CN113073148A - 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113073148A CN113073148A CN202110376177.1A CN202110376177A CN113073148A CN 113073148 A CN113073148 A CN 113073148A CN 202110376177 A CN202110376177 A CN 202110376177A CN 113073148 A CN113073148 A CN 113073148A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- nucleic acid
- tube
- kit
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 80
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 101710085469 CD2 homolog Proteins 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 11
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 101150057545 p72 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 2
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于病毒检测技术领域,尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。包括采样用核酸吸附材料、阳性对照膜片、阴性对照膜片、样品采集管、漂洗管A(红盖)、漂洗管B(蓝盖)、扩增检测管、研磨棒、牙签、滤纸条、说明书。本发明试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪,或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置),检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为55分钟,检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异,且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360‑14L、CD2v三个基因。
Description
技术领域:
本发明属于病毒检测技术领域,尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。
背景技术:
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus,ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。自2018年8月初我国发生ASF疫情,扑杀生猪超过100万头,给我国养猪业造成了无法估量的损失。目前,ASF缺乏有效疫苗防制,建立快速、灵敏、特异的诊断方法对ASF的防控至关重要。由于对ASFV检测更简单、更快速的需求,促进了快速检测试剂盒的飞速发展。2019年1月4日,中国动物疫病预防控制中心批准了11家快速检测试剂方法,其中荧光PCR类有8家公司,核酸等温扩增类(LAMP检测试剂盒)有1家公司,试纸条类(主要为抗原检测试纸条)有2家公司。
2019到2020年,大规模养殖企业逐步建立了ASFV的荧光PCR实验室快速监测体系。通过检测人员、车辆、物资和环境擦拭物等样本,阻断传染源;通过定期抽检和对异常猪加强巡查和监测,在早期阶段及时发现猪场内的ASFV感染;一旦发现阳性猪,荧光PCR检测快速确定猪群感染率,排查传染源和传播途径。这一套体系可有效控制ASFV野毒感染,将疫情的损失控制在一定范围。然而,ASFV的荧光PCR检测方法需要训练有素的操作人员,且依赖于成本昂贵的检测仪器,限制了其在小规模养殖企业或散户检测的应用。
阻碍当前检测方法广泛应用的另一瓶颈是从复杂的生物样品中(如,动物血液、组织、肛拭子等样本)现场快速提取核酸的要求。基于核酸恒温扩增技术(Nucleic acidisothermal amplification technology,NAIAT)的核酸检测方法能够实现快速、简单、高效的扩增,且对仪器依赖性低,非常适用于现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)中,是一种极具应用潜力的核酸分析手段。考虑到当前猪场ASF基因缺失弱毒株的检出率逐渐上升,ASF基因缺失弱毒株在猪场内潜伏感染传播,在感染初期非常难以察觉,一旦发现感染率已经非常高,难以实施拔牙处置,给猪场带来巨大的损失。仅通过常规的ASFV P72荧光定量PCR试剂盒难以在早期发现疫情、对野毒和基因缺失弱毒株进行鉴别诊断,以采取针对性的防控措施。所以急需一种可以在现场快速高灵敏鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒。
发明内容:
本发明要解决的技术问题是无论核酸提取还是荧光PCR检测都存在或是涉及需要外部电源的实验室设备(如荧光PCR检测仪和离心机)、几个小时的测定时间、和训练有素的技术人员,或是提取时间长、需要离心、多个移液转液步骤等问题,不能满足将集中式实验室测试转变为现场养殖环境中普遍存在的核酸检测微型化和实用化的需求。
为解决上述问题,本发明提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒,该试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪,或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置),检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为45分钟,检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异,且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因。
为达到上述目的,本发明通过以下技术方案实现:
一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒,包括以下组分:
表1非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
编号 | 名称 | 数量 | 备注 |
1 | 采样用核酸吸附材料 | 6个 | |
2 | 阳性对照膜片 | 1个 | 4至-20℃保存 |
3 | 阴性对照膜片 | 1个 | 4至-20℃保存 |
4 | 样品采集管 | 6个 | 4至-20℃保存 |
5 | 漂洗管A(红盖) | 6个 | |
6 | 漂洗管B(蓝盖) | 6个 | |
7 | 扩增检测管 | 8个 | |
8 | 研磨棒 | 6个 | |
9 | 牙签 | 1包(30支) | |
10 | 滤纸条 | 4条 | |
11 | 说明书 | 1份 |
本发明基于Cards,WhatmanTM(GE Healthcare,USA)生产的核酸现场快速提取试剂盒可用于动物血液、组织、肛拭子等样本核酸的现场快速提取,整个过程只需3-5分钟,无需任何设备(中途无需过柱离心、热处理等烦琐步骤),通过直接从膜片中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。另外本发明将在此基础上,通过采用石蜡包埋技术和特异性引物设计以改进试剂盒在气溶胶污染和检测灵敏度低等方面存在的问题,研制出简单便携、灵敏特异、低成本、适用于现场检测ASFV的试剂盒。
进一步的,所述扩增检测管内预装检测试剂包括p72基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因的特异性引物,见表2。
表2 p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物序列
本试剂盒具备同时检测B646L基因(p72)、MGF_360-14L基因(位于MGF360-505R基因中间)和CD2v基因的保守区,来鉴定病原体是强毒株、单基因缺失弱毒株还是双基因缺失弱毒株,根据不同的毒株、感染率采取不同的精准清除或者清场方案。
