CN111690778A - 一种appv病毒的pcr引物、探针及其鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，鉴别APPV病毒的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)、具有如SEQ.ID NO1所示核苷酸序列的上游引物、具有如SEQ.ID NO2所示核苷酸序列的下游引物、具有如SEQ.ID NO3所示核苷酸序列的探针、待检测样品的cDNA和水。本发明的微滴式数字PCR方法能够快速检测，具有良好的特异性，其能检出的最低检测限为0.15copies/μL，灵敏度高，而且组内组间重复试验变异系数均小于6％，具有良好的重复性和稳定性。

Description

一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别APPV病毒的方法，具体涉及一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法。
背景技术
猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)是黄病毒科、瘟病毒属成员，基因组序列全长约为11-12kb。APPV与同病毒属其他病毒一样，既可以通过垂直传播也可以通过接触传播，大多数4-14周龄的架子猪和1周龄以内的仔猪感染后会出现病毒血症，受感染的公猪也可以通过精液进行病毒传播。该病毒是造成AⅡ型先天性震颤的主要病原之一，初产母猪感染后，所产仔猪大多数呈现肌肉震颤和八字腿的症状。仔猪感染后，症状轻微的表现为耳朵、侧腹或后腿区域出现明显的震颤，严重的则表现为全身性的肌肉震颤、站立或行走困难，因无法喝上初乳，最终大多数感染仔猪死于饥饿，给养猪业带来巨大损失。
随着猪场集约化养殖的不断发展，密集型饲养方式以及猪群的跨区域流通导致猪群之间接触的几率增大，建立快速有效检测疾病的方法显得十分关键。由于分子生物学的不断发展，PCR检测技术因具有操作简便、耗时短、特异性高且结果精确等特点，在日常检测中得到广泛应用。但是，在以往的疾病检测中，使用传统的PCR、qPCR检测方法常出现假阳性、灵敏性低、重复性不高的情况。在病毒感染初期，这两种方法均无法快速、灵敏的对病毒进行检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，该方法解决了现有PCR检测灵敏度低的问题，可通过泊松分布公式和阳性单元荧光信号占所有反应单元的比值来计算出样品的原始浓度和含量、快速鉴别APPV病毒，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明提供了一种APPV病毒的PCR引物组，该引物组的上游引物具有如SEQ.ID NO1所示的核苷酸序列，其下游引物具有如SEQ.ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴别APPV病毒的探针，该探针具有如SEQ.IDNO3所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴别APPV病毒的微滴式数字PCR方法，该方法采用的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)、具有如SEQ.IDNO1所示核苷酸序列的上游引物、具有如SEQ.ID NO2所示核苷酸序列的下游引物、具有如SEQ.ID NO3所示核苷酸序列的探针、待检测样品的cDNA和水；若待检测样品有阳性微滴出现荧光信号，则含有APPV病毒。
优选地，该方法采用的微滴数字PCR反应程序为：95℃10min；94℃30s，52.7℃60s，共40个循环；98℃10min。
优选地，所述微滴数字PCR反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为450nM；探针浓度为250nM。
优选地，所述微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)10μL、探针0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、待检测样品的cDNA2μL，最终补水至终体积20μL。
本发明的APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，解决了现有PCR检测灵敏度低的问题，具有以下优点：
本发明的微滴式数字PCR方法，能够快速检测，具有良好的特异性，对CSFV、JEV、PCV-2、PCV-3、PRV等相关病毒检测均为阴性，其能检出的最低检测限为0.15copies/μL，灵敏度高，而且组内组间重复试验变异系数均小于6％，表明本发明建立的ddPCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
附图说明
图1为本发明不同退火温度下FAM荧光信号的一维散点图和直方图。
图2为本发明不同引物浓度下FAM荧光信号差值图。
图3为本发明不同探针浓度下FAM荧光信号差值。
图4为本发明ddPCR扩增的APPV标准曲线及TaqMan荧光定量RT-PCR扩增的APPV标准曲线。
图5为本发明的APPV ddPCR特异性试验。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实验中采用的试剂，具体如下：
