CN107002047A - 瘟病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型猪瘟病毒、病毒蛋白和基于病毒及其蛋白的疫苗。本发明还涉及包含所述病毒的基因的DNA片段，和基于所述病毒基因的DNA疫苗。此外，本发明涉及与新型病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。

Description

瘟病毒
本发明涉及新瘟病毒、所述病毒的蛋白和基于所述病毒及其蛋白的疫苗。本发明也涉及包含所述病毒的基因的DNA片段和基于所述病毒的基因的DNA疫苗。另外，本发明涉及可与所述新病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。
在最近的数十年中，观察到世界范围内猪肉消费的强烈增加。结果，观察到农场的数目和大小的增加，以便满足逐渐增大的市场需求。如从畜牧业已知的，一般而言，密集地生活在一起的大量动物易发已知疾病，以及在大规模商业畜牧时代之前几乎不曾知道或见到，或甚至未知的疾病。
从20世纪早期，Kinsley在Veterinary Medicine 1922;17中提到“舞蹈猪”以来，已知已经存在一种病原体等待鉴定的疾病。在接近一个世纪期间，已经出版了几篇文章，其中在不同名称下描述了相同症状，包括“颤抖猪疾病”、猪震颤、先天性肌痉挛(1)或先天性震颤(CT) (2)。该疾病将进一步称为CT。CT的症状是新生猪的头部和腿部的震颤，其严重性不同，但在睡眠期间不存在。这些震颤可通过激动和寒冷而加剧。它们持续数周至数月，随着猪长大而减少。尽管震动本身不直接引起死亡，但震颤可以妨碍仔猪发现奶头来吸吮。这可随后导致因饥饿而死亡。该疾病广泛传播，并在全世界的养猪场定期发生。
已知几种病况引起CT，并且目前这些病况分为两组：A组和B组。A组由具有可见组织病变的病例组成，而B组的病例不展现明显病变。基于CT的不同原因，A组进一步分为五个亚组。已知CT的A-I组病例由经典猪瘟(CSF)病毒引起。A-III组CT的原因是仅在Landrace品种中存在的遗传(性别连锁的)缺陷，而Saddleback品种的隐性遗传(常染色体连锁的)缺陷是A-IV型的原因。A-V组病例由三氯磷酸酯中毒(经常与有机磷处理的食物相关的中毒)引起(3, 4)。
A-II组病例一直是且仍然是最令人困惑的病例。怀疑它们由未知病原体引起。
尽管在过去A-II组CT与PCV感染有关(5)，但各种研究现在已表明相反的情况。例如，在具有CT的猪的神经元组织中不存在PCV(6)，而在非神经元组织中仅发现少量、不显著量的PCV(4)。总而言之，对于A-II组CT的原因，迄今尚无结论性证据。然而，有足够的理由相信A-II组CT是由病原体引起。大多数A-II组颤抖仔猪出生于已在近期被引入新环境中的小母猪(即受精和第一窝仔之间期间的母猪)的窝仔中。值得注意的是，在具有颤抖仔猪的第一窝仔之后，相同母猪的之后的窝仔几乎从来没有显示CT的迹象。这表明在母猪中发展某种免疫力，针对引起CT的病原体进行保护。大约40年前，Patterson等人(50)设法通过用临床受影响的猪的脊髓、脑和脾脏的乳液实验性感染怀孕母猪来诱导仔猪中的A-II组CT。
但如上所述，从来没有从CT仔猪和怀孕母猪中分离到感染病原体。
本发明的一个目的是，提供作为A-II组CT的病原体的新传染性病原体以及目的在于抗击所述疾病的疫苗。此外，本发明的一个目的是，提供检测和鉴定所述疾病相关的传染性病原体的方式。
为了最终检测和分离A-II组CT的病原体，在荷兰的8个不同农场，从2012年9月直至2014年初，获得了患有A-II组CT的猪的血清和在许多情况下，其它的生物材料。这8个农场具有CT-仔猪的历史(在一个特定农场的流行高峰期，通常在四窝仔中的一窝仔，发现仔猪患有CT)。
在荷兰的养猪场，在2012年初诊断有先天性震颤类型A-II的爆发。由小母猪生产的仔猪(头胎动物)受到主要影响，但经产母猪(higher parity sows)偶尔也受到影响。诊断基于临床观察，并且随后排除先天性震颤类型A-I、A-III、A-IV和A-V作为疾病的可能原因。临床上受影响的仔猪由于活动期间过度的肌肉收缩而显示不同等级的震颤。当睡觉时症状减轻。仔猪丧失是由受影响的动物无法自行进食而引起的间接影响，尤其是出生后的第一周期间。在组织学上，脑和脊髓的特征在于髓鞘形成不足。(然而，组织学异常并不总是在受影响的仔猪中看到。在文献中，髓鞘形成不足的程度也被描述为可变的)。如下进一步描述，不是所有受影响的猪都幸存下来。在幸存的那些中，随着猪长大，震颤减轻且最终消失。在2012年的前20周，在由小母猪生产总共231窝仔中，具有先天性震颤症状的总共48窝仔由小母猪生产。这等于由小母猪生产的所有窝仔的21％。在初始爆发后8周的感染高峰时，小母猪窝仔中的85％显示具有先天性震颤类型A-II的仔猪。直到断奶的仔猪丧失(仔猪死亡)百分比在受影响的窝仔中为26％，相比之下，未受影响的窝仔中为11％。在受影响的窝仔中，仔猪死亡的60％归因于先天性震颤。每窝出生的仔猪的总数不受影响。先天性震颤影响新生的雄性和雌性仔猪，并且窝内的流行率在<10% - 100%之间变化。
先天性震颤爆发的问题自2012年以来在该农场继续，并且在2013年和2014年获得受影响的仔猪(参见下文)。然而，发病率下降。
在2012年3月(6个样品，具有CT的症状的所有仔猪，其中可以排除非A-II原因)和2012年4月(5个样品，具有CT的症状的所有仔猪，其中可以排除非A-II原因)获得血浆样品。在11/11个样品中检测到暂时称为“Michael”(M)的新病毒。
在2012年7月从同一农场获得更多的血浆样品。分析来自由2只母猪和1只小母猪生产的仔猪的总共16个血清样品。这些仔猪无一显示先天性震颤。在1/16个样品中发现Michael 1。
在2013年1月诊断到该疾病的新爆发。获得四只新生初乳前仔猪用于尸检，都显示CT的症状，其中可以排除非A-II原因。该新病毒被命名为Michael 1A，因为尽管其源自同一农场，但在原始爆发和新临床问题的出现之间已经过去了很长时间。在4/4个仔猪中检测到新病毒Michael 1A。
再次在2013年3月诊断到该疾病的新爆发。获得三只新生初乳前仔猪用于尸检，都显示CT的症状，其中可以排除非A-II原因。该病毒被命名为Michael 1B (M 1B)。在3/3个样品中检测到新病毒Michael 1B。脑和脊髓显示脱髓鞘的体征(参见图2)。
在2014年1月诊断到该疾病的新爆发。获得四只新生初乳前仔猪，都显示CT的症状，其中可以排除非A-II原因。该病毒被命名为Michael 1C (M 1C)。在4/4个样品中检测到新病毒Michael 1C。在2014年2月进行额外3只仔猪的尸检，再次，所有3只仔猪均显示A-II组CT，并且在3/3个样品中检测到Michael。
对来自在2013年1月、2013年3月和2014年2月的爆发的仔猪进行死后检查。脑和脊髓显示脱髓鞘的体征。
使用获得自来自不具有先天性震颤类型A-II病史的农场的新生初乳前仔猪的总共7种血清，作为PCR和死后检查的阴性对照。所有血浆样品均为Michael病毒阴性，并且在这些仔猪中没有观察到病理学异常。
在荷兰的7个其它农场进行A-II组CT爆发的可比较分析。
分析CT-窝仔的样品，并且在取得初乳前材料(初次摄取初乳或母乳之前取得的材料)的100％的CT-仔猪中发现新型病毒。
根据本发明的新型病毒尚未正式分类，但目前病毒最好被称为“A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒”。该病毒也将在下面称为CTAPV。
分析病毒基因组的序列，并揭示新型病毒意外地与黄病毒科、更具体地与该科内的瘟病毒属具有一定、尽管相对较低的相似性水平。瘟病毒属的已知成员是经典猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和边界病病毒。
瘟病毒病毒粒子的直径为约50nm，呈球形且是包膜的，并且它们包含约12千碱基(kb)长的单链正义RNA。
新病毒的代表的全长DNA序列呈现在SEQ ID NO:19中。
新型病毒的遗传组织密切遵循已知瘟病毒的遗传组织(参见图1)。瘟病毒基因组编码单一多蛋白NH2-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH，其在翻译时和翻译后被加工成结构蛋白(“核心”蛋白(C)和蛋白Erns、E1和E2)和非结构(NS)蛋白二者。多蛋白的氨基末端部分被宿主细胞蛋白酶切割，并且其切割产物：核心和包膜(Erns、E1和E2)蛋白据信是瘟病毒颗粒(病毒粒子)的主要成分。
结构蛋白Erns，也称为E0或gp44/48，是有具有RNA酶活性的独特特性的包膜蛋白(12)。其以相对大的量从感染细胞分泌(13)。然而，甚至更大的量保持膜结合(14)。Erns的作用之一似乎是通过使用其RNA酶活性抑制干扰素反应，来干扰宿主免疫系统(15)。缺失Erns的病毒毒株变得减毒的事实进一步支持此毒力中的作用(16)。E1和E2，先前分别被称为gp33和gp55 (先前也混淆地称为E1)，是其它两种包膜糖蛋白。结构蛋白E2形成同源二聚体并且与E1形成异源二聚体(17, 18)。特别是E1和E2蛋白的异源二聚体对于瘟病毒进入其宿主是重要的，而Erns似乎不是病毒进入所需的(19, 20)。中和抗体主要靶向Erns和E2，且在较小的程度上靶向E1 (17, 21)。
编码由216个氨基酸组成的包膜蛋白Erns的基因发现于SEQ ID NO: 19的位置1258-1899，并且编码由211个氨基酸组成的包膜蛋白E2的基因发现于SEQ ID NO: 19的位置2479-3111。编码由193个氨基酸组成的包膜蛋白E1的基因发现于SEQ ID NO: 19的位置1900-2478。
编码包膜蛋白Erns的基因的DNA序列的实例描绘在SEQ ID NO: 1中。SEQ ID NO: 2代表Erns蛋白的氨基酸序列。
编码包膜蛋白E2的基因的DNA序列的实例描绘在SEQ ID NO: 3中。SEQ ID NO: 4代表E2蛋白的氨基酸序列。
编码包膜蛋白E1的基因的DNA序列的实例描绘在SEQ ID NO: 5中。SEQ ID NO: 6代表E1蛋白的氨基酸序列。
基于最大似然法、泊松校正模型和自举分析(500次重复)，使用所述新病毒的完整序列来制备系统发生树。
这些树使用程序MEGA、版本5使用标准设置制备(MEGA5: MolecularEvolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, EvolutionaryDistance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson,Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol.Evol. 28(10): 2731-2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121，2011年5月4日提前获得出版)。
基于新型瘟病毒的完整序列的系统发生树呈现在图3中。在结点中指定了百分比自举支持。距离条指示每个位点的核苷酸取代的数目。
从图3明显的是，尽管瘟病毒边界病病毒、驯鹿瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、叉角羚瘟病毒和Bungowannah病毒是相对密切相关的，但根据本发明的新型病毒与这些病毒中的每一种更遥远地相关。
在图4中，呈现系统发生树，其中比较根据本发明的病毒的10种不同的分离株。
可以看到，在同一农场、但经三年分离的分离株M1、M1A、M1B和M1C (SEQ ID NO:19、20、21、22)是彼此最密切相关的。来自其它农场的分离株显示有点大的变化。与M1组相比，M2、M4和M9 (SEQ ID NO:23、25、29)彼此更相关。对于M3、M6和M8 (SEQ ID NO:24、26、28)也是如此。不包括M7 (SEQ ID NO:27)。这表明分离株之间存在小遗传变化。对于RNA病毒预期如此，并且该观察与对于其它瘟病毒所见的一致。
SEQ ID NO:1、3和5分别显示编码根据本发明的病毒的Erns、E2和E1的基因的核苷酸序列的典型实例。
SEQ ID NO:2、4和6分别显示根据本发明的病毒的Erns、E2和E1蛋白的氨基酸序列的典型实例。
应该理解，对于这些蛋白，在A-II组先天性震颤相关病毒的各个代表之间可以存在天然变异。导致例如Erns、E2和E1氨基酸序列中的微小变化的遗传变异确实存在。首先，存在所谓的“第二和第三碱基中的摇摆”，从而解释了可能发生核苷酸变化，所述变化在它们编码的氨基酸序列中保持不被注意到：例如三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和TCC都编码亮氨酸。另外，根据本发明的新型猪瘟病毒的代表之间的微小变异可见于在氨基酸序列中。这些变异可以由全部序列中的一个或多个氨基酸差异，或由所述序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入、反转或添加而反映。已经描述了基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸取代，例如Neurath等人在“The Proteins”Academic Press New York (1979)中。相关的氨基酸之间的氨基酸置换或在进化中已经频繁发生的替换尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val (参见Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence andstructure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, 第5卷, 增刊3)。其它氨基酸取代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson开发了一种用于快速且灵敏的蛋白对比(Science 227, 1435-1441, 1985)并确定同源蛋白之间的功能相似性的方法。本发明的示例性实施方案的这样的氨基酸取代、以及具有缺失和/或插入的变异是在本发明范围内。
这解释了为什么Erns、E2和E1当从根据本发明的猪瘟病毒的不同代表分离时可能具有显著低于100%的同源性水平，同时仍然代表根据本发明的新型瘟病毒的Erns、E2和E1。
这清楚地反映在例如Becher, P.等人(49)中的对瘟病毒基因Npro的系统发生树中，其中显示高度相关的瘟病毒仍然具有显著不同的整体基因组核苷酸序列以及显著不同的Npro基因核苷酸序列。
因此，本发明的第一个实施方案涉及作为瘟病毒成员的分离的病毒，其中所述病毒的特征在于：
a)所述病毒是猪中的A-II组先天性震颤的病原体，且
b)所述病毒具有病毒基因组，其包含编码包膜蛋白Erns的基因、编码包膜蛋白E2的基因和编码包膜蛋白E1的基因，其中Erns基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平和/或E2基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平和/或E1基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
对于本发明的目的，同一性水平应理解为例如SEQ ID NO:1的序列与待确定其同一性水平的编码瘟病毒的Erns的对应区域之间的同一性百分比。
用于确定同一性水平的合适程序是NCBI的Basic Local Alignment Search Tool的核苷酸BLAST程序(blastn)，使用“比对2个或多个序列(Align two or moresequences)”选项和标准设置(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
对于本发明的目的，分离(的)是指：脱离所述病毒天然地相关的组织。分离的病毒的一个实例是存在于细胞培养物中的病毒。
该实施方案的一种优选形式涉及这样的病毒：其具有Erns基因，该基因与SEQ IDNO:1所示的Erns的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
该实施方案的另一种优选形式涉及这样的病毒：其具有E2基因，该基因与SEQ IDNO:3所示的E2基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
该实施方案的再另一种优选形式涉及这样的病毒：其具有E1基因，该基因与SEQID NO:5所示的E1基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
该实施方案的一种更优选形式涉及作为瘟病毒成员的分离的病毒，所述病毒的特征在于：
a)所述病毒是猪中的A-II组先天性震颤的病原体，且
b)所述病毒具有病毒基因组，其包含编码包膜蛋白Erns的基因、编码包膜蛋白E2的基因和编码包膜蛋白E1的基因，
其中Erns基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且E2基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且E1基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
表征根据本发明的病毒的另一种替代方式依赖于PCR测试，所述PCR测试使用对根据本发明的病毒的NS5B基因序列或5'UTR序列特异性的引物组。
各种引物的概述以及使用这些引物制备的PCR产物的大小呈现于表a和b中。
根据其对于病毒的NS5B区域的特异性，选择序列描绘于SEQ ID NO:7-8、SEQ IDNO:9-10、SEQ ID NO:11-12和SEQ ID NO:13-14的四种不同的引物组。
使用第一引物组(SEQ ID NO:7-8)、第二引物组(SEQ ID NO:9-10)以及与病毒的NS5B基因特异性反应的正向和反向引物的组合的PCR检测，分别使用以下的二引物对F1-R1、F2-R2、F1-R2和F2-R1。
引物组SEQ ID NO:11-12 (PAN-FW和PAN-REV)和SEQ ID NO:13-14 (PANdeg-FW和PANdeg-REV)也与NS5B特异性反应。设计了具有简并引物SEQ ID NO:13-14的集合，以增加发现具有稍微改变的RNA序列的CTAPV变体的机会。
使用引物组(SEQ ID NO:15-16)的PCR测试与病毒的5'UTR特异性反应，并使用两个引物F3-R3。
使用引物组(SEQ ID NO:17-18)的PCR测试也与病毒的5'UTR特异性反应，并使用两个引物F4-R4。
在实施例部分中更详细描述的测试是对cDNA的标准PCR测试。(不言而喻，由于病毒具有RNA基因组，病毒RNA首先在逆转录酶反应中转录成cDNA。cDNA用于PCR反应)。
如果使用上述的引物组表征病毒，可以说以下：如果例如F1-R1引物组的PCR产物的分析揭示大约156个碱基对的PCR产物或如果例如F2-R2引物组的PCR产物的分析揭示大约335个碱基对的PCR产物，这明确地证实，分析的病毒属于根据本发明的病毒。