进一步的,所述表中样品采集管内预装30~50μl样品裂解液,样品裂解液为SEMP液、3M醋酸钠、3~8M异硫氰酸胍和的混合液,体积比为4:1:4:2;其中,所述SEMP液的组成为1M Tris·HCl(pH8.0)、700mM EDTA、10%SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水,体积比为1:10:10:1:20:58,pH为8.0。
进一步的,所述表中漂洗管A中预装100~500μl 95%乙醇;漂洗管B中预装100~500μl70%~80%乙醇。
进一步的,所述表中扩增检测管编号分别为“1~6”、“-”和“+”。所述各检测管预装检测试剂由石蜡(熔点为53-58℃)分割为上下两层,下层为10×Bst buffer、10mMdNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4、350mM MnCl2和3.5mM Caclein,上层为Bst 2.0DNA聚合酶和ddH2O以及检测p72、MGF_360-14L或CD2v任一基因的特异性引物。
进一步地,所述用于检测ASFV三个基因的扩增检测管内预包埋检测试剂体系分别为:Bst 2.0DNA聚合酶1.0μL、10×Bst buffer 3.5μL、25mM dNTPs 1.96μL、5MBetaine 7.64μL、100mM MgSO42.1μL、350mM MnCl20.05μL、3.5mM Caclein 0.25μL、ddH2O15.0μL以及相对应的p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物包括:40μM FIP 1.0μL、40μM BIP 1.0μL、40μM LF或ddH2O 0.5μL、40μM LB 0.5μL、20μM F30.25μL、20μM B30.25μL。
进一步的,所述非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为6个样本使用量,样本量可以扩大到12T,24T,36T。
本发明提供一种非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具体包括以下操作步骤:
(1)样品裂解:取动物静脉血(约50-100μl)、肛拭子(约0.05-0.1g)或组织样品(约0.05-0.1g)加入至样品采集管中,采用研磨棒研磨30~90秒;
(2)一次漂洗:取采样用核酸吸附材料(直径2~3mm)加入至上述样品采集管中,用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后,挑取至漂洗管A中,用牙签轻轻搅动5~15秒;
(3)二次漂洗:更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到漂洗管B中,搅动核酸吸附材料10~30秒,挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5~15秒);
(4)扩增检测:再用新牙签将上述晾干的采样用核酸吸附材料和自封袋中的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色石蜡分隔上,将检测管置于恒温器中63~65℃(可以用水浴锅、金属浴或PCR仪保温;使用PCR仪时切勿用热盖程序),3~5分钟后小心取出检测管,用手指轻弹管底3~5下,确保膜片下沉到下层反应液中,再迅速放回恒温器内保温50分钟;
(5)检测结果判读:用眼睛观察反应液颜色。阳性对照应显示为浑浊绿色,阴性对照应显示为澄清橙黄色,否则应判定实验结果无效。样品检测结果的判断应比对阳性和阴性对照进行;如果样品的反应液显示浑浊淡绿色至浑浊绿色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阳性,如果样品的反应液显示澄清橙黄色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。
本发明的有益效果在于:
(1)简单、便携:从核酸提取、扩增到检测结果判读既不需要吸取液体,也不需要离心,只需要一个保温设备;而且试剂盒中的所有试管均预装试剂,极大简化了操作复杂性,非常适用于非专业人士的核酸现场快速检测中。
(2)快速、准确:既往检测方法仅核酸提取过程耗时约30分钟~2小时,本发明从核酸提取、扩增到检测结果判读全过程不超过60分钟,且该试剂盒的诊断特异性(DSp)均为100%,诊断灵敏性(DSe)分别为94.7%、100.0%、92.3%,kappa值分别为0.95、1.00、0.94;与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒相比,本发明的试剂盒具有极好的可重复性(Kappa>0.75)。
(3)独绝气溶胶的污染:检测管内采用石蜡分割体系,检测过程中反应体系由石蜡油包埋,检测结束后离开反应温度后石蜡迅速凝固,与检测管形成“双保险”,防止任何气溶胶的产生。
(4)成本非常低:包括有形成本(试剂盒成本和设备成本)和无形成本(时间成本)都明显低于现有的提取方法。
附图说明
图1是实施例1中的试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v检测的可行性分析。
具体实施方式:
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行;所述试剂和材料,均采用分析纯试剂,如无特殊说明,均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。
ASFVp72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的阳性质粒构建为选取GenBack所报道的相关序列片段采用人工基因合成的方法制备(生工生物工程(上海)股份有限公司)。将p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性核酸片段克隆到pMD18-T载体上,分别构建pMD18-p72、pMD18-MGF_360-14L、pMD18-CD2v重组质粒,所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。
5M Betaine(非盐酸盐):购买甜菜碱(C5H11NO2,分子量117.15),分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g,用100mL无RNase水溶解后,在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2,加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。
350mM MnCl2:购买无水氯化锰(MnCl2,MW 125.91)或者四水氯化锰(MnCl2·4H2O,MW197.91),分析纯。称取4.407g无水氯化锰或者6.927g四水氯化锰,溶解于80mL无RNase水中,定容至100mL,分装为2mL/支,冻存于-20℃。
3.5mM Caclein:购买钙黄绿素(C30H26N2O13,MW 622.55)或钙黄绿素钠(Na2C30H26N2O13,MW 666.5),分析纯。称取43.58mg钙黄绿素,加到6mL DMSO,溶解后,加约14mL无RNase水定容到20mL或者称取46.66mg钙黄绿素钠,溶解到20mL无RNase水中。所配溶液分装为0.5mL/支,冻存于-20℃。
700mM EDTA:将260.4gNa2EDTA·2H2O溶于800ml双蒸水,用10M NaOH调节pH至8左右可助溶,完全溶解后,加双蒸水至1000ml。
10%SDS:将100g SDS溶解于双蒸水至1000ml,使用前溶液如果结晶,可在微波炉中略微加热使之溶解。
平衡酚:将苯酚重蒸馏,冷却后加入双蒸水至饱和并形成等体积水相,加入1/100总体积的1M Tris·HCl(pH8.0),用浓盐酸调节混合物的pH至8.0;分装后,在-20℃保存。
样品裂解液配制:分别取1M Tris·HCl(pH8.0)、700mM EDTA、10%SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水,按体积比1:10:10:1:20:58配置适量SEMP液,调pH到8.0。然后,将SEMP液、3M醋酸钠、3~8M异硫氰酸胍和Trizol,按体积比为4:1:4:2配置核酸提取试剂。
