CN110616278B - 检测fav-8和fav-11的特异性引物及试剂盒 - Google Patents

检测fav-8和fav-11的特异性引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测FAV‑8和FAV‑11的特异性引物，包括用于检测FAV‑8的检测引物，如SEQ ID NO.1、2所示，和用于检测FAV‑11的检测引物，如SEQ ID NO.3、4所示。一种检测FAV‑8和FAV‑11的试剂盒，包括上述特异性引物。一种检测并鉴别FAV‑8和FAV‑11的双重荧光定量PCR方法：(1)提取病料核酸；(2)PCR反应；(3)扩增后，对扩增产品进行检测，根据双重荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线Tm值来区分FAV‑8与FAV‑11：若Tm值为88.21℃‑88.81℃，则检测结果为FAV‑8阳性；若Tm值为93.15℃‑93.80℃，则检测结果为FAV‑11阳性。本发明对FAV‑8和FAV‑11的最低检出量分别为31copies/μL和34copies/μL，具有敏感性高、特异性好等优点，在临床上具有重要的应用价值。

Description

检测FAV-8和FAV-11的特异性引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测并鉴别常见血清型鸡包涵体肝炎感染的检测方法，具体涉及一种用于检测并鉴别禽腺病毒血清8型(FAV-8)和禽腺病毒血清11型(FAV-11)的特异性引物及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，分为3个群，其中Ⅰ群禽腺病毒包含12个血清型。鸡包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis in chicken,IBH)是由Ⅰ群禽腺病毒感染引起的一种鸡急性传染病，主要症状是鸡群死亡率突然增加，其中以3～4周龄最多发，发病率可达到10～20％，死亡率较低，一般不超过5％，发病后5～7天又恢复正常。患病鸡主要表现为精神沉郁，食欲不振，嗜睡，鸡冠发白，羽毛杂乱。剖检可见以肝脏发黄、肿大、变脆等为主要病变特征的包涵体肝炎，较少出现心包积液，部分肾脏肿大，呈淡黄色，脾脏也伴有肿大，骨髓呈淡红色至淡黄色。近几年来该病在我国肉鸡中流行有上升的趋势。目前，在我国由Ⅰ群禽腺病毒导致的疾病主要有两种：一是心包积液-肝炎综合征，主要由血清4型引起，典型症状为心包中出现淡黄色、凝胶样物质；二是包涵体肝炎，主要由FAV-8和FAV-11引起，而这两种血清型病毒感染从临床症状和病变上无法区分，给该病的防治带来了很大难度。急需建立一种可快速、准确地区分鸡包涵体肝炎血清8型和11型禽腺病毒感染的检测方法。
发明内容
针对上述现有技术，为解决鸡包涵体肝炎这两种病毒感染在临床上难以区分的问题，本发明提供了一种用于检测并鉴别禽腺病毒血清8型(FAV-8)和禽腺病毒血清11型(FAV-11)的特异性引物及试剂盒。本发明利用荧光定量PCR技术快速、准确、敏感性高的特点，设计了特异性引物，建立了一种用于区分鸡包涵体肝炎血清8型和11型禽腺病毒感染的检测方法，适用于实际生产。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于检测FAV-8和FAV-11的特异性引物，包括用于检测FAV-8的检测引物，和用于检测FAV-11的检测引物；所述用于检测FAV-8的检测引物的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其扩增片段大小为92bp；
FAV8-RTF4:5′-AAGGACAGCAGCGTCGTCT-3′；
FAV8-RTR4:5′-TGCGGCTTGATGATGTCGATA-3′；
所述用于检测FAV-11的检测引物的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示，其扩增片段大小为171bp；
FAV11-RTF1:5′-CGGGGAAGGACCACACC-3′；
FAV11-RTR1:5′-GAAGCGGACGAGGGCAG-3′。
上述引物在制备检测FAV-8和FAV-11的试剂盒中的应用。
一种检测FAV-8和FAV-11的试剂盒，包括上述特异性引物。
上述特异性引物、试剂盒在检测、鉴别FAV-8和FAV-11中的应用，比如在检测疑似感染FAV-4和FAV-8b病毒的临床样品中的应用。
一种检测并鉴别FAV-8和FAV-11的双重荧光定量PCR方法，包括如下步骤：
(1)用常规方法或试剂盒提取病料核酸；
(2)PCR反应：利用上述特异性引物进行对待测样品进行PCR扩增；
进一步地，所述PCR的反应体系为：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL；10μM的FAV8-RTF40.3μL；10μM的FAV8-RTR4 0.3μL；10μM的FAV11-RTF1 1μL；10μM的FAV11-RTR1 1μL；核酸样品2μL；dH2O 5.4μL，总体积为20μL；
进一步地，所述PCR的反应条件为：95℃60sec预变性；95℃变性10sec、58℃退火10sec、72℃延伸15sec，共40个循环；溶解曲线95℃10秒，65℃60秒，97℃1秒；
(3)扩增后，对扩增产品进行检测，根据双重荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线Tm值来区分FAV-8与FAV-11：若Tm值为88.21℃-88.81℃，则检测结果为FAV-8阳性；若Tm值为93.15℃-93.80℃，则检测结果为FAV-11阳性；若Tm值为小于88.21℃或大于93.80℃，则检测结果为FAV-8和FAV-11阴性。
本发明对上述双重荧光定量PCR方法在特异性、敏感性和重复性方面的验证结果：
(1)本发明对禽常见病毒如禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等检测均为阴性。但对禽腺病毒FAV-8和FAV-11的检测均为阳性。
(2)本发明对禽腺病毒FAV-8和FAV-11的检测敏感性分别达到31copies/μL和34copies/μL。
(3)本发明针对建立的双重荧光定量PCR方法分别进行批内重复试验和批间重复试验，FAV-8、FAV-11批内和批间重复试验Tm值变异系数均小于1％。
本发明的特异性引物、试剂盒及检测方法，具有以下有益效果：
1.本发明利用设计的两对特异性引物在同一个体系中能区分8型和11型这两种国内主要流行的引起鸡包涵体肝炎的禽腺病毒，同时还可以对病毒核酸进行定量，具有准确、省时、省力等优点；
2.本发明对FAV-8和FAV-11的最低检出量分别为31copies/μL和34copies/μL，具有敏感性高、特异性好等优点；
3.本发明提供的检测方法不仅能鉴别出FAV-8和FAV-11单独感染，还能检测出这两种病毒的混合感染，这在临床上具有重要的应用价值。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：FAV-8荧光定量PCR扩增的溶解曲线。
图2：FAV-11荧光定量PCR扩增的溶解曲线。
图3：FAV-8和FAV-11双重荧光定量PCR扩增的溶解曲线。
图4：FAV-8和FAV-11双重荧光定量PCR特异性检测结果，其中，A是扩增曲线，B是溶解曲线，1-10：ALV、NDV、REV、CAV、MDV、IBDV、IBV、ILTV、FAV-1和FAV-4。
图5：FAV-8和FAV-11双重荧光定量PCR敏感性检测结果，其中，A是扩增曲线，B是溶解曲线，1-9分别为：
3.1×108copies/μL+3.4×108copies/μL；3.1×107copies/μL+3.4×107copies/μL；
3.1×106copies/μL+3.4×106copies/μL；3.1×105copies/μL+3.4×105copies/μL；
3.1×104copies/μL+3.4×104copies/μL；3.1×103copies/μL+3.4×103copies/μL；
3.1×102copies/μL+3.4×102copies/μL；3.1×101copies/μL+3.4×101copies/μL；
3.1×100copies/μL+3.4×100copies/μL。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1检测引物的设计
根据Genbank中已登录的Ⅰ群禽腺病毒8型和11型52K基因序列，利用Oligo 6.0软件分别设计多组引物，并通过试验筛选出灵敏度、特异性最好，效果最佳的引物FAV8-RTF4/FAV8-RTR4和FAV11-RTF1/FAV11-RTR1，分别用于FAV-8和FAV-11的鉴别并检测。
针对FAV-8设计引物：
FAV8-RTF1：5′-GAAGGACAGCAGCGTCGTCT-3′；
FAV8-RTR1：5′-CGGCTTGATGATGTCGATA-3′；
扩增片段大小为87bp；
FAV8-RTF2：5′-AAGGACAGCAGCGTCGTCT-3′；
FAV8-RTR2：5′-ACTCCGGCTCGGTGGCT-3′；
扩增片段大小为134bp；
FAV8-RTF3：5′-CACCAGCAGCGCTATCGACA-3′；
FAV8-RTR3：5′-GGGCGGACGCGACTC-3′；
扩增片段大小为86bp；
FAV8-RTF4：5′-AAGGACAGCAGCGTCGTCT-3′；
FAV8-RTR4：5′-TGCGGCTTGATGATGTCGATA-3′；
扩增片段大小为92bp；
FAV8-RTF5：5′-GACAGCAGCGTCGTCTACAG-3′；
FAV8-RTR5：5′-CGGCTTGATGATGTCGATA-3′；
扩增片段大小为87bp；
针对FAV-11设计引物：
FAV11-RTF1:5′-CGGGGAAGGACCACACC-3′；
FAV11-RTR1:5′-GAAGCGGACGAGGGCAG-3′；
扩增片段大小为171bp；
FAV11-RTF2:5′-GACCTAGGTCCTCCCGTTTG-3′；
FAV11-RTR2:5′-TTAACGCTGATCGCCTGC-3′；
扩增片段大小为191bp；
FAV11-RTF3:5′-TAGGTCCTCCCGTTTGC-3′；
FAV11-RTR3:5′-ATCGCCTCCCTATCGTAATC-3′；
扩增片段大小为157bp；
FAV11-RTF4:5′-GAGCGGACGTAGACGAGATT-3′；
FAV11-RTR4:5′-AACGCTGATCGCCTGC-3′；
扩增片段大小为155bp。
通过引物的设计及筛选实验可以证明：虽然本发明的引物是通过软件设计得到的，然而保守区域的选择是发明人经过对比后得出的，付出了创造性劳动。且引物设计的原则是由发明人根据保守区域的特点(比如碱基分布比例)所设定的(比如引物长度)。通过设计软件得到若干组引物后，这些引物的特异性如何、灵敏度如何，是无法预知的(设计软件在设计引物时，是不会考虑特异性、灵敏度的平衡的)，其仅能作为一个参考，以协助发明人初步确定引物设计的大致位置，但要想得到特异性强、灵敏度高的引物(引物的长度越长，特异性越高，但是灵敏度越低；引物的长度越短，灵敏度越高，但特异性越差；这两方面需要有一个平衡点)，需要发明人付出创造性劳动，进行大量的、繁复的设计、筛选和验证工作(工作量极大)，选择合适长度的引物，以实现特异性和灵敏度的统一。因此，设计软件所起到的作用是辅助，要想得到成熟的可实际应用的引物，需要发明人付出创造性劳动。
实施例2双重荧光定量PCR反应条件的优化
通过调整引物浓度、退火温度、反应时间等方面对反应条件进行优化。优化后的反应条件为：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL；10μM的FAV8-RTF4 0.3μL；10μM的FAV8-RTR40.3μL；10μM的FAV11-RTF1 1μL；10μM的FAV11-RTR1 1μL；DNA模板2μL；dH2O 5.4μL，总体积为20μL。置于Roche LightCycler 96荧光定量PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃60sec预变性；95℃变性10sec、58℃退火10sec、72℃延伸15sec，共40个循环；溶解曲线95℃10秒，65℃60秒，97℃1秒。
实施例3双重荧光定量PCR的特异性
按照病毒核酸提取试剂盒说明分别提取禽腺病毒血清1型、4型、8型和11型、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡贫血病病毒(CAV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的核酸，并以此为模板利用上述反应条件进行双重荧光定量PCR，通过PCR扩增曲线和溶解曲线Tm值进行结果判定。结果，该双重荧光定量PCR方法对ALV、NDV、REV、CAV、MDV、IBDV、IBV、ILTV、FAV-1和FAV-4的检测均未出现特异扩增和溶解曲线峰值，结果均为阴性。但对FAV-8和FAV-11病毒混合样品的检测出现两个特异的溶解曲线峰值，结果为阳性(如图1-图4所示)。
实施例4双重荧光定量PCR的敏感性
按照病毒核酸提取试剂盒说明分别提取FAV-8和FAV-11病毒DNA，并分别利用引物FAV8-RTF4/FAV8-RTR4、FAV11-RTF1/FAV11-RTR1进行PCR扩增目的条带，回收目的条带，与载体pclone007相连接，转化至DH5α感受态细胞，并提取质粒，PCR鉴定阳性后送测序；利用分光光度计测定质粒含量，并将质粒进行10倍稀释，制备标准品，利用优化好的反应条件进行双重荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线和溶解曲线进行分析，结果如图5，可见FAV-8病毒DNA最低检出量为31copies/μL，FAdV-11病毒DNA最低检出量为34copies/μL。
实施例5双重荧光定量PCR的重复性
以不同浓度的质粒标准品为模板进行双重荧光定量PCR反应，每个浓度重复3次；对FAV-8和FAV-11的溶解曲线Tm值进行分析，验证双重荧光定量PCR方法的重复性。结果，FAV-8和FAV-11的Tm值的变异系数在组内试验和组间试验中均低于1％(表1)，说明该方法稳定性好。
表1 FAV-8和FAV-11双重荧光定量PCR重复性检测结果
Figure BDA0002161904600000061
实施例6双重荧光定量PCR对样品进行检测
(1)样品核酸提取：取200μL待测病料匀浆液，按照病毒核酸提取试剂盒(AXYGEN公司产品)说明书进行，备用。
(2)双重荧光定量PCR反应体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL；10μM的FAV8-RTF40.3μL；10μM的FAV8-RTR4 0.3μL；10μM的FAV11-RTF1 1μL；10μM的FAV11-RTR1 1μL；样品核酸2μL；dH2O 5.4μL，总体积为20μL。
(3)双重荧光定量PCR反应程序：95℃60sec预变性；95℃变性10sec、58℃退火10sec、72℃延伸15sec，共40个循环；溶解曲线95℃10秒，65℃60秒，97℃1秒。
(4)结果分析
根据FAV-8和FAV-11双重荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线，当样品中仅有FAV-8时，有特异性扩增，且溶解曲线仅有一个峰值，Tm值为88.21℃-88.81℃；当样品中仅有FAV-11时，有特异性扩增，且溶解曲线也仅有一个峰值，Tm值为93.15℃-93.80℃；当样品中同时具有FAV-8和FAV-11时，有特异性扩增，且溶解曲线具有两个峰值，分别在Tm值为88.21℃-88.81℃和Tm值为93.15℃-93.80℃处各有一个峰值。
实施例7临床应用
本实施例临床应用检验的样品为不同时期不同鸡场送检的样品49份。应用本发明提供的检测方法和病毒分离同时检测送检样品，横向比较两种方法的符合率情况。
本发明提供的检测方法检出FAV-8阳性病料6份，阳性检出率为12.2％，病毒分离鉴定检出阳性病料4份，阳性检出率为8.2％，两种方法的符合率为95.9％(如表2所示)。
表2双重荧光定量PCR与病毒分离鉴定比较(FAV-8)
Figure BDA0002161904600000071
注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％
本发明提供的检测方法检出FAV-11阳性病料4份，阳性检出率为8.2％，而病毒分离鉴定检出阳性病料3份，阳性检出率为6.1％，两种方法的符合率为98.0％(如表3所示)。
表3双重荧光定量PCR与病毒分离鉴定比较(FAV-11)
Figure BDA0002161904600000072
注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 山东省农业科学院家禽研究所
<120> 检测FAV-8和FAV-11的特异性引物及试剂盒
<140> 2019107350865
<141> 2019-08-09
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aaggacagca gcgtcgtct 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgcggcttga tgatgtcgat a 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cggggaagga ccacacc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaagcggacg agggcag 17

Claims (3)

1.一种用于检测FAV-8和FAV-11的特异性引物，其特征在于：包括用于检测FAV-8的检测引物和用于检测FAV-11的检测引物；所述用于检测FAV-8的检测引物的核苷酸序列如下所示：
FAV8-RTF4：5′-AAGGACAGCAGCGTCGTCT-3′；
FAV8-RTR4：5′-TGCGGCTTGATGATGTCGATA-3′；
所述用于检测FAV-11的检测引物的核苷酸序列如下所示：
FAV11-RTF1：5′-CGGGGAAGGACCACACC-3′；
FAV11-RTR1：5′-GAAGCGGACGAGGGCAG-3′。
2.权利要求1所述的特异性引物在制备检测FAV-8和FAV-11的试剂盒中的应用。
3.一种检测FAV-8和FAV-11的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的用于检测FAV-8和FAV-11的特异性引物。
CN201910735086.5A 2019-08-09 2019-08-09 检测fav-8和fav-11的特异性引物及试剂盒 Active CN110616278B (zh)

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