 각종 방식으로 수득될 수 있다. 이는, 예를 들어 본 발명에 따르는 바이러스를 돌연변이 유발제의 존재하에 성장시킨 다음, 자손 수준 및/또는 복제 속도에서 감소를 나타내는 바이러스를 선별함으로써 수득될 수 있다. 이러한 많은 돌연변이 유발제가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
자주 사용되는 또 다른 방법은 감수성 세포주 상에서 일련으로 시험관내 계대 접종하는 것이다. 이때 바이러스는 일련의 계대 접종에 사용된 세포주에 적응하여, 자연 숙주에게 백신으로 다시 전달될 때 약독화된다.
약독화 바이러스를 수득하는 또 다른 방식은 자연 서식지의 온도에서 벗어난 온도하에 바이러스를 성장시키는 것이다. 온도 감수성 돌연변이체 (Ts-돌연변이체)에 대한 선별 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 통상적으로 돌연변이원의 존재하에 바이러스를 성장시킨 다음, 최적 이하의 온도와 최적 온도 둘 다에서 성장시키며, 세포층 상에서 자손 바이러스를 적정하며, 최적 온도에서 더 느리게 성장하는 이들 플라크를 시각적으로 선별하는 것을 포함한다. 이러한 작은 플라크는 느리게 성장하는 바이러스를 포함하므로, 목적하는 생 약독화 바이러스를 포함한다.
본 발명에 따르는 생 약독화 페스티바이러스를 수득하기 위한 대안 방식은 페스티바이러스의 게놈을 의도적으로 변형시키는 것에 관한 것이다. 이러한 접근 방식은 약독화의 성질이 공지되어 있다는 점에서, 상기 언급된 바와 같이 고전적 약독화 기술에 비해 이점을 갖고 있다. 페스티바이러스의 경우에는, 예를 들어 페스티바이러스 소 바이러스성 설사 바이러스 및 고전적 돼지 발열 바이러스의 많은 생 약독화 바이러스 균주가 보고되었는데, 그로부터 예를 들어, E2 유전자, Erns 유전자 또는 Npro 유전자가 결실되거나 또는 변형된다.
Npro-결실을 갖는 생 약독화 페스티바이러스, 보다 구체적으로 돼지의 페스티바이러스 고전적 돼지 발열 바이러스 (CSFV)의 예가 특히, 미국 특허 번호 US7572455 및 문헌 [Mayer, D. et al.(19)]에 기재되어 있다.
Erns-변형과 Npro-결실 둘 다를 갖는 생 약독화 페스티바이러스, 보다 구체적으로 고전적 돼지 발열 바이러스의 예가 특히, 미국 특허 번호 US7572455에 기재되어 있다.
E2-유전자 내에서의 변형을 갖는 생 약독화 페스티바이러스, 보다 구체적으로 고전적 돼지 발열 바이러스의 예가 특히, 문헌 ([Risatti, G.R. et al.(22)]및 [Risatti, G.R. et al.(23)])에 기재되어 있다.
페스티바이러스 감염은 일반적으로, 돼지, 반추 동물 또는 양을 키우는 많은 국가에서 문제가 된다. 현재, 페스티바이러스가 경제적 손해를 일으키는 여러 나라에서는 페스티바이러스 감염을 다루는 상이한 접근 방식이 일반적으로 적용되고 있다. 일부 국가에서는 스탬프 아웃(stamping-out) 방법을 사용하여 바이러스를 제거하는 반면, 다른 국가에서는 백신 접종 접근 방식을 선호한다. 그러나 이들 상이한 접근 방식을 병행해서 사용한다는 사실 때문에 문제가 발생한다. 한 예로서만: 예를 들어, 돼지 페스티바이러스는 농장에서 사육되는 돼지에서 뿐만 아니라 멧돼지와 같은 야생 동물에서 순환되므로, 바이러스가 가축 내로 유출될 수 있는 저장고가 형성된다. 고전적 백신으로 예방 접종을 한 동물은 현장 감염된 소로부터 용이하게 구분할 수 없는데, 이는 두 가지 경우 모두 바이러스에 대항한 항체가 존재할 것이기 때문이다. 따라서, 페스티바이러스 항체-양성 동물이 감염으로 인해 (바이러스를 보유할 수 있는 경우) 또는 백신 접종으로 인해 항체-양성인지의 여부는 대부분 공지되지 않는다. 그 결과로서, 상기 동물은 그 페스티바이러스에 대한 스탬프 아웃 접근 방식을 선택한 국가로 수송될 수 없을 것이다.
군 A-II CT를 유발하는 신규 페스티바이러스가 본 발명에 의해 확인되었기 때문에, 앞으로 이러한 신규 페스티바이러스에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
이러한 문제는 소위 마커 또는 DIVA 백신 (DIVA = 백신 접종된 동물로부터 차별적으로 감염됨)을 사용하여 해결할 수 있다. 이러한 백신에는 면역원성 바이러스 단백질 중 하나 이상 또는 면역원성 에피토프 중 적어도 하나가 결여되고, 그 결과로서 마커-백신 접종된 동물은 모든 면역원성 바이러스 단백질/에피토프에 대항한 항체를 생성하지 않을 것이다. 백신 접종된 동물과 감염된 동물 간의 항체-팔레트 상의 차이는 이러한 목적을 위해 설계된 진단 시험에 의해 입증될 수 있다. 따라서 이러한 시험은 백신 접종된 동물과 감염된 동물을 구별할 수 있게 해준다.
본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 Erns, Npro, E1 및 E2 단백질을 코딩하는 유전자가 본 발명에 의해 공지되었기 때문에, 예를 들어 돼지 페스티바이러스 CSFV에 대해 기재된 바와 같은 공지된 마커 백신 기술이 본 발명에 의해 새로운 바이러스에 적용될 수 있다. 마커 백신으로서 또한 적합한 생 약독화 CSFV 백신의 예는, 예를 들어 문헌 [Van Gennip, H.G.P. et al.(7), Reimann, I. et al.(8), Beer, M. et al.(9), Wehrle, F. et al.(10), Dong, X.N. and Chen, Y.H.(11), and de Smit, A. J. et al.(24)]에 기재되어 있다. 대부분의 경우에는, E2 또는 Erns 유전자가 이종 바이러스 균주 또는 또 다른 페스티바이러스의 각각의 유전자와 교환되는 키메라 바이러스가 보고되어 있다.
그러나 생 약독화 바이러스의 사용의 가능한 단점은 본질적으로 특정 수준의 독력이 남아 있을 수도 있다는 것이다. 이것은 독력 수준이 허용되는 한은, 즉 백신이 적어도 돼지가 사망하는 것을 방지시켜 주는 한은, 실질적인 단점이 아니다. 물론, 생 약독화 백신의 나머지 독력이 더 낮을수록, 백신 접종 동안/백신 접종 후에 백신 접종이 체중 증가에 미치는 영향이 덜하다.
생 약독화 바이러스를 사용하는 것에 대한 대안은 비-전염성 바이러스를 사용하는 것이다. 이러한 바이러스에서는, 필수 유전자가 결실되고 바이러스를 성장시키는 데 사용되는 세포주에서 트랜스로 보완된다. 그 결과로서, 자손 바이러스는 숙주 세포를 감염시킬 수는 있지만, 그러한 숙주 세포에서 복제할 수 없는 바이러스이다. 이러한 비-전염성 바이러스는 자연적 감염에 근접하게 모방하고, 이와 동시에 바이러스는 확산될 수 없다. 이러한 비-전염성 바이러스를 포함하는 백신은 매우 안전하며, 또한 마커 백신으로서 매우 적합하다. 이러한 백신은, 예를 들어 돼지 페스티바이러스 CSFV에 대하여, 특히 문헌 ([Widjojoatmodjo, M.N. et al.(25)] 및 [Van Gennip, H.G. et al.(26)])에 기재되었다.
불활성화 백신은 생 약독화 대응물과 달리 본질적으로 안전한데, 이는 남아있는 독력이 없기 때문이다. 그들이 생 약독화 백신과 비교해서 다소 높은 용량의 바이러스를 통상적으로 포함한다는 사실에도 불구하고, 이들은 예를 들어, 이미 다른 질병으로 인해 고통받고 있는 돼지에게 바람직한 형태의 백신일 수 있다. 불완전한 영양 또는 최적 이하 주거와 같이 최적 이하의 상태로 유지되는 돼지는 불활성화 백신으로부터도 이득을 얻을 것이다.
따라서, 이러한 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것인데, 여기서 상기 바이러스는 불활성화 형태로 존재한다. 이러한 불활성화 전체 바이러스 백신은 본 발명에 따르는 신규 돼지 페스티바이러스에 대해 만들 수 있다. 공지된 돼지 페스티바이러스 백신의 경우에서와 같이, 생산은 기본적으로, 감수성 돼지 세포에서 신규 돼지 페스티바이러스를 성장시키는 단계, 바이러스를 수거하는 단계, 바이러스를 불활성화시키는 단계 및 불활성화된 바이러스를 제약상 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
불활성화의 표준 방식은 포름알데히드를 이용하는 고전적 처리이다. 불활성화를 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법은 자외선, 감마선, 이원 에틸렌이민, 티메로살을 이용한 처리 등이다. 통상의 기술자에게는 이러한 방법을 적용하는 방식이 공지되어 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스를 β-프로피오락톤, 글루타르알데히드, 에틸렌-이민 또는 포름알데히드로 불활성화시킨다. 바이러스를 불활성화시키는 다른 방식 또한 본 발명에 구체화되는 것은 말할 나위도 없다.
상기 표시된 바와 같이, 본 발명에 따르는 바이러스는 감수성 돼지 세포 또는 세포주 상의 세포 배양물에서 성장시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 페스티바이러스를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다. 이러한 세포주의 한 예가 SK6이다.
본 발명에 따르는 전체 불활성화 돼지 페스티바이러스 및 본 발명에 따르는 비-전염성 돼지 페스티바이러스 바이러스가 불활성화 백신에 대한 우수한 기준을 제공하긴 하지만, 특히 사용된 숙주 세포의 유형, 기질 및 사용된 세포 배양 배지에 따라서 이들의 생산 단가가 비쌀 수 있다.
페스티바이러스의 특이적 경우, 본 발명에 따르는 전체 불활성화 바이러스 또는 비-전염성 돼지 페스티바이러스의 사용을 위한 매력적인 대안은 돼지 페스티바이러스 서브유닛, 특히 Erns 및 E2 단백질의 사용이다.
이러한 서브유닛, 특히 Erns 및 E2 단백질의 발현은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 바쿨로바이러스 발현 시스템과 포유류 세포 둘 다에서 돼지 페스티바이러스 CSFV에 대하여 광범위하게 기재되어 있다 (Hulst, M.M. et al.(27), Bouma, A. et al.(28), Van Rijn, P.A. et al.(29), Moorman, R.J.M. et al.(30), Donofrio, G. et al.(31), Lutticken D. et al.(32), 및 Floegel-Niesmann et al.(33)].
바쿨로바이러스 발현 시스템에서의 Erns 및 E2의 고 수율 발현이, 예를 들어 EP1049788에 기재되어 있다.
더욱이, 바쿨로바이러스 발현 시스템 및 바쿨로바이러스 발현 벡터는 일반적으로, 교과서 (예컨대, 문헌 [O'Reilly et al.(34)] 및 [Murhammer(35)])에 광범위하게 기재되어 있다.
바쿨로바이러스-기반 발현 시스템은 또한, 예를 들어 인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corporation; 미국 캘리포니아주 92008 칼즈배드 파라데이 애비뉴 1600)으로부터 시판되고 있다.
바쿨로바이러스-기반 발현 시스템에 대한 대안은 효모-기반 발현 시스템이다. 효모 발현 시스템은, 예를 들어 문헌 [Gellissen et al.(36)]에 기재되어 있다.
문헌 [Donofrio, G. et al.(31)]에는 포유류 세포주에서의 BVDV E2의 발현이 기재되어 있다.
즉시 사용 가능한 발현 시스템은 특히, 리서치 코포레이션 테크놀로지 (Research Corp. Technologies; 미국 애리조나주 85711-4410 투손 스위트 240 이스트 윌리암스 서클 5210)로부터 시판되고 있다. 효모 및 곤충 세포 발현 시스템이 또한, 예를 들어 클론텍 라보라토리즈, 인크. (Clontech Laboratories, Inc.; 미국 캘리포니아주 94303-4607 팔로 알토 파비안 웨이 4030)로부터 시판되고 있다.
문헌 [Donofrio, G. et al.(31)]에 기재된 바와 같은 포유류 세포 기반 발현 시스템에서의 Erns 및 E2 단백질의 발현이 매우 적합하긴 하지만, 이는 바쿨로바이러스-기반 발현 시스템과 비교해서 사용하는 데 비용이 더 많이 들 것으로 예상된다.
따라서 이러한 실시양태의 또 다른 형태는 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것인데, 이러한 백신은 본 발명에 따르는 Erns 및/또는 E2 및/또는 E1 단백질의 면역원성으로 유효한 양 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
보다 바람직하게, 상기 서브유닛은 소위 페스티바이러스 가성-입자의 형태로 존재한다.
이러한 가성-입자는 기본적으로, Erns, E1 및 E2 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자이다.
그러나, 이들은 전체 페스티바이러스 게놈을 포함하지 않으므로, 숙주에서 복제할 수 없다는 점에서 야생형 바이러스와 상이하다. 그 결과로서, 페스티바이러스 가성-입자는 백신에서 사용되기 전에는 불활성화되지 않아도 되므로, 본질적으로 안전하다는 부가적인 이점이 있다.
페스티바이러스 가성-입자는 Erns, E1 및 E2 단백질을 적합한 발현 시스템에서 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 페스티바이러스 가성-입자의 예 및 이러한 가성-입자를 생성시키는 방법이 특히, EP1454981 및 EP1170367에 기재되어 있다.
따라서, 또한 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 Erns 단백질, 본 발명에 따르는 E2 단백질 및 본 발명에 따르는 E1 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 가성-입자에 관한 것이다.
백신 중에서의 가성-입자의 양 및 투여 경로는 불활성화된 전체 바이러스 입자의 양 및 투여 경로와 거의 동등한 수준일 것인데, 이는 캡시드의 면역원성 및 유사성의 관점에서, 이들은 불활성화된 전체 바이러스 입자와 거의 동등한 수준이기 때문이다.
통상적으로, 1 내지 100 μg의 양의 신규 돼지 페스티바이러스 가성-입자가 백신 용량으로서 매우 적합할 것이다. 비용의 관점에서 볼때, 바람직한 양은 1 내지 50 μg의 범위의 가성-입자일 것이고, 보다 바람직한 양은 1 내지 25 μg의 범위일 것이다.
본 발명에 따르는 백신, 보다 구체적으로 불활성화된 전체 바이러스, 서브유닛, 예컨대 Erns 및 E2 단백질 또는 가성-입자를 기준으로 한 백신은 바람직하게, 아주반트를 포함한다. 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 아주반트는, 예를 들어 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 아주반트, 비타민 E, 비이온성 블록 중합체, 무라밀 디펩티드, 퀼(Quill) A®, 미네랄 오일, 예를 들어 베이욜(Bayol®) 또는 마르콜(Markol®), 식물성 오일, 및 카르보폴(Carbopol®) (단독 중합체), 또는 딜루박 포르테(Diluvac® Forte)이다. 백신은 또한, 소위 "비히클"을 포함할 수 있다. 비히클은 공유 결합 없이 폴리펩티드가 부착되는 화합물이다. 자주 사용되는 비히클 화합물은, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 실리카, 카올린 및 벤토나이트이다.
원칙적으로, 본 발명에 따르는 백신을 단지 한번 투여하는 것으로 충분할 수있다. 그러나, 특히 불활성화 백신의 경우에는, 전체 바이러스 백신, 서브유닛 백신 또는 가성-입자 백신, 바람직하게 또한 1차 부스터 백신 접종 및 가능하게 2차 부스터 백신 접종이 제공된다. 1차 부스터는 통상적으로, 1차 백신 접종 후 적어도 2주에 제공될 것이다. 부스터 백신 접종을 위한 매우 적합한 순간은 1차 백신 접종 후 3주 내지 16주이다. 필요한 경우, 2차 부스터는 통상적으로, 1차 부스터 후 4주 내지 50주일 것이다.
불활성화된 전체 바이러스, 서브유닛, 예컨대 Erns, E2 및 E1 단백질 또는 가성-입자 접근 방식에 대한 대안은 돼지를 그의 숙주 동물로서, 신규 돼지 페스티바이러스 Erns, E2 또는 E1 유전자의 운반체로서 갖는 생 재조합 벡터 바이러스를 사용하는 것이다.
돼지를 그의 숙주 동물로서 갖는 적합한 재조합 벡터 바이러스 중에서, 몇 가지 벡터 바이러스가 운반체로서 특히 적합하다: 가성광견병 바이러스 (PRV), 돼지 아데노 바이러스 (PAV), 돼지 폭스 바이러스 (SPV) 및 고전적 돼지 발열 바이러스 (CSFV). 또한, 백시니아 바이러스가 적합한 벡터 바이러스로서 보고되었다.
이러한 재조합 벡터 바이러스를 백신에 사용하는 것은, 이와 같이 백신 접종된 동물이 상기 벡터 바이러스와 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스 둘 다에 대항하여 동시에 백신 접종된다는 부가의 이점을 갖고 있다.
돼지 페스티바이러스 CSFV E2 유전자에 대한 생 재조합 벡터 바이러스로서 가성광견병 바이러스 (PRV)를 사용하는 것이, 복제 결합있는 PRV 재조합 벡터 바이러스에 대하여 문헌 ([van Zijl et al.(38)] 및 [Peeters et al.(39)])에 기재되어 있다.
돼지 페스티바이러스 CSFV E2 유전자에 대한 벡터 바이러스로서의 생 재조합 돼지 아데노바이러스 (PAV) 벡터 바이러스가 문헌 [Hammond et al.(40,41)]에 기재되어 있다.
돼지 페스티바이러스 CSFV E2 유전자에 대한 벡터 바이러스로서의 생 재조합 돼지 폭스 바이러스 (SPV) 벡터 바이러스가 문헌 [Hahn et al.(42)]에 기재되어 있다.
또한, 백시니아 바이러스가 문헌 [Ruemenapf et al.(37)]에 적합한 벡터 바이러스로서 보고되었는데, 이러한 문헌에는 4개의 모든 구조적 단백질의 발현, 및 특히, E2를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합 벡터로 백신 접종된 돼지에서 보호 면역을 유도시키는 것이 기재되어 있다.
생 약독화 CSFV 바이러스는 또한, 생 재조합 벡터 바이러스로서 매우 적합하다. 한 예로서만; 그로부터 Npro 유전자를 결실시킨 생 약독화 CSFV가 문헌 [Mayer et al.(19)]에 기재되었다. 이러한 생 약독화 바이러스는 특히 Npro 유전자의 결실 부위에, Erns를 코딩하는 유전자 또는 E2 유전자를 삽입할 수 있게 해준다. 따라서, 이러한 생 재조합 CSFV 바이러스는 신규 돼지 페스티바이러스 Erns 또는 E2 유전자에 매우 적합한 벡터 바이러스를 동등하게 형성한다.
이러한 생 재조합 벡터 바이러스의 매우 적합한 양은 바이러스의 약독화 수준에 따라서, 백신 용량당 105 TCID50 내지 5x109 TCID50 범위의 벡터 바이러스일 것이다.
신규 돼지 페스티바이러스 Erns, E2 또는 E1 유전자의 발현은 포유류 세포에서 기능적인 임의의 적합한 이종 프로모터의 제어하에 일어날 수 있다 (하기 참조). 이종 프로모터는 본 발명에 따르는 신규 돼지 페스티바이러스의 야생형 형태에서 신규 돼지 페스티바이러스 Erns, E2 또는 E1 유전자의 전사에 대해 책임이 있는 프로모터가 아닌 프로모터이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 신규 돼지 페스티바이러스 Erns, E2 또는 E1 유전자를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관한 것인데, 상기 유전자가 기능적 이종 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 한다.
포유류 세포에서 기능적인 프로모터는 포유류 세포에서 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 전사를 구동시킬 수 있는 프로모터이다.
포유류 세포에서 기능적인 적합한 프로모터의 예는 고전적 프로모터, 예컨대 CAG 프로모터 (문헌 [Niwa, H. et al., Gene 108:193-199 (1991)]), (인간) 시토메갈로바이러스 즉발형 프로모터 (문헌 [Seed, B. et al., Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478-11482, 1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993]), 라우스 육종 바이러스 LTR (문헌 [RSV, Gorman, C.M. et al., PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan et al., supra; Ulmer et al., supra]), MPSV LTR (문헌 [Stacey et al., J. Virology 50, 725-732, 1984]), SV40 즉발형 프로모터 (문헌 [Sprague J. et al., J. Virology 45, 773, 1983]), SV-40 프로모터 (문헌 [Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983]), 메탈로티오네인 프로모터 (문헌 [Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982]), 열 쇼크 프로모터 (문헌 [Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985]), Ad2의 주요 후기 프로모터 및 β-액틴 프로모터 (문헌 [Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992])를 포함한다. 조절성 서열은 또한, 종결인자 및 폴리-아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 서열 중에서, 널리 공지된 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 서열, SV40 폴리-아데닐화 서열, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV) 종결인자 및 폴리-아데닐화 서열이 있다.
따라서 본 발명은 또한, 기능적 프로모터의 제어하에 본 발명에 따르는 Erns 및/또는 E2 및/또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 생 재조합 벡터 바이러스에 관한 것이다.
백신에 관한 본 발명의 실시양태의 또 다른 형태는 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것인데, 이러한 백신은 기능적 프로모터의 제어하에 본 발명에 따르는 Erns 및/또는 E2 및/또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 생 재조합 벡터 바이러스; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
생 재조합 벡터 바이러스가 Erns 및/또는 E2 및/또는 E1 및/또는 E의 면역원성으로 유효한 양을 발현해야 하는 것은 말할 나위도 없다.
불활성화된 전체 바이러스 백신, 가성-입자 백신 또는 생 재조합 벡터 바이러스를 이용한 백신 접종에 대한 대안은 DNA 백신 접종을 이용하는 것이다.
이러한 DNA 백신 접종은 적합한 프로모터의 제어하에 Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 수반하는 DNA 단편을 숙주 동물 내로 도입하는 것에 근거한다. 일단 이러한 DNA가 숙주 세포에 의해 흡수되면, Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자가 전사되고, 이러한 전사체는 숙주 세포에서 Erns, E2 또는 E1 단백질로 번역된다. 이는 돼지 페스티바이러스의 자연 감염 프로세스를 근접하게 모방한다.
적합한 프로모터는 상기 예시된 바와 같이, 포유류 세포에서 기능적인 프로모터이다.
적합한 프로모터의 제어하에 Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 수반하는 DNA 단편은, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 이러한 플라스미드는 환상 또는 선형 형태로 존재할 수 있다.
돼지의 성공적인 DNA 백신 접종의 예는 문헌 ([Tian, D.Y. et al.(45)], [Sun, Y. et al.(46)], 및 [Sun, Y. et al.(47)])에 기재된 바와 같이, 고전적 돼지 발열 바이러스에 대항한 성공적인 백신 접종이다. 돼지의 성공적인 DNA 백신 접종의 다른 예는 특히, 문헌 [Gerdts et al.(43)]에 기재된 바와 같이 아우제스키병(Aujeszky's disease)에 대항한 성공적인 백신 접종이다. 상기 문헌에는 인간 시토메갈로바이러스의 주요 즉발형 프로모터의 제어하에 당단백질 C를 수반하는 DNA 단편이 사용되는 DNA 백신이 기재되어 있다. 백신 접종은 50 μg의 양의 DNA를 2주 간격으로 4회 수행한다. 백신 접종된 동물에게서, 면역블롯에서 각각의 항원을 인식하고 중화 활성을 나타내는 혈청 항체가 발생되었다.
돼지의 성공적인 DNA 백신 접종의 또 다른 예가 문헌 [Gorres et al.(44)]에 제공되어 있다. 상기 문헌에는 세계적 유행의 돼지 H1N1 인플루엔자와 고전적인 돼지 H1N1 인플루엔자 둘 다에 대항한 돼지의 성공적인 DNA 백신 접종이 기재되어 있다. 그들에게 기능적 프로모터의 제어하에 인플루엔자 H1N1의 HA 유전자를 포함하는 DNA 백신을 프라임 백신 접종하고, 프라이밍 후 3주 및 6주에 2회의 상동 부스트로 백신 접종하였다.
본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 E2 단백질이 가장 면역원성 단백질이기 때문에, 이것이 DNA 백신에 사용하는 데 바람직한 단백질이다. 또한, DNA 백신의 면역원성을 증강시키기 위해, 상기 언급된 방법 ((45),(46),(47))을 사용하거나 또는 (9)에 기재된 바와 같은 부가의 조치에 의존하는 것이 필요할 수 있다.
따라서, 상기 실시양태의 또 다른 형태는 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것인데, 이러한 백신은 기능적 프로모터의 제어하에 본 발명에 따르는 Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 면역원성으로 유효한 양의 Erns, E2 또는 E1 단백질을 발현해야 하는 것은 말할 나위도 없다.
본 발명에 따르는 전체 돼지 페스티바이러스, 본 발명에 따르는 가성-입자, 본 발명에 따르는 생 재조합 벡터 또는 DNA 백신에 근거하는 본 발명에 따르는 백신에 대한 "면역원성으로 유효한 양"을 구성하는 것은 목적하는 효과와 표적 유기체에 좌우된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성으로 유효한 양"은 비-면역된 돼지에서 야생형 군 A-II CT 페스티바이러스로의 감염에 의해 유발된 병리학적 효과와 비교해서, 야생형 군 A-II CT 페스티바이러스로의 감염에 의해 유발된 병리학적 효과를 감소시키는 정도로 돼지에서 면역 반응을 유도시키는 데 필요한 CTAPV, 가성-입자, 생 재조합 벡터 또는 DNA 백신의 양에 관한 것이다.
예를 들어, 백신 접종된 동물에게 실험적인 시험감염을 투여한 다음, 표적 동물의 질병의 임상 징후, 혈청학적 파라미터를 결정하거나 또는 병원체의 재단리를 측정한 후, 이러한 발견을 현장에서 감염된 돼지에서 관찰된 것과 비교함으로써, 치료가 "면역원성으로 유효한" 지의 여부를 결정하는 것은 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
투여된 바이러스의 양은 투여 경로, 아주반트의 존재 및 투여 순간에 좌우될 것이다. 이는 다음에 예시되고, 또한 다른 페스티바이러스 백신에 대한 백신에 관한 상기 및 하기에 인용된 참고문헌이 추가의 지침을 제공한다.
본 발명에 따르는 바이러스를 포함하는 생 백신의 바람직한 양은, 예를 들어 조직 배양 감염성 용량 (TCID50)으로서 표현된다. 예를 들어, 생 바이러스의 경우에는, 바이러스의 나머지 독력에 따라서 동물 용량당 10 내지 109 TCID50의 용량 범위를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 바람직하게는 102 내지 106 TCID50의 범위를 사용한다.
관련 기술분야에 공지된 많은 투여 방식을 적용할 수 있다. 본 발명에 따르는 백신은 바람직하게, 주사 (근육내 또는 복강내 경로)를 통하여 또는 경구적으로 동물에게 투여된다.
투여를 위한 프로토콜은 표준 백신 접종 실시에 따라서 최적화될 수 있다. 모든 경우에, 피내 주사기 (IDAL)를 통한 투여가 바람직한 투여 방식이다.
백신이 본 발명에 따르는 불활성화된 바이러스 또는 가성-입자를 포함하는 경우, 그 용량은 또한, 투여될 바이러스 입자의 수로서 표현될 것이다. 그 용량은 통상적으로, 생 바이러스 입자의 투여와 비교해서 다소 높을 것인데, 이는 생 바이러스 입자가 면역 체계에 의해 제거되기 전에, 이러한 바이러스 입자가 표적 동물에서 특정의 정도로 복제되기 때문이다. 불활성화된 바이러스를 기준으로 한 백신의 경우에는, 사용된 아주반트에 따라서 약 104개 내지 109개 입자의 범위의 바이러스 입자의 양이 통상적으로 적합할 것이다.
백신이 서브유닛, 예를 들어 본 발명에 따르는 Erns, E2 또는 E1 단백질을 포함하는 경우, 그 용량은 또한, 단백질의 마이크로그램으로 표현될 수 있다. 서브유닛을 기준으로 한 백신의 경우, 적합한 용량은 통상적으로, 사용된 아주반트에 따라서 단백질 5 내지 500 마이크로그램의 범위일 것이다.