非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的组装:包括盒体、盒体内的试剂和耗材,说明书。盒体内的试剂分别为预装30~50μl样品裂解液的样品采集管、预装100~500μl 95%乙醇的漂洗管A、预装100~500μl 70%~80%乙醇的漂洗管B和预装检测试剂的扩增检测管双蒸水核酸洗脱管;盒体内的耗材分别为采样用核酸吸附材料、研磨棒、牙签、滤纸条以及阳性对照膜片、阴性对照膜片。
实施例1:试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v检测的可行性分析
方法步骤如下:
步骤(1):分别将100copies/μl的pMD18-p72、pMD18-MGF_360-14L、pMD18-CD2v重组质粒混合,取混合液2μl加至核酸吸附材料中,使其充分吸收;
步骤(2):将上述核酸吸附材料和阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上,将检测管置于WT-100手持式水生动物疫病快速诊断仪(深圳市安鑫宝科技发展有限公司)中,该仪器预置加热振动模块,于65℃反应3分钟后在相同的振动频率下,振动2次,25秒/次,间隔3秒,保证振动30秒,确保膜片下沉到下层反应液中并使反应体系及时混合均匀,每秒读取数值一次连续读取70分钟内的荧光值。
结果如图1所示,试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v均能正确识别,对三个基因的混样检测具有良好的特异性。根据实时检测数据分析得出试剂盒对100copies/μl的目标基因在35分钟时出现荧光拐点,45分钟时处于对数生长期。因此,确定本发明试剂盒对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v的检测时长定为50分钟。
实施例2:本发明提供的非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒的提取效果对比分析
选取某疑似发病猪场40份以上发病样本,按照本发明试剂盒所述检测步骤对临床样本进行检测。同时,所有样本均采用检测各基因的基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒进行比较。
对目标基因p72、MGF_360-14L、CD2v,本发明提供的试剂盒的DSe值分别为94.7%、100.0%、92.3%,DSp值均为100%,kappa值分别为0.95、1.00、0.94(见表2)。结果表明,与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒相比,本发明提供的非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具有极好的可重复性(Kappa>0.75)。
表2非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的商品化qPCR检测试剂盒对临床样品的测试比较结果
注:0<Kappa≤0.40,则说明诊断试验的可重复性差;如果0.40<Kappa<0.75,则说明具有中、高度可重复性;如果Kappa≥0.75,那么该诊断试验就具有极好的可重复性。
由上述实施例可知,本发明提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒,该试剂盒具有简便、快速、低成本、精确、无需特殊仪器等特点,可应用于非洲猪瘟三种基因的现场即时检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用
<130> 青岛农业大学
<140> 1
<141> 2021-03-17
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggattaaaa cctacctgga a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaacggggc taatatcaga t 21
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgttaaca acatgtccga acttttcatc tccgatcaaa atcctc 46
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatgcagcc cactcaccac ttttagatga acatgcgtct gg 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgccaatct cggtgttgat 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagagataa gctttcagga tagag 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacggtttcc aagagtgg 18
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttatacgtt tatttgtgga ttgg 24
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggaaattt taaaagaagt ggccattttt gacaaaacat gtcataaccc a 51
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcggataca ggcgtcaagc ttttgggctt atacgtgttc ct 42
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaatcctgt gcaggagttc tac 23
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcccagttc cgcacaca 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acatgaacca tctcccaga 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcgggatac taggtagtg 19
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggacgcatgt agtaaatagg tgtatttttg aaccattact tcctaagcct 50
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgtcctcca cccaaaccat ttttaatagg attcagctga agga 44
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtccgccacc caaacca 17
Claims (4)
1.一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒,其特征在于包括以下组分:
。
4.如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒,其特征在于检测时包括以下步骤:
(1)样品裂解:取动物静脉血、肛拭子或组织样品加入至样品采集管中,采用研磨棒研磨30~90秒;
(2)一次漂洗:取采样用核酸吸附材料加入至上述样品采集管中,用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后,挑取至漂洗管A中,用牙签轻轻搅动5~15秒;
(3)二次漂洗:更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到漂洗管B中,搅动核酸吸附材料10~30秒,挑取至滤纸条吸干再适当晾干;
(4)扩增检测:再用新牙签将上述晾干的采样用核酸吸附材料和自封袋中的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上,将检测管置于63~65℃,3~5分钟后小心取出检测管,用手指轻弹管底3~5下,确保膜片下沉到下层反应液中,再迅速放回恒温器内保温40分钟;