仅仅作为一个实例：大约156个碱基对的PCR产物是具有156 + 10和156 - 10个碱基对之间的长度的PCR产物。大约335个碱基对的PCR产物是具有335 + 10和335 - 10个碱基对之间的长度的PCR产物。
因此，本发明的该实施方案的另一种形式涉及作为瘟病毒成员的分离的病毒，其特征在于：
a)所述病毒是猪中的A-II组先天性震颤的病原体，且
b)从病毒RNA基因组逆转录的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ IDNO:13和14所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物。
该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的病毒，其中从病毒RNA基因组逆转录的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/-10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:13和14所示的引物组反应以得到896+/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物。
该实施方案的一种更优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述病毒具有病毒基因组，其包含编码Erns的基因、编码E2的基因和编码E1的基因，其中Erns基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且E2基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且E2基因的核苷酸序列与如SEQID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且其中病毒基因组的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:13和14所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/-10个碱基对的PCR产物。
根据本发明的病毒可以呈活的、活减毒的或灭活的形式。
如上面所指出，现在已经表征编码所述病毒的Erns、E2和E1蛋白的基因的DNA序列。这些基因的鉴定是非常有用的，因为它们现在可以特别用作DNA-疫苗的基础，用于制备基于这些蛋白的亚单位疫苗或用于诊断目的，这将在下面广泛地解释。
因此，本发明的另一个实施方案涉及编码Erns蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的Erns基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
该实施方案的一种优选形式涉及这样的基因：其与如SEQ ID NO:1所示的Erns基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
本发明的再另一个实施方案涉及编码E2蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的E2基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
该实施方案的一种优选形式涉及这样的基因：其与如SEQ ID NO:3所示的E2基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
并且本发明的再另一个实施方案涉及编码E1蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的E1基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
该实施方案的一种优选形式涉及这样的基因：其与如SEQ ID NO:5所示的E1基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% (以该优先顺序)的同一性水平。
本发明的仍另一个实施方案涉及这样的Erns蛋白，其特征在于，该Erns蛋白由根据本发明的Erns基因编码。
根据本发明的病毒的此类Erns蛋白是非常合适的，因为它们尤其适合用于疫苗中，更具体地用于亚单位疫苗中，它们可以用于产生抗体，且它们使得诊断测试成为可能，如下面所解释。
该实施方案的一种优选形式涉及具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的Erns。
本发明的再另一个实施方案涉及E2蛋白，其特征在于，所述E2蛋白由编码根据本发明的E2基因编码。
根据本发明的病毒的此类E2是非常合适的，因为它们尤其适合用于疫苗中，更具体地用于亚单位疫苗中，它们可以用于产生抗体，且它们使得诊断测试成为可能，如下面所解释。
该实施方案的一种优选形式涉及具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的E2蛋白。
并且本发明的再另一个实施方案涉及E1蛋白，其特征在于，该E1蛋白由根据本发明的E1基因编码。
根据本发明的病毒的此类E1蛋白是非常合适的，因为它们尤其适合用于疫苗中，更具体地用于假颗粒和包含此类假颗粒的疫苗中，如下面所解释。
该实施方案的一种优选形式涉及具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的E1蛋白。
本发明的优点之一是，现在首次可能跟踪病毒感染的进程和分析所述新型病毒在怀疑被根据本发明的新型病毒感染的猪的不同器官和体液中的存在或不存在。
在实施例部分中描述了现在可以测试来自患有A-II组先天性震颤的猪的许多组织和器官的新型病毒的存在或不存在和量。
发现从患有A-II组先天性震颤的猪分离的血清、血浆、PBL、心脏、小肠和大肠、脑、胸脊髓、腰脊髓、肝、腹股沟淋巴结、肺、胆囊、膀胱、肾、扁桃体和脾脏含有新型病毒。
这有助于更好地洞察疾病的发展。
本发明的另一个优点是，现在可能用所述新病毒感染健康的猪和检查病毒感染的途径。在实施例中描述了出于该目的，如何从A-II组先天性震颤动物分离和纯化器官材料。随后，遵循Patterson应用的方法(通过各种施用途径(经口、经鼻、肌肉内、皮下)注射的10-20% (w/v)均质物)，将该材料注入健康的断奶仔猪中以研究体内病毒的复制。
本发明的再另一个优点是现在可能用新型病毒感染怀孕的小母猪，其目的是显示病毒能够在这些小母猪的仔猪中引起A-II组先天性震颤。这些实验的结果描述于实施例中。
此外，该材料已被用作接种/攻击测试中的攻击材料，如下文所述。
本发明的优点之一还在于，因为新型猪瘟病毒现在已经被分离，所述病毒和/或所述病毒的保护亚单位可以用作用于接种目的的起始原料。
仅仅作为实例：实施例部分尤其描述了制备包含杆状病毒-表达的E2蛋白的疫苗，施用全细胞疫苗和纯化的E2-疫苗以及随后用上述毒性攻击材料攻击。
因此，本发明的另一个实施方案涉及用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其中此类疫苗包含免疫原性有效量的根据本发明的病毒和药学上可接受的载体。
在这方面的抗击应当在广义上解释：认为抗击猪中的A-II组CT包括接种以防止疾病的体征以及接种以减少上述疾病的体征。
适合用在根据本发明的疫苗中的药学上可接受的载体的实例是无菌水、盐水、水性缓冲液诸如PBS等。另外，根据本发明的疫苗可以包含其它添加剂诸如佐剂、稳定剂、抗氧化剂和其它，如下所述。
根据本发明的疫苗尤其可以包含减毒的活的或灭活的形式的根据本发明的病毒。
减毒的活病毒疫苗，即包含活减毒形式的根据本发明的病毒的疫苗，具有胜过灭活疫苗的优点，因为它们最佳地模仿天然的感染途径。另外，它们的复制能力允许接种小量病毒；它们的数目将自动地增加，直到它达到触发免疫系统的水平。从此刻开始，免疫系统将被触发并最后消除病毒。
活减毒病毒是与分离自野外的病毒相比具有降低的毒力水平的病毒。与根据本发明的野生型瘟病毒引起的CT的症状相比，具有降低水平的毒力的病毒被认为是诱导针对A-II组CT的保护或至少减少CT症状的病毒。
因此，本发明的该实施方案的一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒呈活减毒形式。
减毒病毒可以以本领域已知的各种方式获得。它们可以例如如下得到：通过在诱变剂存在下培养根据本发明的病毒，随后选择显示出后代水平的下降和/或复制速度的下降的病毒。许多此类诱变剂是本领域已知的。
另一种经常使用的方法是在易感细胞系上连续体外传代。病毒随后适应了用于连续传代的细胞系，使得它们在再次作为疫苗转移至天然宿主时具有减毒的表现。
得到减毒病毒的再另一种方式是，使病毒在偏离它们的天然生境温度的温度下生长。温度敏感突变体(Ts-突变体)的选择方法是本领域众所周知的。此类方法包括通常在诱变剂存在下培养病毒，随后在次优温度和在最佳温度培养，在细胞层上滴定后代病毒，和视觉选择在最佳温度较慢生长的那些噬斑。此类小噬斑包含缓慢生长的和因此期望的活减毒病毒。
获得根据本发明的活减毒瘟病毒的替代方法涉及瘟病毒的基因组的有意修饰。该方法相对于如上所述的经典减毒技术具有优点，即减毒的性质是已知的。对于瘟病毒，已经描述了例如瘟病毒牛病毒性腹泻病毒和经典猪瘟病毒的许多活减毒病毒毒株，其中缺失或修饰E2基因、Erns基因或Npro基因。
具有Npro-缺失的活减毒瘟病毒、更具体地猪瘟病毒经典猪瘟病毒(CSFV)的实例具体地描述于美国专利US7572455和Mayer, D.等人(19)中。
具有Erns-修饰和Npro-缺失的活减毒瘟病毒、更具体地经典猪瘟病毒的实例具体地描述于美国专利US7572455中。
具有E2-基因中的修饰的活减毒瘟病毒、更具体地经典猪瘟病毒的实例具体地由Risatti, G.R.等人(22)和Risatti, G.R.等人(23)描述。
在饲养猪、反刍动物或绵羊的许多国家，瘟病毒感染一般来说是一个问题。目前，在瘟病毒引起经济损害的不同国家中，一般而言应用不同的处理瘟病毒感染的方法。一些国家使用冲洗方法(stamping-out methods)去除病毒，而其它国家优选接种方法。然而，这些不同方法并行使用的事实引起了问题。仅仅作为实例：例如猪瘟病毒不仅在养殖猪中循环，而且在野生动物诸如野公猪中循环，并且这些因此形成储库，病毒可以从储库涌进家畜动物。已经用经典疫苗接种的动物不能容易地与野外感染的牛进行区分，因为在两种情况下都将存在针对病毒的抗体。因此，瘟病毒抗体阳性动物是由于感染(在该情况下它们可携带病毒)还是由于接种而抗体阳性很大程度上是未知的。因此，将不允许此类动物运送至已为该瘟病毒选择冲洗方法的国家。
由于目前已经鉴定到引起A-II组CT的新型瘟病毒，所以这将来也可适用于该新型瘟病毒。
该问题可以通过使用所谓的标记或DIVA疫苗(DIVA =区分感染的动物与接种的动物)来解决。此类疫苗缺乏一种或多种免疫原性病毒蛋白或至少一种免疫原性表位，作为其结果，标记-接种的动物将不产生针对所有免疫原性病毒蛋白/表位的抗体。接种的动物和感染的动物之间的抗体-调色板(palette)的差异可以通过为此目的设计的诊断测试来证明。因此，此类测试可以区分接种的动物与感染的动物。
由于编码根据本发明的新型瘟病毒的Erns、Npro、E1和E2蛋白的基因现在是已知的，所以现在可以将如对于例如猪瘟病毒CSFV描述的已知的标记疫苗技术应用于新病毒。也适合作为标记疫苗的活减毒CSFV疫苗的实例例如由Van Gennip, H.G.P.等人(7)，Reimann,I.等人(8).，Beer, M.等人(9)，Wehrle, F.等人(10)，Dong, X.N.和Chen, Y.H.(11).和deSmit, A. J.等人(24)描述。在大多数情况下，报道了嵌合病毒，其中将E2或Erns基因交换为异源病毒毒株或另一瘟病毒的相应基因。
然而，活减毒病毒的应用的一个可能的缺点可能是，固有地剩余某一水平的毒力。这不是真实的缺点，只要毒力水平是可接受的即可，即只要疫苗至少阻止猪死亡即可。当然，活减毒疫苗的剩余毒力越低，接种在接种过程中/以后对重量增加的影响越小。
使用活减毒病毒的一种替代方案是使用非传染性病毒。在此类病毒中，必需基因缺失，并且在用于生长病毒的细胞系中得到反式互补。因此，后代病毒是这样的病毒，其尽管能够感染宿主细胞，但不能在该宿主细胞中复制。此类非传染性病毒密切模仿自然感染，并且同时病毒不能扩散。包含此类非传染性病毒的疫苗是非常安全的，此外其非常适合作为标记疫苗。已经对于例如猪瘟病毒CSFV 描述了此类疫苗，具体地由Widjojoatmodjo,M.N.等人(25)和Van Gennip, H.G.等人(26)描述。
与它们的活减毒相应物相比，灭活疫苗是固有地安全的，因为其没有残留剩余毒力。尽管事实上它们经常包含与活减毒疫苗相比稍微更高剂量的病毒，但是它们可以例如是已经患有其它疾病的猪中的疫苗的优选形式。在次优条件(诸如不完全营养物或次优圈舍)下饲养的猪也会受益于灭活疫苗。
因此，该实施方案的另一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒呈灭活形式。
对于根据本发明的新型猪瘟病毒，可以制备此类灭活的完整病毒疫苗。正如已知的猪瘟病毒疫苗的情况，所述生产基本上包括以下步骤：在易感的猪细胞上培养新型猪瘟病毒，收获所述病毒，灭活所述病毒，和将灭活的病毒与药学上可接受的载体混合。
标准的灭活方法是使用甲醛的经典处理。本领域众所周知用于灭活的其它方法是紫外辐射、γ-辐射、用二元乙烯亚胺、硫柳汞处理等。技术人员知道如何应用这些方法。优选地，用ß-丙内酯、戊二醛、乙烯亚胺或甲醛灭活病毒。不言而喻，在本发明中也包括其它将病毒灭活的方式。
如上面所指出，可以在细胞培养物中在易感的猪细胞或细胞系上培养根据本发明的病毒。
因此，本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的瘟病毒的细胞培养物。此细胞系的一个实例是SK6。
尽管根据本发明的完全灭活的猪瘟病毒和根据本发明的非传染性猪瘟病毒病毒为灭活的疫苗提供了良好的基础，但它们的生产可以是昂贵的，这尤其取决于使用的宿主细胞、基质和使用的细胞培养基的类型。
在瘟病毒的具体情况下，使用根据本发明的完全灭活病毒或非传染性猪瘟病毒病毒的有吸引力的替代方案是使用猪瘟病毒亚单位，特别是Erns和E2蛋白。
此类亚单位，特别是Erns和E2蛋白的表达是本领域已知的，并且对于在杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞中的猪瘟病毒CSFV，由Hulst, M.M.等人(27)、Bouma, A.等人(28)、VanRijn, P.A.等人(29)、Moorman, R.J.M.等人(30)、Donofrio, G.等人, (31)、Lutticken D.等人(32)和Floegel-Niesmann等人(33)广泛描述。
杆状病毒表达系统中Erns和E2的高产量表达例如描述于EP1049788中。
此外，杆状病毒表达系统和杆状病毒表达载体通常已经广泛地描述在教科书中，诸如由O'Reilly等人(34)和Murhammer (35)描述。
基于杆状病毒的表达系统也是商购可得的，例如从Invitrogen Corporation,1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008, USA。
基于杆状病毒的表达系统的一个替代方案是基于酵母的表达系统。酵母表达系统例如由Gellissen等人(36)描述。
Donofrio, G.等人(31)描述了BVDV E2在哺乳动物细胞系中的表达。
即用的表达系统尤其可商购得自Research Corp. Technologies, 5210 EastWilliams Circle, Suite 240, Tucson, AZ 85711-4410 USA。酵母和昆虫细胞表达系统例如还可商购得自Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto,California 94303-4607, USA。
如由Donofrio, G.等人(31)所述的基于哺乳动物细胞的表达系统中Erns和E2蛋白的表达，尽管非常合适，但与基于杆状病毒的表达系统相比时，最可能是使用起来更昂贵的。
因此，该实施方案的另一种形式涉及用于抗击猪中的Group A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据本发明的Erns和/或E2和/或E1蛋白和药学上可接受的载体。
更优选地，此类亚单位呈所谓的瘟病毒假颗粒的形式。
此类假颗粒基本上是包含Erns、E1和E2蛋白的病毒样颗粒。
然而，它们与野生型病毒的不同在于它们不包含整个瘟病毒基因组，并且因此它们不能在宿主中复制。因此，瘟病毒假颗粒在疫苗中使用前不必灭活，并且因此它们具有额外优点：它们固有地是安全的。
可以通过在合适的表达系统中表达Erns、E1和E2蛋白来获得瘟病毒假颗粒。瘟病毒假颗粒的实例和如何产生此类假颗粒尤其是描述于EP1454981和EP1170367中。
因此，再另一个实施方案涉及假颗粒，其特征在于它们包含根据本发明的Erns蛋白、根据本发明的E2蛋白和根据本发明的E1蛋白。
疫苗中假颗粒的量和施用途径是与灭活的完整病毒颗粒的量和施用途径相当的，因为在衣壳的免疫原性和相似性方面，它们与灭活的完整病毒颗粒相当。
通常，1-100µg新型猪瘟病毒假颗粒的量作为疫苗剂量是非常合适的。从成本的观点看，优选的量是在1-50µg假颗粒的范围内，更优选地在1-25µg的范围内。
根据本发明的疫苗，更具体地基于灭活的完整病毒，亚单位诸如Erns和E2蛋白或假颗粒的疫苗，优选地包含佐剂。本领域众所周知的常规佐剂是例如弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基二肽、Quill A(R)、矿物油例如Bayol(R)或Markol(R)、植物油和Carbopol(R) (一种同聚物)或Diluvac(R) Forte。所述疫苗也可包含所谓的“媒介物”。媒介物是所述多肽所附着，但没有与其共价结合的化合物。经常使用的媒介物化合物是例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、二氧化硅、高岭土和膨润土。
原则上，根据本发明的疫苗仅施用一次可以是足够的。但是，特别在灭活疫苗(它是完整病毒疫苗、亚单位疫苗或假颗粒疫苗)的情况下，优选地也施用第一次和可能的第二次加强接种。第一加强剂经常在第一次接种以后至少2周施用。加强接种的一个非常合适的时刻是第一次接种以后3-16周之间。第二加强剂(如果必要的话)经常在第一加强剂以后4-50之间周施用。
灭活的完整病毒、亚单位诸如Erns、E2和E1蛋白或假颗粒方法的一个替代方案是使用以猪为它们的宿主动物的活重组载体病毒，作为新型猪瘟病毒Erns、E2或E1基因的载体。
在以猪为它们的宿主动物的合适重组载体病毒中，几种载体病毒作为载体是特别合适的：假性狂犬病病毒(PRV)、猪腺病毒(PAV)、猪痘病毒(SPV)和经典猪瘟病毒(CSFV)。此外，痘苗病毒已被描述为合适的载体病毒。