백신이 Erns, E2 또는 E1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 경우, 그 용량은 DNA의 마이크로그램으로 표현될 것이다. 서브유닛을 기준으로 한 백신의 경우, 적합한 용량은 통상적으로, 특히, 사용된 발현 플라스미드의 효율에 따라서 DNA 5 내지 500 마이크로그램의 범위일 것이다. 많은 경우에, 동물당 20 내지 50 마이크로그램의 플라스미드 양이 유효한 백신 접종에 충분할 것이다.
본 발명에 따르는 백신은 돼지 영농의 맥락에서 투여하기에 적합하고 목적하는 적용 경로 및 목적하는 효과에 부합되는 임의의 형태를 취할 수 있다. 본 발명에 따르는 백신의 제조는 페스티바이러스 백신의 제조 분야의 통상의 기술자에게 통상적인 수단에 의해 수행된다.
경구 투여는 백신의 투여가 용이할 때 바람직하다. 경구 투여하는 경우, 백신은 바람직하게, 경구 투여용으로 적합한 담체, 즉 셀룰로스, 음식물 또는 대사 가능한 물질, 예컨대 알파-셀룰로스 또는 식물성 또는 동물성 기원의 상이한 오일과 혼합된다.
실제로, 수많은 상이한 병원성 바이러스 또는 미생물에 대항하여 돼지에게 백신 접종한다. 따라서, 돼지에 대한 본 발명에 따르는 백신을, 예를 들어 돼지에 대해 병원성인 바이러스 또는 미생물의 부가의 면역원, 또는 상기 바이러스 또는 미생물의 면역원을 코딩하는 유전 정보와 조합하는 것이 실제적이고 경제적인 이유 둘 다로 매우 매력적이다.
따라서, 이러한 실시양태의 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 백신에 관한 것인데, 여기서 이러한 백신은 적어도 하나의 다른 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스; 및/또는 이러한 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스의 적어도 하나의 다른 면역원성 성분 및/또는 이러한 다른 면역원성 성분을 코딩하는 유전적 물질을 포함한다. 면역원 또는 면역원성 성분은 동물에게서 면역 반응을 유도시키는 화합물이다. 이는 예를 들어, 전체 바이러스 또는 박테리움, 또는 이러한 바이러스 또는 박테리움의 단백질 또는 당 모이어티(moiety)일 수 있다.
돼지에 대해 병원성인 가장 흔한 병원성 바이러스 및 미생물은 브라키스피라 히오디센테리아에 (Brachyspira hyodysenteriae), 아프리카 돼지 발열 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 돼지 시르코바이러스(Circovirus), 돼지 토르크 테노(Torque Teno) 바이러스, 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 호흡기 및 생식 증후군 바이러스 (PRRS), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티아에 (Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 하에모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis), 미코플라스마 히오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae)이다.
따라서, 본 발명의 보다 바람직한 형태는 본 발명에 따르는 백신에 관한 것인데, 여기서 돼지에 대해 병원성인 바이러스 또는 미생물은 브라키스피라 히오디센테리아에, 아프리카 돼지 발열 바이러스, 니파 바이러스, 돼지 시르코바이러스, 돼지 토르크 테노 바이러스, 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 호흡기 및 생식 증후군 바이러스 (PRRS), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리키아 콜라이, 에리시펠로 루시오파티아에, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 하에모필루스 파라수이스, 파스테우렐라 물토시다, 스트렙토코쿠스 수이스, 미코플라스마 히오뉴모니아에 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에의 군으로부터 선택된다.
또한 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 백신의 제조 방법에 관한 것인데, 여기서 이러한 방법은 본 발명에 따르는 바이러스 및/또는 본 발명에 따르는 Erns 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 E2 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 E1 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 생 재조합 벡터 바이러스 및/또는 본 발명에 따르는 가성-입자를 제약상 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함한다.
또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 돼지에게서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신에 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 바이러스 및/또는 본 발명에 따르는 Erns 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 E2 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 E1 단백질 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따르는 생 재조합 벡터 바이러스 및/또는 본 발명에 따르는 가성-입자에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, A-II CT는 흔히 발견되는데, 이는 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스가 최초의 임상 징후가 명백해지기 훨씬 전에 농장 또는 특정의 돼지 집단에 존재하는 지의 여부를 아는 것이 중요하다는 것을 의미한다. 따라서, 질병에 대항한 효과적인 예방을 위해, 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 존재를 신속하고도 정확하게 검출하는 것이 중요하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 검출에 적합한 진단 도구를 제공하는 것이다.
이들 도구는 부분적으로, 상기 바이러스에 대항한 항체의 입수 가능성에 의존한다. 이러한 항체는, 예를 들어 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스에 대한 진단 시험에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스에 대항한 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 항혈청은 본 발명에 따르는 바이러스를 이용하여, 예를 들어 돼지, 가금류 또는 예를 들어 토끼를 백신 접종한 다음, 약 4주 후에 출혈시키고, 응고된 혈액을 원심분리시키며 혈청을 경사 분리시킴으로써 신속하고도 용이하게 수득될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
폴리클로날, 단일특이적 또는 모노클로날일 수 있는, 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스에 대항하여 생성된 항체 (또는 그의 유도체)의 제조를 위한 다른 방법이 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 폴리클로날 항체가 요망되는 경우에는, 폴리클로날 혈청을 생성하고 프로세싱하기 위한 기술이 수 십년 동안 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mayer and Walter(35)] 참조).
본 발명에 따르는 바이러스에 대항하여 반응성인 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 오랫동안 공지되어 온 기술에 의해 근친 교배시킨 마우스를 면역시킴으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein(36)] 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 바이러스와 반응성인 항체 또는 항혈청에 관한 것이다.
CTAPV의 검출에 근거한 진단 시험 키트는, 예를 들어 표준 ELISA 시험을 포함할 수 있다. 이러한 시험의 한 예에서는, ELISA 플레이트의 웰의 벽을 상기 바이러스에 대항하여 유도된 항체로 코팅한다. 시험하고자 하는 물질과 함께 인큐베이션한 후, 상기 바이러스와 반응성인 표지된 항체를 상기 웰에 부가한다. 시험하고자 하는 물질이 실제로 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스를 포함하는 경우, 이러한 바이러스는 ELISA의 웰에 코팅된 항체와 결합할 것이다. 웰에 연속해서 부가될 것인 바이러스와 반응성인 표지된 항체는 결국, 이러한 바이러스와 결합될 것이고, 이때 색상 반응은 상기 바이러스의 항원성 물질의 존재를 드러낼 것이다.
따라서, 또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 바이러스와 반응성이거나 또는 그의 항원성 물질과 반응성인 항체를 포함하는, 군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스의 검출을 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다. 바이러스의 항원성 물질은 넓은 의미에서 해석되어야 한다. 이는, 예를 들어 붕해된 형태의 바이러스, 또는 바이러스 외막 단백질을 포함하는 바이러스 외막 물질일 수 있다. 상기 바이러스의 물질이 이러한 바이러스에 대항하여 생성된 항혈청과 반응하는 한은, 그 물질이 항원성 물질인 것으로 간주된다.
군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스과 반응성인 항체의 혈청에서의 검출에 근거한 진단 시험 키트는 또한 예를 들어, 표준 ELISA 시험을 포함할 수 있다. 이러한 시험에서는, ELISA 플레이트의 웰의 벽을, 예를 들어 본 발명에 따르는 바이러스 또는 그의 항원성 물질로 코팅할 수 있다. 시험하고자 하는 물질, 예를 들어 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스에 감염되는 것으로 의심되는 동물의 혈청과 함께 인큐베이션한 후, 본 발명에 따르는 바이러스와 반응성인 표지된 항체를 상기 웰에 부가한다. 항-본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스 항체가 시험된 혈청에 존재하는 경우, 이들 항체는 ELISA의 웰에 코팅된 바이러스와 결합될 것이다. 그 결과로서, 상기 바이러스와 반응성인, 나중에 부가된 표지된 항체는 결합되지 않을 것이고 색상 반응도 발견되지 않을 것이다. 따라서, 색상 반응의 결여는 본 발명에 따르는 바이러스와 반응성인 항체의 존재를 드러낼 것이다.
따라서, 또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따르는 바이러스 또는 그의 항원성 물질을 포함하는, 군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스와 반응성인 항체의 검출을 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다.
면역검정의 설계는 다양할 수 있다. 예를 들어, 면역검정은 경쟁 또는 직접적인 반응에 근거할 수 있다. 더욱이, 프로토콜은 고체 지지체를 이용할 수 있거나 또는 세포성 물질을 사용할 수 있다. 항체-항원 복합체의 검출은 표지된 항체의 사용을 포함할 수 있는데; 이러한 표지는, 예를 들어 효소, 형광성-, 화학발광성-, 방사성- 또는 염료 분자일 수 있다.
샘플 중의 본 발명에 따르는 바이러스와 반응성인 항체의 검출에 적합한 방법은 상기 언급된 ELISA 이외에도, 면역형광 시험 (IFT) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.
군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스의 존재 또는 부재를 진단하기 위한 대안적인 진단 시험이긴 하지만 신속하고도 용이한 진단 시험은 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈과 특이적으로 반응성인 PCR 프라이머 세트를 포함하는, 상기에 언급된 바와 같은 PCR 시험이다. 이러한 맥락에서 특이적은, 예를 들어 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈에 대해 독특하다는 것을 의미하는데, 즉 다른 페스티바이러스의 게놈에 대해서는 그렇지 않다는 것을 의미한다.
상기 확인된 프라이머보다 더 많은 프라이머가 사용될 수 있다는 것은 말할 나위도 없다. 본 발명은 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈의 독특한 서열을 처음으로 제공한다. 이로써, 통상의 기술자는 어떠한 부가의 노력 없이도 다른 선택적 프라이머를 선택할 수 있다. 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈을 간단히 컴퓨터 분석함으로써, 본 발명에 의해 유전자 서열에 다른 페스티바이러스의 공지된 게놈이 제공되고, 통상의 기술자는 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 및/또는 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스와 다른 바이러스 (돼지) 병원체 간을 구별하기 위한 진단 시험을 위한 다른 특이적 PCR-프라이머를 개발할 수 있다.
본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈과 특이적으로 반응하는 PCR-프라이머는 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈하고만 반응하고, 또 다른 (돼지) 병원성 바이러스, 또는 (돼지) 병원성 바이러스의 군의 게놈하고는 반응하지 않는 프라이머인 것으로 이해된다.
따라서, 또 다른 실시양태는 군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스의 검출을 위한 진단 시험 키트에 관한 것인데, 이러한 시험 키트는 본 발명에 따르는 신규 페스티바이러스의 게놈과 특이적으로 반응성인 PCR 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이러한 실시양태의 바람직한 형태는 군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스의 검출을 위한 진단 시험 키트에 관한 것인데, 여기서 상기 시험 키트는 서열식별번호: 15-16에 제시된 바와 같은 프라이머 세트를 포함한다.
특수 형태의 진단 시험이 실시예 10에 보다 상세히 기재된 qRT-PCR 시험에 의해 제공된다. 이러한 시험은 각종 샘플, 예컨대 혈청 샘플, 정액 샘플 및 조직 샘플에 존재하는 바이러스의 양을 정량화하는 데 매우 적합하다. 이러한 시험은 바이러스 RNA를 검출하는 것 이외에도, 상기 샘플에 존재하는 RNA 카피의 수를 신속하고도 신뢰할 수 있게 정량화할 수 있게 해준다.
실시예 10에는, RNA를 단리하고 이를 대상으로 RT-반응을 수행한 후에, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 CTAPV 게놈의 5' UTR 게놈을 증폭시키는 방법이 기재되어 있다. 바이러스 게놈의 이러한 부분은 CTAPV 변이체 1 내지 9 간에 보존된 뉴클레오티드 서열에 근거하여 선택되었다 (뉴클레오티드 서열의 정렬에 근거함). 실시예 10에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: CTAPV-PAN2-F3-B: CGTGCCCAAAGAGAAATCGG (서열식별번호: 35) 및 CTAPV-PAN2-R3-B (서열식별번호: 36): CCGGCACTCTATCAAGCAGT.
그러나 통상의 기술자는 CTAPV 변이체 간에 보존된 뉴클레오티드 서열을 나타내는 바이러스 게놈의 임의의 부분이 적합한 프라이머의 선별에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 10은 본 발명에 따르는 qRT-PCR 반응이, 예를 들어 수퇘지의 정액에서 바이러스 RNA를 검출하기 위해 어떻게 성공적으로 사용되었는지를 나타낸다.
실시예 11에는, 이러한 진단 기술을 이용하여, CTAPV-없는 어린 암퇘지가 CTAPV-감염된 수퇘지의 정액을 통하여 CTAPV에 감염될 수 있다는 사실이 제시되었다.
참고문헌
Figure 112017067358382-pct00003
Figure 112017067358382-pct00004
Figure 112017067358382-pct00005
도 1: CTAPV의 RNA 폴리머라제 유전자 (NS5B)에서 설계된 프라이머, 및 PCR 생성물의 도식적 개요.
도 2: 뇌 및 척수 조직에서 가장 특이한 이상의, 포르말린 고정되고 헤마톡실린-에오신 염색된 400배 배율. (A) 푸르키네(Purkinje) 세포 (과립층과 백질 사이의 큰 세포 층)의 공포형성을 보여주는 소뇌의 단면. 백색 화살표는 푸르키네 세포 중 일부에서 공포형성의 예를 나타낸다. (B) 탈수초화를 나타내는 백질의 공포형성. 척수에서 축삭의 탈수초화의 일부 예는 백색 화살표로써 표시된다. (C) 대뇌에서 퇴행성 뉴런 주변에 미세신경교세포 결절을 형성하는 (신경세포포식) 미세신경교세포 (진한 자색 염색됨)의 축적. 뉴런이 백색 화살표로써 표시된다. (D) 흉부 척수에서의 혈관 주위 커핑(cuffing). 호산구성 과립구는 화살표로써 표시된 혈관을 둘러싸고 있다.
도 3: CTAPV 1 및 기존에 확인된 다른 페스티바이러스 (그의 뉴클레오티드 서열이 유전자은행에 기탁되었고, 그 수탁 번호가 도면에 표시되었다)의 계통수. 폴리프로테인의 아미노산 서열을 가장 가까운 이웃 방법으로 사용하였다. 왼쪽 구석의 막대는 뉴클레오티드 치환/부위의 평균 수를 나타낸다.
도 4: CTAPV 변이체의 계통발생적 분석. 아미노산 서열을 가장 가까운 이웃 방법에 사용하였다. 왼쪽 구석의 막대는 뉴클레오티드 치환/부위의 평균 수를 나타낸다. 분석은 게놈의 첫 번째 5,000개 뉴클레오티드에 근거하였다. CTAPV 유형 7은 포함되지 않았다. CTAPV 5는 CTAPV 8과 동일하다.
도 5: CTAPV 1 및 1B의 Erns-E1-E2 영역의 아미노산 서열 비교. E2 단백질 서열은 이탤릭체이다. Erns 단백질은 진한 선으로 밑줄이 그어져 있고, E1 단백질 서열은 가는 선으로 밑줄이 그어져 있다.
도 6: CTAPV 1B 및 8의 Erns-E1-E2 영역의 아미노산 서열 비교. E2 단백질 서열은 이탤릭체이다. Erns 단백질은 진한 선으로 밑줄이 그어져 있고, E1 단백질 서열은 가는 선으로 밑줄이 그어져 있다.
도 7: 토끼에서 생성된 항체는 바쿨로바이러스/SF9 발현 시스템에서 발현된 CTAPV E2 단백질을 특이적으로 인식한다. 마커 밴드는 (아래에서 위로) 5, 10, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa에 상응한다.
도 8: Erns 단백질 코딩 영역 (진하게 밑줄침), E1 단백질 코딩 영역 (가늘게 밑줄침) 및 E2 단백질 코딩 영역 (이탤릭체)의 위치의 표시. 서열은 참조 게놈의 nt 1259에서 시작한다.
도 9: 표준 라인 샘플 및 음성 대조군 샘플의 RT-qPCR 데이터. 도 9a는 RFU에 대항하여 플롯된 주기를 수반한 Ct 값을 갖는 다이어그램을 도시한 것이고, 도 9b는 표준 곡선을 도시한 것인데; Ct 값은 표적 핵산의 일련의 10배 (로그) 희석물의 로그-변환된 농도에 대항하여 플롯된 것이며; 도 9c는 실시간으로 유도체 용융 곡선을 도시한 것이다.
실시예 :
실시예 1.
네덜란드 내의 한 돼지 농장에서 새로운 바이러스인 CTAPV 1을 발견함
네덜란드 내에 위치한 한 돼지 농장에서, 2012년 초에 선천성 떨림 유형 A-II가 집단 발병한 것으로 진단되었다. 첫 번째 출산 경력 동물인 어린 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지가 주로 병에 걸렸지만, 출산 경력이 더 많은 암퇘지도 때때로 병에 걸렸다. 진단은 임상적 관찰과, 그 질병에 대한 가능한 원인으로서 선천성 떨림 유형 A-I, A-III, A-IV 및 A-V의 후속 배제에 근거하였다. 임상적으로 병에 걸린 새끼 돼지는 활동 중 과도한 근육 수축으로 인해 상이한 등급의 떨림을 나타냈다. 그 증상은 수면 중에는 감소되었다. 새끼 돼지의 사망은, 특히 출생 후 첫 주 동안에 병에 걸린 동물이 스스로 먹을 수 없기 때문에 생기는 2차적인 영향이었다. 조직학적으로, 뇌와 척수는 저수초형성을 특징으로 하였다. 다음에 추가로 기재되는 바와 같이, 병에 걸린 모든 돼지가 살아남은 것은 아니다. 살아 남은 돼지에서는, 떨림이 줄어들었고 돼지가 성장하면서 최종적으로 사라졌다. 이러한 집단 발병 정보에 근거하여, 질병의 감염성 기원이 의심되었다. 2012년도 첫 20주에는, 어린 암퇘지로부터 태어난 총 231마리의 한배 새끼 중에서 총 48마리의 한배 새끼가 선천성 떨림 증상을 보였다. 이는 어린 암퇘지로부터 태어난 모든 한배 새끼의 21%에 달한다. 집단 발병의 개시 후 8주에 감염이 최고조로 될 때, 어린 암퇘지의 한배 새끼의 85%가 선천성 떨림 유형 A-II를 동반한 새끼 돼지를 나타냈다. 이유기 때까지의 새끼 돼지 사망 비율 (%)은, 병에 걸리지 않은 한배 새끼에서의 11%와 비교해서 병에 걸린 한배 새끼에서 26%였다. 병에 걸린 한배 새끼에서는, 새끼 돼지 사망의 60%가 선천성 떨림에 기인하였다. 한배에서 태어난 새끼 돼지의 총수가 영향을 받지는 않았다. 선천성 떨림은 수컷과 암컷 새끼 돼지 둘 다에 영향을 미쳤고, 한배 새끼 내에서의 유병률은 <10% 내지 100%로 다양하였다.
2012년도의 집단 발병 이전에는, 2009년 11월과 2010년 12월에 소수의 한배 새끼에서 선천성 떨림이 관찰되었다.
선천성 떨림의 집단 발병에 따른 문제점은 이러한 농장에서 2012년 이래로 지속되어 왔고, 2013년과 2014년에도 병에 걸린 새끼 돼지가 존재하였다 (하기 참조). 그러나, 그 발생률은 감소되었다.
혈장 샘플을 2012년 3월 (6개 샘플, CT 유형 A-II 증상이 있는 모든 새끼 돼지)과 2012년 4월 (5개 샘플, CT 유형 A-II 증상이 있는 모든 새끼 돼지)에 수득하였다. 11개 샘플 중 11개에서 새로운 바이러스 CTAPV 1이 검출되었다.
2012년 7월에는 동일한 농장으로부터 더 많은 혈장 샘플을 수득하였다. 2마리의 암퇘지와 1마리의 어린 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지로부터의 총 16개의 혈청 샘플을 분석하였다. 이들 새끼 돼지 중 어느 것도 선천성 떨림을 보이지 않았다. 16개 샘플 중 1개에서 CTAPV가 발견되었다.
2013년 1월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 진단되었다. 부검을 위해 4마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데, 이들 모두가 CT 유형 A-II 증상을 보였다. 이러한 바이러스는 CTAPV 1A로 명명되었는데, 이는 동일한 농장에서 유래되긴 하였지만 원래의 집단 발병과 새로운 임상 문제 발생 사이에 상당한 시간이 경과했기 때문이다. 이러한 새로운 바이러스 CTAPV 1A는 4마리의 새끼 돼지 중 4마리에게서 검출되었다.
2013년 3월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 진단되었다. 부검을 위해 3마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데, 이들 모두가 CT 유형 A-II 증상을 보였다. 이러한 바이러스는 CTAPV 1B로 명명되었다. 새로운 바이러스 CTAPV 1B는 3개의 샘플 중 3개에서 검출되었다.
2014년 1월에 상기 질병의 새로운 집단 발병이 진단되었다. 4마리의 초유 이전의 신생아 새끼 돼지를 얻었는데 (직장 면봉), 이들 모두가 CT 유형 A-II 증상을 보였다. 이러한 바이러스는 CTAPV 1C로 명명되었다. 새로운 바이러스 CTAPV 1C는 4개의 샘플 중 4개에서 검출되었다. 2014년 2월에 부가의 3마리 새끼 돼지에 대한 부검을 수행하였는데, 이들 3마리 새끼 돼지 모두는 CT 유형 A-II 증상을 나타냈고, CTAPV가 3개의 샘플 중 3개에서 검출되었다.
2013년 1월, 2013년 3월 및 2014년 2월에 집단 발병에 걸린 새끼 돼지를 대상으로 사후 검사를 수행하였다. 뇌와 척수는 탈수초화 징후를 보였다 (실시예 2 참조).
선천성 떨림 유형 A-II의 병력이 없는 특정 농장으로부터의 7마리의 새끼 돼지 (6마리는 출산 전 임신 마지막 주의 새끼 돼지이고; 1마리는 신생아 새끼 돼지이다)를, PCR 및 사후 검사를 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 혈장 샘플은 CTAPV 바이러스에 대해 음성이었고, 이들 새끼 돼지에게서 조직학적 이상은 전혀 관찰되지 않았다.
혈청 및 대변 샘플의 수집
신생아 돼지에서 CT 유형 A-II로 인한 문제를 나타낸 네덜란드 내의 농장들로부터 대변 및 혈청 샘플을 수득하였다. 혈액을 튜브 [유형: 바쿠올레트(Vacuolette) 8 ml Sep 응고 활성화제 ref: 455071]에 수집하고, 이를 4℃ 하에 3,000 x g로 20분 동안 원심분리시킴으로써 혈청을 단리하였다. 건조 면봉을 이용하여 대변을 수집하고, 2 ml 인산염 완충 식염수 용액 (PBS)을 함유하는 멸균성 튜브에 놓아두었다. 그 다음, 대변이 묻은 면봉을 강하게 교반시키고 버렸다. 혈청 샘플과 대변 샘플 둘 다를 분석할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다.
임의로 DNAse 처리하여 바이러스 RNA를 단리함
바이러스 RNA 단리를 위하여, QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트 [퀴아젠(Qiagen)]를 RNase 무함유 DNase 키트 (퀴아젠)와 조합하여 사용하였다.
요약하면, AVL 완충제 중의 담체-RNA/AVE의 1% 용액을 제조하였다. AVL 중의 560 μl 담체-RNA/AVE를 140 μl 샘플과 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 560 μl 에탄올 (>99%)을 부가하고, 샘플을 QIAamp 미니 스핀 칼럼으로 옮겼다. 칼럼을 6,000 x g 하에 1분 동안 원심분리시켰다. 250 μl AW1을 부가하고 칼럼을 6,000 x g 하에 30초 동안 스피닝함으로써 칼럼을 세척하였다. 10 μL DNase를 샘플당 70 μl RDD 완충제와 혼합함으로써 DNase-혼합물을 제조하였다. 80 μl DNase-혼합물을 실온에서 15분 동안 막 상에서 인큐베이션하였다. 250 μl AW1을 칼럼 위에 놓아두고 이를 6,000 x g 하에 30초 동안 스피닝한 다음, 500 μl AW2를 칼럼에 부가하고 이를 13,000 x g 하에 3분 동안 원심분리시킴으로써 세척을 지속하였다. 수집 튜브를 교체하고 칼럼을 1분 더 원심분리시켰다. 스핀 칼럼을 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내로 옮겼는데, 여기서는 65 μl AVE 완충제를 막 위에 부가하고 이를 6,000 x g 하에 1분 동안 원심분리시켰다. RNA 샘플은 즉시 역전사효소-반응을 거쳤다.
역전사효소 -반응
RT-PCR을 위한 슈퍼스크립트(SuperScript®) III 제1 가닥 합성 시스템 [인비트로젠(Invitrogen)]을 이용하여 RNA를 cDNA로 전사하였다. 일부 작은 변형을 수반하여 제조업자의 프로토콜을 수행하였다. 요약하면, 1 μl 무작위 6량체 및 1 μl 10 mM dNTP를 8 μl RNA와 혼합하였다. 이를 먼저, 65℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 상에서 냉각시켰다. 이어서, 2 μl 10x RT 완충제, 4 μl MgCL2, 2 μl DTT, 1 μl RNaseOUT 및 1 μl 슈퍼스크립트® III RT로 이루어진 10 μl cDNA 합성 혼합물을 상기 샘플에 부가하였다. 이러한 샘플을 먼저, 25℃에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 50℃에서 50분 동안 인큐베이션한 후, 85℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 얼음 상에서 냉각시켰다. 1 μl RNase H를 샘플에 부가하고, 이를 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이로써 수득된 cDNA 샘플을 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
PCR
A. 프라이머 조합 CTAPV-PAN2-F1R1, -F2R1, -F1R2, -F2R2, 표 1,2
각각의 PCR 반응물은 27μl WFI, 1 μl 슈퍼 Taq 플러스 5μl 10x 슈퍼 Taq PCR 완충제, 5 μl dNTP, 5 μl 정방향 프라이머 및 5 μl 역방향 프라이머를 함유하였다. 사용된 프라이머의 개요가 표 1에 제시된다. CTAPV를 검출하기 위해 사용된 PCR 프로그램은 95℃에서 4분의 초기화 단계로 이루어졌다. 이어서, 95℃에서 30초 동안 순차적으로 변성시키고, 프라이머 쌍에 대한 적절한 어닐링 온도에서 30초 동안 어닐링시키며 (표 1 참조), 72℃에서 30초 동안 연장시키는 것을 35주기 수행하였다. 72℃에서의 최종 연장을 10분 동안 유지하였다. 1.5% 아가로스-겔 전기영동을 이용하여 모든 PCR 생성물을 분석하였다 (도 1 참조).
B. 프라이머 조합 CTAPV-PAN-FW-RV, PANdeg-FW-PANdeg-REV, 표 1,2
각각의 PCR 반응물은 27μl WFI, 1 μl 슈퍼 Taq 플러스 5μl 10x 슈퍼 Taq PCR 완충제, 5 μl dNTP, 5 μl 정방향 프라이머 및 5 μl 역방향 프라이머를 함유하였다. 사용된 프라이머의 개요가 표 2에 제시된다. CTAPV를 검출하기 위해 사용된 PCR 프로그램은 95℃에서 4분의 초기화 단계로 이루어졌다. 이어서, 95℃에서 30초 동안 순차적으로 변성시키고, 프라이머 쌍에 대한 적절한 어닐링 온도에서 30초 동안 어닐링시키며 (표 2 참조), 72℃에서 60초 동안 연장시키는 것을 40주기 수행하였다. 72℃에서의 최종 연장을 10분 동안 유지하였다. 1.5% 아가로스-겔 전기영동을 이용하여 모든 PCR 생성물을 분석하였다.
C. 프라이머 조합 CTAPV-PAN2-F3R3, -F4R4, 표 1,2
각각의 PCR 반응물은 27 μl WFI, 1 μl 슈퍼 Taq 플러스 5μl 10x 슈퍼 Taq PCR 완충제, 5 μl dNTP, 5 μl 정방향 프라이머 및 5 μl 역방향 프라이머를 함유하였다. 사용된 프라이머의 개요가 표 1에 제시된다. CTAPV를 검출하기 위해 사용된 PCR 프로그램은 95℃에서 4분의 초기화 단계로 이루어졌다. 이어서, 95℃에서 30초 동안 순차적으로 변성시키고, 프라이머 쌍에 대한 적절한 어닐링 온도에서 30초 동안 어닐링시키며 (표 1 참조), 72℃에서 30초 동안 연장시키는 것을 35주기 수행하였다. 72℃에서의 최종 연장을 10분 동안 유지하였다. 1.5% 아가로스-겔 전기영동을 이용하여 모든 PCR 생성물을 분석하였다.