(5)检测结果判读:用眼睛观察反应液颜色。阳性对照应显示为浑浊绿色,阴性对照应显示为澄清橙黄色,否则应判定实验结果无效。样品检测结果的判断应比对阳性和阴性对照进行;如果样品的反应液显示浑浊淡绿至浑浊绿色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阳性,如果样品的反应液显示澄清橙黄色则表示该样品的非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110376177.1A CN113073148A (zh) | 2021-04-08 | 2021-04-08 | 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110376177.1A CN113073148A (zh) | 2021-04-08 | 2021-04-08 | 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113073148A true CN113073148A (zh) | 2021-07-06 |
Family
ID=76615477
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110376177.1A Pending CN113073148A (zh) | 2021-04-08 | 2021-04-08 | 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113073148A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113584226A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-02 | 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司 | 鉴别诊断非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针及其应用 |
CN114410845A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-29 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式pcr引物组、试剂盒 |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102703431A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 基于石蜡的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂 |
CN105420416A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-03-23 | 北京纳捷诊断试剂有限公司 | 一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光pcr方法 |
CN107020057A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-08-08 | 上海仁度生物科技有限公司 | 利用石蜡的相变转换隔离反应体系的方法 |
CN109628644A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 许昌佰柯蛋白与基因工程研究院有限公司 | 一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用 |
CN110093457A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-06 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒asfv-lamp检测引物组及试剂盒 |
CN110305984A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 |
CN110656202A (zh) * | 2019-05-28 | 2020-01-07 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及其应用 |
CN110791591A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-14 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的lamp检测引物及试剂盒 |
CN110885905A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-17 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 |
CN111020062A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-04-17 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒 |
CN111139287A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-12 | 青岛农业大学 | 一种应用于动物组织中核酸现场提取方法 |
CN111270019A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-06-12 | 北京市动物疫病预防控制中心 | 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法 |
CN111939996A (zh) * | 2020-10-19 | 2020-11-17 | 博奥生物集团有限公司 | 一种试管内试剂存储方法及试剂存储反应检测一体化试管 |
CN111996191A (zh) * | 2020-09-28 | 2020-11-27 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒 |
CN112094948A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-18 | 上海真测生物科技有限公司 | 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒 |
-
2021
- 2021-04-08 CN CN202110376177.1A patent/CN113073148A/zh active Pending
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102703431A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 基于石蜡的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂 |
CN105420416A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-03-23 | 北京纳捷诊断试剂有限公司 | 一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光pcr方法 |
CN107020057A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-08-08 | 上海仁度生物科技有限公司 | 利用石蜡的相变转换隔离反应体系的方法 |
CN109628644A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 许昌佰柯蛋白与基因工程研究院有限公司 | 一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用 |
CN110656202A (zh) * | 2019-05-28 | 2020-01-07 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及其应用 |
CN110093457A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-06 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒asfv-lamp检测引物组及试剂盒 |
CN110305984A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 |
CN110885905A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-03-17 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒 |
CN110791591A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-14 | 华南农业大学 | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的lamp检测引物及试剂盒 |
CN111020062A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-04-17 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒 |
CN111139287A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-12 | 青岛农业大学 | 一种应用于动物组织中核酸现场提取方法 |
CN111270019A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-06-12 | 北京市动物疫病预防控制中心 | 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法 |
CN112094948A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-18 | 上海真测生物科技有限公司 | 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒 |
CN111996191A (zh) * | 2020-09-28 | 2020-11-27 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒 |
CN111939996A (zh) * | 2020-10-19 | 2020-11-17 | 博奥生物集团有限公司 | 一种试管内试剂存储方法及试剂存储反应检测一体化试管 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113584226A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-02 | 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司 | 鉴别诊断非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针及其应用 |
CN114410845A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-29 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式pcr引物组、试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yagupsky et al. | Laboratory diagnosis of human brucellosis | |
Go et al. | Evaluation and clinical validation of two field–deployable reverse transcription-insulated isothermal pcr assays for the detection of the middle east respiratory syndrome–coronavirus | |
Luce-Fedrow et al. | Strategies for detecting rickettsiae and diagnosing rickettsial diseases | |
CN103320434B (zh) | 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法 | |
CN110777220B (zh) | 一种引物组、探针、rpa试纸条试剂盒、鉴别方法 | |
CN110551846A (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
CN113073148A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用 | |
CN105420379A (zh) | 牛支原体的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 | |
Thapa et al. | Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by a dry methyl green loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method | |
CN108048584A (zh) | Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒 | |
CN102286617B (zh) | 斑疹伤寒群立克次体荧光定量pcr试剂盒 | |
CN111286559A (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
CN113186312B (zh) | 一种区分布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的分子标记 | |
CN109486973A (zh) | 一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法 | |
Ghosh et al. | Human papillomavirus testing for suspected cervical cancer patients from Southern Assam by fast-PCR | |
CN106048081A (zh) | 一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用 | |
CN113774166A (zh) | 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 | |
Dogadov et al. | Natural infection of captive cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) with hepatitis E virus genotype 4 | |
CN110607398A (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
Mudhigeti et al. | Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detection and typing of human papilloma virus 16 and 18 from endocervical samples | |
CN106435015B (zh) | 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒 | |
CN113755614A (zh) | 布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 | |
Kim et al. | Modern methods of diagnosis | |
Yin et al. | Visual detection of fowl adenovirus serotype 4 via a portable CRISPR/Cas13a-based lateral flow assay | |
CN116334305A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210706 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |