CN113073148A

CN113073148A - 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113073148A
Application number: CN202110376177.1A
Authority: CN
Inventors: 曹志; 单虎; 周士硕; 秦志华
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2021-07-06

Abstract

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。包括采样用核酸吸附材料、阳性对照膜片、阴性对照膜片、样品采集管、漂洗管A(红盖)、漂洗管B(蓝盖)、扩增检测管、研磨棒、牙签、滤纸条、说明书。本发明试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为55分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360‑14L、CD2v三个基因。

Description

一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用

技术领域：

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。自2018年8月初我国发生ASF疫情，扑杀生猪超过100万头，给我国养猪业造成了无法估量的损失。目前，ASF缺乏有效疫苗防制，建立快速、灵敏、特异的诊断方法对ASF的防控至关重要。由于对ASFV检测更简单、更快速的需求，促进了快速检测试剂盒的飞速发展。2019年1月4日，中国动物疫病预防控制中心批准了11家快速检测试剂方法，其中荧光PCR类有8家公司，核酸等温扩增类(LAMP检测试剂盒)有1家公司，试纸条类(主要为抗原检测试纸条)有2家公司。

2019到2020年，大规模养殖企业逐步建立了ASFV的荧光PCR实验室快速监测体系。通过检测人员、车辆、物资和环境擦拭物等样本，阻断传染源；通过定期抽检和对异常猪加强巡查和监测，在早期阶段及时发现猪场内的ASFV感染；一旦发现阳性猪，荧光PCR检测快速确定猪群感染率，排查传染源和传播途径。这一套体系可有效控制ASFV野毒感染，将疫情的损失控制在一定范围。然而，ASFV的荧光PCR检测方法需要训练有素的操作人员，且依赖于成本昂贵的检测仪器，限制了其在小规模养殖企业或散户检测的应用。

阻碍当前检测方法广泛应用的另一瓶颈是从复杂的生物样品中(如，动物血液、组织、肛拭子等样本)现场快速提取核酸的要求。基于核酸恒温扩增技术(Nucleic acidisothermal amplification technology,NAIAT)的核酸检测方法能够实现快速、简单、高效的扩增，且对仪器依赖性低，非常适用于现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)中，是一种极具应用潜力的核酸分析手段。考虑到当前猪场ASF基因缺失弱毒株的检出率逐渐上升，ASF基因缺失弱毒株在猪场内潜伏感染传播，在感染初期非常难以察觉，一旦发现感染率已经非常高，难以实施拔牙处置，给猪场带来巨大的损失。仅通过常规的ASFV P72荧光定量PCR试剂盒难以在早期发现疫情、对野毒和基因缺失弱毒株进行鉴别诊断，以采取针对性的防控措施。所以急需一种可以在现场快速高灵敏鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是无论核酸提取还是荧光PCR检测都存在或是涉及需要外部电源的实验室设备(如荧光PCR检测仪和离心机)、几个小时的测定时间、和训练有素的技术人员，或是提取时间长、需要离心、多个移液转液步骤等问题，不能满足将集中式实验室测试转变为现场养殖环境中普遍存在的核酸检测微型化和实用化的需求。

为解决上述问题，本发明提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，该试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为45分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，包括以下组分：

表1非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分

编号	名称	数量	备注
				1	采样用核酸吸附材料	6个
2	阳性对照膜片	1个	4至-20℃保存
				3	阴性对照膜片	1个	4至-20℃保存
4	样品采集管	6个	4至-20℃保存
				5	漂洗管A(红盖)	6个
6	漂洗管B(蓝盖)	6个
				7	扩增检测管	8个
8	研磨棒	6个
				9	牙签	1包(30支)
10	滤纸条	4条
				11	说明书	1份

本发明基于

Cards,Whatman^TM(GE Healthcare,USA)生产的核酸现场快速提取试剂盒可用于动物血液、组织、肛拭子等样本核酸的现场快速提取，整个过程只需3-5分钟，无需任何设备(中途无需过柱离心、热处理等烦琐步骤)，通过直接从膜片中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。另外本发明将在此基础上，通过采用石蜡包埋技术和特异性引物设计以改进试剂盒在气溶胶污染和检测灵敏度低等方面存在的问题，研制出简单便携、灵敏特异、低成本、适用于现场检测ASFV的试剂盒。