<표 1>
프라이머의 개요
Figure 112017067358382-pct00006
<표 2>
사용된 프라이머 조합의 개요, 및 표적의 특징
Figure 112017067358382-pct00007
D. SYBR 그린 정량적 PCR
qPCR 결과의 정량화를 위한 표준 라인
qPCR에 대한 표준을 수득하기 위해, qPCR 표적 서열을 함유하는 CTAPV 서열의 155 bp PCR 생성물을 제조업자의 지시에 따라서 TOPO4 플라스미드 벡터 [라이프 테크놀로지(Life Technologies)] 내로 클로닝하였다. CTAPV-PAN2-F1 및 CTAPV-PAN2-R1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 클로닝을 위한 155 bp CTAPV PCR 생성물을 수득하였다 (표 3 참조). 연속해서, 이러한 PCR-생성물을 1.5% 아가로즈-겔 상에서 전기영동하였다. 155 bp 밴드를 커팅하고, TOPO4 벡터에서 클로닝하기 이전에 아가로즈-겔로부터 DNA를 추출하였다.
TOPO TA 클로닝® 키트 (인비트로젠)를 사용하여 PCR 생성물을 pCR®4-TOPO4® 벡터 내로 라이게이션하고, 이를 원 샷(One Shot®) TOP10 화학적으로 적격한 이. 콜라이 (E. Coli) 내로 형질전환시켰다. 요약하면, 4 μl의 DNA를 1 μl 염 용액 및 1 μl의 TOPO 벡터와 혼합하였다. 이러한 라이게이션물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 위에 올려 놓았다. 2 μl 라이게이션 혼합물을 원 샷® TOP10 화학적으로 적격한 이. 콜라이에 부가하였다. 얼음 상에서 30분 인큐베이션한 후, 혼합물을 42℃ 수욕에서 30초 동안 열 쇼크를 가하고, 얼음 위에 다시 놓아두었다. 이어서, 250 μl 가온 SOC 매질을 부가하고, 혼합물을 진탕 인큐베이터에서 37℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션한 후, 100 μl 혼합물을 아가-LB + 100 μg/ml 앰피실린 플레이트 전반에 확산시켰다. 이 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
표준 PCR 검정에서 M13 프라이머 [하기 표 3 참조; (서열식별번호: 30 및 31)]를 이용하여 집락-PCR을 사용한 다음, 겔 전기영동함으로써 정확하게 클로닝된 집락을 확인하였다. 앰피실린을 수반한 LBACF 배지 [MSD AH 미디어 프로덕션 로트 번호 318781; 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지, 동물 성분 없음]에서 상기 정확한 집락을 성장시켰는데, 제조업자의 프로토콜에 따라서 퀴아젠® 플라스미드 미디 키트 (퀴아젠)를 이용하여 그로부터 플라스미드 DNA를 단리시켰다. 돌연변이를 검사하기 위해, M13 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA를 서열 분석하였다.
<표 3>
qPCR 분석을 위해 사용된 프라이머 조합의 개요
Figure 112017067358382-pct00008
벡터의 플라스미드 DNA 농도를 측정함으로써 표적 서열의 표준 희석을 계산하였다. 플라스미드 카피/μl를 계산하기 위한 공식이 다음에 제시된다 (공식 1). DNA 농도 (ng/μl)는 분광광도측정법을 이용하여 측정하였다. A, G, T 및 C는 플라스미드 내의 동음 이의어 뉴클레오티드의 계수치이다. 6.02*1023은 아보가드로(Avogadro) 수이다. 곱하기 2는 ssDNA 농도를 dsDNA 농도로 전환시키고, 곱하기 109는 그램을 나노 그램으로 전환시킨다. qPCR 반응의 경우, 108 내지 101개 카피/2 μl을 함유하는 8개의 희석물을 만들었다.
공식 1: 플라스미드 카피/μl의 계산을 위한 공식
플라스미드 카피/μl = DNA 농도 (ng/μl)/(((A*328.24 + G*344.24 + T*303.22 + C*304.16)/(6.02*10^23)) *2*10^9).
qPCR
SYBR 그린 기반 qPCR을 개발하였다. 각각의 반응물은 10 μl KAPA SYBR 신속 qPCR 마스터 혼합물, 0.4 μl 10 μM 정방향 프라이머, 0.4 μl 10 μM 역방향 프라이머, 7.2 μl WFI 및 2 μl 주형을 함유하였다. 프라이머 CTAPV-PAN-F1 및 CTAPV-PAN-R1을 사용하였다 (표 4 참조). 다음 프로그램을 사용하였다: 95℃에서 3분에 이어, 순차적으로 95℃에서 10초, 60℃에서 10초의 39주기를 수행하고, 플레이트를 바이오래드(Biorad) CFX 시스템에서 판독하였다. 바이오래드 CFX 소프트웨어를 이용하여 그 결과를 분석하였다. 결과를 상기 언급된 바와 같이 표준 라인과 비교하였고; 155 bp CTAPV 생성물의 일련의 10배 희석물을 TOPO4 플라스미드 내로 클로닝하였다. 0.5℃/0.05초로 65℃에서 95℃까지의 용융 곡선 분석이 qPCR 프로그램에 포함되었다.
qPCR 반응의 특이성은 증폭된 PCR 생성물의 겔 전기영동에 의해 검증되었다. 보정 곡선 기울기와 y 절편은 CFX 소프트웨어에 의해 계산되었다. r2는 >0.99였다. 상기 기울기로부터 계산된 PCR 효율은 95 내지 105%였다.
<표 4>
qPCR 반응 혼합물
Figure 112017067358382-pct00009
뉴클레오티드 서열 분석
문헌에 기재된 방법에 따라서 생거(Sanger) 서열 분석을 수행하였다. 서열 분석기 5.0 및 클론 매니저 9를 이용하여 서열을 분석하였다.
계통발생적 분석
계통발생적 분석을 수행하여 CTAPV 1을 페스티바이러스로서 분류하였다.
신규 바이러스의 전체 유전자의 아미노산 서열을 이용하여, 이웃 결합 최대 우도 방법, 프와송 보정 모델 및 부트스트랩 분석에 근거하여 계통수를 만들었다 (500회 복제물).
이들 계통수는 표준 환경을 이용하여, 프로그램 MEGA, 버전 5를 사용하여 만들었다 (MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson, Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol. Evol. 28(10):2731-2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121 Advance Access publication May 4, 2011).
실시예 2.
바이러스 CTAPV는 기관 및 PBL에서 발견될 수 있고; 조직학은 뇌 및 척수에서의 탈수초화를 나타낸다
선천성 떨림 유형 A-II을 동반한, 부검한 초유 이전의 신생아 새끼 돼지 (CTAPV 1A/1B, 2013)의 다음 기관을 PCR 분석한 결과, CTAPV 바이러스가 존재하는 것으로 나타났다.
CTAPV가 혈액, 혈청, 혈장, 및 PBL (말초 혈액 백혈구), 심장, 소장, 대장, 뇌, 흉부 척수, 요추 척수, 간, 사타구니 림프절, 폐, 담낭, 방광, 신장, 편도 및 비장에서 검출될 수 있었다. 가장 많은 양이 혈청 및 편도에서 검출되었다.
동일한 기관은 CT 유형 A-II의 병력이 없는 농장에서 출산 전 (임신 마지막 주) 대조군 새끼 돼지로부터의 샘플이었다. 모든 기관은 PCR에서 음성이었다.
대조군 및 CTAPV-감염된 새끼 돼지의 뇌 및 척수를 부검하고, 프로말린 고정시키며 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 조직학적으로 조사한 결과, CTAPV-감염된 새끼 돼지에서만 탈수초화가 나타난 것으로 밝혀졌다 (도 2A-D).
상이한 지리적 위치에 있는 농장으로부터의 CTAPV 변이체
CTAPV 변이체 2 내지 9는 2013년 집단 발병 이후에 네덜란드 내의 돼지 농장으로부터 수득하였다.
표 5는 각각의 농장에서 시험된 새끼 돼지의 수, 및 CTAPV PCR 양성 새끼 돼지의 수 (혈청/직장 면봉)를 나타낸다.
<표 5>
네덜란드 내의 상이한 농장으로부터의 CTAPV 변이체의 개요. 혈청 및/또는 직장 샘플 중의 CTAPV의 PCR 분석 결과.
Figure 112017067358382-pct00010
질병 연관성은 CT 유형 A-II를 보이는 새끼 돼지의 경우 100%이다. CTAPV 바이러스는 선천성 떨림 유형 II를 동반하는 모든 새끼 돼지에서 검출되었지만, CT 유형 A-II의 병력이 없는 특정 농장에서 취한 대조군 샘플에서는 검출되지 않았다.
CTAPV 1이 선천성 떨림을 보이지 않았던 한 마리의 새끼 돼지에서 발견되었다. 이러한 새끼 돼지는 CT 유형 A-II의 병력이 있는 농장인 농장 1로부터 유래되었다.
CTAPV 4는 선천성 떨림을 보이지 않았던 새끼 돼지에서 발견되었다. CTAPV 4는 CTAPV 3이 발견되었던 곳과 동일한 농장 (농장 3)에서 발견되었다. 따라서, CTAPV 4는 CT 유형 A-II의 병력이 있는 농장에 존재하였다.
8곳의 지리적으로 상이한 위치로부터 총 12개의 변이체가 발견되었다.
● 변이체 CTAPV 1, 1A, 1B, 1C는 상이한 시점에 동일한 농장으로부터 유래된다.
● 변이체 CTAPV 3 및 4는 동일한 농장으로부터 유래된다.
● 변이체 CTAPV 5 및 8은 상이한 지리적 위치에서 발견되긴 하였지만, 뉴클레오티드 수준 면에서 동일하다.
표 6은 프라이머 쌍의 반응성을 나타낸다.
<표 6>
프라이머 쌍의 반응성
Figure 112017067358382-pct00011
모든 변이체는 PCR 프라이머 쌍 F3R3을 사용하여 검출할 수 있다.
모든 변이체는 PCR 프라이머 조합 F1R1, F1R2, F2R1, F2R2 중 하나를 사용하여 검출할 수 있지만, 변이체 CTAPV 9는 시험되지 않았다.
게놈 서열분석
CTAPV 1의 완전한 게놈 서열은 생거 서열 분석에 의해 수득하였다.
다른 변이체, 즉 CTAPV 1A, 1B, 1C, 2, 3, 4, 6, 8 및 9 중에서, Erns, E1 및 E2에 대한 코딩 서열을 포함한 첫 번째 5,000 bp를 수득하였다.
1073 nt의 제한된 뉴클레오티드 서열만이 M7에 이용 가능하다.
게놈 서열 분석에 근거하여, CTAPV 5가 CTAPV 8과 동일한 것으로 결론내었다.
실시예 3.
CTAPV 및 CTAPV 변이체의 계통발생적 분석
CTAPV 1 및 다른 공지된 페스티바이러스의 계통수가 도 3에 제시된다. 부트스트랩 지원 %는 노드에 지정된다. 거리 막대는 부위당 뉴클레오티드 치환 수를 표시한다.
본 특허 출원에 기재된 CTAPV 변이체 중 10개의 계통수가 도 4에 제시된다. 변이체 CTAPV 1, 1A, 1B, 1C, 2, 3, 4, 6, 8 및 9만이 본 분석에 포함되었다. 뉴클레오티드 서열 1 내지 5,000 bp가 본 분석에 포함되었는데, 이는 Erns, E1 및 E2에 대한 코딩 서열을 포함한다.
CTAPV 7이 포함되지 않았는데, 이는 1073 nt만이 M7에 이용 가능하기 때문이다.
CTAPV 5가 포함되지 않는데, 이는 CTAPV 5가 CTAPV 8과 동일하기 때문이다.
실시예 4.
예측된 E2 단백질/뉴클레오티드 서열의 분석 결과, CTAPV 1B E2 단백질이 CTAPV 1 E2 단백질과 동일한 것으로 밝혀졌다. CTAPV 8 단백질은 CTAPV 1과 비교해서 14개 아미노산 치환을 나타낸다.
감염 실험을 위한 출발 물질로서 제공될 수 있었던 부검된 기관은 CTAPV 1B에 이용 가능하였지만, CTAPV 1에 대해서는 그렇지 못하였다. 본 발명자들은 Erns-E1-E2 유전자/CTAPV 1 및 1B의 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 분석하였다. 아미노산 서열은 100% 동일하다 (도 5). E2 단백질 서열은 이탤릭체이다. Erns 단백질은 진한 선으로 밑줄이 그어져 있고, E1 단백질 서열은 가는 선으로 밑줄이 그어져 있다.
감염 실험을 위한 출발 물질로서 제공될 수 있었던 부검된 기관은 또한, CTAPV 8에 이용 가능하였다. 본 발명자들은 Erns-E1-E2 유전자/CTAPV 1B 및 8의 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 분석하였다 (도 6에서의 아미노산 비교). 아미노산 서열은 95% 동일하다. E2 단백질 서열은 이탤릭체이다. Erns 단백질은 진한 선으로 밑줄이 그어져 있고, E1 단백질 서열은 가는 선으로 밑줄이 그어져 있다. CTAPV 8은 CTAPV 1B와 비교해서 14개 아미노산 치환을 갖는데 (93.3% 동일성), 이 중 9개가 양성이다 (양성률 97.6%).
실시예 5.
시험감염 물질의 제조
시험감염 물질은 CTAPV 1B (2013) 및 CTAPV 8 (2014)에 의해 병에 걸린 새끼 돼지의 부검된 기관 (현장 물질)로부터 수득되었다. 부검된 기관은 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다.
CTAPV 1B
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 3마리의 새끼 돼지의 뇌를 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 3마리의 새끼 돼지의 척수를 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 3마리의 새끼 돼지의 비장을 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 3마리의 새끼 돼지의 편도를 풀링하였다.
CTAPV 8
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 4마리의 새끼 돼지의 뇌를 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 4마리의 새끼 돼지의 척수를 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 4마리의 새끼 돼지의 비장을 풀링하였다.
균질화하기 이전에, 병에 걸린 한배 새끼 중 4마리의 새끼 돼지의 편도를 풀링하였다.
풀링된 조직을 해동 후 칭량하였다. 연속해서, 9배 조직-중량 PBS (CTAPV 1B) 또는 10 μM HEPES [시그마(Sigma) H3375-250G, CTAPV 8]를 수반한 M6B8 배지를 조직 물질에 부가하였다. 블렌더를 이용한 다음, 작은 유리 비드와 함께 5분 동안 진탕시킴으로써 상기 조직을 균질화시켰다. 균질화하는 동안 기관-펄프를 얼음 위에 유지시켰다. 이러한 기관-펄프를 3,200 x g 하에 1시간 동안 원심분리시켰다. 상등액을 먼저, 0.45 μm 필터 상으로 통과시키고, 연속해서 0.22 μm 필터 상으로 통과시켰다. 이와 같이 여과된 균질물을 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다.
실시예 6.
감염성 물질을 수득하기 위한 이유기 연령의 새끼 돼지에서의 감염 실험:
현장 단리물로부터 유래되는 CTAPV 1B 및 CTAPV 8 기관 균질물을 이용하는 시험감염 실험을 4 내지 8주생 이유기 연령의 SPF/상업적 피니셔 돼지 품종의 고 건강 새끼 돼지에게서 수행하였다.
시험 시설에 배치할 때, 동물로부터 CPDA (시트레이트 포스페이트 덱스트로스 아데닌) 혈액 샘플, 직장 면봉, 인두 면봉 및 비강 면봉을 수득하였다. 동물은 2개의 별도의 실험실에서 사육하였다: 군 A 8마리 동물 및 군 B 8마리 동물. 실험실 간의 동물 관리인을 통한 간접적 접촉이나 물리적 접촉은 없었다.
군 A에서는, 근육내 (IM), 피하 (SC), 비내 (N) 및 경구 (OR) 경로를 통하여 CTAPV 1B 균질물을 6마리의 돼지에게 접종하였다.
2마리의 돼지에게 혼합된 비장 + 척수 + 뇌 균질물로부터의 접종물을 투여하였다.
2마리의 돼지에게 혼합된 비장 + 편도 + 뇌 균질물로부터의 접종물을 투여하였다.
2마리의 돼지에게 혼합된 뇌 + 척수 균질물로부터의 접종물을 투여하였다.
2마리의 돼지는 접촉 감시군으로서 제공되었다.
IM, SC 및 N 용적은 1회 용량당 왼쪽과 오른쪽 1.0 ml였다. OR 용적은 4 ml였다. 비강 용량은 분무하였다. 시험감염 용량은 표 7에 제공된다.
접종한 후, 모든 돼지를 대상으로 하여 임상 징후에 관하여 매일 관찰하였는데, 이들 동물은 실험 과정 동안 무증상 상태로 남아있었다.
CPDA-혈액, 비강 면봉, 인두 면봉 및 직장 면봉을 접종 후 제0일, 제3일, 제7일, 제10일 및 제14일에 취하여, qPCR 분석을 통하여 CTAPV 1B의 감염 및 배출을 모니터링하였다. 류코셉(Leucosep®) 키트 [그라이너 매트(Greiner Mat). 번호 163 288]를 사용하여 CPDA 혈액으로부터 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플에 대한 qPCR 분석의 결과가 표 7에 제시된다.
접종된 모든 동물은 제10일에 혈장에서 양성 CTAPV qPCR 결과를 나타내었다. 바이러스의 배출을 근거로 하여, 동물을 상이한 시점에 희생시켜 후속 시험관내 및 생체내 연구를 위한 신선한 감염성 물질을 수득하였다.
부검 시, 상기 동물로부터 뇌, 척수, 비장, 편도, 및 혈액을 취하였다.
<표 7>
시험감염 용량 및 시험감염 CTAPV 1B의 결과
Figure 112017067358382-pct00012
군 B에서는, 근육내 (IM), 피하 (SC), 비내 (N) 및 경구 (OR) 경로를 통하여 CTAPV 8 균질물을 6마리의 돼지에게 접종하였다.
2마리의 돼지에게 비장 + 편도 + 뇌 + 척수 균질물로부터의 접종물을 투여하였고;
2마리의 돼지에게 비장 + 편도 균질물로부터의 접종물을 투여하였으며;
2마리의 돼지에게 뇌 + 척수 균질물로부터의 접종물을 투여하였고;
2마리의 돼지는 접촉 감시군으로서 제공되었다.
IM, SC 및 N 용적은 1회 용량당 왼쪽과 오른쪽 2.0 ml였다. OR 용적은 3 또는 4 ml였다. 비강 용량은 분무하였다. 시험감염 용량은 표 8에 제공된다.
접종한 후, 모든 돼지를 대상으로 하여 임상 징후에 관하여 매일 관찰하였는데, 이들 동물은 실험 과정 동안 무증상 상태로 남아있었다.
CPDA-혈액, 비강 면봉, 인두 면봉 및 직장 면봉을 접종 후 제0일, 제3일, 제7일 및 제14일에 취하여, qPCR 분석을 통하여 CTAPV 8의 감염 및 배출을 모니터링하였다. 류코셉® 키트 (그라이너 매트. 번호 163 288)를 사용하여 CPDA 혈액으로부터 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플에 대한 qPCR 분석의 결과가 표 8에 제시된다.
접종된 모든 동물은 제3일 및/또는 제7일에 혈장에서 양성 CTAPV qPCR 결과를 나타내었다. 바이러스의 배출을 근거로 하여, 동물을 상이한 시점에 희생시켜 후속 시험관내 및 생체내 연구를 위한 신선한 감염성 물질을 수득하였다.
부검 시, 상기 동물로부터 뇌, 척수, 비장, 편도, 및 혈액을 취하였다.
상기 기관 물질이 실시예 8/9에 기재된 바와 같이 백신 접종-시험감염 연구에서 시험감염 물질로서 사용되었다.
<표 8>
시험감염 용량 및 시험감염 CTAPV 8의 결과
Figure 112017067358382-pct00013
실시예 7.
백신 접종-시험감염 실험을 위한 시험감염 물질의 제조
시험감염 물질을 실시예 6으로부터 수득하였다.
CTAPV 1B
실시예 6, 군 A의 1마리의 부검된 동물의 뇌, 척수, 비장 및 편도.
CTAPV 8
실시예 6, 군 B의 1마리의 부검된 동물의 뇌, 척수, 비장 및 편도.
풀링된 조직을 해동 후 칭량하였다. 연속해서, 10 μM HEPES (시그마 H3375-250G)를 수반한 9배 조직-중량 M6B8 배지를 조직 물질에 부가하였다. 블렌더를 이용한 다음, 작은 유리 비드와 함께 5분 동안 진탕시킴으로써 상기 조직을 균질화시켰다. 균질화하는 동안 기관-펄프를 얼음 위에 유지시켰다. 이러한 기관-펄프를 3,200 x g 하에 1시간 동안 원심분리시켰다. 상등액을 먼저, 0.45 μm 필터 상으로 통과시키고, 연속해서 0.22 μm 필터 상으로 통과시켰는데, 단 경구 투여용 물질은 제외된다. 이와 같이 여과된 균질물을 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다.
실시예 8.
백신 접종-시험감염 실험
백신 설계: E2 단백질의 발현:
CTAPV 1 바이러스의 아미노산 서열을 분석하였다. CTAPV 바이러스 게놈과 고전적 돼지 발열 바이러스 (CSF) E2 단백질 (유전자은행: AAS 20412.1) 및 소 바이러스 설사 바이러스 (BVDV) E2 단백질 (유전자은행: AGN03787.1)의 정렬을 이용하여 E2 유전자의 출발 및 정지를 결정하였고, 시그널P4.1 소프트웨어 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 E2 단백질의 예측된 절단 부위를 결정하였다.
CTAPV 1 E2의 예측된 아미노산 서열 (서열식별번호: 32):
Figure 112017067358382-pct00014
연속해서, 진스크립트 옵티멈진(Genscript OptimumGene™) 알고리즘 (www.genscript.com)을 이용하여, 곤충 세포 내의 바쿨로바이러스 발현 시스템에서의 CTAPV E2 단백질의 발현을 위한 CTAPV E2 뉴클레오티드 서열을 최적화하였다 (서열식별번호: 33).
Figure 112017067358382-pct00015
제한 부위 BamHI 및 EcoRI에 밑줄이 그어져 있다. 출발 코돈은 이탤릭체로 표시되고 정지 코돈은 볼드체로 표시된다.
형질전환 및 발현:
CTAPV의 E2 유전자를 진스크립트에서 합성하고, BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 이용하여 플라스미드 벡터 (pFastbac1)에서 직접적으로 클로닝하였다. 표준 형질전환 기술을 이용하여 상기 플라스미드를 이. 콜라이로 형질전환시키고, 연속해서 플라스미드 DNA를 정제하며, 이를 SF9 곤충 세포의 형질감염에 사용하였다. 이러한 형질감염은 다음과 같이 수행하였다:
5*105개 세포/ml의 2 ml 세포 현탁액을 6 웰 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다. 세포를 27℃ 하에 1시간 동안 상기 플레이트에 부착시킬 수 있었다. 다음 형질감염 용액 [항생제를 수반하지 않은 200 μl 배지, 5 μl 미니프렙 DNA 및 6 μl 셀펙틴(cellfectin) (인비트로젠)]을 제조하고, 이를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 45분 후, 0.8 ml 배지를 상기 형질감염 용액에 부가하고, 이를 상기 부착된 세포에 부가하였다. 이로써 형질감염된 세포를 27℃ 하에 4시간 동안 인큐베이션하였다. 5시간 후, 배지 (젠타마이신 및 나타마이신이 보충됨) 1 ml를 상기 세포에 더 부가하였다. 세포를 27℃ 하에 3일 동안 성장시켰다. 상등액을 P1 바이러스 스톡으로서 -70℃ 하에 저장하였다.
SF9 배양물에서의 CTAPV E2 단백질의 발현을 SDS-page 겔 전기영동에 의해 검사하였다. SF9 배양물로부터 수득된 샘플을, 5% β-메르캅토에탄올을 수반한 바이오-래드(Bio-Rad) 라엠리(Laemmli) 샘플 완충제로 1:1 희석시키고, 연속해서 샘플을 10분 동안 99℃로 가열하였다. 모든 샘플 및 프리시존 플러스 프로테인(Precision Plus protein™) 올 블루 (바이오-래드) 마커를 바이오-래드 크리테리온(Criterion™)TGX™ 프리케스트 겔 (임의의 kD™) 내로 부하하고, 200 V 하에 42분 동안 전기영동시켰다. 사용된 전기영동 완충제는 1x 트리스/글리신/SDS였다. 전기영동 후, 상기 겔을 인스탄트블루(InstantBlue™) [엑스페데온(Expedeon)] 단백질 염색 완충제에서 1시간 동안 염색하였다.
정제:
SF9 세포에서의 발현 후, E2 단백질을 2가지 상이한 방식으로 정제하였다. 첫 번째 정제 방법은 전체 세포 용해물을 만드는 것이었다. CTAPV의 E2를 발현하는 SF9 배양물을 펠릿화하고, PBS에 재현탁시키며, 브랜슨(Branson) 음파기 (2회 30 펄스, 출력 5, 듀티 사이클 55%)을 이용하여 초음파처리하였다. 초음파 처리 후, 용해물을 8,000 rpm 하에 10분 동안 원심분리시켰다. 과발현된 E2를 함유하는 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. E2 단백질을 정제하는 또 다른 방식은 IMAC 및 음이온성 세정제를 사용하는 정제 방법이다. 이러한 방법은 문헌 [BMC Biotechnology 2012, 12:95]에 기재되어 있다 (BMC Biotechnology 2012, 12:95; Use of anionic denaturing detergents to purify insoluble proteins after overexpression; Benjamin Schlager, Anna Straessle and Ernst Hafen). 음이온성 변성 세정제 (SDS)를 함유하는 용해 완충제를 사용하여, 과발현된 E2 배양물을 용해시켰다. 친화 정제하기 이전에, 과량의 세정제를 냉각 및 정제에 의해 제거하였다.
SF9 세포에서 발현되고 상기 언급된 바와 같이 정제된 E2 단백질을, 공지된 단백질 농도를 수반한 소 혈청 알부민 표준과 함께 SDS-page 겔 상에서 실행하였다. 단백질 농도는 진툴(Genetools) 소프트웨어 [신젠(Syngene) 버전 3.08.07]를 이용하여 밴드 세기를 비교함으로써 추정하였다.
제제화
최종 백신은 미네랄 오일에 근거한 유중수 에멀션에서 제제화하였다. 중량에 근거한 물:오일 비는 45:55였다. 에멀션의 비말 크기는 주로 1 μm 미만이고 점도는 약 80 내지 150 mPa.sec였다.
백신 1: 정제된 E2 단백질로 이루어진 수 상 (E2 농도는 60 μg/ml로 추정됨).
백신 2: 전체 세포 용해물로 이루어진 수 상 (E2 농도는 62 μg/ml로 추정됨).
백신 접종-부스터
본 실험을 위하여, 5주 생인 이유기 연령의 48마리의 새끼 돼지를 입수하였다. 군당 3 x 8마리의 동물을 외양간(stable) 1에서 사육하고, 군당 3 x 8 마리의 동물을 외양간 2에서 사육하였다. 두 외양간 간의 동물들 간의 접촉은 가능하지 않았다.
군당 8마리 동물 중에서, 6마리의 새끼 돼지에게 백신 1로 프리모 백신 접종하였고, 다른 2마리의 새끼 돼지에게는 연구 시작시 백신 접종하지 않았다.
제21일에는, 각각의 군에서 프리모 백신 접종된 6마리 동물 중 5마리에게 백신 2로 부스터 백신 접종하였다.
프리모 백신 접종하기 이전, 부스터 백신 접종하기 이전 감염 후 제21일, 및 시험감염하기 이전 제39일에 혈액 샘플을 수집하였다.
각각의 군 중에서, 프리모 백신 접종과 부스터 백신 접종을 수행한 4마리 동물 + 백신 접종하지 않은 2마리 동물을 시험감염 이전에, 시험감염 시설로 옮겼다.
각각의 군 중에서, 프리모 백신 접종만을 수행한 1마리 동물과, 프리모 백신 접종과 부스터 백신 접종 둘 다를 수행한 1마리 동물을 2주간 더 모니터링하였다.
시험감염
본 실험을 위하여 36마리의 동물을 사육하였는데, 군당 3 x 6마리 동물 (군 1-3)은 외양간 3에서 사육하였고, 군당 3 x 6마리 동물 (군 4-6)은 외양간 4에서 사육하였다. 외양간 3의 동물은 외양간 1로부터 유래되었고, 외양간 4의 동물은 외양간 2로부터 유래되었다.
두 외양간 간의 동물들 간의 접촉은 가능하지 않았다. 외양간 내의 상이한 군의 동물들 간에도 물리적 접촉이 가능하지 않았지만, 공기 접촉은 가능하였다.
프리모 백신 접종 후 제39일에 생 바이러스 물질을 이용하여 동물을 시험감염시켰다.
외양간 3에서는, 3 x 6마리의 새끼 돼지 (군 1-3)를 CTAPV 1 시험감염 물질 (상기 참조)로 시험감염시켰다.
군 1: 10.0 ml 경구 및 2 x 2.0 ml 비강.
군 2: 2 x 1.0 ml IM.
군 3: 2 x 1.0 ml IM.
외양간 4에서는, 3 x 6마리의 새끼 돼지 (군 4-6)를 CTAPV 8 시험감염 물질 (상기 참조)로 시험감염시켰다.
군 1: 10.0 ml 경구 및 2 x 2.0 ml 비강.
군 2: 2 x 1.0 ml IM.
군 3: 2 x 1.0 ml IM.
혈청 혈액 샘플 및 비강, 직장 및 인두 면봉을 시험감염 이전, 및 시험감염 후 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23 및 27일에 수집하여, qPCR 분석을 통하여 CTAPV 바이러스의 감염 및 배출을 모니터링하였다. 군당 3마리 동물 (2마리는 백신 접종하였고, 1마리는 백신 접종하지 않았다)을 시험감염 후 제13일에 부검하였고, 다른 3마리의 동물 (2마리는 백신 접종하였고, 1마리는 백신 접종하지 않았다)을 시험감염 후 제27일에 부검하였다. 사타구니 림프절, 장간막 림프절 및 편도를 부검시 샘플링하였다.
실시예 9.
CTAPV E2 단백질에 대한 항체
이. 콜라이에서의 E2 단백질의 발현:
CTAPV 1 바이러스의 아미노산 서열을 분석하였다. CTAPV 바이러스 게놈과 고전적 돼지 발열 바이러스 (CSF) E2 단백질 (유전자은행: AAS 20412.1) 및 소 바이러스 설사 바이러스 (BVDV) E2 단백질 (유전자은행: AGN03787.1)의 정렬을 이용하여 E2 유전자의 출발 및 정지를 결정하였고, 시그널P4.1 소프트웨어 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 E2 단백질의 예측된 절단 부위를 결정하였다.
CTAPV 1 E2의 예측된 아미노산 서열 (서열식별번호: 32):
Figure 112017067358382-pct00016
이. 콜라이에서의 발현을 위한 단백질 서열 (HIS-태그를 포함한다):
Figure 112017067358382-pct00017
연속해서, 진스크립트 옵티멈진™ 알고리즘 (www.genscript.com)을 이용하여, 이. 콜라이에서의 CTAPV E2 단백질의 발현을 위한 CTAPV E2 뉴클레오티드 서열을 최적화하였다 (서열식별번호: 34).
Figure 112017067358382-pct00018
부가된 제한 부위 (볼드체)는 NdeI 및 XhoI이다.
형질전환 및 발현:
CTAPV의 E2 유전자를 진스크립트에서 합성하고, NdeI 및 XhoI 제한 부위를 이용하여 플라스미드 벡터 (pET22b)에서 직접적으로 클로닝하였다. 표준 형질전환 기술을 이용하여 상기 플라스미드를 이. 콜라이 BL21star + pLysS로 형질전환시키고, 발현을 유도시켰다.
발현 균주를 자동 유도 배지에서 37℃ 하에 18시간 동안 성장시킴으로써 발현을 달성하였다. SDS-page 겔 전기영동을 실행함으로써 발현을 검증하였다.
E2는 불용성 분획 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. E2 단백질은 IMAC 및 음이온성 세정제를 사용하는 정제 방법을 적용함으로써 정제하였다. 이러한 방법은 문헌 [BMC Biotechnology 2012, 12:95]에 기재되어 있다 (BMC Biotechnology 2012, 12:95; Use of anionic denaturing detergents to purify insoluble proteins after overexpression; Benjamin Schlager, Anna Straessle and Ernst Hafen). 음이온성 변성 세정제 (SDS)를 함유하는 용해 완충제를 사용하여, 과발현된 E2 배양물을 용해시켰다. 친화 정제하기 이전에, 과량의 세정제를 냉각 및 정제에 의해 제거하였다.
이와 같이 정제된 단백질을 실시예 8에 기재된 바와 같이 SDS-page 상에서 검사하였다. 정제된 단백질을 GNE에서 제제화하고, 항체를 생성시키기 위해 토끼에게 주사하는 데 사용하였다. 수 상 중의 단백질의 추정 농도는 0.5 mg/ml였다.
도 7에는 토끼에서 생성된 항체 (백신 접종 후 제4주의 혈청)가, 바쿨로바이러스/SF9 발현 시스템에서 발현된 CTAPV E2 단백질에 상응하는 대략 25 kDa 밴드를 특이적으로 인식한다는 것을 도시한 것이다 (레인 2). 레인 1은 마커를 함유하고, 레인 3은 바쿨로바이러스/SF9 발현 시스템에서 무관한 발현 생성물을 함유한다.
실시예 10
SYBR 그린 1-단계 qRT - PCR
동물 샘플
실험적으로 감염된 돼지와 대조군 돼지로부터 돼지 혈청 및 비장 샘플을 수집하였다. 혈액을 수집하고 (바쿠올레트 8 ml Sep 응고 활성화제 ref: 455071; 그라니어 바이오-원), 이를 4℃ 하에 3,000 x g로 20분 동안 원심분리시킴으로써 혈청을 수득하였다. 정액 샘플을 상업적 육종 회사로부터 수득한 다음, 사전 처리 없이 시험하였다.
10% 조직 균질물을 얼음 상의 PBS에서 제조하였다. 균질화는 젠틀 맥 해리기가 있는 젠틀 맥 M 튜브에서 수행하였다 [밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)]. 이어서, 이와 같이 균질화된 물질을 2회 원심분리시키는데, 먼저 3,200 x g로 30분 동안 원심분리시킨 다음, 10,000 x g로 10분 동안 원심분리시킨다. 연속해서 DNase 처리를 수행하였다: 24 μl 10x 터보 DNase 완충제 및 20 μl 터보 DNase [앰비온(AMbion)]를 250 μl 상등액에 부가하고, 이러한 혼합물을 37℃ 하에 10분 동안 인큐베이션하였다.
RNA 추출
외부 용해를 수반한 매그나퓨어(Magnapure) 96 기기 [로슈(Roche)]를 이용하여 이들 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 이러한 시스템은 자기 유리 입자 기술을 이용하여 DNA, RNA, 및 바이러스 핵산을 정제한다. 200 μl 샘플을 250 μl 매그나퓨어 총 핵산 단리 키트 용해/결합 완충제와 혼합하고, 외부 용해 프로토콜을 이용하여 매그나퓨어 기기에서 추출을 수행하였다. RNA 샘플은 앞으로 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다.
SYBR 그린 1-단계 qRT - PCR
특이적 프라이머 설계
올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 CTAPV 게놈의 5' UTR 게놈을 증폭시켰다. 바이러스 게놈의 이러한 부분은 CTAPV 변이체 1 내지 9 간에 보존된 뉴클레오티드 서열에 근거하여 선택되었다 (뉴클레오티드 서열의 정렬에 근거함). 프라이머 서열은 다음과 같다: CTAPV-PAN2-F3-B: CGTGCCCAAAGAGAAATCGG (서열식별번호: 35) 및 CTAPV-PAN2-R3-B (서열식별번호: 36): CCGGCACTCTATCAAGCAGT.
qRT - PCR 프로토콜
슈퍼스크립트 III 백금 SYBR 그린 1-단계 qRT-PCR 키트 [써모피셔(ThermoFisher)]를 이용하여 SYBR 그린 기반 1-단계 qRT-PCR을 전개하였다. 각각의 반응물은 25 μl 2x SYBR 그린 반응 혼합물, 1 μl 슈퍼스크립트 III RT/백금 Taq 혼합물, 1 μl 10 μM CTAPV-PAN2-F3-B 프라이머, 1 μl 10 μM CTAPV-PAN2-R3-B 프라이머, 17 μl RNAse 무함유 수 및 5 μl RNA 주형을 함유하였다. 모든 반응은 다음 순환성 파라미터를 이용하여 바이오래드 CFX96 상에서 수행되었다: 55℃ 하에 3분 동안의 RT 반응, 95℃ 하에 5분 동안 예비-변성; 및 95℃에서 15초, 60℃에서 30초에 이어, 0.5℃/5초로 60℃에서 95℃까지의 용융 곡선 프로그램의 40주기.
표준 라인 창출
SYBR 그린 1-단계 qRT-PCR에서 상기 검출된 RNA를 정량화하기 위하여, 그의 표준 희석율을 계산할 수 있는 q-PCR 표적 서열을 함유하는 표준 라인을 구축하였다. CTAPV 게놈의 5'UTR 부분 (162-338)으로부터의 177개 염기쌍 긴 서열을 합성하고 (진스크립트), pUC57 벡터에서 라이게이션하였는데, 이는 이. 콜라이에서 후속 형질감염시켰다. 플라스미드 DNA를 미디프렙에 의해 단리하였다.
플라스미드 카피/μl를 계산하기 위한 공식은 다음과 같다:
플라스미드 카피/μl = DNA 농도 (ng/μl)/(((A x 328.4 + G x 344.24 + T x 303.22 + C x 304.16)/(6.02 x 1023)) x 2 x 109).
플라스미드의 DNA 농도는 100 ng/μl였다. 108 내지 101 카피/2 μl를 함유하는 8개의 희석물을 만들었다.
결과
qRT - PCR의 검증.
108 내지 101 카피/5 μl를 함유하는 8개의 희석물을 수반한 표준 라인 및 음성 대조군 샘플을 실험에 포함시켜 qRT-PCR을 검증하였다. 도 9a는 qPCR 주기를 상대적 형광 단위에 대항하여 실시간으로 플롯한 다이어그램을 도시한 것이다. 각각의 샘플을 이중으로 시험하였다. 약 100 RFU에서의 직선은 컷오프 라인이고, 0 RFU에서의 직선은 음성 대조군 샘플이다. 가장 많은 양의 주형을 수반한 이중 샘플은 대략 주기 10 (108에 이어, 주기 12 등에서는 107)에서 초기 형광 증가를 나타내는 샘플이다. 도 9b는 동일한 실험 데이터로부터 제조되었지만, 여기서 로그 출발량 표준 곡선 (o)은 정량화 주기에 대항하여 플롯된다. 표준 라인은 102%의 효율 및 0.997의 R2를 갖는데, 이는 그 효율이 95% 내지 105%이어야 하고 R2가 0.990을 초과해야만 하는 특이적이고 정량화 가능한 qPCR에 대한 범위 내에 있다. 도 9c는 패널 a 및 b에 제시된 샘플의 용융 곡선을 도시한 것이다. 모든 양성 샘플은 동일한 곡선 및 특이적 융점을 나타내는데, 이는 특이적 단편이 증폭된다는 것과 그러한 단편이 각각의 반응에서 동일하다는 것을 의미한다.
이들 데이터는 상기와 같이 전개된 qRT-PCR이 CTAPV의 검출 및 정량화에 대한 요구 사항을 충족시킨다는 것을 보여준다. qRT-PCR은 의심되는 CTAPV 양성 샘플 및 대조군 샘플의 샘플 분석에 후속 사용되었다. 이러한 데이터의 해석은 주기당 RFU와 용융 곡선의 특징에 근거하였다. 이상한 용융 곡선은 앰플리콘의 비-특이성을 나타낼 것이다.
혈청, 비장 및 정액 샘플 중의 CTAPV RNA의 검출 및 정량화
실험적으로 감염된 어린 암퇘지 및 대조군 어린 암퇘지로부터의 혈청 및 비장을 대상으로 하여 CTAPV RNA 존재에 관하여 이중으로 시험하였다. 또한, 정액 샘플을 시험하였다. 그 (평균) 결과가 표 9에 제시된다. 수행된 검정에서는, 표준 라인이 정확한 qPCR에 대한 일정 양 범위 내에 있는 것으로 확증되었다 (도 9b, 상기 참조). 또한, CTAPV 특이적 융점이 이들 모든 샘플의 용융 곡선에서 확증되었다. 이들 데이터를 근거로 하여, 본 발명자들은 qRT-PCR이 혈청, 비장 및 정액 샘플 중의 CTAPV RNA의 검출 및 정량화에 적절한 것으로 결론낼 수 있다.
<표 9>
돼지 혈청, 정액 및 비장 샘플의 CTAPV RNA 정량화
Figure 112017067358382-pct00019
* 이중 실험의 평균; ND: 검출 가능하지 않음; 비장은 10% (w/v) 균질물 샘플을 지칭한다.
칼럼 RNA 카피/5 μl는 200 μl의 원래 샘플로부터 수득된 5 μl의 추출된 RNA 샘플 중의 바이러스의 카피 수를 나타낸다.
칼럼 RNA 카피/mL는 원래 샘플 (혈청, 정액) 또는 10% 균질물 (비장) 중의 바이러스의 카피 수를 나타낸다.
실시예 11
CTAPV 양성 정액은 어린 암퇘지 및 그 새끼를 감염시킨다
동물
6마리의 어린 암퇘지를 SPF/고 건강 농장으로부터 수득하였다. CTAPV-양성 수퇘지로부터의 정액을 어린 암퇘지의 인공 수정에 사용하였다.
방법
어린 암퇘지 및 그 새끼로부터 혈액을 수집하였고 (바쿠올레트 5/8 ml Sep 응고 활성화제 ref: 455071; 그라니어 바이오-원), 이를 4℃ 하에 3,000 x g로 20분 동안 원심분리시킴으로써 혈청을 수득하였다. 정액 샘플을 사전 처리 없이 시험하였다.
RNA 추출 및 qRT-PCR을 실시예 10의 섹션 "SYBR 그린 1-단계 qRT-PCR"에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
시험된 어린 암퇘지는 수정 이전에 CTAPV에 대해 혈청-음성이었다 (qRT-PCR). 수퇘지 정액은 qRT-PCR에 의해 분석된 바와 같이 CTAPV에 대해 양성이었다. 수정 후 4주에, 어린 암퇘지 4 및 5는 혈청 내에 검출 가능한 수준의 CTAPV를 함유하였다. 분만 당일, 어린 암퇘지 1, 2 및 6은 혈청 내에 검출 가능한 수준의 CTAPV를 함유하였다. 혈청 내에 검출 가능한 수준의 CTAPV를 함유한 새끼 돼지가 6마리의 어린 암퇘지 중 5마리에게서 태어났다 (결과에 관해서는 표 10 참조). 새끼 돼지는 건강하고 임상적 떨림을 나타내지 않았거나 또는 선천성 떨림 유형 AII와 관련된 다른 임상 증상, 예컨대 다리를 벌리는 증상의 발병이 증가하였다.
<표 10>
CTAPV 양성 정액은 어린 암퇘지 및 그 새끼를 감염시킨다
Figure 112017067358382-pct00020
* 칼럼 RNA 카피는 원래 샘플 (혈청) 중의 1 mL 당 바이러스의 RNA 카피 수를 나타낸다.
** ND: 검출되지 않음 / 검출 수준 아래.
실시예 12
임신한 어린 암퇘지를 "전율하는 새끼 돼지"로부터 수득된 CTAPV 변이체 1B로 감염시킴 및 신생아 새끼 돼지 상에서의 CTAPV 양성 정액 효과
동물
6마리의 어린 암퇘지를 SPF/고 건강 농장으로부터 수득하였다. 어린 암퇘지는 인공 수정을 통하여 CTAPV 양성 정액과 수정시켰다. 초음파를 이용하여 임신 제28일에 임신을 확증하였다. 모든 어린 암퇘지는 임신 제115일 또는 제116일에 새끼 돼지를 낳았다.
감염
어린 암퇘지 중 3마리는 수정 후 제32일에, CTAPV 1B 감염된 물질로 감염된 후 제11일에 부검된 돼지 371로부터 수득된 비장 및 뇌의 기관 균질물로 이루어진 CTAPV 1B 접종물로 감염시켰다. 이러한 실험은 실시예 6/표 7에 기재되었다. 균질물은 다음과 같이 제조하였다. 14 그램의 비장과 8 그램의 뇌에, 10 μM HEPES (시그마 H3375-250G)를 수반한 9배 조직-중량 M6B8 배지 (MSD AH)를 부가하였다. 블렌더를 이용한 다음, 작은 유리 비드와 함께 5분 동안 진탕시킴으로써 상기 조직을 균질화시켰다. 균질화 및 후속 처리 동안, 기관-펄프를 얼음 위에 유지시켰다. 이러한 기관-펄프를 4℃에서 3,200 x g 하에 1시간 동안 원심분리시켰다. 상등액을 0.22 μm 필터 상으로 통과시켰다. 이와 같이 여과된 균질물을 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다. 이들 3마리 어린 암퇘지에게 5 mL 접종물을 근육내 주사하였다 (2.5 mL의 2회분 주사제를 왼쪽 목과 오른쪽 목에 각각 주사하였다).
다른 3마리 어린 암퇘지는 부검 시 동일한 돼지로부터 수득된 혈청의 접종물로 감염시켰다. 이러한 혈청을 주사하기 이전에 0.22 μm 필터 상으로 여과시켰다. 이들 3마리 어린 암퇘지에게 5 mL 접종물을 근육내 주사하였다 (2.5 mL의 2회분 주사제를 왼쪽 목과 오른쪽 목에 각각 주사하였다).
접종물 중의 CTAPV의 정량적 양은 실시예 10에 기재된 바와 같이 qRT-PCR에 의해 결정되었다.
혈청 수집
어린 암퇘지를 감염시키기 이전, 및 수정 후 제10일에 혈청을 수집하였다. 출생 후 수 시간 이내에 신생아 새끼 돼지로부터 혈청을 또한 수집하였다. 혈액을 수집하고 (바쿠올레트 5/8 ml Sep 응고 활성화제 ref: 455071; 그라니어 바이오-원), 이를 4℃ 하에 3,000 x g로 20분 동안 원심분리시킴으로써 혈청을 수득하였다. RNA 추출 및 qRT-PCR을 실시예 10의 섹션 "SYBR 그린 1-단계 qRT-PCR"에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
첫 번째 3마리 어린 암퇘지의 감염을 위하여 사용된 비장과 뇌의 혼합된 균질물은 추출된 RNA 5 μl 당 4.5E+02 게놈 카피를 함유하였다. 이는 어린 암퇘지의 감염을 위해 사용되었던 균질물 1 mL 당 2.3E+04 게놈 카피와 동등하다.
다른 3마리 어린 암퇘지의 감염을 위하여 사용된 혈청 접종물은 추출된 RNA 5 μl 당 1.2E+04 게놈을 함유하였는데, 이는 어린 암퇘지의 감염을 위해 사용되었던 균질물 1 mL 당 6.0E+05 게놈 카피와 동등하다.
표 11은 qRT-PCR 결과에 의해 결정된 바와 같이 감염 후 제10일에 정량적 양 (혈청 1 mL 당 게놈)을 나타낸다. 6마리의 어린 암퇘지 중 5마리가 중증의 선천성 떨림 유형 A-II를 동반한 새끼 돼지를 낳았다. 1마리의 어린 암퇘지는 감염 후 제10일에 혈청에서 비교적 낮은 바이러스 양을 나타낸 어린 암퇘지로서, 비교적 건강한 한배 새끼를 낳았는데, 그 중 2마리의 새끼 돼지만이 경증의 증상을 보이는 것으로 관찰되었다. 분만 후 점수를 매긴 한배 새끼 정보가 표 11에 제시된다. 다리를 벌리는 증상 발생률이 증가하는 것은 엠. 화이트(M. White)에 의해 기재된 바와 같이, 임상적 떨림과 연관이 있었다 (http://www.nadis.org.uk/bulletins/congenital-tremor.aspx?altTemplate=PDF).
한배 새끼들당 3마리의 새끼 돼지에 CTAPV가 존재하는 것은 (임상적 떨림을 보이지 않는 어린 암퇘지 44로부터 태어난 새끼 돼지를 제외하고는, 중증의 임상적 떨림을 보였다), 실시예 10에 기재된 qRT-PCR 시험에 의해 시험되었다. CTAPV 양성 새끼 돼지의 수가 표 11에 제시된다.
<표 11>
접종 후 제10일에 어린 암퇘지 혈청 샘플에서의 RNA 정량화, 및 한배 새끼 정보
Figure 112017067358382-pct00021
* 이중 실험의 평균; 칼럼 RNA 카피/mL는 원래 샘플 (혈청) 중의 바이러스의 카피 수를 나타낸다.
실시예 13
임신한 어린 암퇘지를 "전율하는 새끼 돼지"로부터 수득된 CTAPV 변이체 1B로 감염시킴 및 신생아 새끼 돼지 상에서의 CTAPV 음성 정액 효과
동물
3마리의 어린 암퇘지를 SPF/고 건강 농장으로부터 수득하였다. 어린 암퇘지는 인공 수정을 통하여 CTAPV 음성 정액과 수정시켰다. 초음파를 이용하여 임신 제28일에 임신을 확증하였다. 모든 어린 암퇘지는 임신 제114일 또는 제115일에 새끼 돼지를 낳았다.
감염
3마리 어린 암퇘지는 부검 시 돼지 371로부터 수득된 혈청의 접종물로 감염시켰다 (실시예 12 참조). 이러한 혈청을 주사하기 이전에 0.22 μm 필터 상으로 여과시켰다. 이들 3마리 어린 암퇘지에게 임신 32일에 5 mL 접종물을 근육내 주사하였다 (2.5 mL의 2회분 주사제를 왼쪽 목과 오른쪽 목에 각각 주사하였다).
접종물 중의 CTAPV의 정량적 양은 실시예 10 및 12에 기재된 바와 같이 qRT-PCR에 의해 결정되었다.
혈청 수집
어린 암퇘지를 감염시키기 이전, 및 수정 후 제10일에 혈청을 수집하였다. 출생 후 수 시간 이내에 신생아 새끼 돼지로부터 혈청을 또한 수집하였다. 혈액을 수집하고 (바쿠올레트 5/8 ml Sep 응고 활성화제 ref: 455071; 그라니어 바이오-원), 이를 4℃ 하에 3,000 x g로 20분 동안 원심분리시킴으로써 혈청을 수득하였다. RNA 추출 및 qRT-PCR을 실시예 10의 섹션 "SYBR 그린 1-단계 qRT-PCR"에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
표 12는 qRT-PCR 결과에 의해 결정된 바와 같이 감염 후 제10일에 정량적 양 (혈청 1 mL 당 게놈)을 나타낸다. 3마리의 어린 암퇘지 중 2마리가 경증의 선천성 떨림 유형 A-II를 동반한 새끼 돼지를 낳았다. 1마리의 어린 암퇘지는 감염 후 제10일에 혈청에서 비교적 낮은 바이러스 양을 나타낸 어린 암퇘지로서, 건강한 한배 새끼를 낳았다. 분만 후 점수를 매긴 한배 새끼 정보가 표 12에 제시된다. CT 유형 A-II를 보이는 새끼 돼지에 CTAPV가 존재하는 것은 실시예 10에 기재된 qRT-PCR 시험에 의해 확증되었다. CTAPV 양성 새끼 돼지의 수가 표 12에 제시된다. 다리를 벌리는 증상 발생률이 증가하는 것은 임상적 떨림과 연관이 있었다.