此类重组载体病毒在疫苗中的应用具有以下另外优点：接种的动物同时变成针对载体病毒和根据本发明的新瘟病毒接种的。
伪狂犬病病毒(PRV)作为用于猪瘟病毒CSFV E2基因的活重组载体病毒的用途由van Zijl等人(38)和Peeters等人(39)描述，用于复制缺陷型PRV重组载体病毒。
作为用于猪瘟病毒CSFV E2基因的载体病毒的活重组猪腺病毒(PAV)载体病毒由Hammond等人(40, 41)描述。
作为用于猪瘟病毒CSFV E2基因的载体病毒的活重组猪痘病毒(SPV)载体病毒由Hahn等人(42)描述。
此外，痘苗病毒已由Ruemenapf等人(37)描述为合适的载体病毒，其描述了所有四种结构蛋白的表达，并且尤其描述了在用表达E2的痘苗病毒重组载体接种的猪中保护性免疫的诱导。
活减毒CSFV病毒作为活重组载体病毒也是非常合适的。仅仅作为一个实例；Mayer等人(19)描述了Npro基因已经被删除的活减毒CSFV。此类活减毒病毒尤其允许在Npro基因的删除位点处，插入编码Erns或E2基因的基因。因此，此类活重组CSFV病毒同样形成用于新型猪瘟病毒Erns或E2基因的非常合适载体病毒。
取决于病毒的减毒水平，此类活重组载体病毒的非常合适的量将在105 TCID50至5x109 TCID50的载体病毒/疫苗剂量的范围内。
可以在于哺乳动物细胞中有功能的任意合适异源启动子的控制下，进行新型猪瘟病毒Erns、E2或E1基因的表达(参见下文)。异源启动子是这样的启动子：其不是负责转录根据本发明的新型猪瘟病毒的野生型形式中的新型猪瘟病毒Erns、E2或E1基因的启动子。
因此，本发明的另一个实施方案涉及包含编码根据本发明的新型猪瘟病毒Erns、E2或E1基因的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因是在功能性异源启动子的控制下。
在哺乳动物细胞中有功能的启动子是这样的启动子：其能够在哺乳动物细胞中驱动位于所述启动子下游的基因的转录。
在哺乳动物细胞中有功能的合适启动子的实例包括经典启动子诸如CAG启动子(Niwa, H.等人, Gene 108: 193–199 (1991)、(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Seed, B.等人, Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. 等人, PNAS 90, 11478-11482,1993;Ulmer, J.B. 等人, Science 259, 1745-1748, 1993)、劳斯氏肉瘤病毒LTR (RSV,Gorman, C.M. 等人, PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan等人, 出处同上; Ulmer等人,出处同上)、MPSV LTR (Stacey等人, J. Virology 50, 725-732, 1984)、SV40立即早期启动子(Sprague J. 等人, J. Virology 45, 773,1983)、SV-40启动子(Berman, P.W. 等人, Science, 222, 524-527, 1983)、金属硫蛋白启动子(Brinster, R.L. 等人, Nature296, 39-42, 1982)、热激启动子(Voellmy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,4949-53, 1985)、Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等人, Nature 356,152-154, 1992)。调节序列还可以包括终止子和多腺苷酸化序列。可以使用的序列包括众所周知的牛生长激素多腺苷酸化序列、SV40多腺苷酸化序列、人巨细胞病毒(hCMV)终止子和多腺苷酸化序列。
因此，本发明还涉及活重组载体病毒，其包含在功能性启动子控制下的包含编码根据本发明的Erns和/或E2和/或E1蛋白的基因的DNA片段。
涉及疫苗的本发明实施方案的另一种形式涉及用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含活重组载体病毒和药学上可接受的载体，所述活重组载体病毒包含DNA片段，所述DNA片段包含在功能性启动子控制下编码根据本发明的Erns和/或E2和/或E1蛋白的基因。
不言而喻，活重组载体病毒应当表达免疫原性有效量的Erns和/或E2和/或E1和/或E。
使用灭活的完整病毒疫苗、假病毒疫苗或活重组载体病毒的接种的一个替代方案是使用DNA接种。
此DNA接种是基于DNA片段向宿主动物中的引入，所述DNA片段携带在合适启动子控制下的编码Erns、E2或E1蛋白的基因。一旦所述DNA被宿主的细胞摄入，编码Erns、E2或E1蛋白的基因被转录，且转录物在宿主的细胞中翻译成Erns、E2或E1蛋白。这接近地模仿猪瘟病毒的天然感染过程。
合适的启动子是在哺乳动物细胞中有功能的启动子，如上面所例举。
携带在合适启动子控制下的编码Erns、E2或E1蛋白的基因的DNA片段可以是例如质粒。该质粒可以呈圆形或直链形式。
猪的成功DNA接种的实例是针对经典猪瘟病毒的成功接种，如由Tian, D.Y.等人(45)、Sun, Y.等人(46)和Sun, Y.等人(47)描述。
猪的成功DNA接种的其它实例尤其是如在Gerdts等人(43)中描述的针对伪狂犬病(Aujeszky's disease)的成功接种。他们描述了这样的DNA疫苗：其中使用携带在人巨细胞病毒的主要立即早期启动子控制下的糖蛋白C的DNA片段。使用50µg DNA的量，以2周间隔进行4次接种。接种的动物形成血清抗体，所述血清抗体在免疫印迹中识别各自的抗原且表现出中和活性。
Gorres等人(44)给出了猪的成功DNA接种的另一个实例。他们描述了针对大范围流行的和经典的猪H1N1流感的猪的成功DNA接种。他们接种DNA疫苗的1次引发接种和在引发以后3和6周的2次同源加强，所述DNA疫苗包含在功能性启动子控制下的流感H1N1的HA基因。
由于根据本发明的新型瘟病毒的E2蛋白是最有免疫原性的蛋白，所以这是用于DNA疫苗中的优选蛋白。仍然，可能需要使用上述方法((45),(46),(47))或依赖于如(9)中所述的额外措施，以增强DNA疫苗的免疫原性。
因此，该实施方案的再另一种形式涉及用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含DNA片段和药学上可接受的载体，所述DNA片段包含在功能性启动子控制下的编码根据本发明的Erns、E2或E1蛋白的基因。
不言而喻，包含编码Erns、E2或E1蛋白的基因的DNA片段应当表达免疫原性有效量的Erns、E2或E1蛋白。
构成根据本发明的疫苗的“免疫原性有效量”的量取决于期望的作用和靶生物体，所述疫苗基于根据本发明的完整猪瘟病毒、根据本发明的假颗粒、活重组载体或根据本发明的DNA疫苗。
本文中使用的术语“免疫原性有效量”是指在猪中诱导免疫应答所必需的CTAPV、假颗粒、活重组载体或DNA疫苗的量，所述免疫应答达到相对于未免疫的猪中野生型A-II组CT瘟病毒感染造成的病理学作用，减轻由野生型A-II组CT瘟病毒感染造成的病理学作用的程度。
确定治疗是否是“免疫原性有效的”完全在技术人员的能力之内，例如，通过给接种的动物施用实验性攻击感染，并且接下来确定靶动物的疾病临床体征、血清学参数，或通过测量病原体的重新分离，随后将这些发现与在野外感染的猪中观察到的那些发现进行对比。
施用的病毒的量将取决于施用途径、佐剂的存在和施用时机。这在下面例举，并且此外，上面和下面引用的关于其它瘟病毒疫苗的疫苗文献提供了进一步指导。
将包含根据本发明的病毒的活疫苗的优选量表示为例如组织培养物感染剂量(TCID50)。例如，对于活病毒，可以有利地使用在10-109 TCID50/动物剂量之间的剂量范围，取决于病毒的剩余毒力。优选地使用102-106 TCID50之间的范围。
可以应用许多施用方式，都是本领域已知的。优选地通过注射(肌肉内或经由腹膜内途径)或口服将根据本发明的疫苗施用给动物。
可以根据标准接种实践，优化施用方案。在所有情况下，通过皮内注射器(IDAL)的施用是一种优选的施用方式。
如果疫苗包含根据本发明的灭活病毒或假颗粒，也可以将剂量表达为要施用的病毒颗粒的数目。与活病毒颗粒的施用相比，所述剂量经常稍高，因为活病毒颗粒在被免疫系统除去之前在靶动物中复制达到某种程度。对于基于灭活病毒的疫苗，在约104-109个颗粒范围内的病毒颗粒的量通常是合适的，取决于使用的佐剂。
如果疫苗包含亚单位，例如根据本发明的Erns、E2或E1蛋白，也可以微克蛋白来表达剂量。对于基于亚单位的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克蛋白之间的范围内，同样取决于使用的佐剂。
如果疫苗包含含有编码Erns、E2或E1蛋白的基因的DNA片段，将以微克DNA来表达剂量。对于基于亚单位的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克DNA之间的范围内，尤其取决于使用的表达质粒的效率。在许多情况下，每只动物20-50微克质粒之间的量对于有效的接种而言是足够的。
根据本发明的疫苗可以采取适合于在养猪场的环境中施用，并且匹配期望的应用途径和预期效应的任何形式。通过制备瘟病毒疫苗领域中的技术人员惯用的方式进行根据本发明的疫苗的制备。
当其易于疫苗施用时，口服途径是优选的。
对于口服施用，优选地将疫苗与用于口服施用的合适载体混合，所述合适载体即纤维素、食物或可代谢的物质诸如α-纤维素或植物或动物起源的不同油。
在实践中，针对许多不同病原性病毒或微生物给猪接种。
因此，由于实践和经济二者的原因，非常有吸引力的是，将根据本发明的猪疫苗与例如猪的病原性病毒或微生物的另外免疫原或编码所述病毒或微生物的免疫原的遗传信息组合。
因此，该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的疫苗，其中所述疫苗包含至少一种其它的猪病原性微生物或猪病原性病毒和/或所述猪病原性微生物或猪病原性病毒的至少一种其它的免疫原性组分和/或编码所述其它免疫原性组分的遗传物质。一种免疫原或免疫原性组分是在动物中诱导免疫应答的化合物。它可以是例如完整病毒或细菌、或所述病毒或细菌的蛋白或糖部分。
对猪而言病原性的最常见病原性病毒和微生物是猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒、猪细环病毒(Porcine TorqueTeno virus)、假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌(Escherichia coli)、猪丹毒丝菌(Erysipelo rhusiopathiae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。
因此，本发明的一种更优选形式涉及根据本发明的疫苗，其中猪病原性的病毒或微生物选自猪痢疾短螺旋体、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒、猪细环病毒、假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌、猪丹毒丝菌、支气管炎博德特氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副猪嗜血菌、多杀巴斯德氏菌、猪链球菌、猪肺炎支原体和胸膜炎肺炎放线杆菌。
又另一个实施方案涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，其中所述方法包括将根据本发明的病毒和/或根据本发明的Erns蛋白和/或根据本发明的E2蛋白和/或根据本发明的E1蛋白和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的活重组载体病毒和/或根据本发明的假颗粒和药学上可接受的载体混合。
本发明的再另一个实施方案涉及根据本发明的病毒和/或根据本发明的Erns蛋白和/或根据本发明的E2蛋白和/或根据本发明的E1蛋白和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的DNA片段和/或根据本发明的活重组载体病毒和/或根据本发明的假颗粒，其用于在猪中抗击A-II组CT的疫苗中。
如上所提及，A-II CT是频繁发现的，这意味着，重要的是，在第一临床体征变得显现之前，尽早知晓根据本发明的新型瘟病毒是否存在于农场或某个猪群中。因此，为了有效地保护免于疾病，根据本发明的新型瘟病毒的存在的快速且正确检测是重要的。
因此，本发明的另一个目的是，提供适合用于检测根据本发明的新型瘟病毒的诊断工具。
这些工具部分地依赖于针对病毒的抗体的可用性。此类抗体可以例如用在根据本发明的新型瘟病毒的诊断测试中。
可以如下快速地和容易地得到针对根据本发明的新型瘟病毒的抗体或包含抗体的抗血清：用根据本发明的病毒给例如猪、家禽或例如兔接种，随后在约4周以后，抽血，离心凝固的血液，并倾析血清。此类方法是本领域众所周知的。
用于制备针对根据本发明的新型瘟病毒产生的抗体的其它方法也是本领域众所周知的，所述抗体可以是多克隆抗体、单特异性抗体或单克隆抗体(或其衍生物)。如果多克隆抗体是期望的，用于生产和加工多克隆血清的技术是数十年来本领域众所周知的，参见例如Mayer和Walter (35)。
通过也是本领域长期已知的技术(参见例如Kohler和Milstein (36))，通过免疫近交小鼠，可以制备可与根据本发明的病毒反应的单克隆抗体。
因此，本发明的另一个实施方案涉及可与根据本发明的病毒反应的抗体或抗血清。
基于检测CTAPV的诊断测试试剂盒可以例如包含标准的ELISA测试。在此测试的一个实例中，用针对该病毒的抗体包被ELISA板的孔的壁。与待测试的材料一起孵育以后，将可与该病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果待测试的材料确实包含根据本发明的新型瘟病毒，该病毒将结合包被至ELISA的孔的抗体。随后加入孔中的可与该病毒反应的标记的抗体又会结合该病毒，并且然后显色反应揭示该病毒的抗原材料的存在。
因此，本发明的又另一个实施方案涉及用于检测A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的诊断测试试剂盒，其包含可与根据本发明的病毒或可与其抗原材料反应的抗体。应当在广义上解释所述病毒的抗原材料。它可以是例如分解形式的病毒，或包含病毒外膜蛋白的病毒包膜材料。只要所述病毒的材料与针对该病毒产生的抗血清反应，那么所述材料被视作抗原材料。
基于检测血清中可与A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒反应的抗体的诊断测试试剂盒，也可以例如包含标准的ELISA测试。在此测试中，可以例如用根据本发明的病毒或其抗原材料包被ELISA板的孔的壁。与待测试的材料(例如疑似被根据本发明的新型瘟病毒感染的动物的血清)一起孵育以后，将可与根据本发明的病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果根据本发明的抗新型瘟病毒抗体存在于测试的血清中，这些抗体将结合包被至ELISA的孔的病毒。结果，以后加入的可与该病毒反应的标记的抗体不会结合，且不会发现显色反应。显色反应的缺乏因此揭示可与根据本发明的病毒反应的抗体的存在。
因此，本发明的又另一个实施方案涉及用于检测抗体的诊断测试试剂盒，所述抗体可与A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒反应，所述A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒包括根据本发明的病毒或其抗原材料。
免疫测定的设计可以变化。例如，所述免疫测定可以基于竞争反应或直接反应。此外，方案可以使用固体支持物，或可以使用多孔材料。抗体-抗原复合物的检测可以包括使用标记的抗体；所述标记可以是，例如，酶、荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。
除了上述的ELISA以外，用于检测可与样品中的根据本发明的病毒反应的抗体的合适方法包括免疫荧光测试(IFT)和蛋白质印迹分析。
用于诊断A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的存在或不存在的一种可选的、但是快速的和容易的诊断测试是如上所述的PCR测试，其包含可与根据本发明的新型瘟病毒的基因组特异性反应的PCR引物组。在该背景下，特别是指例如根据本发明的新型瘟病毒的基因组所特有的，即不是其它瘟病毒的基因组的。
不言而喻，可以使用比上述鉴定的引物更多的引物。本发明首次提供了根据本发明的新型瘟病毒的基因组的独特序列。这允许技术人员选择出其它选择性的引物，而无需任何另外努力。通过本发明提供的基因序列，根据本发明的新型瘟病毒的基因组与其它瘟病毒的已知基因组的简单计算机分析，技术人员能够开发用于诊断测试的其它特异性PCR-引物，所述诊断测试用于检测根据本发明的新型瘟病毒和/或将根据本发明的新型瘟病毒与其它病毒性(猪)病原体区分开。
与根据本发明的新型瘟病毒的基因组特异性地反应的PCR-引物被理解为这样的引物：其仅与根据本发明的新型瘟病毒的基因组反应，且不与另一种(猪)病原性病毒或一组(猪)病原性病毒的基因组反应。
因此，另一个实施方案涉及用于检测A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含可与根据本发明的新型瘟病毒的基因组特异性反应的PCR引物组。
该实施方案的一种优选形式涉及用于检测A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的诊断测试试剂盒，其中所述测试包含在SEQ ID NO:15-16中描绘的引物组。
通过实施例10中更详细描述的qRT-PCR测试提供了诊断测试的特殊形式。该测试非常适合于定量各种样品(诸如血清样品、精子样品和组织样品)中存在的病毒量。除了检测病毒RNA之外，此类测试允许此类样品中存在的RNA拷贝量的快速且可靠的定量。
在实施例10中，描述了如何分离RNA并进行RT-反应，然后使用寡核苷酸引物以扩增CTAPV基因组的5'UTR基因组。基于CTAPV变体1-9之间的保守核苷酸序列(基于核苷酸序列的比对)来选择病毒基因组的该部分。实施例10中使用的引物序列如下：CTAPV-PAN2-F3-B: CGTGCCCAAAGAGAAATCGG (SEQ ID NO:35)和CTAPV-PAN2-R3-B (SEQ ID NO:36):CCGGCACTCTATCAAGCAGT。
然而，技术人员将意识到，在CTAPV变体之间显示保守核苷酸序列的病毒基因组的任何部分可用于合适引物的选择。
实施例10显示根据本发明的qRT-PCR反应如何成功地用于检测例如公猪的精子中的病毒RNA。
在实施例11中使用该诊断技术显示，无CTAPV的小母猪可以通过CTAPV感染的公猪的精子变得被CTAPV感染。
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图注.
图1：CTAPV的RNA聚合酶基因(NS5B)中设计的引物和PCR产物的示意图。
图2：400x放大率的福尔马林固定和苏木精-伊红染色的脑和脊髓组织中最明显的异常。(A) 小脑的横截面，其显示浦肯野细胞的空泡化(颗粒层和白质之间的大细胞层)。白色箭头显示一些浦肯野细胞的空泡化的实例。(B) 白质的空泡化，其指示脱髓鞘化。脊髓中的轴突的脱髓鞘化的一些实例由白色箭头指示；(C) 小神经胶质细胞的积累(深紫色的染色)，其形成大脑中的退行性神经元(噬神经细胞作用)周围的小神经胶质细胞结节。神经元由白色箭头指示。(D) 胸部脊髓中的血管周围的围管(Perivascular cuffing)。嗜酸性粒细胞围绕由箭头指示的血管。
图3：CTAPV 1和其它先前鉴定的瘟病毒(其核苷酸序列保藏在Genbank(登录号在图中指示))的系统发生树。多蛋白的氨基酸序列用于最近邻法。左角的线条提供了核苷酸取代/位点的平均数。
图4：CTAPV变体的系统发生分析。氨基酸序列用于最近邻法。左角的线条提供了核苷酸取代/位点的平均数。基于基因组的前5000个核苷酸的分析。不包括CTAPV 7型。CTAPV5与CTAPV 8相同。
图5：CTAPV 1和1B的Erns-E1-E2区域的氨基酸序列比较。E2蛋白序列为斜体。Erns蛋白用粗线加下划线，且E1蛋白序列用细线加下划线。
图6：CTAPV 1B和8的Erns-E1-E2区域的氨基酸序列比较。E2蛋白序列为斜体。Erns蛋白用粗线加下划线，且E1蛋白序列用细线加下划线。
图7：兔中产生的抗体特异性识别在杆状病毒/ SF9表达系统中表达的CTAPV E2蛋白。标记物的条带对应(从底部至顶部)于5、10、20、25、37、50、75、100、150和250 kDa。
图8：Erns蛋白编码区(加粗下划线)、E1蛋白编码区(加细下划线)和E2蛋白编码区(斜体)的位置的指示。序列在参照基因组的nt 1259开始。
图9：标准线样品和阴性对照样品的RT-qPCR数据。图9A显示具有针对RFU绘制的Ct值与循环的图，图9B显示标准曲线；针对靶核酸的连续十倍(对数)稀释度的对数转化的浓度绘制的Ct值，且图9C显示实时的衍生解链曲线。
实施例：
实施例1：在荷兰的养猪场发现新病毒CTAPV 1。
在位于荷兰的养猪场，在2012年初诊断出先天性震颤类型A-II的爆发。由小母猪生产的仔猪(头胎动物)受到主要影响，但经产母猪偶尔也受到影响。诊断基于临床观察，并且随后排除先天性震颤类型A-I、A-III、A-IV和A-V作为疾病的可能原因。在临床上，受影响的仔猪由于活动期间过度的肌肉收缩而显示不同等级的震颤。当睡觉时症状减轻。仔猪丧失是由受影响的动物无法自行进食而引起的间接影响，尤其是出生后的第一周期间。在组织学上，脑和脊髓的特征在于髓鞘形成不足。如下进一步描述，不是所有受影响的猪都幸存下来。在幸存的那些中，随着猪长大，震颤减轻且最终消失。
基于爆发信息，猜测疾病的传染源。2012年的前20周，在由小母猪生产总共231窝仔中，具有先天性震颤症状的总共48窝仔由小母猪生产。这等于由小母猪生产的所有窝仔的21％。在初始爆发后8周的感染高峰时，小母猪窝仔中的85％显示具有先天性震颤类型A-II的仔猪。直到断奶的仔猪丧失(仔猪死亡)百分比在受影响的窝仔中为26％，相比之下，未受影响的窝仔中为11％。在受影响的窝仔中，仔猪死亡的60％归因于先天性震颤。每窝出生的仔猪的总数不受影响。先天性震颤影响两种性别，并且窝内的流行率在<10% - 100%之间变化。
在2012年爆发前，在2009年11月和2010年12月，在少数窝仔中观察到先天性震颤。
先天性震颤爆发的问题自2012年以来在该农场继续，并且在2013年和2014年获得受影响的仔猪(参见下文)。然而，发病率下降。
在2012年3月(6个样品，所有仔猪都具有A-II型CT症状)和2012年4月(5个样品，所有仔猪都具有A-II型CT症状)获得血浆样品。在11/11样品中检测到新病毒CTAPV 1。
在2012年7月从同一农场获得更多的血浆样品。分析来自由2只母猪和1只小母猪生产的仔猪的总共16个血清样品。这些仔猪无一显示先天性震颤。在1/16样品中发现CTAPV。
在2013年1月诊断到该疾病的新爆发。获得四只新生初乳前仔猪用于尸检，都显示A-II型CT。该病毒被命名为CTAPV 1A，因为其源自同一农场，但在原始爆发和新临床问题的出现之间已经过去了很长时间。在4/4仔猪中检测到新病毒CTAPV 1A。
在2013年3月诊断到该疾病的新爆发。获得三只新生初乳前仔猪用于尸检，都显示A-II型CT。该病毒被命名为CTAPV 1B。在3/3样品中检测到新病毒CTAPV 1。
在2014年1月诊断到该疾病的新爆发。获得四只新生初乳前仔猪(直肠拭子)，都显示A-II型CT。该病毒被命名为CTAPV 1C。在4/4样品中检测到新病毒CTAPV 1。在2014年2月进行额外3只仔猪的尸检，再次，所有3只仔猪均显示A-II型CT，并且在3/3样品中检测到CTAPV。
对来自在2013年1月、2013年3月和2014年2月的爆发的仔猪进行死后检查。脑和脊髓显示脱髓鞘的体征(参见实施例2)。
使用来自不具有先天性震颤类型A-II病史的农场的7只仔猪(6只分娩前，妊娠的最后一周；1只新生)作为PCR和死后检查的阴性对照。所有血浆样品均为CTAPV病毒阴性，并且在这些仔猪中没有观察到组织学异常。
血清和粪便样品的收集
在新生猪中具有A-II型CT的问题的荷兰农场获得粪便和血清样品。将血液收集在管(类型：Vacuolette 8 ml Sep Clot Activator参考号：455071)中，并且通过在4℃下以3000 x g离心20分钟来分离血清。使用干棉-拭子收集粪便，并放入含有2 ml磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)的无菌管中。然后，将具有粪便的棉拭子强烈搅拌并弃去。将血清和粪便样品储存在-70℃，直到分析。
具有任选的DNA酶处理的病毒RNA分离
对于病毒RNA分离，将QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)与无RNA酶的DNA酶试剂盒(Qiagen)组合使用。
简言之，制备载体-RNA/AVE于AVL缓冲液中的1％溶液。将560 µl AVL中的载体-RNA/AVE与140μl样品混合，并在室温下孵育10分钟。然后添加560μl乙醇(> 99％)，并将样品转移至QIAamp微型离心柱。将柱以6000 x g离心1分钟。通过添加250 µl AW1并以6000 xg将柱离心30秒来洗涤柱。通过将10μL DNA酶与70μl RDD缓冲液/样品混合来制备DNA酶-混合物。将80μl DNA酶-混合物在室温下在膜上孵育15分钟。通过如下继续洗涤：将250 µlAW1放在柱上并将其以6000 x g离心30秒，然后向柱添加500 µl AW2并以13000 x g离心3分钟。替换收集管，并将柱再离心一分钟。将离心柱转移至1.5 ml Eppendorf管中，其中将65 µl AVE缓冲液加在膜上，并以6000 x g离心1分钟。RNA样品立即进行逆转录酶反应。
逆转录酶反应
使用SuperScript® III第一链合成系统将RNA转录成cDNA，用于RT-PCR(Invitrogen)。遵循制造商的方案，但有一些微小修改。总起来说，将1 μl随机六聚体和1 µl 10mM dNTP与8 µl RNA混合。将其首先在65℃下孵育5分钟，然后在冰上冷却。然后将10 µl cDNA合成混合物(由2 µl 10x RT缓冲液、4 µl MgCL2、2 µl DTT、1 µl RNaseOUT和1 µlSuperscript®III RT组成)添加至样品。将样品首先在25℃下孵育10分钟，然后在50℃下孵育50分钟，随后在85℃下孵育5分钟，最后在冰上冷冻。向样品中添加1μl RNA酶H，并将其在37℃下孵育20分钟。将获得的cDNA样品储存在-20℃备用。
PCR
A. 引物组合CTAPV-PAN2-F1R1、-F2R1、-F1R2、-F2R2、表1、2
每个PCR反应含有27µl WFI、1 µl Super Taq Plus、5µl 10x Super Taq PCR缓冲液、5µl dNTPs、5µl正向引物和5μl反向引物。所用引物的概述描绘于表1中。用于检测CTAPV的PCR程序包含在95℃的4分钟初始化阶段。这随后为35个循环的依次在95℃下变性30秒，在引物对(参见表1)的适当退火温度下退火30秒和在72℃下延伸30秒。在72℃下的最终延伸维持10分钟。所有PCR产物都用1.5％琼脂糖-凝胶电泳分析。参见图1。
B. 引物组合CTAPV-PAN-FW-RV、PANdeg-FW-PANdeg-REV、表1、2
每个PCR反应含有27µl WFI、1 µl Super Taq Plus、5µl 10x Super Taq PCR缓冲液、5µl dNTPs、5µl正向引物和5μl反向引物。所用引物的概述描绘于表2中。用于检测CTAPV的PCR程序包含在95℃的4分钟初始化阶段。这随后为40个循环的依次在95℃下变性30秒，在引物对(参见表2)的适当退火温度下退火30秒和在72℃下延伸60秒。在72℃下的最终延伸维持10分钟。所有PCR产物都用1.5％琼脂糖-凝胶电泳分析。
C. 引物组合CTAPV-PAN2-F3R3、-F4R4、表1、2
每个PCR反应含有27µl WFI、1 µl Super Taq Plus、5µl 10x Super Taq PCR缓冲液、5µl dNTPs、5µl正向引物和5μl反向引物。所用引物的概述描绘于表1中。用于检测CTAPV的PCR程序包含在95℃的4分钟初始化阶段。这随后为35个循环的依次在95℃下变性30秒，在引物对(参见表1)的适当退火温度下退火30秒和在72℃下延伸30秒。在72℃下的最终延伸维持10分钟。所有PCR产物都用1.5％琼脂糖-凝胶电泳分析。
D. SYBR绿定量PCR
定量qPCR结果的标准线
为了获得qPCR的标准，根据制造商的说明书，将含有qPCR靶序列的CTAPV序列的155bpPCR产物克隆至TOPO4质粒载体(Life Technologies)中。通过用CTAPV-PAN2-F1和CTAPV-PAN2-R1引物进行PCR而获得用于克隆的155bp CTAPV PCR产物，参见表3。随后，将PCR-产物在1.5％琼脂糖-凝胶上电泳。切出155 bp条带，并从琼脂糖-凝胶提取DNA，然后克隆在TOPO4载体中。
使用TOPO TA Cloning®试剂盒(Invitrogen)，将PCR产物连接至pCR®4-TOPO4®载体中，并将其转化至One Shot® TOP10化学感受态大肠杆菌中。总起来说，将4 µl DNA与1μl盐溶液和1 µl TOPO载体混合。将该连接物在室温下孵育5分钟，并且然后置于冰上。将2μl连接混合物添加至One Shot® TOP10化学感受态大肠杆菌。在冰上孵育30分钟后，将混合物于30秒期间在42℃水浴中热休克，并放回冰上。此刻，添加250μl温的SOC培养基，并将混合物在37℃下在振荡培养箱中孵育1小时，其后将100μl混合物铺展在琼脂-LB + 100 μg/ml氨苄青霉素板上。将板在37℃培养箱中孵育过夜。
在标准PCR测定中，使用菌落PCR使用M13引物(参见下表3；(SEQ ID NO:30和31))、随后通过凝胶电泳，来鉴定正确克隆的菌落。使正确的菌落在具有氨苄青霉素的LBACF培养基(MSD AH Media 生产批号318781; Luria-Bertani培养基，不含动物组分)中生长，根据制造商的方案使用QIAGEN®质粒Midi试剂盒(Qiagen)从其中分离质粒DNA。为了检查突变，使用M13引物测序质粒DNA。
通过测量载体的质粒DNA浓度来计算靶序列的标准稀释度。下面描绘用于计算质粒拷贝数/μl的公式(公式1)。使用分光光度法测定DNA浓度(ng/µl)。A、G、T和C是质粒中同名核苷酸的计数。6,02*1023是阿伏加德罗数。通过乘以2将ssDNA浓度转换为dsDNA浓度，并且通过乘以109将克数转换为纳克数。对于qPCR反应，制备8个稀释液，其含有108-101拷贝数/2µl。
公式1：用于计算拷贝数/µl的公式。
qPCR
开发了基于SYBR绿的qPCR。每个反应含有10 µl KAPA SYBR Fast qPCR主混合物、0.4µl 10μM正向引物、0.4 µl 10μM反向引物、7.2 µl WFI和2 µl模板。使用引物CTAPV-PAN-F1和CTAPV-PAN-R1 (参见表4)。使用以下程序：在95℃下3分钟，随后39个循环的依次在95℃下10秒，在60℃下10秒，并在Biorad CFX系统中读板。使用Biorad CFX软件分析结果。将结果与如上所述的标准线进行比较；155 bp CTAPV产物的10倍稀释系列，克隆到TOPO4质粒中。65℃ --> 95℃的解链曲线分析；在qPCR程序中包括每0.5℃ 0.05秒。
通过扩增的PCR产物的凝胶电泳验证qPCR反应的特异性。通过CFX软件计算校准曲线斜率和y-截距。r2为>0.99。从斜率计算的PCR效率在95-105％之间。
核苷酸测序
根据文献中描述的方法进行Sanger测序。使用Sequencer 5.0和Clone Manager 9分析序列。
系统发生分析
进行系统发生分析以将CTAPV 1分类为瘟病毒。
基于邻接最大似然法、泊松校正模型和自举分析(500次重复)，将新型病毒的完整基因的氨基酸序列用于制备系统发生树。
这些树使用程序MEGA、版本5使用标准设置制备。(MEGA5: MolecularEvolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, EvolutionaryDistance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson,Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol.Evol. 28(10): 2731–2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121，2011年5月4日提前获得出版)。
实施例2：病毒CTAPV可见于器官和PBL中；指示脑和脊髓中的脱髓鞘的组织学
具有先天性震颤类型A-II的尸检的初乳前新生仔猪(CTAPV 1A/1B, 2013)的以下器官的PCR分析指示存在CTAPV病毒。
可以在血液、血清、血浆和PBL (外周血白细胞)、心脏、小肠、大肠、脑、胸脊髓、腰脊髓、肝、腹股沟淋巴结、肺、胆囊、膀胱、肾、扁桃体和脾中检测到CTAPV。在血清和扁桃体中检测到最高量。
相同的器官是来自没有A-II型CT病史的农场的生产前(妊娠最后一周)对照仔猪的样品。所有器官在PCR中都是阴性的。
将对照和CTAPV感染的仔猪的脑脊髓和脊髓进行尸检、福尔马林固定和苏木精-伊红染色。组织学检查揭示仅在CTAPV-感染的仔猪中的脱髓鞘的迹象(图2 A-D)。
来自不同地理位置的农场的CTAPV变体。
CTAPV变种2-9获自荷兰的养猪场，来自2013年及以后的爆发。
表5显示在每个农场测试的仔猪的数量和CTAPV PCR阳性仔猪(血清/直肠拭子)的数量。
表 5：来自荷兰的不同农场的CTAPV变体的概况。血清和/或直肠样品中CTAPV的PCR分析的结果
。
对于显示A-II型CT的仔猪，疾病相关性为100％。在具有先天性震颤II型的所有仔猪中都检测到CTAPV病毒，而在没有A-II型CT病史的农场采集的对照样品中则没有检测到。
在一只未显示先天性震颤的仔猪中发现CTAPV 1。该仔猪源自农场1，具有A-II型CT病史的农场。
在未显示先天性震颤的仔猪中发现CTAPV 4。在发现CTAPV 3相同的农场(农场3)发现了CTAPV 4。因此，CTAPV 4存在于具有A-II型CT病史的农场。
从8个不同地理位置发现了总共12种变体。
● 变体CTAPV 1、1A、1B、1C在不同时间点源自同一农场。
● 变体CTAPV 3和4源自同一农场。
● 尽管在不同地理位置发现，但CTAPV 5和8变体在核苷酸水平上是相同的
。
可以使用PCR引物对F3R3检测到所有变体。
可以使用PCR引物组合F1R1、F1R2、F2R1、F2R2之一检测到所有变体，然而，未测试变体CTAPV 9。
基因组测序
通过Sanger测序获得CTAPV 1的完整基因组序列。
在其它变体(CTAPV 1A、1B、1C、2、3、4、6、8和9)中，获得了包括Erns、E1和E2的编码序列的前5000 bp。
仅1073 nt的有限核苷酸序列可用于M7。
基于基因组测序，得出结论：CTAPV 5 = CTAPV 8。
实施例3：CTAPV和CTAPV变体的系统发生分析
CTAPV 1和其它已知瘟病毒的系统发生树呈现于图3中。在节点处指定百分比自举支持。距离条指示每个位点的核苷酸取代数。
本专利申请中描述的10种CTAPV变体的系统发生树呈现于图4中。在该分析中仅包括变体CTAPV 1、1A、1B、1C、2、3、4、6、8和9。该分析中包括核苷酸序列1- 5000 bp，其包括Erns、E1和E2的编码序列。
不包括CTAPV 7，因为仅1073 nt可用于M7。
不包括CTAPV 5，因为CTAPV 5 = CTAPV 8。
实施例4：预测的E2蛋白/核苷酸序列的分析显示CTAPV 1B E2蛋白= CTAPV 1 E2蛋白。与CTAPV 1相比，CTAPV 8蛋白显示14个氨基酸取代。
可充当感染实验的起始材料的尸检器官可用于CTAPV 1B，但对CTAPV 1不可用。我们分析了CTAPV 1和1B的Erns-E1-E2基因/蛋白的核苷酸和氨基酸序列。氨基酸序列是100％相同的(图5)。E2蛋白序列为斜体。Erns蛋白用粗线加下划线，E1蛋白序列用细线加下划线。
可充当感染实验的起始材料的尸检器官也可用于CTAPV 8。我们分析了CTAPV 1B和8的Erns-E1-2基因/蛋白的核苷酸和氨基酸序列(图6中的氨基酸比较)。氨基酸序列是95％相同的。E2蛋白序列为斜体。Erns蛋白用粗线加下划线，E1蛋白序列用细线加下划线。CTAPV8与CTAPV 1B相比具有14个氨基酸取代(93.3％同一性)，其中9个为阳性(阳性率为97.6％)。
实施例5：攻击材料的制备
攻击材料获得自受CTAPV 1B (2013)和CTAPV 8 (2014)影响的仔猪的尸检器官(现场材料)。尸检器官储存于-70℃备用。
CTAPV 1B
在均质化之前，合并受影响窝的3只仔猪的脑
在均质化之前，合并受影响窝的3只仔猪的脊髓
在均质化之前，合并受影响窝的3只仔猪的脾
在均质化之前，合并受影响窝的3只仔猪的扁桃体。
CTAPV 8
在均质化之前，合并受影响窝的4只仔猪的脑
在均质化之前，合并受影响窝的4只仔猪的脊髓
在均质化之前，合并受影响窝的4只仔猪的脾
在均质化之前，合并受影响窝的4只仔猪的扁桃体。
在解冻之后，称重合并的组织。随后，将9倍组织重量的PBS (CTAPV 1B)或具有10µM HEPES的M6B8培养基(Sigma H3375-250G, CTAPV 8)添加至组织材料。使用混合器将组织均质化，随后用小玻璃珠振荡5分钟。在均质化期间将器官-浆保持在冰上。将器官-浆以3200 x g离心1小时。
将上清液首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器。将过滤的均质物储存于-70℃备用。
实施例6：断奶龄的仔猪中的感染实验以获得感染性材料：
在商业成品猪品种的4至8周龄断奶龄的SPF/高健康仔猪中进行用源自现场分离株的CTAPV 1B和CTAPV 8器官均质物的攻击实验。
在置于测试设备中时，从动物获得CPDA(柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖腺嘌呤)血液样品、直肠拭子、口咽拭子和鼻拭子。将动物圈养于两个分开的实验室中：组A 8只动物和组B8只动物。在各室之间没有物理接触或经由动物看守者的间接接触。
在组A中，经由肌肉内(IM)、皮下(SC)、鼻内(N)和口服(OR)途径用CTAPV 1B均质物接种6只猪。
两只猪接受来自混合的脾+脊髓+脑均质物的接种物
两只猪接受来自混合的脾+扁桃体+脑均质物的接种物
两只猪接受来自混合的脑+脊髓均质物的接种物
两只猪充当接触哨兵(contact sentinels)。
IM、SC和N体积每剂量为1.0ml，左右。或者体积为4 ml。将鼻剂量喷雾。攻击剂量在表7中给出。
接种后，每天观察所有猪的临床体征，但动物在实验过程期间保持无症状。
在接种后第0天、第3天、第7天、第10天和第14天取CPDA-血、鼻拭子、口咽拭子和直肠拭子，以经由qPCR分析监测CTAPV 1B的感染和排泄。使用Leucosep®试剂盒(GreinerMat. 编号163 288)从CPDA血液获得血浆。对血浆样品的qPCR分析的结果呈现于表7中。
所有接种的动物在第10天显示血浆中的阳性CTAPV qPCR结果。基于病毒的排泄，将动物在不同时间点处死，以获得新鲜的感染材料用于随后的体外和体内研究。
在尸检时，从动物取出脑、脊髓、脾、扁桃体和血液。
在组B中，经由肌肉内(IM)、皮下(SC)、鼻内(N)和口服(OR)途径用CTAPV 8均质物接种6只猪。
两只猪接受来自脾+扁桃体+脑+脊髓均质物的接种物
两只猪接受来自脾+扁桃体均质物的接种物
两只猪接受来自脑+脊髓均质物的接种物
两只猪充当接触哨兵。
IM、SC和N体积每剂量为2.0 ml，左右。或者体积为3或4 ml。将鼻剂量喷雾。攻击剂量在表8中给出。
接种后，每天观察所有猪的临床体征，但动物在实验过程期间保持无症状。
在接种后第0天、第3天、第7天和第14天取CPDA-血、鼻拭子、口咽拭子和直肠拭子，以经由qPCR分析监测CTAPV-8的感染和排泄。使用Leucosep®试剂盒(Greiner Mat. 编号163 288)从CPDA血液获得血浆。对血浆样品的qPCR分析的结果呈现于表8中。
所有接种的动物在第3天和/或第7天显示血浆中的阳性CTAPV qPCR结果。基于病毒的排泄，将动物在不同时间点处死，以获得新鲜的感染材料用于随后的体外和体内研究。
在尸检时，从动物取出脑、脊髓、脾、扁桃体和血液。
如实施例8/9中所述，器官材料用作接种-攻击研究中的攻击材料。
实施例7：用于接种-攻击实验的攻击材料的制备
攻击材料获得自实施例6。
CTAPV 1B
实施例6，组A的1只尸检动物的脑、脊髓、脾和扁桃体。
CTAPV 8
实施例6，组B的1只尸检动物的脑、脊髓、脾和扁桃体。
在解冻之后，称重合并的组织。随后，将9倍组织重量的具有10µM HEPES的M6B8培养基(Sigma H3375-250G)添加至组织材料。使用混合器将组织均质化，随后用小玻璃珠振荡5分钟。在均质化期间将器官-浆保持在冰上。将器官-浆以3200 x g离心1小时。将上清液首先通过0.45μm过滤器，随后通过0.22μm过滤器，除了用于经口施用的材料。将过滤的均质物储存于-70℃备用。
实施例8：接种-攻击实验
疫苗设计：E2蛋白的表达：
分析CTAPV 1病毒的氨基酸序列。使用CTAPV病毒基因组与经典猪瘟病毒(CSF) E2蛋白(Genbank:AAS 20412.1)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E2蛋白(Genbank:AGN03787.1)的比对来确定E2基因的开始和停止，并使用SignalP4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)来确定E2蛋白的预测切割位点。
CTAPV 1 E2的预测氨基酸序列(SEQ ID NO:32)：
。
随后，使用Genscript OptimumGeneTM算法(www.genscript.com)优化用于在昆虫细胞中杆状病毒表达系统中表达CTAPV E2蛋白的CTAPV E2核苷酸序列(SEQ ID NO:33)。
限制性位点BamHI和EcoRI加下划线。起始密码子以斜体指示，且终止密码子以粗体指示。
转化和表达：
CTAPV的E2基因在Genscript合成，并使用BamHI和EcoRI限制性位点直接克隆在质粒载体(pFastbac1)中。使用标准转化技术将质粒转化至大肠杆菌中，随后纯化质粒DNA并用于转染SF9昆虫细胞。转染如下进行：
将2ml 5*105个细胞/ml的细胞悬浮液添加至6孔板的每个孔中。使细胞在27℃下附着至板上1小时。制备以下转染溶液(200μl不含抗生素的培养基、5 µl miniprep DNA和6μlcellfectin (Invitrogen))，并在室温下孵育45分钟。45分钟后，将0.8ml培养基添加至转染溶液中，并将其添加至附着的细胞。将转染的细胞在27℃下孵育4小时。5小时后，向细胞再添加1 ml培养基(补充有庆大霉素和纳他霉素)。使细胞在27℃下生长3天。将上清液作为P1病毒储备物储存在-70℃。
通过SDS-PAGE凝胶电泳检测SF9培养物中CTAPV E2蛋白的表达。用含有5％β-巯基乙醇的Bio-Rad Laemmli样品缓冲液将来自SF9培养物的样品1:1稀释，随后将样品加热至99℃持续10分钟。将所有样品和Precision Plus proteinTM All Blue (Bio-Rad)标记物上样至Bio-Rad CriterionTMTGXTM预制凝胶(任何kDTM)中，并在200V下电泳42分钟。所用的电泳缓冲液为1x Tris/甘氨酸/SDS。电泳后，将凝胶在InstantBlueTM (Expedeon)蛋白染色缓冲液中染色1小时。
纯化：
在SF9细胞中表达后，以两种不同的方式纯化E2蛋白。第一种纯化方法是通过制备全细胞裂解物。将表达CTAPV的E2的SF9培养物沉淀，重悬浮于PBS中，并使用Branson超声波仪进行超声处理(2次30次脉冲，输出5，占空比(duty cycle)55％)。超声处理后，将裂解物以8,000rpm离心10分钟。将含有过表达的E2的沉淀物重悬浮于PBS中。纯化E2蛋白的另一种方法是通过使用IMAC和阴离子去垢剂的纯化方法。该方法描述于BMC Biotechnology 2012,12:95. (BMC Biotechnology 2012, 12:95; Use of anionic denaturing detergentsto purify insoluble proteins after overexpression; Benjamin Schlager, AnnaStraessle and Ernst Hafen)。含有阴离子变性去垢剂(SDS)的裂解缓冲液用于裂解过表达的E2培养物。在亲和纯化之前，通过冷却和纯化除去过量的去垢剂。
如上所述在SF9细胞中表达并纯化的E2蛋白与已知蛋白浓度的牛血清白蛋白标准品一起在SDS-页凝胶上运行。通过使用Genetools软件(Syngene版本3.08.07)比较条带强度来估计蛋白浓度。
制剂
在基于矿物油的油包水乳液中配制最终疫苗。水:油重量比为45:55。乳液的液滴大小主要小于1μm，且粘度为约80 -150 mPa.sec。
疫苗1：水相由纯化的E2蛋白组成(估计的E2浓度60 µg/ml)
疫苗2：水相由全细胞裂解物组成(估计的E2浓度62 µg/ml)。
接种-加强剂
对于该实验，可得到48只5周龄的断奶龄仔猪。将每组3 x 8只动物圈养在猪厩1中，且将每组3 x 8只动物圈养在猪厩2中。在猪厩之间的动物之间的接触是不可能的。
每组8只动物，6只仔猪接受疫苗1的引发接种，其它2只仔猪在研究开始时未接种。
在t = 21天，每组6只接种的动物中的5只接受用疫苗2的加强接种。
在引发接种前，在感染后第21天且在加强接种前，且在第39天，在攻击前，收集血液样品。
在每组中，接受引发和加强接种的4只动物加上2只未接种的动物在攻击前移至攻击设施。
在每组中，将仅接受引发接种的1只动物和接受引发和加强接种的1只动物监测额外两周。
攻击
圈养用于该实验的36只动物，在猪厩3中，圈养每组3 x 6只动物，组1-3，并且在猪厩4中，圈养每组3 x 6只动物，组4-6。猪厩3中的动物源自猪厩1，而猪厩4中的动物源自猪厩2。
在猪厩之间的动物之间的接触是不可能的。在猪厩内的不同组的动物之间的物理接触是不可能的，但空气接触是可能的。
在引发接种后第39天，用活病毒材料攻击动物。
在猪厩3中，用CTAPV 1攻击材料攻击3x 6只仔猪(组1-3)(参见上文)。
组1：10.0 ml经口和2 x 2.0 ml经鼻
组2：2 x 1.0 ml IM
组3：2 x 1.0 ml IM。
在猪厩4中，用CTAPV 8攻击材料攻击3x 6只仔猪(组4-6)(参见上文)。
组1：10.0 ml经口和2 x 2.0 ml经鼻
组2：2 x 1.0 ml IM
组3：2 x 1.0 ml IM。
在攻击前和攻击后3、6、9、13、16、20、23和27天收集血清样品和鼻、直肠和口咽拭子，以经由qPCR分析监测CTAPV病毒的感染和排泄。将每组3只动物(两只接种，一只未接种)在攻击后第13天进行尸检，其它3只动物(两只接种，一只未接种)在攻击后第27天进行尸检。在尸检时取样腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结和扁桃体。
实施例9：CTAPV E2蛋白的抗体
大肠杆菌中E2蛋白的表达：
分析CTAPV 1病毒的氨基酸序列。使用CTAPV病毒基因组与经典猪瘟病毒(CSF) E2蛋白(Genbank:AAS 20412.1)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E2蛋白(Genbank:AGN03787.1)的比对来确定E2基因的开始和停止，并使用SignalP4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)来确定E2蛋白的预测切割位点。
CTAPV 1 E2的预测氨基酸序列(SEQ ID NO:32)：
。
用于在大肠杆菌中表达的蛋白序列(包括HIS-标签)
。
随后，使用Genscript OptimumGeneTM算法(www.genscript.com)优化用于在大肠杆菌中表达CTAPV E2蛋白的CTAPV E2核苷酸序列。
添加的限制性位点(粗体)是NdeI和XhoI。
转化和表达：
CTAPV的E2基因在Genscript合成，并使用NdeI和XhoI限制性位点直接克隆在质粒载体(pET22b)中。使用标准转化技术将质粒转化至大肠杆菌BL21star + pLysS中，并诱导表达。
通过使表达菌株在自诱导培养基中在37℃下生长18小时来实现表达。通过运行SDS-PAGE凝胶电泳来验证表达。
发现E2在不溶性级分中。通过应用使用IMAC和阴离子去垢剂的纯化方法来纯化E2蛋白。该方法描述于BMC Biotechnology 2012, 12:95. (BMC Biotechnology 2012, 12:95; Use of anionic denaturing detergents to purify insoluble proteins afteroverexpression; Benjamin Schlager, Anna Straessle and Ernst Hafen)。含有阴离子变性去垢剂(SDS)的裂解缓冲液用于裂解过表达的E2培养物。在亲和纯化之前，通过冷却和纯化除去过量的去垢剂。
如实施例8中所述，在SDS-page上检查纯化的蛋白。将纯化的蛋白配制在GNE中，并用于注射兔以产生抗体。水相中蛋白的估计浓度为0.5 mg/ml。
图7显示兔中产生的抗体(t =接种后4周的血清)特异性识别对应于杆状病毒/SF9表达系统中表达的CTAPV E2蛋白的约25kDa条带(泳道2)。泳道1含有标记，泳道3含有在杆状病毒/ SF9表达系统中的不相关表达产物。
实施例10：SYBR绿一步qRT-PCR
动物样品
从实验感染和对照猪收集猪血清和脾脏样品。收集血液(Vacuolette 8 ml Sep ClotActivator参考号：455071；Greiner Bio-one)中，并且通过在4℃下以3,000 x g离心20分钟来获得血清。精子样品获得自商业饲养公司，并且在没有预处理的情况下进行测试。
在冰上在PBS中制备10％组织均质物。用Gentle Macs Dissociator (MiltenyiBiotec)在Gentle Macs M管中进行均质化。然后将该均质化材料离心两次，首先以3,200 xg离心30分钟，然后以10,000 x g离心10分钟。随后进行DNA酶处理：将24µl 10x Turbo DNA酶缓冲液和20 µl Turbo DNA酶(AMbion)添加至250μl上清液，并将该混合物在37℃下孵育10分钟。
RNA提取
用Magnapure 96仪器(Roche)以外部裂解从这些样品提取RNA。该系统使用磁性玻璃颗粒技术纯化DNA、RNA和病毒核酸。将200 μl样品与250 µl magnapure总核酸分离试剂盒裂解/结合缓冲液混合，并使用外部裂解方案在Magnapure仪器中进行提取。RNA样品在-70℃保存，直至进一步使用。
SYBR绿一步qRT-PCR
特定引物设计
寡核苷酸引物用于扩增CTAPV基因组的5'UTR基因组。基于CTAPV变体1-9之间的保守核苷酸序列(基于核苷酸序列的比对)来选择病毒基因组的该部分。引物序列如下：CTAPV-PAN2-F3-B: CGTGCCCAAAGAGAAATCGG (SEQ ID NO:35)和CTAPV-PAN2-R3-B (SEQ ID NO:36): CCGGCACTCTATCAAGCAGT。
qRT-PCR方案
使用Superscript III Platinum SYBR绿一步qRT-PCR试剂盒(ThermoFisher)开发了基于SYBR绿的一步qRT-PCR。每个反应含有25 µl 2x SYBR绿反应混合物、1 µlSuperscript III RT/Platinum Taq混合物、1 µl 10 µM CTAPV-PAN2-F3-B引物、1 µl 10µM CTAPV-PAN2-R3-B引物、17 µl无RNA酶的水和5 µl RNA模板。所有反应都在BioRadCFX96上用以下循环参数进行；在55℃下RT反应3分钟，在95℃下预变性5分钟，然后40个循环的95℃持续15秒，60℃持续30秒，随后为60℃至95℃的解链曲线程序，0.5℃/5秒。
标准线产生
为了在SYBR绿一步qRT-PCR中定量检测到的RNA，构建含有可以计算其标准稀释度的q-PCR靶序列的标准线。合成来自CTAPV基因组的5'UTR部分(162-338)的177个碱基对长序列(Genscript)，并连接于pUC57载体中，其随后转染于大肠杆菌中。通过midiprep分离质粒DNA。
用于计算质粒拷贝数/µl的公式是：
质粒拷贝数/µl = DNA浓度(ng/ µl)/ (( A x 328,4 + G x 344,24 + T x 303,22 +C x 304,16 )/(6,02 x 1023)) x 2 x 109)。
质粒的DNA浓度为100 ng/µl。制备八种稀释液，其含有108至101拷贝/2μl。
结果
qRT-PCR的验证。
在实验中包括含有108至101拷贝/5μl的八种稀释液和阴性对照样品的标准线以验证qRT-PCR。图1A显示其中针对实时相对荧光单位绘制qPCR循环的图。一式两份测试各样品。在约100 RFU处的直线为截止线，在0 RFU处的直线为阴性对照样品。具有最大量模板的一式两份样品是显示约循环10 (108，随后在循环12的107，等)的初始荧光增加的样品。图1B由相同的实验数据制备，但此处将Log起始量标准曲线(o)针对定量循环进行绘制。标准线具有102％的效率和0.997的R2，这在特定和可定量qPCR的范围内，效率应当在95％和105％之间，R2必须高于0.990。图1C显示小图A和B中显示的样品的解链曲线。所有阳性样品显示相同的曲线和特定的熔点，这意味着扩增特定片段，并且片段在每个反应中是相同的。
这些数据显示，开发的qRT-PCR符合CTAPV的检测和定量的要求。随后将qRT-PCR用于可疑CTAPV阳性样品和对照样品的样品分析。数据的解释基于每个循环的RFU加上解链曲线的特征。异常的解链曲线将指示扩增子的非特异性。
血清、脾脏和精子样品中的CTAPV RNA的检测和定量。
对于CTAPV RNA存在，一式两份测试来自实验感染和对照小母猪的血清和脾脏。此外，测试精子样品。(平均)结果呈现于表9中。在进行的测定中，证实标准线在准确qPCR的质量范围内(图9B，参见上文)。此外，在所有这些样品的解链曲线中证实了CTAPV的特定熔点。基于这些数据，我们可以得出结论，qRT-PCR适用于检测和定量血清、脾脏和精子样品中的CTAPV RNA。
RNA拷贝数/5μl的列显示获得自200μl初始样品的5μl提取的RNA样品中的病毒拷贝数。
RNA拷贝数/mL的列显示初始样品(血清、精子)或10％均质物(脾脏)中病毒的拷贝数。
实施例11：CTAPV阳性精子感染小母猪和后代
动物
从SPF/高健康农场获得六只小母猪。使用来自CTAPV阳性公猪的精子用于小母猪的人工授精。
方法
从小母猪和后代收集血液(Vacuolette 5/8 ml Sep Clot Activator参考号：455071；Greiner Bio-one)中，并且通过在4℃下以3,000 x g离心20分钟来获得血清。在没有预处理的情况下测试精子样品。
如实施例10的部分“SYBR绿一步qRT-PCR”中所述进行RNA提取和qRT-PCR。
结果
在授精前，测试的小母猪是CTAPV血清阴性的(qRT-PCR)。如通过qRT-PCR分析，公猪精子是CTAPV阳性的。在授精后的t=+4周，小母猪4和5在血清中含有可检测水平的CTAPV。在产小猪当天，小母猪1、2和6在血清中含有可检测水平的CTAPV。6只小母猪中的5只生产在血清中具有可检测水平的CTAPV的仔猪(参见表10的结果)。仔猪是健康的，并且没有显示临床震颤或与先天性震颤类型AII相关的其它临床症状的其它临床症状(诸如外翻腿)的增加发生率。
实施例12：用获得自“颤抖仔猪”的CTAPV变体1B感染怀孕小母猪和对新生仔猪的影响：CTAPV阳性精子
动物
从SPF/高健康农场获得六只小母猪。经由用CTAPV阳性精子的人工授精将小母猪授精。使用超声波在妊娠第28天证实怀孕。所有小母猪在妊娠的第115天或第116天生产一窝仔猪。
感染
在用CTAPV1B接种物授精之后第32天感染小母猪中的三只，所述CTAPV1B接种物由在用CTAPV1B感染的材料感染后t = 11天时获得自尸检的猪371的脾脏和脑的器官均质物组成。该实验描述于实施例6 /表7中。如下制备均质物。向14克脾和8克脑中加入9倍组织重量的具有10µM HEPES (Sigma H3375-250G)的M6B8培养基(MSD AH)。使用混合器将组织均质化，随后用小玻璃珠振荡5分钟。在均质化和随后处理期间，将器官-浆保持在冰上。将器官-浆在4℃下以3200 x g离心1小时。将上清液通过0.22μm过滤器。将过滤的均质物储存于-70℃，直到使用。这三只小母猪接受5mL接种物的肌肉内注射(在左和右颈部各2.5 mL的两次注射)。
在尸检时，用获得自同一猪的血清的接种物感染其它三只小母猪。在注射前将血清过滤通过0.22μm过滤器。这三只小母猪接受5mL接种物的肌肉内注射(在左和右颈部各2.5 mL的两次注射)。
如实施例10中所述，通过qRT-PCR测定接种物中CTAPV的定量量。
血清收集
在感染小母猪之前和授精后t = 10天时，收集血清。在出生后数小时内也从新生仔猪收集血清。收集血液(Vacuolette 5/8 ml Sep Clot Activator参考号：455071；GreinerBio-one)中，并且通过在4℃下以3,000 x g离心20分钟来获得血清。如部分“SYBR绿一步qRT-PCR”，实施例10中所述进行RNA提取和qRT-PCR。
结果
用于感染前三只母猪的脾和脑的混合均匀物含有4.5E+02基因组拷贝/5μl提取的RNA。这等于2.3E+04基因组拷贝/mL 用于感染小母猪的均质物。
用于感染其它三只母猪的血清接种物含有1.2E+04基因组/5μl提取的RNA，其等于6.0E+05基因组/mL用于感染小母猪。
表11呈现如通过qRT-PCR结果确定的感染后第10天的定量量(每mL血清的基因组数)。六只小母猪中的五只生产具有重度先天性震颤类型A-II的仔猪。一只小母猪，在感染后t= 10天在血清中具有相对较少病毒数量的小母猪，生产了相对健康的窝仔，其中仅观察到2只具有轻度症状的仔猪。产小猪后评分的窝仔信息呈现于表11中。外翻腿的增加发生率与临床震颤相关，如由M. White所述。
通过实施例10中所述的qRT-PCR测试来测试每窝三只仔猪(具有严重临床震颤的那些，除了从没有临床震颤的小母猪44生产的那些仔猪)中的CTAPV的存在。CTAPV阳性仔猪的数量描绘于表11中。
实施例13：用获得自“颤抖仔猪”的CTAPV变体1B感染怀孕小母猪和对新生仔猪的影响：CTAPV阴性精子
动物
从SPF/高健康农场获得三只小母猪。经由人工授精对小母猪授精，并且在妊娠的第28天使用超声证实CTAPV阴性怀孕。所有小母猪在妊娠的第114天或第115天生产一窝仔猪。
感染
用在尸检时获得自猪371的血清的接种物感染三只小母猪(参见实施例12)。在注射前将血清过滤通过0.22μm过滤器。在妊娠32天，三只小母猪接受5mL接种物的肌肉内注射(在左和右颈部各2.5 mL的两次注射)。
如实施例10和12中所述，通过qRT-PCR测定接种物中CTAPV的定量量。
血清收集
在感染小母猪之前和授精后t = 10天时，收集血清。还在出生后数小时内，从新生仔猪收集血清。收集血液(Vacuolette 5/8 ml Sep Clot Activator参考号：455071；GreinerBio-one)中，并且通过在4℃下以3,000 x g离心20分钟来获得血清。如实施例10的“SYBR绿一步qRT-PCR”一节中所述进行RNA提取和qRT-PCR。
结果
表12呈现如通过qRT-PCR结果确定的感染后第10天的定量量(每mL血清的基因组数)。三只小母猪中的两只生产具有轻度先天性震颤类型A-II的仔猪。一只小母猪，在感染后t =10天在血清中具有相对较少病毒数量的小母猪，生产了健康窝仔。产小猪后评分的窝仔信息呈现于表11中。
通过实施例10中描述的qRT-PCR测试证实具有A-II型CT的仔猪中CTAPV的存在。CTAPV阳性仔猪的数量描绘于表12中。外翻腿的增加发生率与临床震颤相关。
序列表
<110> Intervet International B.V.
<120> 瘟病毒
<130> 23911
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 新型病毒
<400> 1
aaggttcagt ggttcttaaa ggacgaaaac tcgacgggga tcaatcagat cctgtggcaa 60
agacagatta acagaaccct gcatggagaa tggcctaacc agatctgcca tggcatgcca 120
aatgaaacta ttacagatga ggaattacgt agcctgggaa tgatagacac aagccccaga 180
acaaactaca cttgctgcca gttgcaatat catgaatgga agaaacatgg ttggtgcaac 240
tatccacaaa aacaggtctg gatcaggagg ataacggccc tacaagctaa cctcaccgga 300
gcctatgagg ggcctgagtg tgccgtcatt tgtagattta acggcagcta taacatcgta 360
aaacaagcca gagatgaggt gagtccactg acagggtgca aggaagggca cccttttcta 420
ttctctggtg aaagatccga cacctcatgc ctgaggcccc cttccactag ttgggtaaga 480
ccggtaaaaa tggacgaggc gtcattggct gatagcttcg cccatggggt tgacaaggca 540
ataatactaa tcagaaaagg ggcatcagga ataattaatt tcctagacac tattgggagg 600
tggctaccgg tagctgaggc agctatagta ccatattgtg aa 642
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 新型病毒
<400> 2
Lys Val Gln Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser Thr Gly Ile Asn Gln
1 5 10 15
Ile Leu Trp Gln Arg Gln Ile Asn Arg Thr Leu His Gly Glu Trp Pro
20 25 30
Asn Gln Ile Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr Ile Thr Asp Glu Glu
35 40 45
Leu Arg Ser Leu Gly Met Ile Asp Thr Ser Pro Arg Thr Asn Tyr Thr
50 55 60
Cys Cys Gln Leu Gln Tyr His Glu Trp Lys Lys His Gly Trp Cys Asn
65 70 75 80
Tyr Pro Gln Lys Gln Val Trp Ile Arg Arg Ile Thr Ala Leu Gln Ala
85 90 95
Asn Leu Thr Gly Ala Tyr Glu Gly Pro Glu Cys Ala Val Ile Cys Arg
100 105 110
Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala Arg Asp Glu Val Ser
115 120 125
Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe Leu Phe Ser Gly Glu
130 135 140
Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser Thr Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Leu Ala Asp Ser Phe Ala His Gly
165 170 175
Val Asp Lys Ala Ile Ile Leu Ile Arg Lys Gly Ala Ser Gly Ile Ile
180 185 190
Asn Phe Leu Asp Thr Ile Gly Arg Trp Leu Pro Val Ala Glu Ala Ala
195 200 205
Ile Val Pro Tyr Cys Glu
210
<210> 3
<211> 633
<212> DNA
<213> 新型病毒
<400> 3
tcgtgccaca agagacaaga ctattacagt atccagctag tcgttgacgg aaaaacgggc 60
gtagaaaaac gatctatagt gggcaagtgg acagtgataa ctagggaagg tcgggaacca 120
agattaatgg agcaaataag catggtgtca aatgatagct tatcagaaac ttactgctac 180
aataggctaa atactagcag ttgggggcga caaccggcaa gacagagagg gtgtggtcaa 240
accgtaccct tttggcctgg tgacaatgtc ctggaagaac aatactatag cacaggttac 300
tgggtaaatg caacaggtgg ttgccagttg agagaaggcg tgtggctatc aagaaagggc 360
aatgtacagt gccagcgtaa cggctcatcc ttgatactgc aactggcgat aaaagaagag 420
aatgacacta tggaaatacc atgtgacccg gtggaaaccg aaagtatggg tccagttaca 480
cagggcactt gcgtgtacag ctgggcattc gccccaagag ggtggtatta caacaggaaa 540
gatggttatt ggctccagta cgtaaagaaa aacgactacc agtactggac gaaaatgccc 600
actgcttcat ccgccacaac gatgtaccgc cat 633
<210> 4
<211> 210
<212> PRT
<213> 新型病毒
<400> 4
Ser Cys His Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Ser Ile Gln Leu Val Val Asp
1 5 10 15
Gly Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Val Gly Lys Trp Thr Val
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Ser Met
35 40 45
Val Ser Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn
50 55 60
Thr Ser Ser Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln
65 70 75 80
Thr Val Pro Phe Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Thr
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Val Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Thr Thr Met
195 200 205
Tyr Arg
210
<210> 5
<211> 579
<212> DNA
<213> 新型病毒
<400> 5
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aagcattcaa agataatttc cccgacaata atatacttgg gggaaggtga cccagcccat 120
aatattcagc acttatttgg ctcaggtata gcaaagtggg tcttagtcct actcggggtt 180
ctgggtgagt ggtatggaga attggcctct acaatatact tactactaga gtatgggtct 240
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atagaactcc cagctagtca tactgtacct ggttgggtgt gggtcgcagg ccggtgggta 360
tgcgtgaaac cagattggtg gcccacacag atttggattg aaactatagt ggcagaggtc 420
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ctggaattgg tatacctggt cataatatta gtcaaaatat caaaggggaa cctgataggc 540
gctatattgt ggtgcctatt actgtcaggg gctgaaggc 579
<210> 6
<211> 193
<212> PRT
<213> 新型病毒
<400> 6
Thr Tyr Thr Val Thr Gly Met Tyr Val His Val Lys Asn Cys Leu Pro
1 5 10 15
Arg Gly Leu Pro Lys His Ser Lys Ile Ile Ser Pro Thr Ile Ile Tyr
20 25 30
Leu Gly Glu Gly Asp Pro Ala His Asn Ile Gln His Leu Phe Gly Ser
35 40 45
Gly Ile Ala Lys Trp Val Leu Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Glu Trp
50 55 60
Tyr Gly Glu Leu Ala Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser
65 70 75 80
Glu Trp Leu Glu His Glu Ser Leu Val Thr Glu Gly Leu Ile Pro Gly
85 90 95
Ile Asn Ile Thr Ile Glu Leu Pro Ala Ser His Thr Val Pro Gly Trp
100 105 110
Val Trp Val Ala Gly Arg Trp Val Cys Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro
115 120 125
Thr Gln Ile Trp Ile Glu Thr Ile Val Ala Glu Val Trp His Ile Leu
130 135 140
Lys Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Asn Ile Val Thr Ala Phe Val Asn
145 150 155 160
Leu Glu Leu Val Tyr Leu Val Ile Ile Leu Val Lys Ile Ser Lys Gly
165 170 175
Asn Leu Ile Gly Ala Ile Leu Trp Cys Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu
180 185 190
Gly
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gccatgatgg aggaagtg 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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gggcagrttt gtggattcag 20
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 引物
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ccgaatgcag ctarcagagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gaaacagcca tgccaaaaaa tgag 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
agtgggttcc aggggtagat cag 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gaaacagcca tgccmaaraa tgag 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
agtgggttcc aggrgtagat yag 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gagtacgggg cagacgtcac 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
catccgccgg cactctatca agcag 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
atgcataatg ctttgattgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gtgacgtctg ccccgtactc 20
<210> 19
<211> 11561
<212> DNA
<213> 新型瘟病毒
<400> 19
gcataatgct ttgattggct gcattatgta tgggacatcc taaattgttg tgagccctgt 60
ggtgagtggg ggaaaggggt taaccaggcc tctagtacca caggcaccaa cagacagggc 120
aactcgaacc tgagagagag gtaccgagct cttaagcccc gagtacgggg cagacgtcac 180
cgagtagtac acccaaagac caccacttct aggtgtaggg tctactgagg ctcgggtgga 240
cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gggcctgggg gtcggggcca ccatgcccct 300
ttatggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga tgcctcgggt aagagtataa 360
aatccgttgt ctattaacat ggaaaaacag attgcacatt acttaaaaaa agaaaaacaa 420
aggaatgggt ggacggaact ggtggtagga gaaagtcaca ctaaaataac tacgctttct 480
ggaaagacct atcgaggtac ttgggaaatg gagaaacggc caaatcctta cggaacctat 540
tttcccagac ctagtcccca gcagctcaca gccctacacc cccacccagt ggtaaattgc 600
aaggtgatag agtacaaggg gacggaccct aattatggtg attgcccaaa tacaaacggg 660
gtgttcatcg atgaaaaggg tagaaggttg agcagccctc cattaggtat ttggaagata 720
agattggact acagcgacct gataaatata aacagaccag tccccactag aggggaaaac 780
tcttatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctactg taatgctggt acacaatagg 840
gtacttgtgg aagactgtag ggggctatac caatggaaac ccaactgtga aggaattgtg 900
ctctatgtaa aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg aaaaacagga gaagggaagc 960
cccccaaaac cacaacggcc accaaggcga gacccacgaa aaggcttaca accacaagtc 1020
cccagagaaa ctgaggttac ggaaaagaag aggcaaccta gtgtcacctt agtagcaggg 1080
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ccgacaataa tatacttggg ggaaggtgac ccagcccata atattcagca cttatttggc 2040
tcaggtatag caaagtgggt cttagtccta ctcggggttc tgggtgagtg gtatggagaa 2100
ttggcctcta caatatactt actactagag tatgggtctg agtggttgga acatgaaagt 2160
ctggtcacgg aagggttgat ccctggcatc aatattacaa tagaactccc agctagtcat 2220
actgtacctg gttgggtgtg ggtcgcaggc cggtgggtat gcgtgaaacc agattggtgg 2280
cccacacaga tttggattga aactatagtg gcagaggtct ggcatatact aaaaatattg 2340
gcatcagccc tggtaaacat agtcactgca ttcgtaaacc tggaattggt atacctggtc 2400
ataatattag tcaaaatatc aaaggggaac ctgataggcg ctatattgtg gtgcctatta 2460
ctgtcagggg ctgaaggctc gtgccacaag agacaagact attacagtat ccagctagtc 2520
gttgacggaa aaacgggcgt agaaaaacga tctatagtgg gcaagtggac agtgataact 2580
agggaaggtc gggaaccaag attaatggag caaataagca tggtgtcaaa tgatagctta 2640
tcagaaactt actgctacaa taggctaaat actagcagtt gggggcgaca accggcaaga 2700
cagagagggt gtggtcaaac cgtacccttt tggcctggtg acaatgtcct ggaagaacaa 2760
tactatagca caggttactg ggtaaatgca acaggtggtt gccagttgag agaaggcgtg 2820
tggctatcaa gaaagggcaa tgtacagtgc cagcgtaacg gctcatcctt gatactgcaa 2880
ctggcgataa aagaagagaa tgacactatg gaaataccat gtgacccggt ggaaaccgaa 2940
agtatgggtc cagttacaca gggcacttgc gtgtacagct gggcattcgc cccaagaggg 3000
tggtattaca acaggaaaga tggttattgg ctccagtacg taaagaaaaa cgactaccag 3060
tactggacga aaatgcccac tgcttcatcc gccacaacga tgtaccgcca tttgctccct 3120
ttactggtgg cctgcctcat gggcggtaga atatcggtat ggattgtggc gatgctcctg 3180
tctttacagg tggaagctag tgaagtaggt accaagcaac tggctgtcac gctaactctg 3240
tggaaaatgg actggacaga attactcttc tatattgtta taatgctagc cgttaaggaa 3300
gaactcataa aaaaaatagt gactgcaagc cttgtggcct taaaaaatag tccagtagcc 3360
ttgagcttcc ttattgtact caggcttgtg gggggtagtg aggcactccc agtgggtttg 3420
ttattagaaa agatgtgcat agaccaaccg gagtttggaa cccctttcct gatctaccta 3480
tgggacaatt ggaagtggac tgtactagtc agcttctccg cactgaatca tgaaaaaact 3540
ataaaactgg caagaaaact gctgttggca acacacataa cagcgctcac attgactggt 3600
ctgagtgatt caatcttcta tatgatgctt ataatgacta atttattaat aaagacattc 3660
atatatctac tgggagccag tataaattgg gtcgagagag aaaaaaagaa gttgctagtg 3720
aagagaacac taatatataa gaaagccgcg atttgcagtc aagatggaaa tgaattggag 3780
aataaattta ataagataac tgtaaatgcg gatttcaccc catgtaaact tgaacttctg 3840
caactactca gggctttttt agtctctcta tgcttttcct attacaagcc tctcctgtat 3900
gcggaaacta ctctaaccgt aatagtaatt ggcgtacagg agtacaacgt agctatggct 3960
cgcgggcgaa gcgtggtcca tagactgcta gccatggcct actacatata cggccgtata 4020
cagggtgaca tgttccagct cgccactatc cagtgcctgt tgtcaagtcc taggaaaatt 4080
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tttaaccagg gtgtcagcca gtccaaaata gtgaatccaa agagtattgg gctggaagaa 4200
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atggacttac tctccaagct tatgaccttt ctgggggttg agagctcaag agtccccagg 4440
accccagtcc actcgacaag gaaattattg aagatagtga gaggcttaga aactggatgg 4500
ggatacaccc atgcaggggg gataagtagc gcaaaacacg tcacaggtga aaaaaacttg 4560
atgactcaca tggaaggcag gaagggaaag tatatcctac aatcccaaga acatggtgct 4620
gatgaggtag aatatggagt gaaaactgac caaaaagcac ccgacaatgc cttatgctac 4680
tgctttaacc ctgaagccac aaacataaaa ggagaaacgg gagccatggt gtttatgaag 4740
aagataggaa aaaaatggac tctcgtaaca tcagatggta acaaagccta ttataatgta 4800
aacaacctga aagggtggtc tggactaccg ataatgttgc actctaccgg ggctatagta 4860
gggaggatta agtcagcgta ttcagatgaa aacgacttgg tagaggaact tatcgactcc 4920
aggactatca gcaagagcaa tgaggcaaac ctggatcacc ttatcaagga attagcagat 4980
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ctgcccaggc aataccttac aacggtgggt gcccataaat cagtgttggt cctagtccct 5100
ttaaaagcac ctgctgaaag tgtctgtcgc ttcatgaggt ccaaataccc tactatcaac 5160
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acgtacggat tctgctgcca gctaaaccta gtccaactca aagaatggat atccaggtac 5280
tcaatggtgt tttttgatga ataccacaca gcaactccag aacaaatagc aataataagt 5340
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caggctcaag agtacggtat cttggaacaa gttaatataa cagagtactt catcataatg 6000
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gataaactaa aagatgtcaa cccacaagcc atttatgtcc tagctgaaga ggagagagcc 6300
acggaaatga tgggccttga gtttgaacaa gacccttctg acttacagga ctcagtagct 6360
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aacgaggaga aaaggacact gatactgaaa atgtttgtca aaaactttat agaccaggcg 7380
gcactagacg agttagacaa actggagcca gaaaaaataa tcctctcatt gttggagggt 7440
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agccaagtgg ccataggcaa agtcaagctg accgattact gtaatcaaaa aggaataata 8160
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agggacatta catgggagct gtacacaggc gggacgtgca ccgttaaggg gatatccctt 8340
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cttagcccct gttacttagt caacggaagg agaccatccc catttgacgt cgtggaaggt 8460
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gaagaaagat atactagcca tcttaaatta agtgactgga tcagtgaaaa tatttcggag 9060
ccacatagag tccaaattat gcttgatgga acggtgagag tcacaataaa agagggcaaa 9120
gtcaaacacc tatttggggt ctacagaatc gaaaactccc tggaagcaat gtttaaagag 9180
accatagctg accttcctgt agccacccaa ccgccccgag ggccaatcta cacggccaaa 9240
gagttggctc aagggaacat tgccccgatc caacccgcag caaactttta tggaatgata 9300
gaggggagag gtgatccaat gacggcattc gaagccttat cagtcctgcg gtcacaaaaa 9360
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gaggacgtag gacacgtcga tcagccgcag ttatcccgga tgaattatag catgacttac 10980
ttagggatct ggaaaccaaa gacgagccag cggttagttg aacaatgctg tcgactggcc 11040
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tactaagtgg gaagcgttca tttaattata accagtatct ggtaagtata agacttgtgt 11340
aaataaaaca tataactgaa aggggcaggt ggccgtacag gctggggcga tcgccgcacc 11400
cccccttcgc caggcgcctc aaccccatac accatggggt tgttgtaaat acttgaaaga 11460
atggagtaat acgggtaata aacttacagg ccagtattgc cccatttgct ttgtagtggt 11520
gacgacctgt ataggtctga tctagatgaa gcaagggggc c 11561
<210> 20
<211> 5048
<212> DNA
<213> 新型瘟病毒
<400> 20
gcataatgct ttgattggct gcattatgta tgggacatcc taaattgttg tgagccctgt 60
ggtgagtggg ggaaaggggt taaccaggcc tctagtacca caggcaccaa cagacagggc 120
aactcgaacc tgagagagag gtaccgagct cttaagcccc gagtacgggg cagacgtcac 180
cgagtagtac acccaaagac caccacttct aggtgtaggg tctactgagg ctcgggtgga 240
cgtgggcgtg cccaaagaga aatcggtggt gggcctgggg gtcggggcca ccatgcccct 300
ttatggggta gaccttactg cttgatagag tgccggcgga tgcctcgggt aagagtataa 360
aatccgttgt ctattaacat ggaaaaacag attgcacatt acttaaaaaa agaaaaacaa 420
aggaatgggt ggacggaact ggtggtagga gaaagtcaca ctaaaataac tacgctttct 480
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gtgttcatcg atgaaaaggg tagaaggttg agcagccctc cattaggtat ttggaagata 720
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tcttatcgag tcgagacctg cagtggggag ctggctactg taatgctggt acacaatagg 840
gtacttgtgg aagactgtag ggggctatac caatggaaac ccaactgtga aggaattgtg 900
ctctatgtaa aaacttgttc tgattgggca gatcaggtgg aaaaacagga gaagggaagc 960
cccccaaaac cacaacggcc accaaggcga gacccacgaa aaggcttaca accacaagtc 1020
cccagagaaa ctgaggttac agaaaagaag aggcaaccta gtgtcacctt agtagcaggg 1080
gggcagaagg cccaaatcat ctacaaaggc aggactaaaa ataaaaagac tccggatggg 1140
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ctgagtgatt caatcttcta tatgatgctt ataatgacta atttattaat aaagacattc 3660
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caactactca gggctttttt agtctctcta tgcttttcct attacaagcc tctcctgtat 3900
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cgcgggcgaa gcgtggtcca tagactgcta gccatggcct attacatata cggccgtata 4020
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agtgattggt gtacaagagt acaacgtagc tatggcccgc gggcgaagcg tggttcacag 3720
attgctagcc atggcctatt acatatatgg ccgcatgcag ggtgacatgt ttcagctcgc 3780
caccatccag tgcctgttgt cgagtccgag gaaagtcatg aagcacatga tagaaaatcc 3840
aactctcagg aagctctggc aaggcgaaac agaacttttt aaccagggtg tcagccagtc 3900
caaaatagtg aacccaaaga agattgggct agaagaatta cataagggta tgtgcggtct 3960
cccaaccgta gtccaaaact tggtcatata tgcaaagaag aatgactctc ttatcttagg 4020
ggagttgggt tacccccctg gggacctcac tagtgatggg tgggaaatat taggtcctgg 4080
cagaatccca aagattacca atgtcgagtc tgctaaaatg gacttactct ccaaactcat 4140
gacctttctg gggattgaaa gctcaagggt ccccaggact ccagtccacc caacaaggaa 4200
attattgaag atagtaagag gcctggaaac tggatggggg tacactcatg cagggggaat 4260
aagcagcgca aaacatgtca caggtgaaaa aaacttgatg acccacatgg aaggccggaa 4320
gggcaagtat atcctacaat cccaagaaca tggtgctgac gaggtagaat atggagtaaa 4380
gactgatcaa aaagcacccg acaatgccct atgctactgc tttaaccctg aagccacaaa 4440
tataaaagga gaaacgggag ccatggtgtt catgaagaag ataggaaaaa aatggactct 4500
cgtaacatca gatggtaaca aggcctatta caatgtgaaa caa 4543
<210> 27
<211> 1073
<212> DNA
<213> 新型瘟病毒
<400> 27
ggcctggggg tcgggtccac catgcccctt tagggggtag accttactgc ttgatagagt 60
gccggcggat gcctcgggta agagtataaa atccgttgtt tgttaacatg gaaaaacaga 120
ttgtatatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa gaaatgggtg gacggaattg gtggtaggag 180
aaagccatac aaaaataacc acactctctg gaaagaccta tcgaggtact tgggaaatgg 240
agaaacggtc gaatccttac ggaacctatc tccccagacc tagtcctcga cagcttacag 300
ccctacaccc ccacccagtg gtgaattgta aggtgactga gtacaaagag ctagacccta 360
attatggtga ctgcccaaat acaaacgggg tgttcatcga tgaaaagggt agaaggctga 420
gtagccctcc attgggcatt tggaagataa gactggacta cagcgacctg gtaaatataa 480
acaaaccagc ccccgctagt aggaaaaact cttatcgagt cgagacctgc agtggggagc 540
tggctactgt aacaccagta cacgacagag tgcttgtaga agactgcagg gggctatacc 600
aatggaaacc caattgtgaa ggaatggtgc tctatgtgaa aacttgttct gattgggcag 660
atcaggtaga aaaccaggag aaggaaagcc ccccaaaacc tcagcgacca ccgaggcgag 720
acccacgaaa aggattacaa ccacaagtcc ccaaagagac tgaggtcaca gaaaagaaga 780
gacaacccag cgtcacctta gtatcggggg ggcagaaggc ccaagtcatc tacaagggca 840
agactaagaa taaaaagact ccggatggag tctataagta tccaggagcc agagaaggag 900
atgtagtaaa ggttaggaag atgctgaaga attggcatat agctgtagtg atgtacctga 960
tctatatcat aaccccgagc tttgccaagg ttcagtggtt cttaaaggat gaaaactcga 1020
cggggattaa ccagatactg tggcaaagac agatcaatag atccctgcat gga 1073
<210> 28
<211> 5050
<212> DNA
<213> 新型瘟病毒
<400> 28
cctctagtac cacaggcacc gatagacggg gcaactcgaa cctgagagag aggtaccgaa 60
ctcttaagtc ccgagtacgg ggcagacgtc accgagtagt acacccaacg accaccactc 120
ctaggtgtag ggtctactga ggctcgggtg gacgtgggcg tgcccaaaga gaaatcggtg 180
gtggacctgg gggccggggc caccatgctc ctttacgggg tagaccttac tgcttgatag 240
agtgccggcg gatgcctcgg gtaagagtat aaaatccgtt gtctattaat atggaaaaac 300
agatcgcata ttacttaaaa aaagaaaaac aaacaaacgg atggacggaa ctggtggtag 360
gagaaagtca tacaaaaata accacgctct ctggaaaaac ctatcgagga acttgggaaa 420
tggagaagcg gtcaaatcct tatggaacct atctccccag acctagtccc caacagctta 480
cagccctaca cccccaccca gtggtgaatt gtaaggtgat cgaatacaag gagaaggacc 540
ctaattatgg cgattgccca aatacaaatg gggtgttcgt cgacgaaaaa ggcagaaggc 600
tgagtagccc tccattgggt atttggaaga taagattgga ctatagtgac ctggtgaaca 660
taaatagacc gacccccgct ggtgggaaaa actcttaccg agtcgagacc tgcagtgggg 720
agctggctac tgtaacactg gtacacaaaa gggtaattgt ggaagaccgt aggggattat 780
accagtggaa acccaactgt gatgggatgg tgctctatgt gaaaacttgt tctgattggg 840
cagaccaggt agaaaaacag gagaaggaaa gtcccccaaa acctcagcgg ccaccaaggc 900
gagatccccg aaaagggtta caaccacaag tccccaaaga gattgaggtt actgaaaaga 960
agagacaacc cagcgtcacc ctagtatctg gggggcagaa ggcccaagtc atctataaag 1020
gcaggactaa gaataaaagg accccggatg gggtctataa gtatccggga gccaaagaag 1080
gggatgtgac gaaggtcagg aagatgctaa agaattggca tatagccttg gtaatgtacc 1140
taatatatgt tataacccca ggtttcgcca aagtccagtg gttcttaaag gatgaaaact 1200
cgacggggat cagtcagata ctgtggcaaa gacagatcag cagatccctg catggagaat 1260
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gcctgggaat gatagataca agccccagaa caaactacac ctgttgccag ttgcaatatc 1380
acgagtggaa gaaacatggc tggtgtaact atccacaaaa acaagcttgg attaggagaa 1440
taacggcctt acaagccaac ctcaccggag cttatgaggg acccgagtgc gctgtcatct 1500
gtcgattcaa tggcagctat aacatcgtaa agcaggctag agatgaggta agtccgttga 1560
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atggctttgc ccatggggtt gacaaggcaa taatactaat cagaaaaggg gcatcaggaa 1740
tcatcaactt cctagacacc attggggggt ggctaccagt agctgaagca actataacac 1800
catattgtga aacttacacc gtgacaggga tgtatgtcca tgtgaagaat tgcctcccca 1860
aagggttacc taagcattca aaaataattt ccccaacaat gatatatctg ggggaaggtg 1920
acccggccca taatatccag catctgtttg gctcaggtat agcaaagtgg gttctagtct 1980
tactcggggt tctgggtgag tggtatggag aattggcctc tacaatatac ctgctactag 2040
agtatgagtc tgagtggttg gaacacgaaa gtctgatcac ggaaggattg attcctggca 2100
tcaatatcac aatagaactc ccagccagtc atacagtgcc tggttgggtg tgggtcgcag 2160
gccagtgggt atgcgtgaaa ccagactggt ggcctacaca gatttggatc gaaactgttg 2220
tggcggaggc ctggcatata ctaaaaatac tggcatcagc cctggtgaat atagtcactg 2280
catttgtgaa cctggaatta gtctacctgg tcataatact agttaaaata tcaaagggga 2340
acctgattgg cgctatacta tggtgcctat tgctgtcagg ggctgaaggc tcttgccaca 2400
aaagacaaga ctattacaat atccagctag ttgtcgaaga aaagacaggc gtagaaaaac 2460
gatctataat aggcaagtgg actgtgataa ccaaggaagg tagggaacca agattaatgg 2520
agcaaataaa catggtgtca aatgatagcc tgtcagagac ttactgctat aataggctaa 2580
ataccagcag ttggaggcgg caaccggcaa aacagagagg gtgtggtcaa actgtgccct 2640
attggcctgg tgacaatgtc ctagaggaac aatactatag cacaggttac tgggtgaacg 2700
caacaggcgg ttgtcagctg agggaaggcg tatggctatc aagaaagggc aatgtacagt 2760
gccagcgtaa cggctcatcc ttgatgctgc aattggcgat aaaagaagaa aacgacacta 2820
tggaaatacc atgtgacccg gtggaaacag aaagcatggg tccagttgca cagggcactt 2880
gtgtgtacag ctgggcattt gccccaaggg ggtggtacta taataggaaa gacggttact 2940
ggctccaata cataaagaaa aacgactacc agtactggac aaaaatgccc gctgcctcgt 3000
ccgccgcaac aatgtaccgc catttgctcc ccttactagt ggcctgcctg atgggcggca 3060
ggatatcggt gtggattgtg gcaatgctcc tgtctctaca ggtggaagcc agcgaagtgg 3120
gtactaagca actggctgtc actctaactc tgtggaaaat ggactggaca gagctgcttt 3180
tctatgttgt cataatgcta gctgttaagg aagaactcgt aaagaaaata gtgaccgcaa 3240
gccttgtggc cctaaaaaat agtccagtag ccttgagctt tcttattgtt ctcaggcttg 3300
tggggggcag tgaagcactc ccagtgggtc tactattaga aaagatgtgt atagaccaac 3360
cggagttcgg aacccctttc ctgatctacc tgtgggacaa ttggaagtgg actgtactag 3420
ttagcttctc tgcactgaat catgaaaaaa ctataaaact ggcaagaaaa ctgttattgg 3480
caacacatat aacagcactc acattgaccg gtctgagtga ttcaatcttt tatgtaatgc 3540
ttataacgac caacctactg ataaagacat tcatatattt attgggggct agcatgaatt 3600
gggttgagag agaaaaaagg aaattactag taaagaggag actaatatat aagaaagccg 3660
caatttgcaa tcaggatgag aatgaactgg agaataaatt taacaagata accgtaaata 3720
cggatttcac cccatgcaaa cttgaacttt tgcaactact cagggctttt ttagtctcat 3780
tatgtttttc ctattacaag cctctcttgt atgcagagac taccctaact gttatagtga 3840
ttggtgtaca agagtacaac gtagctatgg cccgcgggcg aagcgtggtt cacagattgc 3900
tagccatggc ctattacata tatggccgca tgcagggtga catgtttcag ctcgccacca 3960
tccagtgcct gttgtcgagt ccgaggaaag tcatgaagca catgatagaa aatccaactc 4020
tcaggaagct ctggcaaggc gaaacagaac tttttaacca gggtgtcagc cagtccaaaa 4080
tagtgaaccc aaagaagatt gggctagaag aattacataa gggtatgtgc ggtctcccaa 4140
ccgtagtcca aaacttggtc atatatgcaa agaagaatga ctctcttatc ttaggggagt 4200
tgggttaccc ccctggggac ctcactagtg atgggtggga aatattaggt cctggcagaa 4260
tcccaaagat taccaatgtc gagtctgcta aaatggactt actctccaaa ctcatgacct 4320
ttctggggat tgaaagctca agggtcccca ggactccagt ccacccaaca aggaaattac 4380
tgaagatagt aagaggcctg gaaactggat gggggtacac tcatgcaggg ggaataagca 4440
gcgcaaaaca tgtcacaggt gaaaaaaact tgatgaccca catggaaggc cggaagggca 4500
agtatatcct acaatcccaa gaacatggtg ctgacgaggt agaatatgga gtaaagactg 4560
atcaaaaagc acccgacaat gccctatgct actgctttaa ccctgaagcc acaaatataa 4620
aaggagaaac gggagccatg gtgttcatga agaagatagg aaaaaaatgg actctcgtaa 4680
catcagatgg taacaaggcc tattacaatg tgaacaacct gaaagggtgg tctggactac 4740
caataatgtt gcactctact ggggccatag tagggaggat aaagtcagca tattcagatg 4800
aaaatgactt ggtggaggaa cttattgact ctaggactat cagcaagagc aatgagacaa 4860
acctggacca tcttatcaag gaattggcag atatgcggag gggggagttt cgctcaatca 4920
cccttggaac gggagctggg aaaactacgg aactgcccag gcaatatctc acaacggtag 4980
gtgcccataa atctgtgttg gtcctagtcc ctttaaaagc acccgccgag agtgtctgtc 5040
gcttcatgag 5050
<210> 29
<211> 4664
<212> DNA
<213> 新型瘟病毒
<400> 29
gcgtgcccaa agagaaatcg gtggtggacc tgggggtcgg gtccaccatg cccctttagg 60
gggtagacct tactgcttga tagagtgccg gcggatgcct cgggtaagag tataaaatcc 120
gttgtctatt aacatggaaa agcagattgc atattactta aaaaaagaaa aacaaagaaa 180
tgggtggacg gaactggtag tgggagaaag ccatacgaaa ataaccacac tttctggaaa 240
gatctatcga ggtacatggg aaatggagaa acggtcgaat ccttacggaa cctatcttcc 300
tagacctagt cctcaacagc ttacagctct acacccccac ccagtggtga attgtaaggt 360
gaccgagtat aaggagctgg accctaatta tggtgattgc ccgaagacaa atggggtatt 420
catcgacgaa aagggtcgaa ggctgagcag ccctccattg ggaatttgga agataagact 480
ggactacagc gacctggtaa atataaacag accagctctc gctagtggaa aaaactctta 540
tcgagtcgag acctgcagtg gggaactggc tattgtaaca ccggtacacg atagggtact 600
tgtagaagac tacagggggc tataccaatg gaaacccaac tgtgaaggaa tggtgctcta 660
tgtgaaaact tgctctgact gggcagacca ggtggaaaaa caggaaagag aaaacccccc 720
aaaacctcag cgaccaccga ggcgagaccc acgaaaaggg ttacaaccgc aagtccctaa 780
agagactgag gtcactgaaa agaggagaca acccagcgtt accttagtat cggggggaca 840
gaaggcccaa gtcatctaca aaggcaagac taagaataaa aagactccgg atggagtcta 900
taagtatcca ggagccagag aaggggatgt ggtaaaggtt aggaagatgc tgaagaattg 960
gcatatagct gtagcaatgt tcctgattta tatcataacc ccaggctttg ccaaggttca 1020
gtggttctta aaggatgaga actcgacggg gatcaatcag atactgtggc gaagacaaat 1080
caatagatcc ctgcatggag aatggcccaa ccagatctgc catggtatgc cgaatgaaac 1140
catcacggat gaggaattac gtagtctggg aatgatagat acaagtccca gaacaaacta 1200
cacttgttgc cagttgcaat atcatgagtg gaagaaacat ggttggtgca actatccaca 1260
aaaacagact tggattagga gaataacggc cctacaggct aacctcaccg gaacttatga 1320
gggacctgag tgcgctgtca tctgtcgatt taacggcagc tataacatcg taaaacaggc 1380
cagagacgag gtgagcccac tgacagggtg taaggagggg caccctttcc tattttctgg 1440
tgcaagatcc gacacctcgt gtctgaggcc tccttccact agttgggtca gaccagtgaa 1500
gatggatgag gcatcaatgg ccgatggctt tgcccatggg gttgacaagg caataatact 1560
aattagaaaa ggagcatcag gaattattaa tttcctagac actattggga ggtggctacc 1620
agtagccgaa gcaactatag taccatattg tgaaacttac actgtgacag ggatgtatat 1680
ccatgtgaag aattgcctcc ccaaagggtt acctaagcat tcaaaaataa tttccccgac 1740
aatgatatac ctgggggaag gtgacccagc ccataacatc cagcacttat ttggctcagg 1800
tatagcaaag tgggtcctag tcttactcgg ggtcctgggt gagtggtatg gagaattggc 1860
ctctacaata tacctactac tggagtacgg gtctgagtgg ttggaacatg aaagcttgat 1920
tacagaaggg ttgatccctg gcattaatat cacagtagaa ctcccagcta gccaaacagt 1980
gcctggttgg gtgtgggtcg caggccagtg ggtatgtgtg aagccagact ggtggcctac 2040
tcagatttgg attgaaaccg tggtggcgga ggcctggcat atactaaaaa tactggcatc 2100
agcccttgtg aacatagtca ctgcatttgt aaacttggaa ttggtctacc tggtcataat 2160
attagtcaaa atatcaaagg ggaacctaat aggcgccata ttatggtgcc tattattgtc 2220
aggggctgaa ggctcatgcc acaaaagaca agactattac aatattcagt tagttgtcga 2280
agaaaaaaca ggtgtagaaa aacgatccat aatgggcaaa tggactgtaa taactaggga 2340
aggtcgggaa ccaagattaa tggagcaaat aaatatggtg ttcaacgata gcctgtcaga 2400
aacttactgc tataataggc taaacaccag tagttggggg cgacaaccgg caagacagag 2460
agggtgtggt cagactgtac cctattggcc tggtgacaat gtcctagaag aacaatacta 2520
tagcactggt tactgggtga acacaacagg cggttgccag ttgagagaag gagtgtggct 2580
atcaagaaaa ggcaacgtac agtgccagcg taatggctca tccttgatac tgcaattagc 2640
aataaaagaa gagaatgaca ctatggaaat accatgtgac ccggtggaaa cagaaagcat 2700
gggtccagtt gcacagggta cttgcgtata tagctgggca ttcgccccaa gagggtggta 2760
ttataatagg aaagacggtt attggcttca gtacataaag aaaaacgact accagtactg 2820
gacaaaaatg cctaccgcct cgtccgctgc aacaatgtac cgccatttgc ttcccttact 2880
ggtagcttgc ctcatgggcg gcaggatatc ggtgtggatt gtagcaatgc tcctatctct 2940
acaggtggaa gctagcgaag tgggtaccaa gcaactggct gtcacactaa ctctgtggaa 3000
aatggactgg acagaactac tcttttatat tgttataatg ctagccatca aggaagagct 3060
cataaagaaa atagtgactg caagcctagt agccttaaaa aatagtccag tggctttgag 3120
ttttcttatt gtactcaggc ttgtaggggg cagtgaagca ctcccagtag gtttactgct 3180
agaaaagatg tgtatagacc aaccggagtt tggaacccct ttcctgatct acctgtggga 3240
caattggaag tggactgtac tagtcagctt ctccgcactg aaccatgaaa aaactataaa 3300
actggcaaga aaactgctac tggccacgca tataacagcg ctcacattga ctggtctgag 3360
tgattcaatc ttctacatga tgcttataat gaccaaccta ctgataaaga cattcatata 3420
tctactgggg gccagcataa attgggtcga gaaagaaaaa agaaaattgc tggcgaagag 3480
gaaattaata tataagaaag ccgcgatttg caatcatgaa gagaatgaat tggagaataa 3540
atttaacagg ataactgtaa atgcggactt caccccatgc aaactcgaac ttctacaatt 3600
acttagggct tttttagtct ctttatgttt ttcctattat aagcctcttc tgtatgcaga 3660
gaccacccta actgttatag taattggcgt acaagagtac aatgtagcaa tggcccgtgg 3720
gcgaagtgtg gtccatagac tactagccat ggcctactac atatatggcc gcatacaggg 3780
tgaaatgttc caactcgcca ctatccagtg cctgttgtca agcccgagga aaattatgaa 3840
acacatgata gaaaatccaa ctcttaagaa gctctggcaa ggcgaaacag aactttttaa 3900
ccagggtgtc agccagtcca aaatagtgaa tccaaggaaa attgggctgg gggaattaca 3960
taagggcatg tgcggcctcc caactgtagt gcaaaatcta gtcatatatg caaagaagaa 4020
tgactctctc attttaggag agttgggtta cccccctggg gacctcacca gtgatgggtg 4080
ggaaatttta ggtcctggca gaatcccaaa aatcactaat gttgagtccg caaaaatgga 4140
cttactctcc aaactcatga ccttcttggg gattgaaagc tcaagagtcc ccagaacccc 4200
agtccactca acaagaaagt tattgaagat agtaagaggc ctcgaaactg gatgggggta 4260
cactcatgca ggaggaatca gtagcgcaaa acacgttaca ggtgagaaga acttgatgac 4320
ccacatggag ggtaggaagg gtaagtatat cctacaatcc caagaacatg gcgctgatga 4380
ggtagaatat ggggtgaaaa ctgaccaaaa agcacccgac aatgccttgt gctactgctt 4440
taaccctgaa gccacaaaca taaaaggtga aacgggagcc atggtgttca tgaagaagat 4500
aggaaaaaaa tggactcttg taacatcgga tggtaacaaa gcctattaca atgtaaacaa 4560
cttgaaaggg tggtctggac ttccaataat gttgcactcc accggggcca tagtagggag 4620
gattaagtca gcatattcgg atgaaaatga cttggtggag gaac 4664
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
caggaaacag ctatgac 17
<210> 32
<211> 211
<212> PRT
<213> 新型病毒
<400> 32
Ser Cys His Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Ser Ile Gln Leu Val Val Asp
1 5 10 15
Gly Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Val Gly Lys Trp Thr Val
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Ser Met
35 40 45
Val Ser Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn
50 55 60
Thr Ser Ser Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln
65 70 75 80
Thr Val Pro Phe Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Thr
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Val Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Thr Thr Met
195 200 205
Tyr Arg His
210
<210> 33
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 杆状病毒调整的DNA
<400> 33
cgcggatcca aatatgtcat gtcacaagcg tcaagactac tactctatcc aactggtggt 60
ggacggaaaa actggcgtgg aaaagcgttc tatcgtgggc aagtggacgg tcatcaccag 120
ggagggcaga gaaccgcgcc taatggagca aatttcgatg gtatctaacg actctctttc 180
agaaacctac tgctataacc gtctcaatac tagctcttgg ggtcgtcaac ctgcccgtca 240
gcgcggatgt gggcaaaccg tccccttctg gcctggtgac aacgtactcg aggaacagta 300
ctatagcacc ggatactggg ttaacgctac tggcggttgc caactacgcg agggagtttg 360
gttatctcgt aaggggaacg tgcaatgtca gcgtaatggc tcatcgctga tccttcaact 420
cgctattaaa gaggaaaacg acaccatgga aatcccgtgc gatccagtcg agactgaatc 480
aatgggcccc gttactcaag gcacgtgtgt gtacagctgg gctttcgccc ctaggggatg 540
gtactataac cgtaaggacg gctactggct tcaatacgtg aagaaaaacg attaccagta 600
ctggaccaaa atgcccactg catccagcgc gaccactatg taccgtcacc atcaccatca 660
ccatcactaa gaattctcga g 681
<210> 34
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA
<400> 34
catatgtcgt gtcacaaacg ccaagattat tattctattc aactggtcgt ggatggtaaa 60
acgggtgtcg aaaaacgctc tatcgtcggt aaatggaccg tgattacgcg tgaaggccgc 120
gaaccgcgtc tgatggaaca gatcagtatg gtttccaacg atagcctgtc tgaaacctat 180
tgctacaacc gcctgaatac gagctcttgg ggtcgtcagc cggcacgtca acgcggctgt 240
ggtcagaccg tcccgttttg gccgggcgac aacgtgctgg aagaacaata ttacagtacc 300
ggttattggg tgaatgcaac gggcggttgc cagctgcgtg aaggcgtttg gctgtctcgt 360
aagggtaacg tccagtgtca acgcaatggc agttccctga ttctgcaact ggcgatcaaa 420
gaagaaaacg ataccatgga aatcccgtgc gacccggtcg aaaccgaatc aatgggcccg 480
gtgacccagg gcacgtgtgt ttattcgtgg gcattcgcac cgcgcggctg gtattacaac 540
cgtaaagatg gttattggct gcagtacgtg aagaaaaacg actatcaata ctggaccaaa 600
atgccgacgg catcatcggc taccacgatg taccgtcatc accatcacca tcaccattaa 660
ctcgag 666
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-pcr引物
<400> 35
cgtgcccaaa gagaaatcgg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-pcr引物
<400> 36
ccggcactct atcaagcagt 20

Claims (31)

1.作为瘟病毒成员的分离的病毒，所述病毒的特征在于：
a) 所述病毒是猪中的A-II组先天性震颤的病原体，且
b) 所述病毒具有病毒基因组，其包含编码包膜蛋白Erns的基因、编码包膜蛋白E2的基因和编码包膜蛋白E1的基因，其中所述Erns基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平和/或所述E2基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平和/或所述E1基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
2.根据权利要求1所述的分离的病毒，其特征在于，所述Erns基因的核苷酸序列与如SEQID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述E2基因的核苷酸序列与如SEQID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述E1基因的核苷酸序列与如SEQID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
3.作为瘟病毒成员的分离的病毒，所述病毒的特征在于：
a) 所述病毒是猪中的A-II组先天性震颤的病原体，且
b) 从所述病毒RNA基因组逆转录的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:13和14所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物和/或在PCR反应中与如SEQ ID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物。
4.根据权利要求3所述的分离的病毒，其特征在于，从所述病毒RNA基因组逆转录的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:13和14所示的引物组反应以得到896+/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的病毒，其特征在于，所述Erns基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述E2基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述E1基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，且其特征在于，从所述病毒RNA基因组逆转录的cDNA在PCR反应中与如SEQ ID NO:7和8所示的引物组反应以得到156 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:9和10所示的引物组反应以得到335 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:11和12所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:13和14所示的引物组反应以得到896 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQ ID NO:15和16所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物且在PCR反应中与如SEQID NO:17和18所示的引物组反应以得到182 +/- 10个碱基对的PCR产物。
6.细胞培养物，其特征在于，所述培养物包含根据权利要求1-5中任一项所述的病毒。
7.编码Erns蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的Erns基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
8.Erns蛋白，其特征在于，所述Erns蛋白由根据权利要求7所述的基因编码。
9.编码E2蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:3所示的E2基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
10.E2蛋白，其特征在于，所述E2蛋白由根据权利要求9所述的基因编码。
11.编码E1蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与如SEQ ID NO:5所示的E1基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。
12.E1蛋白，其特征在于，所述E1蛋白由根据权利要求11所述的基因编码。
13.包含根据权利要求7所述的Erns基因的DNA片段，其特征在于，所述Erns基因在功能性的异源启动子的控制下。
14.包含根据权利要求9所述的E2基因的DNA片段，其特征在于，所述E2基因在功能性的异源启动子的控制下。
15.包含根据权利要求11所述的E1基因的DNA片段，其特征在于，所述E1基因在功能性的异源启动子的控制下。
16.活重组载体病毒，其包含根据权利要求13-15中任一项所述的DNA片段。
17.假颗粒，其特征在于，所述假颗粒包含根据权利要求8所述的Erns蛋白、根据权利要求10所述的E2蛋白和根据权利要求12所述的E1蛋白。
18.用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求1-5中任一项所述的病毒和药学上可接受的载体。
19.根据权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述病毒是活减毒形式。
20.根据权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述病毒是灭活形式。
21.用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求8所述的Erns蛋白和/或免疫原性有效量的根据权利要求10所述的E2蛋白和/或免疫原性有效量的根据权利要求12所述的E1蛋白，和药学上可接受的载体。
22.用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求17所述的假颗粒和药学上可接受的载体。
23.用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据权利要求16所述的活重组载体病毒和药学上可接受的载体。
24.用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据权利要求13所述的DNA片段和/或根据权利要求14所述的DNA片段和/或根据权利要求15所述的DNA片段，和药学上可接受的载体。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至少一种其它猪致病性微生物或猪致病性病毒和/或所述猪致病性微生物或猪致病性病毒的至少一种其它免疫原性组分和/或编码所述其它免疫原性组分的遗传物质。
26.与根据权利要求1-5中任一项所述的病毒反应的抗体或抗血清。
27.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒和/或根据权利要求8所述的Erns蛋白和/或根据权利要求10所述的E2蛋白和/或根据权利要求12所述的E1蛋白和/或根据权利要求13所述的DNA片段和/或根据权利要求14所述的DNA片段和/或根据权利要求15所述的DNA片段和/或根据权利要求16所述的活重组载体病毒和/或根据权利要求17所述的假颗粒，其用于抗击猪中的A-II组CT的疫苗中。
28.用于制备根据权利要求18-25中任一项所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将根据权利要求1-5中任一项所述的病毒和/或根据权利要求8所述的Erns蛋白和/或根据权利要求10所述的E2蛋白和/或根据权利要求12所述的E1蛋白和/或根据权利要求13所述的DNA片段和/或根据权利要求14所述的DNA片段和/或根据权利要求15所述的DNA片段和/或根据权利要求16所述的活重组载体病毒和/或根据权利要求17所述的假颗粒，与药学上可接受的载体混合。
29.用于检测与A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒反应的抗体的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含根据权利要求1-5中任一项所述的病毒或其抗原性材料。
30.用于检测A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含与根据权利要求1-5中任一项所述的病毒或其抗原性材料反应的抗体。
31.用于检测A-II组先天性震颤相关的猪瘟病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含与根据权利要求1-5中任一项所述的病毒的基因组特异性反应的PCR引物组。
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