进一步的，所述扩增检测管内预装检测试剂包括p72基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因的特异性引物，见表2。

表2 p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物序列

本试剂盒具备同时检测B646L基因(p72)、MGF_360-14L基因(位于MGF360-505R基因中间)和CD2v基因的保守区，来鉴定病原体是强毒株、单基因缺失弱毒株还是双基因缺失弱毒株，根据不同的毒株、感染率采取不同的精准清除或者清场方案。

进一步的，所述表中样品采集管内预装30～50μl样品裂解液，样品裂解液为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和

的混合液，体积比为4:1:4:2；其中，所述SEMP液的组成为1M Tris·HCl(pH8.0)、700mM EDTA、10％SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，体积比为1:10:10:1:20:58，pH为8.0。

进一步的，所述表中漂洗管A中预装100～500μl 95％乙醇；漂洗管B中预装100～500μl70％～80％乙醇。

进一步的，所述表中扩增检测管编号分别为“1～6”、“－”和“+”。所述各检测管预装检测试剂由石蜡(熔点为53-58℃)分割为上下两层，下层为10×Bst buffer、10mMdNTPs、5M Betaine、100mM MgSO₄、350mM MnCl₂和3.5mM Caclein，上层为Bst 2.0

DNA聚合酶和ddH₂O以及检测p72、MGF_360-14L或CD2v任一基因的特异性引物。

进一步地，所述用于检测ASFV三个基因的扩增检测管内预包埋检测试剂体系分别为：Bst 2.0

DNA聚合酶1.0μL、10×Bst buffer 3.5μL、25mM dNTPs 1.96μL、5MBetaine 7.64μL、100mM MgSO42.1μL、350mM MnCl20.05μL、3.5mM Caclein 0.25μL、ddH2O15.0μL以及相对应的p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物包括：40μM FIP 1.0μL、40μM BIP 1.0μL、40μM LF或ddH₂O 0.5μL、40μM LB 0.5μL、20μM F30.25μL、20μM B30.25μL。

进一步的，所述非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为6个样本使用量，样本量可以扩大到12T，24T，36T。

本发明提供一种非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具体包括以下操作步骤：

(1)样品裂解：取动物静脉血(约50-100μl)、肛拭子(约0.05-0.1g)或组织样品(约0.05-0.1g)加入至样品采集管中，采用研磨棒研磨30～90秒；

(2)一次漂洗：取采样用核酸吸附材料(直径2～3mm)加入至上述样品采集管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至漂洗管A中，用牙签轻轻搅动5～15秒；

(3)二次漂洗：更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5～15秒)；

(4)扩增检测：再用新牙签将上述晾干的采样用核酸吸附材料和自封袋中的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色石蜡分隔上，将检测管置于恒温器中63～65℃(可以用水浴锅、金属浴或PCR仪保温；使用PCR仪时切勿用热盖程序)，3～5分钟后小心取出检测管，用手指轻弹管底3～5下，确保膜片下沉到下层反应液中，再迅速放回恒温器内保温50分钟；

(5)检测结果判读：用眼睛观察反应液颜色。阳性对照应显示为浑浊绿色，阴性对照应显示为澄清橙黄色，否则应判定实验结果无效。样品检测结果的判断应比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示浑浊淡绿色至浑浊绿色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阳性，如果样品的反应液显示澄清橙黄色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。

进一步的，所述采样用核酸吸附材料为

Cards,Whatman^TM(GE Healthcare,USA)经打孔器制作成直径2～3mm，能够有效吸附样品裂解液中的核酸。

本发明的有益效果在于：

(1)简单、便携：从核酸提取、扩增到检测结果判读既不需要吸取液体，也不需要离心，只需要一个保温设备；而且试剂盒中的所有试管均预装试剂，极大简化了操作复杂性，非常适用于非专业人士的核酸现场快速检测中。

