CN114410845A - 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式pcr引物组、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组、试剂盒，涉及分子生物领域；包括外引物对、内引物对和探针，所述外引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述外引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述内引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述内引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：4所示序列；所述探针的序列为SEQ ID NO：5所示序列。本发明基于巢式PCR原理，通过设计两对嵌套式引物，同时对外引物进行锁核酸修饰，提高外引物的Tm值和稳定性，进行两次独立的循环镶套式扩增，具有较高的灵敏度和特异性，易于操作，交叉污染少。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物领域，特别是涉及检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组、试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)，是由非洲猪瘟病毒(African SwineFever Virus，ASFV)感染家猪和各种野猪而引起的急性、烈性传染病，发病迅速，死亡率高达90％～100％，严重危害我国养猪业，被我国农业部列为一类传染病。ASFV属于双链DNA病毒目非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，ASFV个体较大，结构复杂，表面为二十面体结构和一层含类脂的囊膜，基因组编码大量蛋白，易变异，自然伫主基因型多样。非洲猪瘟病毒对外界的抵抗力较强，在环境中存活时间长，据报道，在血液、粪便和组织中存活时间长达半年，在感染的生的或者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达3个月，在冻肉中可存活数年。而且，非洲猪瘟病毒基因型多，易变异，我国非洲猪瘟疫苗处于研发阶段，但研制成功和获得应用尚需时日。目前，防控非洲猪瘟的主要手段，仍然是监控和灭源。所以，防控依赖早期的高灵敏度和高特异性的诊断检测，进而灭源头根除，故实验室诊断尤为重要。
目前对非洲猪瘟病毒的实验室诊断方法主要有，抗体检测：荧光免疫方法、Elisa抗体检测方法，核酸检测：荧光定量PCR方法、普通PCR方法。荧光定量PCR和普通PCR作为实验室常规，快速的检测方法之一。检测限大约在200～1000拷贝数/反应。但猪场采样到实验室检测存在时间差，导致核酸降解，或者样本采集质量较差，核酸提取不当，或者样本类型和病程不同，导致检测样本病毒载量可能低于传统荧光PCR的检测限，导致假阴性结果。采用数字PCR可以对样本含微量的病毒载量进行检测，但是往往需要独立的配套试剂、设备和软件，以及专业的人员，且价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组、试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明基于巢式PCR原理，通过设计两对嵌套式引物，同时对外引物进行锁核酸修饰，提高外引物的Tm值和稳定性，进行两次独立的循环镶套式扩增，具有较高的灵敏度和特异性，易于操作，交叉污染少。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组，包括外引物对、内引物对和探针，所述外引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述外引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述内引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述内引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：4所示序列；所述外引物对的上游引物序列中，第二位、第九位、第十三位、第十六位和第十八位的碱基均为锁核酸，所述外引物对的下游引物序列中，第一位、第七位、第十位、第十三位和第十七位的碱基均为锁核酸；所述探针的序列为SEQ ID NO：5所示序列。
本发明还提供上述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包含上述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组。
进一步地，在所述试剂盒的PCR反应体系中，所述探针在反应体系中的浓度为100nmol/L。
进一步地，所述试剂盒还包括Probe Master Mix和去核酸酶水。
进一步地，在所述试剂盒的PCR反应体系中，外引物对的退火温度为67℃。
进一步地，在所述试剂盒的PCR反应体系中，内引物对的退火温度为59℃。
进一步地，在所述试剂盒的PCR反应体系中，内引物对的上游引物和下游引物的浓度均为300nmol/L。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR方法对非洲猪瘟病毒的检测限比普通探针荧光定量PCR最低检测限高出100倍，具有良好的灵敏度。
本发明的锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR方法组内变异系数小于1％，组间变异系数小于3％，说明该方法具有良好的重复性。
本发明的锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR方法，对临床样品核酸的阳性检出率高于普通探针荧光定量PCR，灵敏度更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR方法镶套引物和探针设计示意图；
图2为内、外引物梯度退火温度凝胶成像，其中A为外引物梯度退火温度凝胶成像，B为内引物梯度退火温度凝胶成像；
图3为不同浓度的内引物和探针的扩增曲线，A为200～600nmol/L浓度引物的荧光PCR扩增曲线，B为100～500nmol/L各浓度探针的荧光PCR扩增曲线；
图4为非洲猪瘟病毒标准质粒的锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR标准曲线，其中A为锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR荧光扩增曲线，1～5依次为：3×104，3×103，3×102，3×101，3×100拷贝数/反应，NC：阴性对照；B为普通探针荧光PCR扩增曲线，1～4依次为：3×104，3×103，3×102，3×101，NC：阴性对照；C为锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR和普通探针荧光PCR标准曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1引物和探针设计
参考非洲猪瘟病毒B646L(P72)蛋白全基因核酸序列(Gene ID：22220311)，基因序列全长1941bp。进行变异株序列比对后，选择保守序列，通过Oligo 7进行设计镶套引物以及探针，作为锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR的引物和探针，见图1。镶套引物以及探针核酸序列，如表1所示：
表1锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR引物和探针碱基序列
注：(+)表示该核酸进行锁核酸修饰的碱基
锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR方法流程，如图1所示，第一步用锁核酸修饰的外引物F2、R2于序列的164～762位点进行扩增，10个循环，获得592bp的产物片段；第二步基于第一步扩增出来的产物片段，用内引物F1、R1，于序列的377～488的位点扩增，同时与探针结合，释放出FAM荧光基团，供荧光PCR设备采集信号。
实施例2扩增条件优化
1.外引物退火温度
用外引物F1和外引物R1进行常规PCR扩增，退火温度设置为66～72℃，梯度为1℃，其余条件均与常规PCR相同，加入的DNA模板为非洲猪瘟病毒B646L(P72)蛋白标准质粒。反应结束后取PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测。结果如图2A所示，最佳的退火温度为67℃。
2.内引物退火温度
用内引物F2和内引物R2进行常规PCR扩增，退火温度设置为58～66℃，梯度为1℃，其余条件均为与常规PCR相同，加入的DNA模板为非洲猪瘟病毒B646L(P72)蛋白标准质粒。反应结束后取PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测。结果如图2B所示，最佳的退火温度为59℃。
3.内引物浓度优化
用最佳的退火温度进行锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR，反应条件为：95℃预变性5min；变性95℃15s，67℃退火30s，72℃延伸40s，循环10次；95℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸15s，循环45次。设置内引物浓度分别为200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L、600nmol/L，反应体系如下，
结果如图3A所示，内引物F1、内引物R1最佳浓度均为300nmol/L。
4.探针浓度优化
用最佳的退火温度进行锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR，反应条件为：95℃预变性5min；变性95℃15s，67℃退火30s，72℃延伸40s，循环10次；95℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸15s，循环45次。设置探针T1浓度为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和500nmol/L，反应体系如下：
结果如图3B所示，探针T1最佳浓度均为100nmol/L。
实施例3标准曲线建立
将非洲猪瘟病毒P72标准质粒按3×104，3×103，3×102，3×101，3×100拷贝数/反应，进行10倍梯度稀释，去核酸酶水作为阴性对照，按实施例2优化后的反应体系与条件，进行锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR，获得不同浓度质粒的扩增曲线，并绘制标准曲线。采用普通探针荧光PCR作为对照。
检测结果判断：
若荧光定量PCR结果，Cq值小于等于31，且有特异性的“S”型扩增曲线，则判定为阳性；若荧光定量PCR结果，Cq值大于31，或无特异性的“S”型扩增曲线，则判定为阴性。
结果：锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR扩增曲线，如图4A所示；普通探针荧光PCR荧光扩增曲线如图4B所示；锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR和普通探针荧光PCR，如图4C所示。结果显示，锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR最低检测限为3×100拷贝数/反应；普通探针荧光PCR最低检测限为3×102拷贝数/反应；锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR最低检测限较普通探针荧光PCR最低检测限高100倍。
实施例4锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR重复性检验
将非洲猪瘟病毒P72标准质粒按3×104，3×103，3×102，3×101，3×100拷贝数/反应，进行10倍梯度稀释，进行3次独立重复试验，每次每个浓度设置三个重复，按实施例2优化后的反应体系与条件，进行锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR。
结果：如表2所示，组内变异系数<1％，组间变异系数<3％。说明建立的方法重复性较好，结果可靠。
表2锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR重复性检验
实施例5锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR临床样品检测
选取96份临床疑似患有非洲猪瘟的样品核酸进行检测，临床样品核酸提取于广东省农科院动物卫生研究所猪病室。使用本发明的方法进行检测，扩增引物和探针如实施例1，反应条件和体系见实施例2，判断阳性见实施例3；同时采用普通探针荧光PCR进行检测，平行对比。
结果：锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR检测结果为：55份阳性，41份阴性，阳性检出率为57.3％；普通探针荧光PCR检测结果为47份阳性，49份阴性，阳性检出率为48.9％。说明锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR较普通探针荧光PCR灵敏度高。
表3普通探针法与一锁核酸修饰的一步巢式荧光PCR临床检测
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组、试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtattcct cccgtggctt c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccagtaga cgcaatatac gc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atagatgaac atgcgtctgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaaatcctc atcaacaccg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgaaagctt atctctgcgt ggt 23
Claims (8)
1.检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组，其特征在于，包括外引物对、内引物对和探针，所述外引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述外引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述内引物对的上游引物序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述内引物对的下游引物序列为SEQ ID NO：4所示序列；所述外引物对的上游引物序列中，第二位、第九位、第十三位、第十六位和第十八位的碱基均为锁核酸，所述外引物对的下游引物序列中，第一位、第七位、第十位、第十三位和第十七位的碱基均为锁核酸；所述探针的序列为SEQ ID NO：5所示序列。
2.权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
3.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组。
4.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的PCR反应体系中，所述探针在反应体系中的浓度为100nmol/L。
5.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Probe Master Mix和去核酸酶水。
6.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的PCR反应体系中，外引物对的退火温度为67℃。
7.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的PCR反应体系中，内引物对的退火温度为59℃。
8.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的PCR反应体系中，内引物对的上游引物和下游引物的浓度均为300nmol/L。
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