DL2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix均购自天根生化科技(北京)有限公司；逆转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、pMD19-T载体、质粒抽提试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司产品；ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)、ddPCRTM DropletGeneration Oil、ddPCRTM Droplet Reader Oil、Droplet Generator GD8TM Cartndge、Droplet Generator GD8TM Gasket、Pierceable Foil Heat Seal等均购于Bio-Rad公司。
实施例1
一种用于鉴别APPV病毒的微滴式数字PCR方法，该方法采用的引物序列为：APPV-F：GTCAATAAGTTCCTCCACCAAGTCGT(SEQ.ID NO 1)；APPV-R：ACCTGAAAGGGTGGTCCGG(SEQ.IDNO 2)，其根据GenBank中的APPV NS5A基因设计的；采用的探针序列为：APPV-P：ACGCCGATTTGATTCTC(SEQ.ID NO 3)，该探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。
该方法采用的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(nodUTP)10μL、探针0.5μL、上下游引物各1μL、待检测样品的cDNA(模板)2μL，最终补水至终体积20μL。微滴数字PCR反应程序为：95℃10min；94℃30s，52.7℃60s，共40个循环；98℃10min。
若待检测样品有阳性微滴出现荧光信号，则含有APPV病毒。
实验例1微滴数字PCR(ddPCR)反应体系的优化
1、APPV重组质粒标准品的制备
采用Trizol法提取猪非典型瘟病毒阳性病料的总RNA。按照Prime Script反转录试剂盒说明书方法进行反转录以获得cDNA，用上述引物对得到的cDNA进行扩增，得到的PCR产物在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，看得到的电泳条带是否与预期条带(113bp)大小一致，对扩增产物进行初步验证。
利用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行回收纯化并将回收产物与pMD19-T SimpleVector连接过夜，将重组质粒转化至DH5α感受态细胞。
用质粒DNA提取试剂盒提取质粒鉴定是否为阳性，对鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测序结果在NCBI网站上进行比对，分析表明该阳性重组质粒符合预期目标，可以作为APPV荧光定量RT-PCR的阳性标准品用于实验。用核酸蛋白仪测定阳性标准品的浓度，将其置于-20℃保存备用。
2、退火温度的优化
以上述阳性标准品作为模板，以不同的退火温度Tm(51～61℃)分别进行PCR扩增，当达到某一退火温度时阴阳性微滴的荧光信号值最大，及确定最佳退火温度。
为确定最佳退火温度，选取52～62℃8个梯度温度进行PCR扩增，当退火温度为52.7℃时，阳性微滴聚拢且阴阳性微滴荧光信号差值最大。通过直方图可以看出阴阳性微滴单独成峰，阳性反应峰与阴性反应峰明显分开，表明ddPCR仪可以有效区分阳性反应和阴性反应，见图1(A：不同退火温度下FAM荧光信号的一维散点图；B：直方图)。
最佳反应程序为：95℃10min；94℃30s，52.7℃60s，共40个循环；98℃10min。
3、引物浓度的优化
选取9.2×103copies/μL的阳性模板(上述阳性标准品)进行ddPCR引物浓度优化试验，以上下游引物为唯一变量，采用不同引物浓度配比(125nM、225nM、450nM、900nM)进行引物浓度的优化试验，每个浓度做2个重复。
选取9.2×103copies/μL APPV重组质粒标准品进行ddPCR引物浓度的优化，在相同模板浓度和反应体系中，控制引物浓度单一变量，调整引物浓度分别为125nM、225nM、450nM、900nM，结果如图2所示，当上下游引物浓度为450nM时，阴阳性微滴数差值较大、阳性微滴最为聚拢且拷贝数略大。
4、探针浓度的优化
选取9.2×103copies/μL的阳性模板进行ddPCR探针浓度优化试验，以探针为唯一变量，分别设定探针浓度为125nM、250nM、375nM、500nM进行优化，每个浓度做2个重复。
选取9.2×103copies/μL APPV重组质粒标准品进行ddPCR探针浓度的优化，在相同模板浓度和反应体系中，控制探针浓度单一变量，调整探针浓度分别为125nM、250nM、375nM、500nM，结果如图3显示，当探针浓度为250nM时，阴阳性微滴数差值较大、阳性微滴最为聚拢且拷贝数最大。
最终优化体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)10μL、探针0.5μL、上下游引物各1μL、模板2μL，最终补水至终体积20μL。
5、ddPCR与qPCR标准曲线的建立与对比
通过上述优化后，将APPV重组质粒标准品进行10倍连续稀释，最后选取9.2×105～9.2×100copies/μL的APPV重组质粒标准品为模板，分别进行ddPCR和荧光定量RT-PCR，反应结束后绘制相应方法的标准曲线，并对其进行线性回归分析。
通过上述优化后的反应体系和程序进行APPV ddPCR与TaqMan荧光定量RT-PCR扩增，反应结束后对结果进行线性回归分析，结果如图4所示(A：TaqMan荧光定量RT-PCR扩增的APPV标准曲线；B：ddPCR扩增的APPV标准曲线)。结果表明，荧光定量RT-PCR y＝-3.406x+33.442，R2＝1，E＝96.6％；ddPCR y＝0.1111x-6.2682，R2＝1，两种方法均具有良好的线性关系。
实验例2特异性试验
用本研究建立的APPV ddPCR检测方法对APPV及其他5种(CSFV、JEV、PCV-2、PCV-3、PRV)阳性样品进行检测，并设立阴性对照。
通过将建立的APPV ddPCR检测方法对APPV、CSFV、JEV、PCV-2、PCV-3、PRV等相关病毒核酸进行检测，结果见图5(1：CSFV；2：JEV；3：PCV-2；4：APPV；5：PCV-3；6：PRV)，除APPV有明显的阳性微滴出现荧光信号以外，其他的均为阴性，表明建立的APPV ddPCR检测方法具有良好的特异性。
实验例3敏感性试验
将连续稀释的模板进行ddPCR，每个浓度梯度设3个平行重复，并设立阴性对照，最终结果取3个重复样品的平均值进行敏感性分析。
通过上述优化后的反应体系和程序进行APPV ddPCR与TaqMan荧光定量RT-PCR扩增，进行敏感性分析。结果如表1所示，ddPCR方法能检出的最低检测限为0.15copies/μL，低于该浓度后无法检测到阳性微滴。而TaqMan荧光定量RT-PCR方法检出的最低检测限才为92copies/μL，本发明的方法灵敏度显著高于TaqMan荧光定量RT-PCR方法。
实验例4重复性试验
分别选取同一批3个不同浓度的APPV重组质粒标准品进行连续10倍的倍比稀释，每个浓度设3个重复，用本试验建立的ddPCR方法进行检测，作为组内重复性试验。将稀释好的质粒在相同条件下反复进行三次独立的检测，作为组间重复性试验。通过统计学分析分别计算平均数和变异系数，来验证该方法的重复性。
分别选取同一批APPV重组质粒标准品进行连续10倍的倍比稀释，每个浓度设3个重复，结果如表2所示，组内组间重复试验变异系数均小于6％，表明建立的ddPCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
实验例5临床检测
从四川乐山、宜宾、广元和遂宁等地采集的135份临床病料，按照本试验建立的ddPCR扩增体系和扩增条件进行检测，并设立阴阳性对照，结果如表3所示：135份临床样品中，ddPCR检测的阳性率为27.4％，远高于qPCR的14.8％。
表1梯度稀释的APPV质粒标准品分别进行ddPCR和TaqMan荧光定量RT-PCR
Figure BDA0002587712860000061
Figure BDA0002587712860000071
表2 ddPCR重复性试验
Figure BDA0002587712860000072
表3 ddPCR和qPCR检测结果
Figure BDA0002587712860000073
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtcaataagt tcctccacca agtcgt 26
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acctgaaagg gtggtccgg 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acgccgattt gattctc 17

Claims (6)

1.一种APPV病毒的PCR引物组，其特征在于，该引物组的上游引物具有如SEQ.ID NO1所示的核苷酸序列，其下游引物具有如SEQ.ID NO2所示的核苷酸序列。
2.一种用于鉴别APPV病毒的探针，其特征在于，该探针具有如SEQ.ID NO3所示的核苷酸序列。
3.一种用于鉴别APPV病毒的微滴式数字PCR方法，其特征在于，该方法采用的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(nodUTP)、具有如SEQ.ID NO1所示核苷酸序列的上游引物、具有如SEQ.ID NO2所示核苷酸序列的下游引物、具有如SEQ.ID NO3所示核苷酸序列的探针、待检测样品的cDNA和水；若待检测样品有阳性微滴出现荧光信号，则含有APPV病毒。
4.根据权利要求3所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，该方法采用的微滴数字PCR反应程序为：95℃10min；94℃30s，52.7℃60s，共40个循环；98℃10min。
5.根据权利要求3所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为450nM；探针浓度为250nM。
6.根据权利要求3所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)10μL、探针0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、待检测样品的cDNA 2μL，最终补水至终体积20μL。
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