(2)快速、准确：既往检测方法仅核酸提取过程耗时约30分钟～2小时，本发明从核酸提取、扩增到检测结果判读全过程不超过60分钟，且该试剂盒的诊断特异性(DSp)均为100％，诊断灵敏性(DSe)分别为94.7％、100.0％、92.3％，kappa值分别为0.95、1.00、0.94；与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒相比，本发明的试剂盒具有极好的可重复性(Kappa＞0.75)。

(3)独绝气溶胶的污染：检测管内采用石蜡分割体系，检测过程中反应体系由石蜡油包埋，检测结束后离开反应温度后石蜡迅速凝固，与检测管形成“双保险”，防止任何气溶胶的产生。

(4)成本非常低：包括有形成本(试剂盒成本和设备成本)和无形成本(时间成本)都明显低于现有的提取方法。

附图说明

图1是实施例1中的试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v检测的可行性分析。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。

ASFVp72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的阳性质粒构建为选取GenBack所报道的相关序列片段采用人工基因合成的方法制备(生工生物工程(上海)股份有限公司)。将p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性核酸片段克隆到pMD18-T载体上，分别构建pMD18-p72、pMD18-MGF_360-14L、pMD18-CD2v重组质粒，所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。

Bst 2.0

DNA聚合酶及配套10×Bst buffer和100mM MgSO4(#M0538L)，购自NEB。

5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱(C5H11NO2，分子量117.15)，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。

350mM MnCl2：购买无水氯化锰(MnCl2,MW 125.91)或者四水氯化锰(MnCl2·4H2O,MW197.91)，分析纯。称取4.407g无水氯化锰或者6.927g四水氯化锰，溶解于80mL无RNase水中，定容至100mL，分装为2mL/支，冻存于-20℃。

3.5mM Caclein：购买钙黄绿素(C30H26N2O13,MW 622.55)或钙黄绿素钠(Na2C30H26N2O13,MW 666.5)，分析纯。称取43.58mg钙黄绿素，加到6mL DMSO，溶解后，加约14mL无RNase水定容到20mL或者称取46.66mg钙黄绿素钠，溶解到20mL无RNase水中。所配溶液分装为0.5mL/支，冻存于-20℃。

采样用核酸吸附材料：

Cards,Whatman^TM购自美国GE Healthcare公司，经打孔器制作成直径2～3mm。

700mM EDTA：将260.4gNa2EDTA·2H2O溶于800ml双蒸水，用10M NaOH调节pH至8左右可助溶，完全溶解后，加双蒸水至1000ml。

10％SDS：将100g SDS溶解于双蒸水至1000ml，使用前溶液如果结晶，可在微波炉中略微加热使之溶解。

平衡酚：将苯酚重蒸馏，冷却后加入双蒸水至饱和并形成等体积水相，加入1/100总体积的1M Tris·HCl(pH8.0)，用浓盐酸调节混合物的pH至8.0；分装后，在-20℃保存。

样品裂解液配制：分别取1M Tris·HCl(pH8.0)、700mM EDTA、10％SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，按体积比1:10:10:1:20:58配置适量SEMP液，调pH到8.0。然后，将SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol，按体积比为4:1:4:2配置核酸提取试剂。

非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的组装：包括盒体、盒体内的试剂和耗材，说明书。盒体内的试剂分别为预装30～50μl样品裂解液的样品采集管、预装100～500μl 95％乙醇的漂洗管A、预装100～500μl 70％～80％乙醇的漂洗管B和预装检测试剂的扩增检测管双蒸水核酸洗脱管；盒体内的耗材分别为采样用核酸吸附材料、研磨棒、牙签、滤纸条以及阳性对照膜片、阴性对照膜片。

实施例1：试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v检测的可行性分析

方法步骤如下：

步骤(1)：分别将100copies/μl的pMD18-p72、pMD18-MGF_360-14L、pMD18-CD2v重组质粒混合，取混合液2μl加至核酸吸附材料中，使其充分吸收；

步骤(2)：将上述核酸吸附材料和阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上，将检测管置于WT-100手持式水生动物疫病快速诊断仪(深圳市安鑫宝科技发展有限公司)中，该仪器预置加热振动模块，于65℃反应3分钟后在相同的振动频率下，振动2次，25秒/次，间隔3秒，保证振动30秒，确保膜片下沉到下层反应液中并使反应体系及时混合均匀，每秒读取数值一次连续读取70分钟内的荧光值。

结果如图1所示，试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v均能正确识别，对三个基因的混样检测具有良好的特异性。根据实时检测数据分析得出试剂盒对100copies/μl的目标基因在35分钟时出现荧光拐点，45分钟时处于对数生长期。因此，确定本发明试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v的检测时长定为50分钟。

实施例2：本发明提供的非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒的提取效果对比分析

选取某疑似发病猪场40份以上发病样本，按照本发明试剂盒所述检测步骤对临床样本进行检测。同时，所有样本均采用检测各基因的基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒进行比较。

对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v，本发明提供的试剂盒的DSe值分别为94.7％、100.0％、92.3％，DSp值均为100％，kappa值分别为0.95、1.00、0.94(见表2)。结果表明，与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒相比，本发明提供的非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具有极好的可重复性(Kappa＞0.75)。

表2非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒对临床样品的测试比较结果

注：0＜Kappa≤0.40，则说明诊断试验的可重复性差；如果0.40＜Kappa＜0.75，则说明具有中、高度可重复性；如果Kappa≥0.75，那么该诊断试验就具有极好的可重复性。

由上述实施例可知，本发明提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，该试剂盒具有简便、快速、低成本、精确、无需特殊仪器等特点，可应用于非洲猪瘟三种基因的现场即时检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用

<130> 青岛农业大学

<140> 1

<141> 2021-03-17

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggattaaaa cctacctgga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaacggggc taatatcaga t 21

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgttaaca acatgtccga acttttcatc tccgatcaaa atcctc 46

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatgcagcc cactcaccac ttttagatga acatgcgtct gg 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgccaatct cggtgttgat 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacggtttcc aagagtgg 18

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttatacgtt tatttgtgga ttgg 24

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctggaaattt taaaagaagt ggccattttt gacaaaacat gtcataaccc a 51

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcggataca ggcgtcaagc ttttgggctt atacgtgttc ct 42

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaatcctgt gcaggagttc tac 23

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcccagttc cgcacaca 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acatgaacca tctcccaga 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcgggatac taggtagtg 19

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggacgcatgt agtaaatagg tgtatttttg aaccattact tcctaagcct 50

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtgtcctcca cccaaaccat ttttaatagg attcagctga agga 44

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtccgccacc caaacca 17

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于包括以下组分：

编号名称数量备注 1 采样用核酸吸附材料 6个 2 阳性对照膜片 1个 4至-20℃保存 3 阴性对照膜片 1个 4至-20℃保存 4 样品采集管 6个 4至-20℃保存 5 漂洗管A(红盖) 6个 6 漂洗管B(蓝盖) 6个 7 扩增检测管 8个 8 研磨棒 6个 9 牙签 1包(30支) 10 滤纸条 4条 11 说明书 1份

。

2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述扩增检测管内预装检测试剂包括p72基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因的特异性引物：

3.如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述扩增检测管编号分别为“1～6”、“－”和“+”；各扩增检测管内的预装检测试剂由石蜡分割为上下两层，下层为10×Bstbuffer、10mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO₄、350mM MnCl₂和3.5mMCaclein，上层为Bst 2.0

4.如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，其特征在于检测时包括以下步骤：

(1)样品裂解：取动物静脉血、肛拭子或组织样品加入至样品采集管中，采用研磨棒研磨30～90秒；

(2)一次漂洗：取采样用核酸吸附材料加入至上述样品采集管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至漂洗管A中，用牙签轻轻搅动5～15秒；

(3)二次漂洗：更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干；

(4)扩增检测：再用新牙签将上述晾干的采样用核酸吸附材料和自封袋中的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上，将检测管置于63～65℃，3～5分钟后小心取出检测管，用手指轻弹管底3～5下，确保膜片下沉到下层反应液中，再迅速放回恒温器内保温40分钟；

(5)检测结果判读：用眼睛观察反应液颜色。阳性对照应显示为浑浊绿色，阴性对照应显示为澄清橙黄色，否则应判定实验结果无效。样品检测结果的判断应比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示浑浊淡绿至浑浊绿色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阳性，如果样品的反应液显示澄清橙黄色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。