<표 12>
접종 후 제10일에 어린 암퇘지 혈청 샘플에서의 RNA 정량화, 및 한배 새끼 정보
Figure 112017067358382-pct00022
* 이중 실험의 평균; 칼럼 RNA 카피/mL는 원래 샘플 (혈청) 중의 바이러스의 카피 수를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Intervet International B.V. <120> novel pestivirus <130> 23911 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> novel virus <400> 1 aaggttcagt ggttcttaaa ggacgaaaac tcgacgggga tcaatcagat cctgtggcaa 60 agacagatta acagaaccct gcatggagaa tggcctaacc agatctgcca tggcatgcca 120 aatgaaacta ttacagatga ggaattacgt agcctgggaa tgatagacac aagccccaga 180 acaaactaca cttgctgcca gttgcaatat catgaatgga agaaacatgg ttggtgcaac 240 tatccacaaa aacaggtctg gatcaggagg ataacggccc tacaagctaa cctcaccgga 300 gcctatgagg ggcctgagtg tgccgtcatt tgtagattta acggcagcta taacatcgta 360 aaacaagcca gagatgaggt gagtccactg acagggtgca aggaagggca cccttttcta 420 ttctctggtg aaagatccga cacctcatgc ctgaggcccc cttccactag ttgggtaaga 480 ccggtaaaaa tggacgaggc gtcattggct gatagcttcg cccatggggt tgacaaggca 540 ataatactaa tcagaaaagg ggcatcagga ataattaatt tcctagacac tattgggagg 600 tggctaccgg tagctgaggc agctatagta ccatattgtg aa 642 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> novel virus <400> 2 Lys Val Gln Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser Thr Gly Ile Asn Gln 1 5 10 15 Ile Leu Trp Gln Arg Gln Ile Asn Arg Thr Leu His Gly Glu Trp Pro 20 25 30 Asn Gln Ile Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr Ile Thr Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Arg Ser Leu Gly Met Ile Asp Thr Ser Pro Arg Thr Asn Tyr Thr 50 55 60 Cys Cys Gln Leu Gln Tyr His Glu Trp Lys Lys His Gly Trp Cys Asn 65 70 75 80 Tyr Pro Gln Lys Gln Val Trp Ile Arg Arg Ile Thr Ala Leu Gln Ala 85 90 95 Asn Leu Thr Gly Ala Tyr Glu Gly Pro Glu Cys Ala Val Ile Cys Arg 100 105 110 Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala Arg Asp Glu Val Ser 115 120 125 Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe Leu Phe Ser Gly Glu 130 135 140 Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser Thr Ser Trp Val Arg 145 150 155 160 Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Leu Ala Asp Ser Phe Ala His Gly 165 170 175 Val Asp Lys Ala Ile Ile Leu Ile Arg Lys Gly Ala Ser Gly Ile Ile 180 185 190 Asn Phe Leu Asp Thr Ile Gly Arg Trp Leu Pro Val Ala Glu Ala Ala 195 200 205 Ile Val Pro Tyr Cys Glu 210 <210> 3 <211> 633 <212> DNA <213> novel virus <400> 3 tcgtgccaca agagacaaga ctattacagt atccagctag tcgttgacgg aaaaacgggc 60 gtagaaaaac gatctatagt gggcaagtgg acagtgataa ctagggaagg tcgggaacca 120 agattaatgg agcaaataag catggtgtca aatgatagct tatcagaaac ttactgctac 180 aataggctaa atactagcag ttgggggcga caaccggcaa gacagagagg gtgtggtcaa 240 accgtaccct tttggcctgg tgacaatgtc ctggaagaac aatactatag cacaggttac 300 tgggtaaatg caacaggtgg ttgccagttg agagaaggcg tgtggctatc aagaaagggc 360 aatgtacagt gccagcgtaa cggctcatcc ttgatactgc aactggcgat aaaagaagag 420 aatgacacta tggaaatacc atgtgacccg gtggaaaccg aaagtatggg tccagttaca 480 cagggcactt gcgtgtacag ctgggcattc gccccaagag ggtggtatta caacaggaaa 540 gatggttatt ggctccagta cgtaaagaaa aacgactacc agtactggac gaaaatgccc 600 actgcttcat ccgccacaac gatgtaccgc cat 633 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> novel virus <400> 4 Ser Cys His Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Ser Ile Gln Leu Val Val Asp 1 5 10 15 Gly Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Val Gly Lys Trp Thr Val 20 25 30 Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Ser Met 35 40 45 Val Ser Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn 50 55 60 Thr Ser Ser Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln 65 70 75 80 Thr Val Pro Phe Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu 100 105 110 Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly 115 120 125 Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met 130 135 140 Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Thr 145 150 155 160 Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr 165 170 175 Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Val Lys Lys Asn Asp 180 185 190 Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Thr Thr Met 195 200 205 Tyr Arg 210 <210> 5 <211> 579 <212> DNA <213> novel virus <400> 5 acttacactg tgacagggat gtatgtccat gtgaagaatt gtctccctag agggttaccg 60 aagcattcaa agataatttc cccgacaata atatacttgg gggaaggtga cccagcccat 120 aatattcagc acttatttgg ctcaggtata gcaaagtggg tcttagtcct actcggggtt 180 ctgggtgagt ggtatggaga attggcctct acaatatact tactactaga gtatgggtct 240 gagtggttgg aacatgaaag tctggtcacg gaagggttga tccctggcat caatattaca 300 atagaactcc cagctagtca tactgtacct ggttgggtgt gggtcgcagg ccggtgggta 360 tgcgtgaaac cagattggtg gcccacacag atttggattg aaactatagt ggcagaggtc 420 tggcatatac taaaaatatt ggcatcagcc ctggtaaaca tagtcactgc attcgtaaac 480 ctggaattgg tatacctggt cataatatta gtcaaaatat caaaggggaa cctgataggc 540 gctatattgt ggtgcctatt actgtcaggg gctgaaggc 579 <210> 6 <211> 193 <212> PRT <213> novel virus <400> 6 Thr Tyr Thr Val Thr Gly Met Tyr Val His Val Lys Asn Cys Leu Pro 1 5 10 15 Arg Gly Leu Pro Lys His Ser Lys Ile Ile Ser Pro Thr Ile Ile Tyr 20 25 30 Leu Gly Glu Gly Asp Pro Ala His Asn Ile Gln His Leu Phe Gly Ser 35 40 45 Gly Ile Ala Lys Trp Val Leu Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Glu Trp 50 55 60 Tyr Gly Glu Leu Ala Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Glu Trp Leu Glu His Glu Ser Leu Val Thr Glu Gly Leu Ile Pro Gly 85 90 95 Ile Asn Ile Thr Ile Glu Leu Pro Ala Ser His Thr Val Pro Gly Trp 100 105 110 Val Trp Val Ala Gly Arg Trp Val Cys Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro 115 120 125 Thr Gln Ile Trp Ile Glu Thr Ile Val Ala Glu Val Trp His Ile Leu 130 135 140 Lys Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Asn Ile Val Thr Ala Phe Val Asn 145 150 155 160 Leu Glu Leu Val Tyr Leu Val Ile Ile Leu Val Lys Ile Ser Lys Gly 165 170 175 Asn Leu Ile Gly Ala Ile Leu Trp Cys Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu 180 185 190 Gly <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 7 gccatgatgg aggaagtg 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 8 gggcagrttt gtggattcag 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 9 cggatacaga aatactac 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 10 ccgaatgcag ctarcagagg 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 11 gaaacagcca tgccaaaaaa tgag 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 12 agtgggttcc aggggtagat cag 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 13 gaaacagcca tgccmaaraa tgag 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 14 agtgggttcc aggrgtagat yag 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 15 gagtacgggg cagacgtcac 20 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 16 catccgccgg cactctatca agcag 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 17 atgcataatg ctttgattgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 18 gtgacgtctg ccccgtactc 20 <210> 19 <211> 11561 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 19 gcataatgct ttgattggct gcattatgta tgggacatcc taaattgttg tgagccctgt 60 ggtgagtggg ggaaaggggt taaccaggcc tctagtacca caggcaccaa cagacagggc 120 aactcgaacc tgagagagag gtaccgagct cttaagcccc gagtacgggg cagacgtcac 180 cgagtagtac acccaaagac caccacttct aggtgtaggg tctactgagg ctcgggtgga 240 cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gggcctgggg gtcggggcca ccatgcccct 300 ttatggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga tgcctcgggt aagagtataa 360 aatccgttgt ctattaacat ggaaaaacag attgcacatt acttaaaaaa agaaaaacaa 420 aggaatgggt ggacggaact ggtggtagga gaaagtcaca ctaaaataac tacgctttct 480 ggaaagacct atcgaggtac ttgggaaatg gagaaacggc caaatcctta cggaacctat 540 tttcccagac ctagtcccca gcagctcaca gccctacacc cccacccagt ggtaaattgc 600 aaggtgatag agtacaaggg gacggaccct aattatggtg attgcccaaa tacaaacggg 660 gtgttcatcg atgaaaaggg tagaaggttg agcagccctc cattaggtat ttggaagata 720 agattggact acagcgacct gataaatata aacagaccag tccccactag aggggaaaac 780 tcttatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctactg taatgctggt acacaatagg 840 gtacttgtgg aagactgtag ggggctatac caatggaaac ccaactgtga aggaattgtg 900 ctctatgtaa aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg aaaaacagga gaagggaagc 960 cccccaaaac cacaacggcc accaaggcga gacccacgaa aaggcttaca accacaagtc 1020 cccagagaaa ctgaggttac ggaaaagaag aggcaaccta gtgtcacctt agtagcaggg 1080 gggcagaagg cccaaatcat ctacaaaggc aggactaaaa ataaaaagac tccggatggg 1140 gtctataagt acccaggagc taaagaaggg gatgtggtaa aggtcaggaa gatgcttaag 1200 aattggcata tagccttgat aatgtacctg atatatatta taactccagg ttttgccaag 1260 gttcagtggt tcttaaagga cgaaaactcg acggggatca atcagatcct gtggcaaaga 1320 cagattaaca gaaccctgca tggagaatgg cctaaccaga tctgccatgg catgccaaat 1380 gaaactatta cagatgagga attacgtagc ctgggaatga tagacacaag ccccagaaca 1440 aactacactt gctgccagtt gcaatatcat gaatggaaga aacatggttg gtgcaactat 1500 ccacaaaaac aggtctggat caggaggata acggccctac aagctaacct caccggagcc 1560 tatgaggggc ctgagtgtgc cgtcatttgt agatttaacg gcagctataa catcgtaaaa 1620 caagccagag atgaggtgag tccactgaca gggtgcaagg aagggcaccc ttttctattc 1680 tctggtgaaa gatccgacac ctcatgcctg aggccccctt ccactagttg ggtaagaccg 1740 gtaaaaatgg acgaggcgtc attggctgat agcttcgccc atggggttga caaggcaata 1800 atactaatca gaaaaggggc atcaggaata attaatttcc tagacactat tgggaggtgg 1860 ctaccggtag ctgaggcagc tatagtacca tattgtgaaa cttacactgt gacagggatg 1920 tatgtccatg tgaagaattg tctccctaga gggttaccga agcattcaaa gataatttcc 1980 ccgacaataa tatacttggg ggaaggtgac ccagcccata atattcagca cttatttggc 2040 tcaggtatag caaagtgggt cttagtccta ctcggggttc tgggtgagtg gtatggagaa 2100 ttggcctcta caatatactt actactagag tatgggtctg agtggttgga acatgaaagt 2160 ctggtcacgg aagggttgat ccctggcatc aatattacaa tagaactccc agctagtcat 2220 actgtacctg gttgggtgtg ggtcgcaggc cggtgggtat gcgtgaaacc agattggtgg 2280 cccacacaga tttggattga aactatagtg gcagaggtct ggcatatact aaaaatattg 2340 gcatcagccc tggtaaacat agtcactgca ttcgtaaacc tggaattggt atacctggtc 2400 ataatattag tcaaaatatc aaaggggaac ctgataggcg ctatattgtg gtgcctatta 2460 ctgtcagggg ctgaaggctc gtgccacaag agacaagact attacagtat ccagctagtc 2520 gttgacggaa aaacgggcgt agaaaaacga tctatagtgg gcaagtggac agtgataact 2580 agggaaggtc gggaaccaag attaatggag caaataagca tggtgtcaaa tgatagctta 2640 tcagaaactt actgctacaa taggctaaat actagcagtt gggggcgaca accggcaaga 2700 cagagagggt gtggtcaaac cgtacccttt tggcctggtg acaatgtcct ggaagaacaa 2760 tactatagca caggttactg ggtaaatgca acaggtggtt gccagttgag agaaggcgtg 2820 tggctatcaa gaaagggcaa tgtacagtgc cagcgtaacg gctcatcctt gatactgcaa 2880 ctggcgataa aagaagagaa tgacactatg gaaataccat gtgacccggt ggaaaccgaa 2940 agtatgggtc cagttacaca gggcacttgc gtgtacagct gggcattcgc cccaagaggg 3000 tggtattaca acaggaaaga tggttattgg ctccagtacg taaagaaaaa cgactaccag 3060 tactggacga aaatgcccac tgcttcatcc gccacaacga tgtaccgcca tttgctccct 3120 ttactggtgg cctgcctcat gggcggtaga atatcggtat ggattgtggc gatgctcctg 3180 tctttacagg tggaagctag tgaagtaggt accaagcaac tggctgtcac gctaactctg 3240 tggaaaatgg actggacaga attactcttc tatattgtta taatgctagc cgttaaggaa 3300 gaactcataa aaaaaatagt gactgcaagc cttgtggcct taaaaaatag tccagtagcc 3360 ttgagcttcc ttattgtact caggcttgtg gggggtagtg aggcactccc agtgggtttg 3420 ttattagaaa agatgtgcat agaccaaccg gagtttggaa cccctttcct gatctaccta 3480 tgggacaatt ggaagtggac tgtactagtc agcttctccg cactgaatca tgaaaaaact 3540 ataaaactgg caagaaaact gctgttggca acacacataa cagcgctcac attgactggt 3600 ctgagtgatt caatcttcta tatgatgctt ataatgacta atttattaat aaagacattc 3660 atatatctac tgggagccag tataaattgg gtcgagagag aaaaaaagaa gttgctagtg 3720 aagagaacac taatatataa gaaagccgcg atttgcagtc aagatggaaa tgaattggag 3780 aataaattta ataagataac tgtaaatgcg gatttcaccc catgtaaact tgaacttctg 3840 caactactca gggctttttt agtctctcta tgcttttcct attacaagcc tctcctgtat 3900 gcggaaacta ctctaaccgt aatagtaatt ggcgtacagg agtacaacgt agctatggct 3960 cgcgggcgaa gcgtggtcca tagactgcta gccatggcct actacatata cggccgtata 4020 cagggtgaca tgttccagct cgccactatc cagtgcctgt tgtcaagtcc taggaaaatt 4080 atgaaacaca tgatagaaaa tccaactctt aagaagctct ggcaaggtga aacagagctt 4140 tttaaccagg gtgtcagcca gtccaaaata gtgaatccaa agagtattgg gctggaagaa 4200 ttacacaagg gtatgtgcgg cctcccaact gtagtgcaaa atttggtcat atatgctaag 4260 aagaatgact ctcttatctt aggagagctg ggttaccccc ctggggacct caccagtgac 4320 gggtgggaaa ttttaggtcc tggcagaatc ccaaagatta ccaacgttga gtccgctaaa 4380 atggacttac tctccaagct tatgaccttt ctgggggttg agagctcaag agtccccagg 4440 accccagtcc actcgacaag gaaattattg aagatagtga gaggcttaga aactggatgg 4500 ggatacaccc atgcaggggg gataagtagc gcaaaacacg tcacaggtga aaaaaacttg 4560 atgactcaca tggaaggcag gaagggaaag tatatcctac aatcccaaga acatggtgct 4620 gatgaggtag aatatggagt gaaaactgac caaaaagcac ccgacaatgc cttatgctac 4680 tgctttaacc ctgaagccac aaacataaaa ggagaaacgg gagccatggt gtttatgaag 4740 aagataggaa aaaaatggac tctcgtaaca tcagatggta acaaagccta ttataatgta 4800 aacaacctga aagggtggtc tggactaccg ataatgttgc actctaccgg ggctatagta 4860 gggaggatta agtcagcgta ttcagatgaa aacgacttgg tagaggaact tatcgactcc 4920 aggactatca gcaagagcaa tgaggcaaac ctggatcacc ttatcaagga attagcagat 4980 atgcggaggg gggagtttcg ctccatcacc cttggaacag gagctgggaa aactacagaa 5040 ctgcccaggc aataccttac aacggtgggt gcccataaat cagtgttggt cctagtccct 5100 ttaaaagcac ctgctgaaag tgtctgtcgc ttcatgaggt ccaaataccc tactatcaac 5160 ttttccttga gagtggggga gcggaaagag ggggatgtga gcagtggcat cacttacgcc 5220 acgtacggat tctgctgcca gctaaaccta gtccaactca aagaatggat atccaggtac 5280 tcaatggtgt tttttgatga ataccacaca gcaactccag aacaaatagc aataataagt 5340 aagatccatg cactgaaggt caaaaccagg atagtggcta tgtcagcaac tcccccgggt 5400 accgtgacga ctgaaggcag gaaatttgat attgaagagg taggggttgc cactatagag 5460 aaaggagagg aaccaaaaag ggggcgtata gcggtagctg gtatgcaggt cccattagaa 5520 gacttgacgg ggaagaactg cctagtgttc gtcgcaacca aagaagctgc ggagacagag 5580 gctaaagaac tgcgtgccag gggagttaat gccacctact actattcagg catagaccct 5640 aagactctgg aacatgggat gaccaatcag ccatattgta ttgtggctac caatgctatc 5700 gaatcaggca taacttgtcc tgacttagac gtggtcatag ataccatgca gaagtatgaa 5760 aaagtagtga atttttcagc aaagctgccc ttgattgtca cttcattagt aaagaagaaa 5820 attactaggg aagaacaggg ccagaggaaa ggtcgggtag gtagacaaaa gaagggaaaa 5880 tactactacc cttcaggagt ggtaccgaat gggtcaaaag acctaagcta tttaatcctg 5940 caggctcaag agtacggtat cttggaacaa gttaatataa cagagtactt catcataatg 6000 aatgaggact ggggtcttta tgatgtagat gaggtagagg taagaatact tgagagaatg 6060 aacaaggaaa ttctgcttcc gctaggtatc gtggagaagc aaatcctgga aagaagcact 6120 cacccggaaa aagtggcatt gttgtataac aaattagtac agaaaaaccc tatagtatac 6180 cctaaagtac aggaaggtga ggtcagcaag gaatacaata cccataatct ggccgtatac 6240 gataaactaa aagatgtcaa cccacaagcc atttatgtcc tagctgaaga ggagagagcc 6300 acggaaatga tgggccttga gtttgaacaa gacccttctg acttacagga ctcagtagct 6360 caactttgtg aagacatcaa gaggtataca aaactctctg ggatcactga gaaattatta 6420 gtaggcacga tggtggggta tattggatat aaagccctaa ccagaaacca cgtgccctgg 6480 gtcagtaagg agtatagtta tgagctgacc gattcaccgg acacttacga aaattcattt 6540 gcacctttgg atgtcgacgt ccaaaacccc ggtgagggaa aacacccaga gcaactggca 6600 gaccatcaac tgaggcaact actggagacc gggagagaca aggcgattga cttcttaaaa 6660 ggaatccgcg agttcgctag tggggccatt aacagtccaa aggcattaag tatatgggag 6720 aaaatgtatc agtacttgag gaagcatcag ggtgagatta tcgcatcagc ggcgtggggc 6780 agtgcaacag ccctccacga cagtattaaa tctaggcttg gagatgaggt cgctactgca 6840 gtaataatcc tcaagtatct agcatttggt gaaagagaac tgtccggact gactaggcaa 6900 gtcctaattg acattatagt gtattatata gtcaacaagc cccggtttga aggggatgac 6960 tatgcaaaga gaaagggaag aaggctagtc attgaagtct tgatgggggc actggcaact 7020 tatgcagtgt ccaacttttg gggcgtgtcc atcaataaga tactgcaacc aatatctgac 7080 tatttaccct atgccaccgc cactttggct ttccttcgcc caactttcat ggaatcagca 7140 gtggtggtcg cttcctctat ctatagagct ttcctctcca ttaaacatgc ggaaaacagg 7200 agtcttgtca cacaggttgc ttctgccgcc cttgaagtca tgggcttgac cccagtatca 7260 gccggcctag gcgtcttact ggggctcggg ctatgcgtgc tccatatgaa catcgacaaa 7320 aacgaggaga aaaggacact gatactgaaa atgtttgtca aaaactttat agaccaggcg 7380 gcactagacg agttagacaa actggagcca gaaaaaataa tcctctcatt gttggagggt 7440 attcaaactt gcacaaaccc ggtcagagca atcatgattt tgtacagggt gtactataag 7500 ggggaatcgt tcacagaagc tttgtctaag atggctggca agtccctcat cgtgatggtc 7560 atagtcgagt tcctagaact gacgggccaa acccaagggg ggtacataga tcttagtgcc 7620 aatttgctga cccttctcct agaaaaacta aaaaagatga ccaacctcgc catcggggaa 7680 gctagaaagg tcttacttcc tatcccatac ttgtactgtg aaacctggca gtctgacgcc 7740 agaatcaagg ctcctgagtc ctatgatcaa gtggtagtgg aatgcaaatg tggtgcttca 7800 gcaaggtatt ccttccgaca tggggttcac gagatactgg aagaaaaaag aaccaagtgg 7860 tgtaagaact tcttcttgtg gggacctaac tttcacaacc cggatccaaa gaggatgaca 7920 ttctatgagt tcggccaagc aaaaaaatgt cctgttgtca taatgggtga agacataacc 7980 ttcggcaaat atggtatata tatcaaattc ggccataagc ctgatggggg aaggttaata 8040 aggggcacca cccacgccac tattagcagg gaggaactgc tggaaattct aacggctcca 8100 agccaagtgg ccataggcaa agtcaagctg accgattact gtaatcaaaa aggaataata 8160 gacaggaaac tggccgtact tgaaggtgac aaaatacatt tttggaaagc acaccgtgga 8220 tccaagatca cagatcaact cactattgag agtctgacag atgatttggg gtcagaaatc 8280 agggacatta catgggagct gtacacaggc gggacgtgca ccgttaaggg gatatccctt 8340 agatcatgcg cgccaggtca aagaaataag gctacggtct tgtgcgattg cactgacgta 8400 cttagcccct gttacttagt caacggaagg agaccatccc catttgacgt cgtggaaggt 8460 tatgaatgcc accatcggaa gccccgagcg acgtatgagg acttagaaat ggaggaaata 8520 ctaaagagaa gggtccctgt ttatgatcct ttgagtctgt ttgacactga cagtaaactg 8580 ctgcctcctg acacctatta cttggaagaa gatcaagaag acttcgagta tgcattgagg 8640 tgttggggcc tcggggttta tgtaacggac gggcctgcta tttctccccc ggacataagg 8700 gtacaccaca gttctgtact gttactgttg acacctggag tggactctga gttgccctta 8760 cagtacatac gttgttactc tcatcaggtg gaggtggaca tctatattag gggccaactt 8820 ctggaggagg aagatactgc cacggaggcg gaagactctc aggaagatag tgatgaaggg 8880 atgggcgacg tggtaataaa agatgaggat acattgtcca caacagaatc aataccccca 8940 ctagaagagg aggaaggggg cgaagagcca atcacttatg tggtcattag gggattacaa 9000 gaagaaagat atactagcca tcttaaatta agtgactgga tcagtgaaaa tatttcggag 9060 ccacatagag tccaaattat gcttgatgga acggtgagag tcacaataaa agagggcaaa 9120 gtcaaacacc tatttggggt ctacagaatc gaaaactccc tggaagcaat gtttaaagag 9180 accatagctg accttcctgt agccacccaa ccgccccgag ggccaatcta cacggccaaa 9240 gagttggctc aagggaacat tgccccgatc caacccgcag caaactttta tggaatgata 9300 gaggggagag gtgatccaat gacggcattc gaagccttat cagtcctgcg gtcacaaaaa 9360 gtctcagcta aggaagtgaa gatgaacacc cgcagggctc aagcttttct gaataaagtc 9420 agggggactg ctgaggtcag agcatcagaa ttaacattaa aatgcttgcc agcacttggt 9480 aaagtaaatg ggaggaaatt gattagagag gaaaccaaca tccccaacca aaggttggca 9540 tcaataatga cctcaatagg aattagatta gaaaaactgc cggtggttag agcaaacacc 9600 tctggctcta agttcaggca gtcgatctta gaaaaaatgg ataaatatga aaatgaacaa 9660 gttccagggt tacatgagaa aatgtgggca gcattcttgg caactgccag gcaagactta 9720 agaaacacat atgaagaagt aacttatctt gaactggaga ccggaatcaa ccggaaggga 9780 gctccaggtt tttttgagaa agaaagttca ataggagaag tgctggaaag aaaaggaaaa 9840 attgacgttg taatccaaga gattgaaaaa ggcaaccact tgtactatga aacagccatg 9900 ccaaaaaatg agaaaagaga cgtgcttgat gattggttgt ctgaggactt cgtcacttat 9960 aagaaaccac gtgtaataca gtaccctgag gcagtcaccc ggttggccat caccaaaata 10020 atgtacaagt gggtaaaaca gaaacctata gtgattcccg gttacgaggg aaaaaccccg 10080 atctttgaaa tattcgaaaa agttagtgca gattgggctc agttcagaaa cccggtagca 10140 gtcagctttg ataccaaagc ttgggacaca caagtaacta gagaggacct caggctggtg 10200 gggcggatac agaaatacta ctacaaaaaa aagtattgga aattcattga caatttgacg 10260 gccatgatgg aggaagtgcc tgtgatcact gtagaaggag atatgttcct cagagttgga 10320 cagcgcgggt ccgggcagcc tgatacctca gcaggcaatt ccatattaaa tgtgctaaca 10380 atgttagtag ccttctctga atccacaaac ctgcccatag cggccgcctg gaaggcttgt 10440 cggatccacg tctgtgggga cgatggcttt ttaatcacgg aatcagaatt agggcggaaa 10500 ttcgctgaaa aaggtgtccc tctgctagct gcattcggca aacctcaaaa gattacagag 10560 ggagcaagcc taaagataac cagtaatttt gacggaatag agttttgtag tcattctccc 10620 attagagtcc aaacaccaaa cataaggtgg atgccagcga ggcctacagc aacaattcta 10680 ggcaaaatga gtaccaggct gggtgagggt gctaccagat caggagaaga atatgaaaaa 10740 caggtggcat ttgcatatct actgatgtac ccctggaacc cactggtcag gagaatcagc 10800 ctcctactgt tgtcaaccac tgacccaatg gggagagagg aaaccccatg ctctgatgag 10860 ggggtgaagt atgttgggga ccctatcgct gcatacaggg atgtatgggg gcacaaatta 10920 gaggacgtag gacacgtcga tcagccgcag ttatcccgga tgaattatag catgacttac 10980 ttagggatct ggaaaccaaa gacgagccag cggttagttg aacaatgctg tcgactggcc 11040 gagaaaaaca attgtgtggc acgtgctgat tccctaatta agaaaaaggt caagatcacc 11100 tatgacccgg ggataggagc ggctcaggtc attcgtaggt gggaagagct tgagtggacc 11160 agaaggaaac ctgaaccttc taatgcaacc gcagaagatg atatcttcct agtcctgtgg 11220 aaaagatttt caaagtacat tttccagaaa atgaagttca tgcagagaat gctggccccc 11280 tactaagtgg gaagcgttca tttaattata accagtatct ggtaagtata agacttgtgt 11340 aaataaaaca tataactgaa aggggcaggt ggccgtacag gctggggcga tcgccgcacc 11400 cccccttcgc caggcgcctc aaccccatac accatggggt tgttgtaaat acttgaaaga 11460 atggagtaat acgggtaata aacttacagg ccagtattgc cccatttgct ttgtagtggt 11520 gacgacctgt ataggtctga tctagatgaa gcaagggggc c 11561 <210> 20 <211> 5048 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 20 gcataatgct ttgattggct gcattatgta tgggacatcc taaattgttg tgagccctgt 60 ggtgagtggg ggaaaggggt taaccaggcc tctagtacca caggcaccaa cagacagggc 120 aactcgaacc tgagagagag gtaccgagct cttaagcccc gagtacgggg cagacgtcac 180 cgagtagtac acccaaagac caccacttct aggtgtaggg tctactgagg ctcgggtgga 240 cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gggcctgggg gtcggggcca ccatgcccct 300 ttatggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga tgcctcgggt aagagtataa 360 aatccgttgt ctattaacat ggaaaaacag attgcacatt acttaaaaaa agaaaaacaa 420 aggaatgggt ggacggaact ggtggtagga gaaagtcaca ctaaaataac tacgctttct 480 ggaaagacct atcgaggtac ttgggaaatg gagaaacggc caaatcctta cggaacctat 540 tttcccagac ctagtcccca gcagctcaca gccctacacc cccacccagt ggtaaattgc 600 aaggtgatag agtacaaggg gacggaccct aattatggtg attgcccaaa tacaaacggg 660 gtgttcatcg atgaaaaggg tagaaggttg agcagccctc cattaggtat ttggaagata 720 agattggact acagcgacct gataaatata aacagaccag tccccactag aggggaaaac 780 tcttatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctactg taatgctggt acacaatagg 840 gtacttgtgg aagactgtag ggggctatac caatggaaac ccaactgtga aggaattgtg 900 ctctatgtaa aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg aaaaacagga gaagggaagc 960 cccccaaaac cacaacggcc accaaggcga gacccacgaa aaggcttaca accacaagtc 1020 cccagagaaa ctgaggttac agaaaagaag aggcaaccta gtgtcacctt agtagcaggg 1080 gggcagaagg cccaaatcat ctacaaaggc aggactaaaa ataaaaagac tccggatggg 1140 gtctataagt acccaggagc taaagaaggg gatgtggtaa aggtcaggaa gatgcttaag 1200 aattggcata tagccttgat aatatacctg atatatatta taactccagg ttttgccaag 1260 gttcagtggt tcttaaagga cgaaaactcg acggggatca atcagatcct gtggcaaaga 1320 cagattaaca gaaccctgca tggagaatgg cctaaccaga tctgccacgg catgccaaat 1380 gaaactatta cagatgagga attacgtagc ctgggaatga tagacacaag ccccagaaca 1440 aactacactt gctgccagtt gcaatatcat gaatggaaga aacatggttg gtgcaactat 1500 ccacaaaaac aggtctggat caggaggata acggccctac aagctaacct caccggagcc 1560 tatgaggggc ctgagtgtgc cgtcatttgt agatttaacg gcagctataa catcgtaaaa 1620 caagccagag atgaggtgag tccactgaca gggtgcaagg aagggcaccc ttttctattc 1680 tctggtgaaa gatccgacac ctcatgcctg aggccccctt ccactagttg ggtaagaccg 1740 gtaaaaatgg acgaggcgtc attggctgat agcttcgccc atggggttga caaggcaata 1800 atactaatca gaaaaggggc atcaggaata attaatttcc tagacactat tgggaggtgg 1860 ctaccggtag ctgaggcagc tatagtacca tattgtgaaa cttacactgt gacagggatg 1920 tatgtccatg tgaagaattg tctccctaga gggttaccga agcattcaaa gataatttcc 1980 ccgacaataa tatacttggg ggaaggtgac ccagcccata atattcagca cttatttggc 2040 tcaggtatag caaagtgggt cttagtccta ctcggggttc tgggtgagtg gtatggagaa 2100 ttggcctcta caatatactt actactagag tatgggtctg agtggttgga acatgaaagt 2160 ttggtcacgg aagggttgat ccctggcatc aatattacaa tagaactccc agctagtcat 2220 actgtacctg gttgggtgtg ggtcgcaggc cggtgggtat gcgtgaaacc agattggtgg 2280 cccacacaga tttggattga aactatagtg gcagaggtct ggcatatact aaaaatattg 2340 gcatcagccc tggtaaacat agtcactgca ttcgtaaacc tggaattggt atacctggtc 2400 ataatattag tcaaaatatc aaaggggaac ctgataggcg ctatattgtg gtgcctatta 2460 ctgtcagggg ctgaaggctc gtgccacaag agacaagact attacagtat ccagctagtc 2520 gttgacggaa aaacgggcgt agaaaaacga tctatagtgg gcaagtggac agtgataact 2580 agggaaggtc gggaaccaag attaatggag caaataagca tggtgtcaaa tgatagctta 2640 tcagaaactt actgctacaa taggctaaat actagcagtt gggggcgaca accggcaaga 2700 cagagagggt gtggtcaaac cgtacccttt tggcctggtg acaatgtcct ggaagaacaa 2760 tactatagca caggttactg ggtaaatgca acaggtggtt gccagttgag agaaggcgtg 2820 tggctatcaa gaaagggcaa tgtacagtgc cagcgtaacg gctcatcctt gatactgcaa 2880 ctggcgataa aagaagagaa tgacactatg gaaataccat gtgacccggt ggaaaccgaa 2940 agtatgggtc cagttacaca gggcacttgc gtgtacagct gggcattcgc cccaagaggg 3000 tggtattaca acaggaaaga tggttattgg ctccagtacg taaagaaaaa cgactaccag 3060 tactggacga aaatgcccac tgcttcatcc gccacaacga tgtaccgcca tttgctccct 3120 ttactggtgg cctgcctcat gggcggtaga atatcggtat ggattgtggc gatgctcctg 3180 tctttacagg tggaagctag tgaagtaggt accaagcaac tggctgtcac gctaactctg 3240 tggaaaatgg actggacaga attactcttc tatattgtta taatgctagc cgttaaggaa 3300 gaactcataa aaaaaatagt gactgcaagc cttgtggcct taaaaaatag tccagtagcc 3360 ttgagcttcc ttattgtact caggcttgtg gggggtagtg aggcactccc agtgggtttg 3420 ttattagaaa agatgtgcat agaccaaccg gagtttggaa cccctttcct gatctaccta 3480 tgggacaatt ggaagtggac tgtactagtc agcttctccg cactgaatca tgaaaaaact 3540 ataaaactgg caagaaaact gctgttggca acacacataa cagcgctcac attgactggt 3600 ctgagtgatt caatcttcta tatgatgctt ataatgacta atttattaat aaagacattc 3660 atatatctac tgggagccag tataaattgg gtcgagagag aaaaaaagaa gttgctagtg 3720 aagagaaaac taatatataa gaaagccgcg atttgcagtc aagatggaaa tgaattggag 3780 aataaattta ataagataac tgtaaatgcg gatttcaccc catgtaaact tgaacttctg 3840 caactactca gggctttttt agtctctcta tgcttttcct attacaagcc tctcctgtat 3900 gcggaaacta ctctaaccgt gatagtaatt ggcgtacagg agtacaacgt agctatggct 3960 cgcgggcgaa gcgtggtcca tagactgcta gccatggcct attacatata cggccgtata 4020 cagggtgaca tgttccagct cgccactatc cagtgcctgt tgtcaagtcc taggaaaatt 4080 atgaaacaca tgatagaaaa tccaactctt aagaagctct ggcaaggtga aacagagctt 4140 tttaaccagg gtgtcagcca gtccaaaata gtgaatccaa agagcattgg gctggaagaa 4200 ttacacaagg gtatgtgcgg cctcccaact gtagtgcaaa atttggtcat atatgctaag 4260 aagaatgact ctcttatctt aggagagctg ggttaccccc ctggggacct caccagtgac 4320 gggtgggaaa ttttaggtcc tggcagaatc ccaaagatta ccaacgttga gtccgctaaa 4380 atggacttac tctccaagct tatgaccttt ctgggggttg agagctcaag agtccccagg 4440 accccagtcc actcgacaag gaaattattg aagatagtga gaggcttaga aactggatgg 4500 ggatacaccc atgcaggggg gataagtagc gcaaaacacg tcacaggtga aaaaaacttg 4560 atgactcaca tggaaggcag gaagggaaag tatatcctac aatcccaaga acatggtgct 4620 gatgaggtag aatatggagt gaaaactgac caaaaagcac ccgacaatgc cttatgctac 4680 tgctttaacc ctgaagccac aaacataaaa ggagaaacgg gagccatggt gtttatgaag 4740 aagataggaa aaaaatggac tctcgtgaca tcagatggta acaaagccta ttataatgta 4800 aacaacctga aagggtggtc cggactaccg ataatgttgc actctaccgg ggctatagta 4860 gggaggatta agtcagcgta ttcagatgaa aacgacttgg tagaggaact tatcgactcc 4920 aggactatca gcaagagcaa tgaggcaaac ctggatcacc ttatcaagga attagcagat 4980 atgcggaggg gggagtttcg ctccatcacc cttggaacag gagctgggaa aactacagaa 5040 ctgcccag 5048 <210> 21 <211> 5037 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 21 tgattggctg cattatgtat gggacatcct aaattgttgt gagccctgtg gtgagtgggg 60 gaaaggggtt aaccaggcct ctagtaccac aggcaccaac agacagggca actcgaacct 120 gagagagagg taccgagctc ttaagccccg agtacggggc agacgtcacc gagtagtaca 180 cccaaagacc accacttcta ggtgtagggt ctactgaggc tcgggtggac gtgggcgtgc 240 ccaaagagaa atcggtggtg ggcctggggg tcggggccac catgcccctt tatggggtag 300 accttactgc ttgatagagt gccggcggat gcctcgggta agagtataaa atccgttgtc 360 tattaacatg gaaaaacaga ttgcacatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa ggaatgggtg 420 gacggaactg gtggtaggag aaagtcacac taaaataact acgctttctg gaaagaccta 480 tcgaggtact tgggaaatgg agaaacggcc aaatccttac ggaacctatt ttcccagacc 540 tagtccccag cagctcacag ccctacaccc ccacccagtg gtaaattgca aggtgataga 600 gtacaagggg acggacccta attatggtga ttgcccaaat acaaacgggg tgttcatcga 660 tgaaaagggt agaaggttga gcagccctcc attaggtatt tggaagataa gattggacta 720 cagcgacctg ataaatataa acagaccagt ccccactaga ggggaaaact cttatcgagt 780 cgagacctgc agtggggagc tggctactgt aatgctggta cacaataggg tacttgtgga 840 agactgtagg gggctatacc aatggaaacc caactgtgaa ggaattgtgc tctatgtaaa 900 aacttgttct gattgggcag atcaggtgga aaaacaggag aagggaagcc ccccaaaacc 960 acaacggcca ccaaggcgag acccacgaaa aggcttacaa ccacaagtcc ccagagaaac 1020 tgaggttacg gaaaagaaga ggcaacctag tgtcacctta gtagcagggg ggcagaaggc 1080 ccaaatcatc tacaaaggca ggactaaaaa taaaaagact ccggatgggg tctataagta 1140 cccaggagct aaagaagggg atgtggtaaa ggtcaggaag atgcttaaga attggcatat 1200 agccttgata atgtacctga tatatattat aactccaggt tttgccaagg ttcagtggtt 1260 cttaaaggac gaaaactcga cggggatcaa tcagatcctg tggcaaagac agattaacag 1320 aaccctgcat ggagaatggc ctaaccagat ctgccatggc atgccaaatg aaactattac 1380 agatgaggaa ttacgtagcc tgggaatgat agacacaagc cccagaacaa actacacttg 1440 ctgccagttg caatatcatg aatggaagaa acatggttgg tgcaactatc cacaaaaaca 1500 ggtctggatc aggaggataa cggccctaca agctaacctc accggagcct atgaggggcc 1560 tgagtgtgcc gtcatttgta gatttaacgg cagctataac atcgtaaaac aagccagaga 1620 tgaggtgagt ccactgacag ggtgcaagga agggcaccct tttctattct ctggtgaaag 1680 atccgacacc tcatgcctga ggcccccttc cactagttgg gtaagaccgg taaaaatgga 1740 cgaggcgtca ttggctgata gcttcgccca tggggttgac aaggcaataa tactaatcag 1800 aaaaggggca tcaggaataa ttaatttcct agacactatt gggaggtggc taccggtagc 1860 tgaggcagct atagtaccat attgtgaaac ttacactgtg acagggatgt atgtccatgt 1920 gaagaattgt ctccctagag ggttaccgaa gcattcaaag ataatttccc cgacaataat 1980 atacttgggg gaaggtgacc cagcccataa tattcagcac ttatttggct caggtatagc 2040 aaagtgggtc ttagtcctac tcggggttct gggtgagtgg tatggagaat tggcctctac 2100 aatatactta ctactagagt atgggtctga gtggttggaa catgaaagtc tggtcacgga 2160 agggttgatc cctggcatca atattacaat agaactccca gctagtcata ctgtacctgg 2220 ttgggtgtgg gtcgcaggcc ggtgggtatg cgtgaaacca gattggtggc ccacacagat 2280 ttggattgaa actatagtgg cagaggtctg gcatatacta aaaatattgg catcagccct 2340 ggtaaacata gtcactgcat tcgtaaacct ggaattggta tacctggtca taatattagt 2400 caaaatatca aaggggaacc tgataggcgc tatattgtgg tgcctattac tgtcaggggc 2460 tgaaggctcg tgccacaaga gacaagacta ttacagtatc cagctagtcg ttgacggaaa 2520 aacgggcgta gaaaaacgat ctatagtggg caagtggaca gtgataacta gggaaggtcg 2580 ggaaccaaga ttaatggagc aaataagcat ggtgtcaaat gatagcttat cagaaactta 2640 ctgctacaat aggctaaata ctagcagttg ggggcgacaa ccggcaagac agagagggtg 2700 tggtcaaacc gtaccctttt ggcctggtga caatgtcctg gaagaacaat actatagcac 2760 aggttactgg gtaaatgcaa caggtggttg ccagttgaga gaaggcgtgt ggctatcaag 2820 aaagggcaat gtacagtgcc agcgtaacgg ctcatccttg atactgcaac tggcgataaa 2880 agaagagaat gacactatgg aaataccatg tgacccggtg gaaaccgaaa gtatgggtcc 2940 agttacacag ggcacttgcg tgtacagctg ggcattcgcc ccaagagggt ggtattacaa 3000 caggaaagat ggttattggc tccagtacgt aaagaaaaac gactaccagt actggacgaa 3060 aatgcccact gcttcatccg ccacaacgat gtaccgccat ttgctccctt tactggtggc 3120 ctgcctcatg ggcggtagaa tatcggtatg gattgtggcg atgctcctgt ctttacaggt 3180 ggaagctagt gaagtaggta ccaagcaact ggctgtcacg ctaactctgt ggaaaatgga 3240 ctggacagaa ttactcttct atattgttat aatgctagcc gttaaggaag aactcataaa 3300 aaaaatagtg actgcaagcc ttgtggcctt aaaaaatagt ccagtagcct tgagcttcct 3360 tattgtactc aggcttgtgg ggggtagtga ggcactccca gtgggtttgt tattagaaaa 3420 gatgtgcata gaccaaccgg agtttggaac ccctttcctg atctacctat gggacaattg 3480 gaagtggact gtactagtca gcttctccgc actgaatcat gaaaaaacta taaaactggc 3540 aagaaaactg ctgttggcaa cacacataac agcgctcaca ttgactggtc tgagtgattc 3600 aatcttctat atgatgctta taatgactaa tttattaata aagacattca tatatctact 3660 gggagccagt ataaattggg tcgagagaga aaaaaagaag ttgctagtga agagaacact 3720 aatatataag aaagccgcga tttgcagtca agatggaaat gaattggaga ataaatttaa 3780 taagataacc gtaaatgcgg atttcacccc atgtaaactt gaacttctgc aactactcag 3840 ggctttttta gtctctctat gcttttccta ttacaagcct ctcctgtatg cggaaactac 3900 tctaaccgta atagtaattg gcgtacagga gtacaatgta gctatggctc gcgggcgaag 3960 cgtggtccat agactgctag ccatggccta ctacatatac ggccgtatac agggtgacat 4020 gttccagctc gccactatcc agtgcctgtt gtcaagtcct aggaaaatta tgaaacacat 4080 gatagaaaat ccaactctta agaagctctg gcaaggtgaa acagagcttt ttaaccaggg 4140 tgtcagccag tccaaaatag tgaatccaaa gagtattggg ctggaagaat tacacaaggg 4200 tatgtgcggc ctcccaactg tagtgcaaaa tttggtcata tatgctaaga agaatgactc 4260 tcttatctta ggagagctgg gttacccccc tggggacctc accagtgacg ggtgggaaat 4320 tttaggtcct ggcagaatcc caaagattac caacgttgag tccgctaaaa tggacttact 4380 ctccaagctt atgacctttc tgggggttga gagctcaaga gtccccagga ccccagtcca 4440 ctcgacaagg aaattattga agatagtgag aggcttagaa actggatggg gatacaccca 4500 tgcagggggg ataagtagcg caaaacacgt cacaggtgaa aaaaacttga tgactcacat 4560 ggaaggcagg aagggaaagt atatcctaca atcccaagaa catggtgctg atgaggtaga 4620 atatggagtg aaaactgacc aaaaagcacc cgacaatgcc ttatgctact gctttaaccc 4680 tgaagccaca aacataaaag gagaaacggg agccatggtg tttatgaaga agataggaaa 4740 aaaatggact ctcgtaacat cagatggtaa caaagcttat tataatgtaa acaacctgaa 4800 agggtggtcc ggactaccga taatgttgca ctctaccggg gctatagtag ggaggattaa 4860 gtcagcgtat tcagatgaaa atgacttggt agaggaactt atcgactcca ggactatcag 4920 caagagcaat gaggcaaacc tggatcacct tatcaaggaa ttagcagata tgcggagggg 4980 ggagtttcgc tccatcaccc ttggaacagg agctgggaaa actacagaac tgcccag 5037 <210> 22 <211> 5039 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 22 gcataatgct ttgattggct gcattatgta tgggacatcc taaattgttg tgagccctgt 60 ggtgagtggg ggaaaggggt taaccaggcc tctagtacca caggcaccaa cagacagggc 120 aactcgaacc tgagagagag gtaccgagct cttaagcccc gagtacgggg cagacgtcac 180 cgagtagtac acccaaagac caccacttct aggtgtaggg tctactgagg ctcgggtgga 240 cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gggcctgggg gtcggggcca ccatgcccct 300 ttatggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga tgcctcgggt aagagtataa 360 aatccgttgt ctattaacat ggaaaaacag attgcatatt acttaaaaaa agaaaaacaa 420 aggaatgggt ggacggaact ggtggtagga gaaagtcaca ctaaaataac tacgctttct 480 ggaaagacct atcgaggtac ttgggaaatg gagaaacggc caaatcctta cggaacctat 540 tttcccagac ctagtcccca gcagctcaca gccctacacc cccacccagt ggtaaattgc 600 aaggtgatag agtacaaggg gacggaccct aattatggtg attgcccaaa tacaaacggg 660 gtgttcatcg atgaaaaggg tagaaggttg agcagccctc cattaggtat ttggaagata 720 agattggact acagcgacct gatcaatata aacagaccag tccccactag tggggaaaac 780 tcttatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctactg taatgccggt acacaatagg 840 gtacttgtgg aagactgtag ggggctatac caatggaaac ccaactgtga aggaattgtg 900 ctctacgtaa aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg aaaaacagga gaagggaagc 960 cccccaaaac cacaacggcc accaaggcga gacccacgaa aaggcttaca accacaagtc 1020 cccagagaaa ctgaggttac agaaaagaag aggcaaccta gtgttacctt agtagcaggg 1080 gggcagaagg cccaaatcat ctacaaaggc aggactaaaa ataaaaagac tccggatggg 1140 gtctataagt acccaggagc taaagaaggg gatgtggtaa aggtcaggaa gatgcttaag 1200 aattggcata tagccttagt aatgtacctg atatatatta taactccagg ttttgccaag 1260 gttcagtggt tcttaaagga cgaaaactcg acggggatca atcagatcct gtggcaaaga 1320 cagattaaca gaaccctgca tggagaatgg cctaaccaga tctgccacgg catgccaaat 1380 gaaactatta cggatgagga attacgtagc ctgggaatga tagacacaag ccccagaaca 1440 aactacactt gctgccagtt gcaatatcat gaatggaaga aacatggttg gtgcaactat 1500 ccacaaaaac aggtctggat caggagaata acggccctac aagctaacct caccggagcc 1560 tatgaggggc ctgagtgtgc cgtcatttgt agatttaacg gcagctataa catcgtaaaa 1620 caggccagag atgaggtgag tccactgaca gggtgcaagg aagggcaccc ttttctattc 1680 tctggtgaaa gatccgacac ctcatgcctg aggccccctt ccactagttg ggtaagaccg 1740 gtaaaaatgg acgaggtgtc attggctgat ggcttcgccc atggggttga caaggcaata 1800 atactaatca gaaaaggggc atcaggaata attaatttcc tagacactat tgggaggtgg 1860 ctaccggtag ctgaggcagc tatagtacca tattgtgaaa cttacactgt gacagggatg 1920 tatgtccatg tgaagaattg tctccctaga gggttaccga agcattcaaa aataatttcc 1980 ccgacaatga tatacttggg ggaaggtgac ccagcccata atattcagca cttatttggc 2040 tcaggtatag caaagtgggt cttagtccta ctcggggttc tgggtgagtg gtatggagaa 2100 ttggcctcta caatatactt actactagag tatgggtctg agtggttgga acatgaaagt 2160 ctggtcacgg aagggttgat ccctggcatc aatattacaa tagaactccc agctagtcat 2220 actgtacctg gttgggtgtg ggtcgcaggc cggtgggtat gcgtgaaacc agactggtgg 2280 cccacacaga tttggattga aactatggtg gcagaggtct ggcatatact aaaaatattg 2340 gcatcagccc tggtaaacat agtcactgca ttcgtaaacc tggaattggt atacctggtc 2400 ataatattag tcaaaatatc aaaggggaac ctgataggcg ctatattgtg gtgcctatta 2460 ctgtcagggg ctgaaggctc gtgccacaag agacaagact attacagtat ccagctagtc 2520 gttgaagaaa aaacgggcgt agaaaaacga tctataatgg gcaagtggac agtgataact 2580 agggaaggtc gggaaccaag attaatggag caaataagta tggtgtcaaa tgatagcttg 2640 tcagaaactt actgctacaa taggctaaat actagcagtt gggggcgaca accggcaaga 2700 cagagagggt gtggtcaaac cgtacccttt tggcctggtg acaatgtcct ggaagaacaa 2760 tactatagca caggttactg ggtaaatgca acaggtggtt gccagttgag agaaggcgtg 2820 tggctatcaa gaaagggcaa tgtacagtgc cagcgtaacg gctcatcctt gatactgcaa 2880 ctggcgataa aagaagagaa tgatactatg gaaataccat gtgacccggt ggaaaccgaa 2940 agtatgggtc cagttgcaca gggcacttgc gtgtacagct gggcattcgc cccaagaggg 3000 tggtattaca acaggaaaga tggttattgg ctccagtacg taaagaaaaa cgactaccag 3060 tactggacga aaatgcccac tgcttcatcc gccgcaacga tgtaccgcca tttgctccct 3120 ttactggtgg cctgccttat gggcggtaga atatcggtat ggattgtggc gatgctcctg 3180 tctttacagg tggaagctag tgaagtaggt accaagcaac tggctgtcac gctaactctg 3240 tggaaaatgg actggacaga attactcttc tatattgtta taatgctagc cgttaaggaa 3300 gaactcataa aaaaaatagt gactgcaagc cttgtggcct taaaaaatag tccagtagcc 3360 ttgagcttcc ttattgtact caggcttgtg gggggtagtg aagcactccc agtgggtttg 3420 ctattagaaa agatgtgcat agaccaaccg gagtttggaa cccctttcct gatctaccta 3480 tgggacaatt ggaagtggac tgtactagtc agcttctccg cactgaatca tgaaaaaact 3540 ataaaactgg caagaaaact gctgttggca acacacataa cggcgctcac attgactggt 3600 ctgagtgatt caatcttcta tatgatgctt ataatgacta atttattaat aaagacattc 3660 atatatctac tgggagccag tatgaattgg gtcgagagag aaaaaaagaa gttgctagtg 3720 aagagaaaac taatatataa gaaagccgcg atttgcagtc aagatggaaa tgaattggag 3780 aataaattta ataagataac tgtaaatgcg gatttcaccc catgtaaact tgaacttctg 3840 caactactca gggctttttt agtctctcta tgcttttcct attacaagcc tctcctgtat 3900 gcggaaacta ctctaaccgt aatagtaatt ggcgtacagg agtacaacgt agctatggct 3960 cgcgggcgaa gcctggtcca tagactgcta gccatggcct actacatata cggccgtata 4020 cagggtgaca tgttccagct cgccactatc cagtgcctgt tgtcaagtcc taggaaaatt 4080 atgaaacaca tgatagaaaa tccaactctt aagaagctct ggcaaggtga aacagagctt 4140 tttaaccagg gtgtcagcca gtccaaagta gtgaatccaa agagcattgg gctggaagaa 4200 ttacacaagg gtatgtgcgg cctcccaact gtagtgcaaa atttggtcat atatgctaag 4260 aagaatgact ctcttatctt aggagagctg ggttaccccc ctggggacct caccagtgac 4320 gggtgggaaa ttttaggtcc tggcagaatc ccaaagatta ccaacgttga gtccgctaaa 4380 atggacttac tctccaagct tatgaccttt ctgggggttg agagctcaag agtccccagg 4440 actccagtcc actcgacaag gaaattattg aagatagtga gaggcttaga aactggatgg 4500 ggatacaccc atgcaggggg gataagtagc gcaaaacacg tcacaggtga aaaaaacttg 4560 atgactcaca tggaaggcag gaagggaaag tatatcctac aatcccaaga acatggtgct 4620 gatgaggtag aatatggagt gaaaactgac caaaaagcac ccgacaatgc cttatgctat 4680 tgctttaacc ctgaagccac aaacataaaa ggagaaacgg gagccatggt gtttatgaag 4740 aagataggaa aaaaatggac tctcgtaaca tcagatggta acaaagccta ttataatgta 4800 aacaacctga aagggtggtc cggactaccg ataatgttgc actctaccgg ggctatagta 4860 gggaggatta agtcagcgta ttcagatgaa aacgacttgg tagaggaact tatcgactcc 4920 aggactatca gcaagagcaa tgaggcaaac ctggatcacc ttatcaagga attagcagat 4980 atgcggaggg gggagtttcg ctccatcacc cttggaacag gagctgggaa aactacaga 5039 <210> 23 <211> 5035 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 23 cataatgctt tgattggctg cattatgtat gggacatcct aaattgttgt gagccctgtg 60 gtgagtgggg gaaaggggtt aaccaggcct ctagtaccac aggcaccaac agacagggca 120 actcgaacct gagagagagg taccgaactc ttaagtcccg agtacggggc agacgtcact 180 gagtagtaca cccaaagacc accacttcta ggtgtagggt ctactgaggc tcaggtggac 240 gtgggcgtgc ccaaagagaa atcggtggcg gacctggggg tcgggtccac catgcccctt 300 tagggggtag accttactgc ttgatagagt gccggcggat gcctcgggta agagtataaa 360 atccgttgtt tgttaacatg gaaaaacaga ttgcatatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa 420 gaaatgggtg gacggaattg gtggtaggag aaagccatac aaaaataacc acactctctg 480 gaaagaccta tcgaggcact tgggaaatgg agaaacggtc gaatccttac ggaacctatc 540 tccccagacc tagtcctcga cagcttacag ccctacaccc ccacccagtg gtgaattgta 600 aggtgactga gtacaaagag ctagacccta attatggtga ctgcccaaat acaaacgggg 660 tgttcatcga cgaaaagggt agaaggctga gcagccctcc attgggcatt tggaaaataa 720 gactggacta cagcgacctg gtaaatataa acaaaccagc ctccgctagt ggaaaaaact 780 cttatcgagt cgagacctgt agtggggagc tggctactgt aacaccagta cacgacagag 840 tgcttgtaga agactgcagg gggctatacc aatggaaacc caattgtgaa ggaatggtgc 900 tctatgtgaa aacttgttct gattgggcag accaggtaga aaaacaggag aaggaaagcc 960 ccccaaaacc ccagcgacca ccgaggcgag acccacgaaa aggattacaa ccacaagtcc 1020 ccaaagagac tgaggtcaca gaaaagaaga gacaacccag cgttacctta gtatcggggg 1080 ggcagaaggc ccaagtcatc tacaagggca agactaagaa taaaaagact ccggatggag 1140 tctataagta tccaggagcc agagaagggg atgtagtaaa ggttaggaag atgctgaaga 1200 attggcatat agctgtagtg atgtacctga tttatatcat aaccccgagc tttgccaagg 1260 ttcagtggtt cttaaaggat gaaaactcga cggggatcaa ccagatactg tggcaaagac 1320 agatcaatag atccctgcat ggagaatggc ccaaccagat ctgccacggc atgccgaacg 1380 aaaccatcac ggatgaagaa ttacgcagtc tgggaatgat tgacacaagc cccagaacaa 1440 actatacttg ctgccagttg caatatcatg aatggaagaa acatggttgg tgcaactatc 1500 cacaaaaaca gacttggatt aggaggataa cggccctaca aactaacctc accggagctt 1560 atgagggacc tgagtgcgct gttatttgtc gatttaatgg cagctataac atcgtaaaac 1620 aggccagaga cgaggtgagt ccactgacag ggtgtaagga agggcaccct ttcctatttt 1680 ctggtgaaag atccgatacc tcatgcctga ggcctccttc cacaagttgg gtaagaccag 1740 tgaagatgga tgaggcatca atagccgatg gctttgccca tggggttgac aaggcgataa 1800 tactgattag aaaaggggca tcaggaatca ttaatttcct agacaccatt gggaggtggc 1860 taccggtagc cgaagcaact atagtaccat attgtgaaac ttacactgtg acagggatgt 1920 atgtccatgt gaagaattgc ctccctagag ggttacctaa gcattcaaaa ataatttccc 1980 caacaatgat atacctgggg gaaggtgacc cagctcataa catccaacac ttatttggct 2040 caggtatagc aaagtgggtt ctagtcttac tcggggtcct gggtgagtgg tatggagaat 2100 tggcttctac aatataccta ctgctagagt atgggtctga gtggttggaa catgaaagcc 2160 tgaccacgga agggttgatc cccggcatta atatcacaac agaactccca gctagtcata 2220 cagtgcctgg ctgggtgtgg gtcgcaggcc agtgggtgtg tgtgaagcca gactggtggc 2280 ctacacagat ttggattgaa accgtggtgg cggaggcctg gcatatacta aaaatattgg 2340 catcagccct ggtgaacata gtcactgcat ttgtaaacct agaactggtc tacttggtca 2400 taatattggt caaaatatca aaggggaacc tgataggcgc catattatgg tgcctattgt 2460 tgtcaggggc tgaaggctcg tgccacaaaa gacaagatta ttataatatc cagctggttg 2520 tcgaagaaaa gacaggtgta gaaaaacgat ctataatggg caaatggact gtgataacta 2580 gggaaggccg ggaaccaaga ttaatggagc aaataaatat ggtgtcaaat gatacactgt 2640 cagaaactta ctgctataat aggctaaaca ccagtagttg ggggcggcaa ccagtaagac 2700 agagagggtg tggtcagacc gtgccctatt ggcctggtga taatatcctg gaagaacaat 2760 actatagcac aggttactgg gtgaacgcga caggcggttg ccagctgaga gaaggtgtgt 2820 ggctgtcaag aaagggtaat gtacagtgcc agcgtaacgg ctcatccttg atactgcaat 2880 tagcgataaa agaagaaaat gacactatgg aaataccatg tgacccggtg gaaacagaaa 2940 gcatgggtcc ggtcgcacag ggcacttgcg tgtatagctg ggcattcgcc ccaagagggt 3000 ggtattacaa taggaaagat ggctattggc tccagtacat aaagaaaaac gactaccagt 3060 actggacaaa aatgcctacc acctcgtccg ctgcgacaat gtaccgccac ttgcttcccc 3120 tactggtggc ttgccttatg ggcggcagga tatcggtgtg gattgtagca atgctcctat 3180 ctctgcaggt ggaagctagc gaagtaggta ccaagcaact ggctgtcaca ctaacactgt 3240 ggaaaatgga ctggatagaa ctactcttct atattatcat aatgctagcc gtcaaggaag 3300 aacttataaa gaaaatagtg actgcaagcc tagtggcctt aaaaaatagt ccagtggctt 3360 tgagctttct tgttgtactc aggcttgtag ggggcagtga agcactccca gtgggattac 3420 tattagaaaa gatgtgcata gaccaaccgg agtttggaac ccctttcctg atctacctgt 3480 gggacaattg gaagtggact gtattagtca gtttctccgc actgaaccat gaaaaaacta 3540 taaaactggc aagaaaactg ctattggcca cacatataac agcgctcata ctgactggtc 3600 tgagtgattc aatcttctac atgatgctta taataaccaa cctactggta aagacattca 3660 tatatttact gggggccagc atgaattggg tcgagaaaga aaaaaagaag ttgctggtaa 3720 agaggaaatt aatatataag aaagccgcga tttgcagtca ggatgagaat gaattggaga 3780 ataaattcaa taggatcact gtaaatgcgg atttcacccc atgcaaactt gaacttttac 3840 aactgcttag ggctttttta gtctctctat gcttttccta ttacaagcct ctcctgtatg 3900 cagagaccac tctaactgtc atagtaattg gcgtacaaga gtacaacgta gcaatggccc 3960 gcgggcggag tttggtccat agactactag ccatggccta ctacatatat ggccgcatgc 4020 agggtgacat gttccaactc gccaccattc agtgcctgtt gtcaagcccg aggaaaatta 4080 tgaaacatat gatagaaaat ccgactctta agaagctatg gcaaggcgaa acagaacttt 4140 ttaaccaggg tgtcaaccag tccaagatag tgaacccaag gaaaattggg ttggaggaat 4200 tacataaggg catgtgcggc ctcccaaccg tagtgcaaaa tttggtcata tatgcaaaga 4260 agaacgactc tcttatttta ggagagttgg gttactcccc tggggacctc accagcgatg 4320 ggtgggaaat tttaggccct ggcagaatcc caaagatcac taatgttgag tctgctaaaa 4380 tggacttact ttccaaactc atgaccttcc tggggattga aagctcaagg gtccccagaa 4440 ccccagtcca ctcaacaagg aaattattga agatagtaag aggcctggaa actggatggg 4500 ggtacaccca cgcaggagga attagcagcg cgaaacatgt tacaggtgaa aagaacttga 4560 tgacccacat ggagggcagg aagggtaagt atatcctaca atcccaagaa catggtgctg 4620 atgaggtaga atatggagta aaaactgacc aaaaagcgcc cgacaatgcc ttgtgctatt 4680 gctttaaccc tgaagctaca aacataaaag gtgaaacagg ggccatggtg ttcatgaaga 4740 agataggaaa aaaatggact ctcgtgacat cagatggtaa caaagcctat tataatgtaa 4800 ataatctgaa agggtggtct ggactaccaa taatgttgca ctccaccggg gccatagtag 4860 ggaggattaa gtcagcatat tcagatgaaa atgacttggt ggaggaactt atcgattcta 4920 ggactatcag caagagtaat gaggcaaacc tggaccacct tatcaaggaa ttggccgata 4980 tgcggagggg ggagttccgc tcaattaccc ttggaacggg agccgggaaa actac 5035 <210> 24 <211> 4921 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 24 tgattggctg cattatgtat gggacatctt aaattgctat gagccccgtg gtgagtgggg 60 gaaaggggtt aaccaggcct ctaggtccac aggcaccgat agacggggca actcaagcct 120 gagagagagg taccgaactc ttaagtcccg agtacggggc agacgtcacc gagtagtaca 180 cccaacgacc accacttcta ggtgtagggt ctactgaggc tcgggtggac gtgggcgcgc 240 ccaaagagaa atcggtggtg gacctggggg tcggggccac catgcccctt tacggggtag 300 accttactgc ttgatagagt gccggcggat gcctcaggta agagtataaa atccgttgtc 360 tattaacatg gaaaagcaga tcacatatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa caaatggatg 420 gacggaatta gtggtaggag aaagtaatac gaaaataacc acgctctctg gaaaaaccta 480 ccgaggtact tgggaaatgg agaaacggcc gaatccctac ggaacctatc tccccagacc 540 tagtccccaa cagcttacag ccctacaccc ccacccagta gtgaattgca aggtgattga 600 atacaaggat aaggacccta attatggtga ttgcccaaat acaaatgggg tgttcatcga 660 cgaaaaaggc agaaggctga gcagccctcc attgggtatt tggaagataa ggttggacta 720 cagcgacctg gtgaatataa acagaccaat ccccgctggt ggaaaaaact tctaccgagt 780 tgagacctgt agtggggagc tggctactgt gacactggta cacaaaagag tacttgtgga 840 agaccgtagg ggattgtacc aatggaaacc caactgtgaa gggatggtgc tctatgtgaa 900 aacttgttct gattgggcag atcaggtgga aaaacaggag aaggaaagcc ccccaaaacc 960 tcagcgacca ccaaggcgag atccccgaag agggttacaa ccacaagtcc ccaaagagac 1020 tgaggtcact gaaaagaaga gacaacccag tgtcacctta gtatcggggg ggcagaaggc 1080 ccaagtcatc tacaaaggca ggactaagaa caaaaagact ccggacgggg tctataagta 1140 tccgggggct aaagaggggg atgtgataaa ggtcaggaag atgctgaaga attggcacgt 1200 agctctggta atgtatctaa tatatatcat aaccccaggc ttcgccaagg ttcagtggtt 1260 cttaaaagat gaaaactcaa cggggatcag tcagatactg tggcgaagac agatcaacag 1320 atctctgcat ggagaatggc ctaatcagat ctgccacggt atgccaaatg aaactattac 1380 ggacgaggaa ttacgcagcc tgggaatgat agatacaagc cccagaacga actacacttg 1440 ttgccagttg caatatcatg agtggaagaa acatggttgg tgtaactatc cacaaaaaca 1500 ggcttggatt aggaggataa cggccttaca agccaacctc accggagctt acgcgggacc 1560 tgagtgcgct gtcatctgtc gatttaacgg tagctataac atcgtaaagc aagccagaga 1620 tgaggtaagt ccactgacag ggtgtaagga agggcacccc ttcctattct ctgacgaaag 1680 atccgacacc tcatgcctga ggcctccttc cactagctgg gtaagaccag taaaaatgga 1740 cgaggcatca attgccgatg gctttgccca tggggttgac aaggcaataa tactgatcag 1800 aaaaggggca actggaatta ttaatttcct agatactatc gggaggtggc taccggtagc 1860 tgaagcaacc ataacaccat attgtgaaac ttataccgtc acagggatgt atgtccatgt 1920 gaagaattgc ctccccaaag ggttacctaa gcattcaaaa ataatttccc caacgatgat 1980 atatctgggg gaaggtgacc cagcccataa tattcagcac ctgtttggct caggtatagc 2040 aaagtgggtt ctagtcttac tcggggttct gggtgagtgg tatggagaat tggcttctac 2100 gatataccta ctactagagt atgggtctga gtggttggaa catgaaagtc tgaccacgga 2160 agggttgatc cctggcatca acatcacaat agaactccca gccagtcaca cagtgcctgg 2220 ttgggtgtgg gtcgcaggcc agtgggtatg cgtgaagcca gactggtggc ctacacagat 2280 ctggatcgaa actatggtgg cggaggcctg gcatatacta aaaatattgg catcagccct 2340 ggtgaacata gtaactgcat ttgtgaacct ggaattagtc tacctggtca taatactagt 2400 taaaatatca aaggggaacc tgattggtgc catactatgg tgcctgttac tatcaggggc 2460 tgaaggctct tgccacaaaa gacaagacta ttacaatgtc cagctgatcg tcgatgaaaa 2520 gacaggcgta gaaagacgat ctataatggg caagtggact gtgataacca gggaaggcag 2580 ggaaccaaga ttaatggagc aaataaacat ggtgtcaaat gacagcctgt cagagactta 2640 ctgctataat aggctaaata ccagcagttg gaggcggcaa ccggcaaaac agagagggtg 2700 tggtcaaact gtgccctatt ggcctggcga caatgtctta gaagaacaat actatagtac 2760 agggtattgg gtgaacgtga caggcggttg tcagctgaga gaaggcgtgt ggctatcaag 2820 aaagggcaat gtacagtgcc agcgtaacgg ctcagccttg atgctgcaat tggcgataaa 2880 agaagaaaat gacactatgg aaataccgtg tgacccggtg gaaacagaaa gcatgggtcc 2940 agttgcacaa ggcacttgcg tgtatagctg ggcatttgcc ccaagagggt ggtactataa 3000 taagaaagat ggttactggc tccaatacat aaagaaaaac gactaccagt actggacaaa 3060 aatgcctgct gcctcgtccg ccgcaacgat gtaccgccat ttgcttccct tactagtggc 3120 ctgcctgatg ggcggcagga tatcggtgtg gattgtggcg atgctcctgt ctttgcaggt 3180 ggaagccagc gaagtgggta ctaagcaact ggctgtcact ctaaccctgt ggaaaatgga 3240 ctggacggaa ctgcttttct atgttgtcat aatgctagcc gttaaggaag agcttgttaa 3300 gaaaatagtg accgcaagcc ttgtggccct aaaaaacagt ccagtagctt tgagctttct 3360 tattgttctc aggcttgtgg ggggcagtga agcactccca gtaggtttac tattagaaaa 3420 gatgtgcata gaccaaccgg agttcggaac ccctttcctg atctacctgt gggacaattg 3480 gaagtggact gtactagtca gcttctctgc actgaatcat gaaaaaacta taaaactggc 3540 aagaaaactg ttattggcaa cacatataac agcgctcaca ctgaccggtc tgagtgattc 3600 aatcttttat gtgatgctta taatgaccaa cctactaata aagacattta tatatctact 3660 gggggctagt atgaattggg tcgagagaga aaagaagaag ttgctagtaa agaggaaact 3720 aatatataag aaagctgcaa tttgcaatca agatgagaat gaattggaga ataaatttaa 3780 caagataacc gtaaatgcgg acttcacccc atgtaaactt gaactcttac aactactcag 3840 ggctttttta gtctctttat gtttttccta ttacaagccc ctcctgtatg cagagaccac 3900 cctaactgtt atagtgattg gcgtacaaga gtacaatgtg gctatggccc gcgggcgaag 3960 cgtgattcat agattgctag ccatggccta ctacgtatac ggccgcatgc agggtgacat 4020 gtttcagctc gccaccatcc agtgcctgtt gtcgagtccg aggaaagtta tgaaacacat 4080 gatagaaaac ccaactctca agaagctctg gcaaggcgaa acagaacttt ttaaccaggg 4140 tgtcagccaa tccaaaatag tgaacccaaa gaagattggg ctagaggaat tacataaggg 4200 catgtgcggc ctcccaactg tagtgcaaaa tttggtcata tatgcgaaga agaatgactc 4260 tcttatctta ggagagttag gttacccccc cggggacctc actagtgatg ggtgggaaat 4320 actaggtcct ggcagaatcc caaagatcac taacgtcgag tctgctaaaa tggacttgct 4380 ctccaaactt atgacctttc tggggatcga aagctcaagg gtccccagga ctccaatcca 4440 cccaacaagg aaattactga agatagtaag aggcctggaa actggatggg ggtatactca 4500 tgcaggggga ataagcagcg caaaacatgt tacaggtgaa aaaaacttga tgacccacat 4560 ggagggccgg aagggcaagt atatcctaca atcccaagaa cacggtgccg atgaggtaga 4620 atatggagta aaaactgatc aaaaagcacc cgacaatgcc ttatgctact gctttaaccc 4680 tgaagccaca aatataaaag gagaaacggg agccatggta ttcatgaaga agataggaaa 4740 aaaatggact ctcgtaacat cagatggtaa caaggcctat tataatgtga acaacctgaa 4800 agggtggtct ggactaccga taatgttgca ctctactggg gccatagtag gaggataaag 4860 tcagcatatt cagatgaaaa cgacttggtg gaggaactta ttgactctag gactatcagc 4920 a 4921 <210> 25 <211> 4702 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 25 gagtacgggg cagacgtcac tgagtagtac acccaaagac caccactttt aggtgtaggg 60 tctactgagg ctcaggtgga cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gaacctgggg 120 gtcgggttca ccatgcccct ttagggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga 180 tgcctcgggt aagagtataa aatccgttgt acattaacat ggaaaaacag attgcatatt 240 atttaaaaaa agaaaaacaa agaaatgggt ggacggaact ggtagtagga gaaagctata 300 caaaaataac cacgctctct gggcggacct atcgaggtac ctgggaaatg gagaaacggc 360 cgaatcctta cggaacctac ctacccaagc ccagtcctca acagcttaca gccctacacc 420 cccacccagt agtgaattgt aaggtgactg agtacaaaga gctggaccct aattatggtg 480 attgcccgag cacaaatggg gtgttcatcg acgaaaaggg tagaaggctg agtggccctc 540 cattgggtat ttggaagata agactggact acagcgacct ggtaaatatg aacagaccag 600 cccccgctag taaaaaaaac tcgtatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctattg 660 tgacaccggt acacgatagg gtacttgtgg aggactgcag ggggctatat caatggaaac 720 ccaactgtga aggaatggtg ctctatgtga aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg 780 aaaaacagga gaaggaaagc cccccaaaac ctcagcgacc accgaggcga gacccacgga 840 aagggttaca accacaagtc cccaaagaga ctgaggtcac agaaaagaag agacaaccta 900 gcgttacctt agtatcgggg gggcagaagg cccaagtcat ctacaaaggc aagactaaga 960 ataaaaagac cccggatgga gtctataaat atccaggagc cagacaaggg gatgtagtaa 1020 aagttaggaa gatgctgaag aattggcata tagcagtagt actatgcctg atttacatca 1080 taaccccaag ccttgccaag gttcagtggt tcctaaagga tgaaaactcg acggggatta 1140 accaggtact gtggcgaaga cagatcaata gatctctgca tggagaatgg cccaaccagg 1200 tctgccacgg tatgccaaat gaaaccatca cagatgagga attgcgcagc ctgggaatga 1260 tagatacaag ccccaaaaca aactatactt gttgccagtt gcaatatcat gagtggaaga 1320 aacatggctg gtgcaactat ccacaaaaac agacttggat taggaggata atggccctac 1380 aagccaacct caccggagct tatgagggac ctgagtgcgc tgttatctgt cgattcaacg 1440 gcagttataa catcgtaaaa caggccagag acgaagtaag tccactgacg gggtgcaagg 1500 aagggcaccc tttcctattt tccggtgaaa aatccggctc ctcatgcctg aggcctcctt 1560 ccactagttg ggtaaggcca gtgaagatgg atgaggcatc aatagctgat ggctttgccc 1620 atggggttga caaagcaata atactaatta gaaaaggggc atcaggaatt ataaatttcc 1680 tagacactat tgggaggtgg ctacctgtag ccgaagcagc tatagtacca tattgtgaaa 1740 cttacactgt gacagggatg tatgtccatg tgaggaattg cctccctaga gggttaccca 1800 agcattcaaa aataatttcc ccgacgttaa tatacctagg ggaaggtgac ccagcccata 1860 acatccagca cttatttggc tcaggtatag caaagtgggt tctagtctta ctcggggtcc 1920 tgggtgagtg gtatggagaa ttggcttcta caatatatct actactagag tatgggtctg 1980 agtggttgga acatgaaaac ctgatcacgg aagggttgat ccctggcatt aatatcacaa 2040 tagaactccc agctagtcat acagtgcctg gttgggtgtg ggttgcaggc caatgggtgt 2100 gtgtgaagcc agactggtgg cctacacaga tttggattga aaccatggta gcagaggcct 2160 ggcatatact aaaaatacta gcatcagccc tggtgaacat agtcactgca tttataaacc 2220 tggaattggt ctacctggtc ataatactag tcaaagtatc aaaggggaac ctgataggcg 2280 ccatactatg gtgcctatta ctgtcagggg ctgaaggctc atgccacaaa agagaagatt 2340 attacaatat ccagctagtt gttgaagaaa aaacaggtgt ggaaaaacga tctgtaatgg 2400 gcaaatggac tgtggtatcc agggaaggtc aggaaccaag gttaatggag caaataaata 2460 tggtgtcaaa tgataggctg tcagaaactt actgctacaa taggctaaat accagtagtt 2520 ggggacggca accggcaaga cagagagggt gtggtcagat tgtgccctat tggcctggtg 2580 acaatgtcct agaggaacaa tactatagca caggttactg ggtgaacgca acaggcggtt 2640 gccagctgag agaaggcgtg tggctatcaa gaaagggcaa tgtacagtgc cagcgtaacg 2700 gctcatcctt aacactgcaa ttagcgataa aagaagagaa tgacactatg gaaataccat 2760 gtgacccggt ggaaacagaa agcatgggtc cagtagcaca gggcacttgc gtgtatagct 2820 gggcattcgc cccaagaggg tggtattata ataggaaaga cggttattgg cttcagtaca 2880 taaagaaaaa cgactaccag tactggacaa aaatgcctac tgcctcgtcc gctgcaacga 2940 tgtaccgcca tttacttccc ttactggtgg cctgccttat gggcggcaga atatcggtgt 3000 ggattgtggc aatgctccta tctctacagg tggaagctag cgaagtaggc accaagcaac 3060 tggctgtcac actaactctg tggaaaatgg actggacaga actactcttc tatatcgtta 3120 taatgttagc cgtcaaggaa gaactcataa agaaaatagt gactgcaagc ctagtggcct 3180 taaaaaatag tccagtagcc ttgagctttc ttattgtact caggcttgta gggggcagtg 3240 aagcactccc agtgggttta ctattagaaa agatgtgcat agaccaaccg gagttcggaa 3300 cccctttcct gatctacctg tgggacaatt ggaagtggac tgtactagtc agcttctccg 3360 cactgaacca tgaaaaaact atcaaactgg caagaaaact gctattggcc acacatataa 3420 cagcgctcac attgactggt ctgagtgatt caatctttta catgatgctt ataatgacca 3480 acttactaat aaagacattc atatatctac tgggggccag cataaattgg gtcgagaaag 3540 aaaaaaagaa gctgctggta aagaggaaat taatatataa gaaagccgca atttgtagtc 3600 aggatgagaa tgaactggag aataaattca acaggataac tataaatgcg gatttcaccc 3660 catgcaaact tgaactttta caactactca gggctttttt agtctctata tgtttttcat 3720 attataagcc tctcctgtat gcagagacca ccttaactgt aatagtaatt ggtgtacaag 3780 agtacaatgt agcaatggcc cgcgggcgaa gcgtagtcca tagactacta gctatggcct 3840 actacatata tggccgcata cagggtgaca tgttccaact tgccactatt cagtgcctgt 3900 tgtcgagccc taggaaaatc atgaaacaca tgatagaaaa cccaactctt aagaagctct 3960 ggcaaggcga aacagaactt tttaaccagg gtgtcagcca gtccaaaata gtgaattcaa 4020 gaaaaattgg gctggaggaa ttacacaagg gcatgtgtgg cctcccaact gtagtgcaaa 4080 atttggtcat atatgcaaag aagaatgact ctctcatttt aggagagttg ggttaccccc 4140 ctggggacct caccagtgat gggtgggaaa ttttaggccc tggcagaatt ccaaagatca 4200 ctaatgtcga gtctgccaaa atggacttac tctccaaact catgaccttt ctggggattg 4260 aaagctcaag ggtccctaga accccagtcc actcaacaag gaaattactg aagatagtaa 4320 ggggcttgga aactggatgg gggtacactc acgcaggggg aatcagcagc gcaaaacacg 4380 ttacaggtga aaaaaacttg atgacccaca tggagggcag gaagggtaag tatatcctac 4440 aatcccaaga acatggtgcc gatgaggtag aatatggtgt aaaaactgac caaaaagcac 4500 ctgacaatgc cttatgctac tgctttaacc ctgaagccac aaacataaaa ggtgaaacgg 4560 gagccatggt gttcatgaag aagataggaa aaaaatggac tctcgtaaca tcagacggta 4620 acaaagccta ttataatgtg aacaacctga aagggtggtc tggactacca ataatgttgc 4680 actccaccgg ggccatagta gg 4702 <210> 26 <211> 4543 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 26 cggtggtgga cctgggggcc ggggccacca tgctccttta cggggtagac cttactgctt 60 gatagagtgc cggcggatgc ctcgggtaag agtataaaat ccgttgtcta ttaatatgga 120 aaaacagatc gcacattact taaaaaaaga aaaacaaaca aacggatgga cggaactggt 180 ggtaggagaa agtcatacaa aaataaccac gctctctgga aaaacctatc gaggaacttg 240 ggaaatggag aagcggtcaa atccttatgg aacctatctc cccagaccta gtccccaaca 300 gcttacagcc ctacaccccc acccagtggt aaattgcagg gtgatcgaat acaaggaaaa 360 tgaccctaat tatggtgatt gcccaaatac aaatggggtg ttcgtcgacg aaaaaggcag 420 gaggctgagt agccctccat tgggtatttg gaagataaga ttggactata gtgacctggt 480 gaacataaat agaccgaccc ccgctggtgg gaaaaactct taccgagtcg agacctgcag 540 tggggagctg gctactgtaa cactggtaca caaaagggta attgtggaag accgtagggg 600 attataccag tggaaaccca actgtgatgg gatggtgctc tatgtgaaaa cttgttctga 660 ttgggcagac caggtagaaa aacaggagaa ggaaagtccc ccaaaacctc agcggccacc 720 aaggcgagat ccccgaaaag ggttacaacc acaagtcccc aaagagattg aggttactga 780 aaagaagaga caacccagcg tcaccctagt atctgggggg cagaaggccc aagtcatcta 840 taaaggcagg actaagaata aaaggacccc ggatggggtc tataagtatc cgggagccaa 900 agaaggggat gtgacgaagg tcaggaagat gctaaagaat tggcatatag ccttggtaat 960 gtacctaata tatgttataa ccccaggttt cgccaaagtc cagtggttct taaaggatga 1020 aaactcgacg gggatcagtc agatactgtg gcaaagacag atcagcagat ccctgcatgg 1080 agaatggcct gatcagatct gccacggcat gccaaatgaa actattacgg atgaggaatt 1140 acgcagcctg ggaatgatag atacaagccc cagaacaaac tacacctgtt gccagttgca 1200 atatcacgag tggaagaaac atggctggtg taactatcca caaaaacaag cttggattag 1260 gagaataacg gccttacaag ccaacctcac cggagcttat gagggacccg agtgcgctgt 1320 catctgtcga ttcaatggca gctataacat cgtaaagcag gctagagatg aggtaagtcc 1380 gttgacaggg tgcaaggaag ggcacccctt cctattctct gacgaaagat ccgacacctc 1440 atgcctgagg cctccttcca ctagctgggt gagaccagta aaaatggacg aagcatcaat 1500 ggccgatggc tttgcccatg gggttgacaa ggcaataata ctaatcagaa aaggggcatc 1560 aggaatcatc aacttcttag acaccattgg gaggtggcta ccagtagctg aagcaactat 1620 aacaccatat tgtgaaactt acaccgtgac agggatgtat gtccatgtga agaattgcct 1680 ccccaaaggg ttacctaagc attcaaaaat aatttcccca acaatgatat atctggggga 1740 aggtgacccg gcccataata tccagcatct gtttggctca ggtatagcaa agtgggttct 1800 agtcttactc ggggttctgg gtgagtggta tggagaattg gcctctacaa tatacctgct 1860 actagagtat gggtctgagt ggttggaaca cgaaagtctg atcacggaag gattgattcc 1920 tggcatcaat atcacaatag aactcccagc cagtcataca gtgcctggtt gggtgtgggt 1980 cgcaggccag tgggtatgcg tgaaaccaga ctggtggcct acacagattt ggatcgaaac 2040 tgttgtggcg gaggcctggc atatactaaa aatactggca tcagccctgg tgaatatagt 2100 cactgcattt gtgaacctgg aattagtcta cctggtcata atactagtta aagtatcaaa 2160 ggggaacctg attggcgcta tactatggtg cctattgctg tcaggggctg aaggctcttg 2220 ccacaaaaga caagactatt acaatatcca gctagttgtc gaagaaaaga caggcgtaga 2280 aaaacgatct ataataggca agtggactgt gataaccaag gaaggtaggg aaccaagatt 2340 aatggagcaa ataaacatgg tgtcaaataa tagcctgtca gagacttact gctataatag 2400 gctaaatacc agcagttgga ggcggcaacc ggcaaatcag agagggtgtg gtcaaactgt 2460 gccctattgg cctggtgaca atgtcctaga ggaacaatac tatagcacag gttactgggt 2520 gaacgcaaca ggcggttgtc agctgaggga aggcgtatgg ctatcaagaa agggcaatgt 2580 acagtgccag cgtaacggct catccttgat gctgcaattg gcgataaaag aagaaaacga 2640 cactatggaa ataccatgtg acccggtgga aacagaaagc atgggtccag ttgcacaggg 2700 cacttgtgtg tacagctggg catttgcccc aagggggtgg tactataata ggaaagacgg 2760 ttactggctc caatacaaaa agaaaaacga ctaccagtac tggacaaaaa tgcccgctgc 2820 ctcgtccgcc gcaacaatgt accgccattt gctcccctta ctagtggcct gcctgatggg 2880 cggcaggata tcggtgtgga ttgtggcaat gctcctgtct ctacaggtgg aagccagtga 2940 agtgggtact aagcaactgg ctgtcactct aactctgtgg aaaatggact ggacagagct 3000 gcttttctat gttatcataa tgctagctgt taaggaagaa ctcgtaaaga aaatagtgac 3060 cgcaagcctt gtggccctaa aaaatagtcc agtagccttg agctttctta ttgttctcag 3120 gcttgtgggg ggcagtgaag cactcccagt gggtctacta ttagaaaaga tgtgtataga 3180 ccaaccggag ttcggaaccc ctttcctgat ctacctgtgg gacaattgga agtggactgt 3240 actagttagc ttctctgcac tgaatcatga aaaaactata aaactggcaa gaaaactgtt 3300 attggcaaca catataacag cactcacatt gaccggtctg agtgattcaa tcttttatgt 3360 aatgcttata acgaccaacc tactgataaa gacattcata tatttattgg gggctagcat 3420 gaattgggtt gagagagaaa aaaggaaatt actagtaaag aggagactaa tatataagaa 3480 agccgcaatt tgcaatcagg atgagaatga actggagaat aaatttaaca agataaccgt 3540 aaatacggat ttcaccccat gcaaacttga acttttgcaa ctactcaggg cttttttagt 3600 ctcattatgt ttttcctatt acaagcctct cttgtatgca gagactaccc taactgttat 3660 agtgattggt gtacaagagt acaacgtagc tatggcccgc gggcgaagcg tggttcacag 3720 attgctagcc atggcctatt acatatatgg ccgcatgcag ggtgacatgt ttcagctcgc 3780 caccatccag tgcctgttgt cgagtccgag gaaagtcatg aagcacatga tagaaaatcc 3840 aactctcagg aagctctggc aaggcgaaac agaacttttt aaccagggtg tcagccagtc 3900 caaaatagtg aacccaaaga agattgggct agaagaatta cataagggta tgtgcggtct 3960 cccaaccgta gtccaaaact tggtcatata tgcaaagaag aatgactctc ttatcttagg 4020 ggagttgggt tacccccctg gggacctcac tagtgatggg tgggaaatat taggtcctgg 4080 cagaatccca aagattacca atgtcgagtc tgctaaaatg gacttactct ccaaactcat 4140 gacctttctg gggattgaaa gctcaagggt ccccaggact ccagtccacc caacaaggaa 4200 attattgaag atagtaagag gcctggaaac tggatggggg tacactcatg cagggggaat 4260 aagcagcgca aaacatgtca caggtgaaaa aaacttgatg acccacatgg aaggccggaa 4320 gggcaagtat atcctacaat cccaagaaca tggtgctgac gaggtagaat atggagtaaa 4380 gactgatcaa aaagcacccg acaatgccct atgctactgc tttaaccctg aagccacaaa 4440 tataaaagga gaaacgggag ccatggtgtt catgaagaag ataggaaaaa aatggactct 4500 cgtaacatca gatggtaaca aggcctatta caatgtgaaa caa 4543 <210> 27 <211> 1073 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 27 ggcctggggg tcgggtccac catgcccctt tagggggtag accttactgc ttgatagagt 60 gccggcggat gcctcgggta agagtataaa atccgttgtt tgttaacatg gaaaaacaga 120 ttgtatatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa gaaatgggtg gacggaattg gtggtaggag 180 aaagccatac aaaaataacc acactctctg gaaagaccta tcgaggtact tgggaaatgg 240 agaaacggtc gaatccttac ggaacctatc tccccagacc tagtcctcga cagcttacag 300 ccctacaccc ccacccagtg gtgaattgta aggtgactga gtacaaagag ctagacccta 360 attatggtga ctgcccaaat acaaacgggg tgttcatcga tgaaaagggt agaaggctga 420 gtagccctcc attgggcatt tggaagataa gactggacta cagcgacctg gtaaatataa 480 acaaaccagc ccccgctagt aggaaaaact cttatcgagt cgagacctgc agtggggagc 540 tggctactgt aacaccagta cacgacagag tgcttgtaga agactgcagg gggctatacc 600 aatggaaacc caattgtgaa ggaatggtgc tctatgtgaa aacttgttct gattgggcag 660 atcaggtaga aaaccaggag aaggaaagcc ccccaaaacc tcagcgacca ccgaggcgag 720 acccacgaaa aggattacaa ccacaagtcc ccaaagagac tgaggtcaca gaaaagaaga 780 gacaacccag cgtcacctta gtatcggggg ggcagaaggc ccaagtcatc tacaagggca 840 agactaagaa taaaaagact ccggatggag tctataagta tccaggagcc agagaaggag 900 atgtagtaaa ggttaggaag atgctgaaga attggcatat agctgtagtg atgtacctga 960 tctatatcat aaccccgagc tttgccaagg ttcagtggtt cttaaaggat gaaaactcga 1020 cggggattaa ccagatactg tggcaaagac agatcaatag atccctgcat gga 1073 <210> 28 <211> 5050 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 28 cctctagtac cacaggcacc gatagacggg gcaactcgaa cctgagagag aggtaccgaa 60 ctcttaagtc ccgagtacgg ggcagacgtc accgagtagt acacccaacg accaccactc 120 ctaggtgtag ggtctactga ggctcgggtg gacgtgggcg tgcccaaaga gaaatcggtg 180 gtggacctgg gggccggggc caccatgctc ctttacgggg tagaccttac tgcttgatag 240 agtgccggcg gatgcctcgg gtaagagtat aaaatccgtt gtctattaat atggaaaaac 300 agatcgcata ttacttaaaa aaagaaaaac aaacaaacgg atggacggaa ctggtggtag 360 gagaaagtca tacaaaaata accacgctct ctggaaaaac ctatcgagga acttgggaaa 420 tggagaagcg gtcaaatcct tatggaacct atctccccag acctagtccc caacagctta 480 cagccctaca cccccaccca gtggtgaatt gtaaggtgat cgaatacaag gagaaggacc 540 ctaattatgg cgattgccca aatacaaatg gggtgttcgt cgacgaaaaa ggcagaaggc 600 tgagtagccc tccattgggt atttggaaga taagattgga ctatagtgac ctggtgaaca 660 taaatagacc gacccccgct ggtgggaaaa actcttaccg agtcgagacc tgcagtgggg 720 agctggctac tgtaacactg gtacacaaaa gggtaattgt ggaagaccgt aggggattat 780 accagtggaa acccaactgt gatgggatgg tgctctatgt gaaaacttgt tctgattggg 840 cagaccaggt agaaaaacag gagaaggaaa gtcccccaaa acctcagcgg ccaccaaggc 900 gagatccccg aaaagggtta caaccacaag tccccaaaga gattgaggtt actgaaaaga 960 agagacaacc cagcgtcacc ctagtatctg gggggcagaa ggcccaagtc atctataaag 1020 gcaggactaa gaataaaagg accccggatg gggtctataa gtatccggga gccaaagaag 1080 gggatgtgac gaaggtcagg aagatgctaa agaattggca tatagccttg gtaatgtacc 1140 taatatatgt tataacccca ggtttcgcca aagtccagtg gttcttaaag gatgaaaact 1200 cgacggggat cagtcagata ctgtggcaaa gacagatcag cagatccctg catggagaat 1260 ggcctgatca gatctgccac ggcatgccaa atgaaactat tacggatgag gaattacgca 1320 gcctgggaat gatagataca agccccagaa caaactacac ctgttgccag ttgcaatatc 1380 acgagtggaa gaaacatggc tggtgtaact atccacaaaa acaagcttgg attaggagaa 1440 taacggcctt acaagccaac ctcaccggag cttatgaggg acccgagtgc gctgtcatct 1500 gtcgattcaa tggcagctat aacatcgtaa agcaggctag agatgaggta agtccgttga 1560 cagggtgcaa ggaagggcac cccttcctat tctctgacga aagatccgac acctcatgcc 1620 tgaggcctcc ttccactagc tgggtgagac cagtaaaaat ggacgaagca tcaatggccg 1680 atggctttgc ccatggggtt gacaaggcaa taatactaat cagaaaaggg gcatcaggaa 1740 tcatcaactt cctagacacc attggggggt ggctaccagt agctgaagca actataacac 1800 catattgtga aacttacacc gtgacaggga tgtatgtcca tgtgaagaat tgcctcccca 1860 aagggttacc taagcattca aaaataattt ccccaacaat gatatatctg ggggaaggtg 1920 acccggccca taatatccag catctgtttg gctcaggtat agcaaagtgg gttctagtct 1980 tactcggggt tctgggtgag tggtatggag aattggcctc tacaatatac ctgctactag 2040 agtatgagtc tgagtggttg gaacacgaaa gtctgatcac ggaaggattg attcctggca 2100 tcaatatcac aatagaactc ccagccagtc atacagtgcc tggttgggtg tgggtcgcag 2160 gccagtgggt atgcgtgaaa ccagactggt ggcctacaca gatttggatc gaaactgttg 2220 tggcggaggc ctggcatata ctaaaaatac tggcatcagc cctggtgaat atagtcactg 2280 catttgtgaa cctggaatta gtctacctgg tcataatact agttaaaata tcaaagggga 2340 acctgattgg cgctatacta tggtgcctat tgctgtcagg ggctgaaggc tcttgccaca 2400 aaagacaaga ctattacaat atccagctag ttgtcgaaga aaagacaggc gtagaaaaac 2460 gatctataat aggcaagtgg actgtgataa ccaaggaagg tagggaacca agattaatgg 2520 agcaaataaa catggtgtca aatgatagcc tgtcagagac ttactgctat aataggctaa 2580 ataccagcag ttggaggcgg caaccggcaa aacagagagg gtgtggtcaa actgtgccct 2640 attggcctgg tgacaatgtc ctagaggaac aatactatag cacaggttac tgggtgaacg 2700 caacaggcgg ttgtcagctg agggaaggcg tatggctatc aagaaagggc aatgtacagt 2760 gccagcgtaa cggctcatcc ttgatgctgc aattggcgat aaaagaagaa aacgacacta 2820 tggaaatacc atgtgacccg gtggaaacag aaagcatggg tccagttgca cagggcactt 2880 gtgtgtacag ctgggcattt gccccaaggg ggtggtacta taataggaaa gacggttact 2940 ggctccaata cataaagaaa aacgactacc agtactggac aaaaatgccc gctgcctcgt 3000 ccgccgcaac aatgtaccgc catttgctcc ccttactagt ggcctgcctg atgggcggca 3060 ggatatcggt gtggattgtg gcaatgctcc tgtctctaca ggtggaagcc agcgaagtgg 3120 gtactaagca actggctgtc actctaactc tgtggaaaat ggactggaca gagctgcttt 3180 tctatgttgt cataatgcta gctgttaagg aagaactcgt aaagaaaata gtgaccgcaa 3240 gccttgtggc cctaaaaaat agtccagtag ccttgagctt tcttattgtt ctcaggcttg 3300 tggggggcag tgaagcactc ccagtgggtc tactattaga aaagatgtgt atagaccaac 3360 cggagttcgg aacccctttc ctgatctacc tgtgggacaa ttggaagtgg actgtactag 3420 ttagcttctc tgcactgaat catgaaaaaa ctataaaact ggcaagaaaa ctgttattgg 3480 caacacatat aacagcactc acattgaccg gtctgagtga ttcaatcttt tatgtaatgc 3540 ttataacgac caacctactg ataaagacat tcatatattt attgggggct agcatgaatt 3600 gggttgagag agaaaaaagg aaattactag taaagaggag actaatatat aagaaagccg 3660 caatttgcaa tcaggatgag aatgaactgg agaataaatt taacaagata accgtaaata 3720 cggatttcac cccatgcaaa cttgaacttt tgcaactact cagggctttt ttagtctcat 3780 tatgtttttc ctattacaag cctctcttgt atgcagagac taccctaact gttatagtga 3840 ttggtgtaca agagtacaac gtagctatgg cccgcgggcg aagcgtggtt cacagattgc 3900 tagccatggc ctattacata tatggccgca tgcagggtga catgtttcag ctcgccacca 3960 tccagtgcct gttgtcgagt ccgaggaaag tcatgaagca catgatagaa aatccaactc 4020 tcaggaagct ctggcaaggc gaaacagaac tttttaacca gggtgtcagc cagtccaaaa 4080 tagtgaaccc aaagaagatt gggctagaag aattacataa gggtatgtgc ggtctcccaa 4140 ccgtagtcca aaacttggtc atatatgcaa agaagaatga ctctcttatc ttaggggagt 4200 tgggttaccc ccctggggac ctcactagtg atgggtggga aatattaggt cctggcagaa 4260 tcccaaagat taccaatgtc gagtctgcta aaatggactt actctccaaa ctcatgacct 4320 ttctggggat tgaaagctca agggtcccca ggactccagt ccacccaaca aggaaattac 4380 tgaagatagt aagaggcctg gaaactggat gggggtacac tcatgcaggg ggaataagca 4440 gcgcaaaaca tgtcacaggt gaaaaaaact tgatgaccca catggaaggc cggaagggca 4500 agtatatcct acaatcccaa gaacatggtg ctgacgaggt agaatatgga gtaaagactg 4560 atcaaaaagc acccgacaat gccctatgct actgctttaa ccctgaagcc acaaatataa 4620 aaggagaaac gggagccatg gtgttcatga agaagatagg aaaaaaatgg actctcgtaa 4680 catcagatgg taacaaggcc tattacaatg tgaacaacct gaaagggtgg tctggactac 4740 caataatgtt gcactctact ggggccatag tagggaggat aaagtcagca tattcagatg 4800 aaaatgactt ggtggaggaa cttattgact ctaggactat cagcaagagc aatgagacaa 4860 acctggacca tcttatcaag gaattggcag atatgcggag gggggagttt cgctcaatca 4920 cccttggaac gggagctggg aaaactacgg aactgcccag gcaatatctc acaacggtag 4980 gtgcccataa atctgtgttg gtcctagtcc ctttaaaagc acccgccgag agtgtctgtc 5040 gcttcatgag 5050 <210> 29 <211> 4664 <212> DNA <213> novel pestivirus <400> 29 gcgtgcccaa agagaaatcg gtggtggacc tgggggtcgg gtccaccatg cccctttagg 60 gggtagacct tactgcttga tagagtgccg gcggatgcct cgggtaagag tataaaatcc 120 gttgtctatt aacatggaaa agcagattgc atattactta aaaaaagaaa aacaaagaaa 180 tgggtggacg gaactggtag tgggagaaag ccatacgaaa ataaccacac tttctggaaa 240 gatctatcga ggtacatggg aaatggagaa acggtcgaat ccttacggaa cctatcttcc 300 tagacctagt cctcaacagc ttacagctct acacccccac ccagtggtga attgtaaggt 360 gaccgagtat aaggagctgg accctaatta tggtgattgc ccgaagacaa atggggtatt 420 catcgacgaa aagggtcgaa ggctgagcag ccctccattg ggaatttgga agataagact 480 ggactacagc gacctggtaa atataaacag accagctctc gctagtggaa aaaactctta 540 tcgagtcgag acctgcagtg gggaactggc tattgtaaca ccggtacacg atagggtact 600 tgtagaagac tacagggggc tataccaatg gaaacccaac tgtgaaggaa tggtgctcta 660 tgtgaaaact tgctctgact gggcagacca ggtggaaaaa caggaaagag aaaacccccc 720 aaaacctcag cgaccaccga ggcgagaccc acgaaaaggg ttacaaccgc aagtccctaa 780 agagactgag gtcactgaaa agaggagaca acccagcgtt accttagtat cggggggaca 840 gaaggcccaa gtcatctaca aaggcaagac taagaataaa aagactccgg atggagtcta 900 taagtatcca ggagccagag aaggggatgt ggtaaaggtt aggaagatgc tgaagaattg 960 gcatatagct gtagcaatgt tcctgattta tatcataacc ccaggctttg ccaaggttca 1020 gtggttctta aaggatgaga actcgacggg gatcaatcag atactgtggc gaagacaaat 1080 caatagatcc ctgcatggag aatggcccaa ccagatctgc catggtatgc cgaatgaaac 1140 catcacggat gaggaattac gtagtctggg aatgatagat acaagtccca gaacaaacta 1200 cacttgttgc cagttgcaat atcatgagtg gaagaaacat ggttggtgca actatccaca 1260 aaaacagact tggattagga gaataacggc cctacaggct aacctcaccg gaacttatga 1320 gggacctgag tgcgctgtca tctgtcgatt taacggcagc tataacatcg taaaacaggc 1380 cagagacgag gtgagcccac tgacagggtg taaggagggg caccctttcc tattttctgg 1440 tgcaagatcc gacacctcgt gtctgaggcc tccttccact agttgggtca gaccagtgaa 1500 gatggatgag gcatcaatgg ccgatggctt tgcccatggg gttgacaagg caataatact 1560 aattagaaaa ggagcatcag gaattattaa tttcctagac actattggga ggtggctacc 1620 agtagccgaa gcaactatag taccatattg tgaaacttac actgtgacag ggatgtatat 1680 ccatgtgaag aattgcctcc ccaaagggtt acctaagcat tcaaaaataa tttccccgac 1740 aatgatatac ctgggggaag gtgacccagc ccataacatc cagcacttat ttggctcagg 1800 tatagcaaag tgggtcctag tcttactcgg ggtcctgggt gagtggtatg gagaattggc 1860 ctctacaata tacctactac tggagtacgg gtctgagtgg ttggaacatg aaagcttgat 1920 tacagaaggg ttgatccctg gcattaatat cacagtagaa ctcccagcta gccaaacagt 1980 gcctggttgg gtgtgggtcg caggccagtg ggtatgtgtg aagccagact ggtggcctac 2040 tcagatttgg attgaaaccg tggtggcgga ggcctggcat atactaaaaa tactggcatc 2100 agcccttgtg aacatagtca ctgcatttgt aaacttggaa ttggtctacc tggtcataat 2160 attagtcaaa atatcaaagg ggaacctaat aggcgccata ttatggtgcc tattattgtc 2220 aggggctgaa ggctcatgcc acaaaagaca agactattac aatattcagt tagttgtcga 2280 agaaaaaaca ggtgtagaaa aacgatccat aatgggcaaa tggactgtaa taactaggga 2340 aggtcgggaa ccaagattaa tggagcaaat aaatatggtg ttcaacgata gcctgtcaga 2400 aacttactgc tataataggc taaacaccag tagttggggg cgacaaccgg caagacagag 2460 agggtgtggt cagactgtac cctattggcc tggtgacaat gtcctagaag aacaatacta 2520 tagcactggt tactgggtga acacaacagg cggttgccag ttgagagaag gagtgtggct 2580 atcaagaaaa ggcaacgtac agtgccagcg taatggctca tccttgatac tgcaattagc 2640 aataaaagaa gagaatgaca ctatggaaat accatgtgac ccggtggaaa cagaaagcat 2700 gggtccagtt gcacagggta cttgcgtata tagctgggca ttcgccccaa gagggtggta 2760 ttataatagg aaagacggtt attggcttca gtacataaag aaaaacgact accagtactg 2820 gacaaaaatg cctaccgcct cgtccgctgc aacaatgtac cgccatttgc ttcccttact 2880 ggtagcttgc ctcatgggcg gcaggatatc ggtgtggatt gtagcaatgc tcctatctct 2940 acaggtggaa gctagcgaag tgggtaccaa gcaactggct gtcacactaa ctctgtggaa 3000 aatggactgg acagaactac tcttttatat tgttataatg ctagccatca aggaagagct 3060 cataaagaaa atagtgactg caagcctagt agccttaaaa aatagtccag tggctttgag 3120 ttttcttatt gtactcaggc ttgtaggggg cagtgaagca ctcccagtag gtttactgct 3180 agaaaagatg tgtatagacc aaccggagtt tggaacccct ttcctgatct acctgtggga 3240 caattggaag tggactgtac tagtcagctt ctccgcactg aaccatgaaa aaactataaa 3300 actggcaaga aaactgctac tggccacgca tataacagcg ctcacattga ctggtctgag 3360 tgattcaatc ttctacatga tgcttataat gaccaaccta ctgataaaga cattcatata 3420 tctactgggg gccagcataa attgggtcga gaaagaaaaa agaaaattgc tggcgaagag 3480 gaaattaata tataagaaag ccgcgatttg caatcatgaa gagaatgaat tggagaataa 3540 atttaacagg ataactgtaa atgcggactt caccccatgc aaactcgaac ttctacaatt 3600 acttagggct tttttagtct ctttatgttt ttcctattat aagcctcttc tgtatgcaga 3660 gaccacccta actgttatag taattggcgt acaagagtac aatgtagcaa tggcccgtgg 3720 gcgaagtgtg gtccatagac tactagccat ggcctactac atatatggcc gcatacaggg 3780 tgaaatgttc caactcgcca ctatccagtg cctgttgtca agcccgagga aaattatgaa 3840 acacatgata gaaaatccaa ctcttaagaa gctctggcaa ggcgaaacag aactttttaa 3900 ccagggtgtc agccagtcca aaatagtgaa tccaaggaaa attgggctgg gggaattaca 3960 taagggcatg tgcggcctcc caactgtagt gcaaaatcta gtcatatatg caaagaagaa 4020 tgactctctc attttaggag agttgggtta cccccctggg gacctcacca gtgatgggtg 4080 ggaaatttta ggtcctggca gaatcccaaa aatcactaat gttgagtccg caaaaatgga 4140 cttactctcc aaactcatga ccttcttggg gattgaaagc tcaagagtcc ccagaacccc 4200 agtccactca acaagaaagt tattgaagat agtaagaggc ctcgaaactg gatgggggta 4260 cactcatgca ggaggaatca gtagcgcaaa acacgttaca ggtgagaaga acttgatgac 4320 ccacatggag ggtaggaagg gtaagtatat cctacaatcc caagaacatg gcgctgatga 4380 ggtagaatat ggggtgaaaa ctgaccaaaa agcacccgac aatgccttgt gctactgctt 4440 taaccctgaa gccacaaaca taaaaggtga aacgggagcc atggtgttca tgaagaagat 4500 aggaaaaaaa tggactcttg taacatcgga tggtaacaaa gcctattaca atgtaaacaa 4560 cttgaaaggg tggtctggac ttccaataat gttgcactcc accggggcca tagtagggag 4620 gattaagtca gcatattcgg atgaaaatga cttggtggag gaac 4664 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 30 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 31 caggaaacag ctatgac 17 <210> 32 <211> 211 <212> PRT <213> novel virus <400> 32 Ser Cys His Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Ser Ile Gln Leu Val Val Asp 1 5 10 15 Gly Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Val Gly Lys Trp Thr Val 20 25 30 Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Ser Met 35 40 45 Val Ser Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn 50 55 60 Thr Ser Ser Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln 65 70 75 80 Thr Val Pro Phe Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu 100 105 110 Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly 115 120 125 Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met 130 135 140 Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Thr 145 150 155 160 Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr 165 170 175 Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Val Lys Lys Asn Asp 180 185 190 Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Thr Thr Met 195 200 205 Tyr Arg His 210 <210> 33 <211> 681 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> baculo-adapted DNA <400> 33 cgcggatcca aatatgtcat gtcacaagcg tcaagactac tactctatcc aactggtggt 60 ggacggaaaa actggcgtgg aaaagcgttc tatcgtgggc aagtggacgg tcatcaccag 120 ggagggcaga gaaccgcgcc taatggagca aatttcgatg gtatctaacg actctctttc 180 agaaacctac tgctataacc gtctcaatac tagctcttgg ggtcgtcaac ctgcccgtca 240 gcgcggatgt gggcaaaccg tccccttctg gcctggtgac aacgtactcg aggaacagta 300 ctatagcacc ggatactggg ttaacgctac tggcggttgc caactacgcg agggagtttg 360 gttatctcgt aaggggaacg tgcaatgtca gcgtaatggc tcatcgctga tccttcaact 420 cgctattaaa gaggaaaacg acaccatgga aatcccgtgc gatccagtcg agactgaatc 480 aatgggcccc gttactcaag gcacgtgtgt gtacagctgg gctttcgccc ctaggggatg 540 gtactataac cgtaaggacg gctactggct tcaatacgtg aagaaaaacg attaccagta 600 ctggaccaaa atgcccactg catccagcgc gaccactatg taccgtcacc atcaccatca 660 ccatcactaa gaattctcga g 681 <210> 34 <211> 666 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificial DNA <400> 34 catatgtcgt gtcacaaacg ccaagattat tattctattc aactggtcgt ggatggtaaa 60 acgggtgtcg aaaaacgctc tatcgtcggt aaatggaccg tgattacgcg tgaaggccgc 120 gaaccgcgtc tgatggaaca gatcagtatg gtttccaacg atagcctgtc tgaaacctat 180 tgctacaacc gcctgaatac gagctcttgg ggtcgtcagc cggcacgtca acgcggctgt 240 ggtcagaccg tcccgttttg gccgggcgac aacgtgctgg aagaacaata ttacagtacc 300 ggttattggg tgaatgcaac gggcggttgc cagctgcgtg aaggcgtttg gctgtctcgt 360 aagggtaacg tccagtgtca acgcaatggc agttccctga ttctgcaact ggcgatcaaa 420 gaagaaaacg ataccatgga aatcccgtgc gacccggtcg aaaccgaatc aatgggcccg 480 gtgacccagg gcacgtgtgt ttattcgtgg gcattcgcac cgcgcggctg gtattacaac 540 cgtaaagatg gttattggct gcagtacgtg aagaaaaacg actatcaata ctggaccaaa 600 atgccgacgg catcatcggc taccacgatg taccgtcatc accatcacca tcaccattaa 660 ctcgag 666 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Q-pcr primer <400> 35 cgtgcccaaa gagaaatcgg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Q-pcr primer <400> 36 ccggcactct atcaagcagt 20

Claims (31)

  1. 페스티바이러스의 구성원인 단리된 바이러스로서,
    a) 상기 바이러스는 돼지에서 군 A-II 선천성 떨림의 원인 감염체이고,
    b) 상기 바이러스는
    외막 단백질 Erns를 코딩하는 유전자,
    외막 단백질 E2를 코딩하는 유전자, 및
    외막 단백질 E1을 코딩하는 유전자
    를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며,
    여기서 Erns 유전자는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖고/갖거나,
    E2 유전자는 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖고/갖거나,
    E1 유전자는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 것
    을 특징으로 하는 것인 단리된 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    Erns 유전자는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖고,
    E2 유전자는 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖고,
    E1 유전자는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 것
    을 특징으로 하는 것인 단리된 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항의 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
  4. 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 Erns 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, Erns 단백질을 코딩하는 유전자.
  5. 제4항의 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 Erns 단백질.
  6. 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, E2 단백질을 코딩하는 유전자.
  7. 제6항의 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 E2 단백질.
  8. 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 E1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, E1 단백질을 코딩하는 유전자.
  9. 제8항의 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 E1 단백질.
  10. 제4항의 Erns 유전자를 포함하며, 상기 Erns 유전자가 기능적 이종 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 것인 DNA 단편.
  11. 제6항의 E2 유전자를 포함하며, 상기 E2 유전자가 기능적 이종 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 것인 DNA 단편.
  12. 제8항의 E1 유전자를 포함하며, 상기 E1 유전자가 기능적 이종 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 것인 DNA 단편.
  13. 면역원성으로 유효한 양의 제1항 또는 제2항의 바이러스, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신.
  14. 면역원성으로 유효한 양의 제5항의 Erns 단백질, 또는
    면역원성으로 유효한 양의 제7항의 E2 단백질, 또는
    면역원성으로 유효한 양의 제9항의 E1 단백질, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신.
  15. 제10항의 DNA 단편, 또는
    제11항의 DNA 단편, 또는
    제12항의 DNA 단편, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신.
  16. 제13항에 있어서,
    적어도 하나의 다른 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스, 또는
    상기 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스의 적어도 하나의 다른 면역원성 성분, 또는 상기 다른 면역원성 성분을 코딩하는 유전적 물질
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  17. 제1항 또는 제2항의 바이러스, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 혼합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 군 A-II CT를 퇴치하기 위한 백신을 제조하는 방법으로서,
    상기 백신은
    면역원성으로 유효한 양의 제1항 또는 제2항의 바이러스, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항의 바이러스의 게놈과 특이적으로 반응성인 PCR 프라이머 세트
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 군 A-II 선천성 떨림 관련 돼지 페스티바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 키트.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
KR1020177019567A 2014-12-19 2015-12-18 페스티바이러스 KR102472939B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14199430 2014-12-19
EP14199430.1 2014-12-19
PCT/EP2015/080400 WO2016097245A1 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Pestivirus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170098871A KR20170098871A (ko) 2017-08-30
KR102472939B1 true KR102472939B1 (ko) 2022-11-30

Family

ID=52278411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177019567A KR102472939B1 (ko) 2014-12-19 2015-12-18 페스티바이러스

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10954491B2 (ko)
EP (1) EP3233890B1 (ko)
JP (1) JP6772137B2 (ko)
KR (1) KR102472939B1 (ko)
CN (1) CN107002047B (ko)
BR (1) BR112017012484B1 (ko)
CA (1) CA2968912A1 (ko)
DK (1) DK3233890T3 (ko)
ES (1) ES2717544T3 (ko)
MX (1) MX2017008096A (ko)
PL (1) PL3233890T3 (ko)
RU (1) RU2710041C2 (ko)
WO (1) WO2016097245A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140170180A1 (en) 2012-12-17 2014-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine parvovirus 5a, methods of use and vaccine
BR112017012484B1 (pt) * 2014-12-19 2024-02-06 Intervet International B.V Vacina para combater tremor congênito (ct) do grupo a-ii em porcos
US9920302B2 (en) * 2015-08-31 2018-03-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirus vaccines for congenital tremors
CN106929606A (zh) * 2017-04-14 2017-07-07 华南农业大学 一种检测鉴定非典型猪瘟病毒（appv）的pcr引物及检测方法与检测试剂盒
CN110041411B (zh) * 2018-01-15 2023-10-03 浙江海隆生物科技有限公司 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用
DE102018110208A1 (de) 2018-04-27 2019-10-31 Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Gentechnisch veränderte Pestiviren und deren Verwendung als Markerimpfstoff
CN110652584A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 西北民族大学 猪瘟弱毒株与猪口蹄疫(o型)灭活抗原二联苗
CN111690778B (zh) * 2020-07-16 2022-06-03 四川农业大学 一种appv病毒的pcr引物、探针及其鉴别方法
CN111733289B (zh) * 2020-07-16 2022-04-05 四川农业大学 用于检测appv、csfv、pcv3和ptv1的引物组、探针及方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744750C (en) * 2008-12-03 2018-10-09 Pfizer Inc. Bovine viral diarrhea virus with a modified erns protein
BR112017012484B1 (pt) * 2014-12-19 2024-02-06 Intervet International B.V Vacina para combater tremor congênito (ct) do grupo a-ii em porcos

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACTA VETERINARIA SCANDINAVICA. 2014.12.16., vol. 56, no. 1, page 82.
JOURNAL OF VIROLOGY. 2012, vol. 86, no. 20, pages 10999-11012.
VETERINARY MICROBIOLOGY. 2007, vol. 125, no. 1-2, pages 11-21.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3233890B1 (en) 2019-02-06
EP3233890A1 (en) 2017-10-25
CN107002047B (zh) 2022-02-08
RU2710041C2 (ru) 2019-12-24
WO2016097245A1 (en) 2016-06-23
US20170342387A1 (en) 2017-11-30
BR112017012484A2 (pt) 2018-02-27
JP2018500028A (ja) 2018-01-11
BR112017012484B1 (pt) 2024-02-06
ES2717544T3 (es) 2019-06-21
CN107002047A (zh) 2017-08-01
JP6772137B2 (ja) 2020-10-21
KR20170098871A (ko) 2017-08-30
RU2017125526A3 (ko) 2019-09-23
US10954491B2 (en) 2021-03-23
DK3233890T3 (en) 2019-04-15
CA2968912A1 (en) 2016-06-23
MX2017008096A (es) 2017-10-31
PL3233890T3 (pl) 2019-06-28
RU2017125526A (ru) 2019-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102472939B1 (ko) 페스티바이러스
US20110104178A1 (en) Novel avian astrovirus
JP6938155B2 (ja) ブタパルボウイルス
JP7046607B2 (ja) 先天性振戦に対するペスチウイルスワクチン
WO2020099293A1 (en) Novel porcine rotavirus
KR20190096965A (ko) 선천적 진전 a를 야기하는 신규한 페스티바이러스의 단리
CN109195624B (zh) Hev疫苗
RU2765658C9 (ru) Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а
RU2817872C2 (ru) Парвовирус свиней

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant