CN110656202A - 一种非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及ASFV检测方法。为应对2018年在我国发现的非洲猪瘟疫情，本发明使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于毒株检测和出入境快速筛查。所述LAMP检测方法可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。

Description

一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及其应用。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病时间短，病死率高。ASF是对养猪业危害最为严重的疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。ASFV属于双链DNA病毒目非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，该属目前仅有一个ASFV病毒种。ASFV的基因组为单分子线状DNA，长度约170～190kb。ASFV个体较大，直径可达200nm，表面为二十面体结构和一层含类脂的囊膜，因此高温和一些破坏囊膜的消毒剂均可有效杀灭ASFV。但是由于其复杂的分子结构，ASFV对消毒剂的抵抗力较其他的囊膜病毒稍强，特别是在一些猪肉制品或血液中存活时间更长。据报道，ASFV在在血液、粪便和组织中存活时间长达半年，在生肉或者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达3个月，这就导致ASFV一旦传入，往往在疫源地长期存在，造成二次或次级感染。非洲猪瘟的发病率和病死率均可达到100％，且目前世界范围内尚无有效疫苗问世，其扩散和流行对养猪产业可能造成毁灭性打击，由此产生的间接损失则无法估量。

非洲猪瘟病毒在1921年第一次被发现于肯尼亚，1957年ASF从非洲大陆传出，并于葡萄牙的里斯本地区暴发疫情，随后蔓延至西班牙、意大利、法国、比利时、荷兰、马耳他等欧洲国家。2018年8月3日，沈阳市沈北新区某猪场证实发生ASF疫情。这是我国首次发生ASF，分子流行病学研究结果表明，传入我国的非洲猪瘟病毒属基因Ⅱ型，与格鲁吉亚、俄罗斯、波兰公布的毒株全基因组序列同源性为99.95％左右。截至2018年12月3日，全国共有21个省份发生79起家猪疫情、2起野猪疫情，全国累计扑杀生猪63.1万头(来源：农业农村部、新华网)，直接经济损失达到数十余亿元。由于对ASF不能进行预防接种和有效治疗，其防控工作必须采取扑杀净化措施，严重干扰了养殖业的正常生产和生活秩序，造成重大经济损失。因此，非洲猪瘟已经成为我国养猪业的巨大威胁，其研究成果具有重大政治经济意义。

现有的实验室检测方法主要有血清学方法和病原学方法。血清学方法主要有间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验等，其中酶联免疫吸附试验已经有商品化的试剂盒出售。ASFV的病原学方法也有很多，如病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA法、普通PCR和荧光PCR方法等，其中OIE推荐的普通PCR和荧光PCR方法最为常用。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中提到了3种ASFV病原学检测方法：双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应(OIE官方网站)。除此以外，还要加大ASF防控技术研制工作力度，尽快开发简易、高效、特异的诊断试剂和诊断方法，并能够与古典猪瘟、高致病性猪蓝耳病等其他猪群疫病相鉴别。

环介导等温扩增法(Loop mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的核酸扩增技术，它采用独特的引物设计实现等温条件下的核酸快速扩增。在现有期刊文献中也出现了多篇LAMP检测非洲猪瘟的文章，例如江彦增等①、杨吉飞等②、王彩霞等③、王华等④均建立了非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法，然而，市场上并未出现相关的产品。为了将该技术运用到ASFV的检测和产品中，应对2018年在我国发现的非洲猪瘟疫情，本研究使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于毒株检测和出入境快速筛查，且检测结果准确性高，重复性好。

发明内容：

为了解决非洲猪瘟检测常规检测方法效率低、对于仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，本发明旨在提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及其应用，该LAMP检测方法可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。

本发明的目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因。

本发明的另一目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，该试剂盒采用环介导等温扩增技术通过对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因的检测，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。

本发明的第三个目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，该检测方法可快速检出ASF，检测结果准确性高，重复性好。所述方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的，例如，科研当中病毒的确认、病毒的分型鉴定等。

为了实现上述目的，本发明提供非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物。其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

4F3 ACGCAGAGATAAGCTT(SEQ ID No.1)

4B3 AAGGTAATCATCATCGC(SEQ ID No.2)

内引物：

4FIP TGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC(SEQ ID No.3)

4BIP CCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT(SEQ ID No.4)

环引物

4LoopF ATAGATGAACATGCGTC(SEQ ID No.5)

4LoopB AGTTCTGCAGCTCTTA(SEQ ID No.6)。

本发明另提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组。

优选的，所述试剂盒包含以上所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。

优选的，外引物、环引物、内引物的摩尔比为4FIP：4BIP：4LoopF；4LoopB：4F3；4B3为10∶10∶4∶4∶1∶1。

优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

所述LAMP反应液可以为商业化购买的缓冲液，例如荣研生物科技(中国)公司核糖核酸扩增试剂盒中的缓冲液、新海基因的LAMP浊度扩增试剂盒(产品编号：A3803A/A3803B)等，或者是自行配制的LAMP反应液。

优选的，所述LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液。

优选的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为无菌水，优选采用双蒸水、三蒸水或者DEPC水。

优选的，所述阳性对照为含有p72基因的质粒DNA。

优选的，所述p72基因的序列如SEQ ID No.7所示。

本发明另提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有以上所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后于63-68℃下反应30-60min；

(3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带，如反应管中溶液变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带则判定为阳性，否则为阴性。

优选的，还可以在环介导等温扩增反应体系中增加显色剂或者荧光物质，通过颜色变化或者荧光检测进行结果的判定。

优选的，反应温度为65℃，反应时间为40min。

所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

第一，本发明选取非洲猪瘟病毒的保守基因序列p72作为检测的目标基因，能够检测多种基因型和不同的毒株可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，对于猪场或者养殖区域进行净化工作具有重要的意义。

第二，本发明采用LAMP技术，其特异性高，仅能特异性扩增非洲猪瘟病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。

第三，本发明的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法灵敏度高，最低检测极限是10拷贝阳性质粒DNA，高于现有技术报道的LAMP检测方法，相比OIE推荐的PCR检测方法，其灵敏度提高了近50倍。

第四，操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳、添加显色剂显色或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，不仅适合猪场现场检测，也适合科研单位进行运用和推广。

附图说明：

图1：酶切验证图：1，pUC57-P72质粒；2，通过SalI-XbaI酶切后的质粒pUC57-P72；M，Marker。

图2：LAMP检测结果图：1，检测ddH₂O；2，质粒pUC57-P72作为模板进行检测；3，以SPF猪淋巴结提取的DNA作为模板进行LAMP检测。

图3：LAMP检测结果电泳图：1，检测ddH₂O；2，质粒pUC57-P72作为模板进行检测；3，以SPF猪淋巴结提取的DNA作为模板进行LAMP检测；M，Marker。

图4：LAMP灵敏度试验结果图:1，质粒1×10⁷拷贝/μl；2，质粒1×10⁶拷贝/μl；3，质粒1×10⁵拷贝/μl；4，质粒1×10⁴拷贝/μl；5，质粒1×10³拷贝/μl；6，质粒1×10²拷贝/μl；7，质粒1×10¹拷贝/μl；8，质粒1×10⁰拷贝/μl；9，阳性对照质粒pUC57-P72；10，阴性对照。

图5：LAMP灵敏度试验结果电泳图:1，阳性对照质粒pUC57-P72；2，质粒1×10⁷拷贝/μl；3，质粒1×10⁶拷贝/μl；4，质粒1×10⁵拷贝/μl；5，质粒1×10⁴拷贝/μl；6，质粒1×10³拷贝/μl；7，质粒1×10²拷贝/μl；8，质粒1×10¹拷贝/μl；9，质粒1×10⁰拷贝/μl；10，阳性对照质粒pUC57-P72；11，阴性对照。

图6：LAMP检测实验样品的重复性检测结果图：1，阴性对照(清亮)；2，阳性质粒pUC57-P72-1；3，阳性质粒pUC57-P72-2；4，阳性质粒pUC57-P72-3；5，阳性质粒pUC57-P72-4；6，阳性质粒pUC57-P72-5；7，阳性对照。

图7：LAMP特异性检测结果图：1，非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72；2，猪日本乙型脑炎病毒；3，猪瘟病毒；4，猪细小病毒；5，猪伪狂犬病毒；6，猪圆环病毒；7，猪传染性胃肠炎病毒；8，SPF猪淋巴结；9，SPF猪血清；10，阴性对照。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不局限于此。

实施例1：样品、引物设计和制备

1.1质粒、样品来源及实验地点

根据Genebank上提供的非洲猪瘟病毒P72蛋白基因(SEQ ID No.7所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成质粒pUC57-P72，溶解稀释至1.0×10⁷拷贝/μL。

猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪传染性胃肠炎病毒由陕西诺威利华生物科技有限公司提供。

SPF猪淋巴结、SPF猪血清采集自陕西诺威利华生物科技有限公司。

1.2阳性质粒的鉴定

对阳性质粒pUC57-P72的SalI-XbaI位点进行酶切，验证质粒的正确性。对阳性质粒pUC57-P72的SalI-XbaI位点进行酶切鉴定，结果表明，质粒形态正常、目的基因大小正确、载体大小正确、电泳条带清晰、无基因组、无杂带。结果如图1所示。

1.3 ASFV LAMP引物设计和筛选

根据Genebank公布的ASFV毒株P72基因序列，通过http：//PrimerExplorer.jp设计5套引物，引物序列如表1所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体引物序列如下表1所示：

表1非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组

实施例2：非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的建立

一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组。

优选的，所述试剂盒包含以上实施例1所述的引物组、Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。

优选的，外引物、环引物、内引物的比例为：外引物、环引物、内引物的摩尔比为4FIP：4BIP：4LoopF；4LoopB：4F3；4B3为10∶10∶4∶4∶1∶1。引物配制时，4FIP、4BIP、4LoopF、4LoopB、4F3、4B3，其与去离子水的最佳配比为10∶10∶4∶4∶1∶1∶250。

优选的，所述LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO₄水溶液。

所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为无菌水，优选采用双蒸水、三蒸水或者DEPC水。优选的，所述阳性对照为含有p72基因的质粒DNA。优选的，所述p72基因的序列如SEQ ID No.7所示。

【注意事项】

1.为了减少交叉污染，请分区操作(试剂和模板的配置操作最好在不同区域中进行)。

2.各区物品均为专用，不可交叉使用，防止污染。

3.实验过程中应穿工作服，带手套，口罩。

实施例3：非洲猪瘟LAMP检测方法的建立

3.1 LAMP反应体系的建立

根据实施例2的试剂盒，利用以上引物确定非洲猪瘟病毒LAMP检测的25μl反应体系中各组分的含量及比例，将其置于恒温容器中进行扩增。通过肉眼观察白色浑浊和凝胶电泳相结合，判断检测结果。其中25μL反应体系如表2所示。

表2 25μL反应体系

3.2 LAMP反应

3.2.1 LAMP反应时间的确定

按照上述已确定的LAMP反应体系，假定在65℃的条件下，将阳性质粒pUC57-P72分别进行20min、30min、40min、50min、60min的特异性扩增，记录结果，确定最佳反应时间。

分别将浓度为10⁴拷贝的阳性质粒pUC57-P72在65℃下，分别在20min、30min、40min、50min、60min的时间下进行特异性扩增，结果表明，在40min及以后，阳性质粒pUC57-P72LAMP反应管均呈现白色浑浊(见图2)，经凝胶电泳，可见梯状条带(见图3)即检测结果为阳性。因此，其最佳反应时间为40min。

3.2.2 LAMP反应温度的确定

根据上述已确定的反应体系及反应时间。分别将浓度为10⁴拷贝阳性质粒pUC57-P72在60-70℃下，设置61℃、63℃、65℃、67℃、69℃五个温度进行反应，观察试验结果，确定最佳反应温度。

结果表明在65℃的条件下，阳性质粒pUC57-P72LAMP反应管均呈现白色浑浊。因此，其最佳反应温度为65℃。

3.2.3非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度检测

非洲猪瘟阳性冻干质粒pUC57-P72用ddH₂O将质粒充分溶解稀释到1×10⁷个拷贝数，溶解后的质粒在-20℃中保存，备用。将稀释到1×10⁷拷贝/μl的质粒做10^-1～10^-7梯度稀释，分别对不同拷贝数的阳性质粒样本进行LAMP扩增。

非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72从10^-1～10^-6倍稀释的质粒中均可扩增到预期的阳性，可测到的质粒数为10拷贝/μl(见图4-5)。对上述样品检测的灵敏度结果见表3。

表3 LAMP检测实验样品的敏感性检测结果

可见，本发明所构建的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为10拷贝/μL。相比OIE推荐的PCR检测方法约500拷贝的灵敏度(参见参考文献①)，本发明的灵敏度提高了约50倍。

3.3非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的敏感性试验

用试剂盒检测5份敏感性质控样品：非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-1、非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-2、非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-3、非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-4、非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-5，分别将5种4μg非洲猪瘟阳性冻干质粒用ddH₂O将质粒充分溶解稀释到1×10⁷个拷贝数，重复检测3次。

用本研究研制的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒检测5份敏感性质控样品，重复检测3次，5份3次检测的敏感性质控样品均为阳性(见图6)。对上述样品检测的灵敏度和重复性结果见表4。

表4 LAMP检测实验样品的重复性检测结果

3.4非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验

使用常规方法提取猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪传染性胃肠炎病毒、SPF猪淋巴结、SPF猪血清的核酸作为模板，与阳性质粒pUC57-P72一起应用本研究研制的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒分别进行检测，观察其特异性。

实验结果表明，用该试剂盒检测猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、SPF猪淋巴结、SPF猪血清，结果全为阴性。检测已知非洲猪瘟阳性质粒pUC57-P72-2，结果为阳性。结果见表5、图7。

表5 ASFV LAMP的特异性测定

实施例4：非洲猪瘟LAMP检测方法的灵敏度比较

在本发明研究过程中，对于引物进行了大量的优化工作，得到多组引物，并且比较了现有技术的多组引物，具体比较的引物组序列如下表6：

表6现有技术的引物组序列(对照组1--6)

注：以上对照组1-4的序列为现有技术中的引物序列，具体见背景技术部分的相关文献，对照组5为本公司研发过程中筛选较好的一组引物，对照组6为不含环引物的引物组。

采用以上实施例3中“3.2.3非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度检测”的方法测定了本发明实施例1的引物以及以上对照组1-6的敏感性，具体检测结果如下表7。

表7 LAMP检测实验样品的敏感性检测结果(一)

拷贝数

10<sup>8</sup>

10<sup>7</sup>

10<sup>6</sup>

10<sup>5</sup>

10<sup>4</sup>

10<sup>3</sup>

10<sup>2</sup>

10<sup>1</sup>

100

实施例1

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对照1

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对照2

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对照3

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对照4

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对照5

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对照6

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可见，本发明所构建的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为10拷贝/μL。相比现有技术的引物组1-4以及本公司产品开发过程中筛选的其他引物、以及不添加环引物的引物组，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，对于非洲猪瘟疫情早期或者潜伏期的检测具有更加重要的意义。

以上实施例是对本发明的进一步详细描述，给出实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

参考文献：

①江彦增，非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立，《中国农业科学院学位论文》，第31页。

②杨吉飞等，非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用，《中国动物传染病学报》，2011,19(4):7-12。

③王彩霞等，环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒，《动物医学进展》，2010年第31卷第2期：15-19。

④王华等，非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立，《中国兽医科学》，2010，40(09)：940-944。

序列表

<110> 陕西诺威利华生物科技有限公司

<120> 一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 4F3(ASFV)

<400> 1

acgcagagat aagctt 16

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 4B3(ASFV)

<400> 2

aaggtaatca tcatcgc 17

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 4FIP(ASFV)

<400> 3

tgatcggata cgtaacggga tagagataca gctcttc 37

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 4BIP(ASFV)

<400> 4

ccgtaactgc tcatggtacg tagtggaagg gtat 34

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 4LoopF(ASFV)

<400> 5

atagatgaac atgcgtc 17

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 4LoopB(ASFV)

<400> 6

agttctgcag ctctta 16

<210> 7

<211> 2366

<212> DNA

<213> P72(ASFV)

<400> 7

gtcacggacg ttgtaaaacg acggccagtg aattcgagct cggtacctcg cgaatgcatc 60

tagaatggca tcaggaggag ctttttgtct tattgctaac gatgggaagg ccgacaagat 120

tatattggcc caagacttgc tgaatagcag gatctctaac attaaaaatg tgaacaaaag 180

ttatgggaaa cccgatcccg aacccacttt gagtcaaatc gaagaaacac atttggtgca 240

ttttaatgcg cattttaagc cttatgttcc agtagggttt gaatacaata aagtacgccc 300

gcatacgggt acccccacct tgggaaacaa gcttaccttt ggtattcccc agtacggaga 360

ctttttccat gatatggtgg gccatcatat attgggtgca tgtcattcat cctggcagga 420

tgctccgatt cagggcacgt cccagatggg ggcccatggg cagcttcaaa cgtttcctcg 480

caacggatat gactgggaca accaaacacc cttagagggc gccgtttaca cgcttgtaga 540

tccttttgga agacccattg tacccggcac aaagaatgcg taccgaaact tggtttacta 600

ctgcgaatac cccggagaac gactttatga aaacgtaaga ttcgatgtaa atggaaattc 660

cctagacgaa tatagttcgg atgtcacaac gcttgtgcgc aaattttgca tcccagggga 720

taaaatgact ggatataagc acttggttgg ccaggaggta tcggtggagg gaaccagtgg 780

ccctctccta tgcaacattc atgatttgca caagccgcac caaagcaaac ctattcttac 840

cgatgaaaat gatacgcagc gaacgtgtag ccataccaac ccgaaatttc tttcacagca 900

ttttcccgag aactctcaca atatccaaac agcaggtaaa caagatatta ctcctatcac 960

ggacgcaacg tatctggaca taagacgtaa tgttcattac agctgtaatg gacctcaaac 1020

ccctaaatac tatcagcccc ctcttgcgct ctggattaag ttgcgctttt ggtttaatga 1080

gaacgtgaac cttgctattc cctcagtatc cattcccttc ggcgagcgct ttatcaccat 1140

aaagcttgca tcgcaaaagg atttggtgaa tgaatttcct ggactttttg tacgccagtc 1200

acgttttata gctggacgcc ccagtagacg caatatacgc tttaaaccat ggtttatccc 1260

aggagtcatt aatgaaatct cgctcacgaa taatgaactt tacatcaata acctgtttgt 1320

aacccctgaa atacacaacc tttttgtaaa acgcgttcgc ttttcgctga tacgtgtcca 1380

taaaacgcag gtgacccaca ccaacaataa ccaccacgat gaaaaactaa tgtctgctct 1440

taaatggccc attgaatata tgtttatagg attaaaacct acctggaaca tctccgatca 1500

aaatcctcat caacaccgag attggcacaa gttcggacat gttgttaacg ccattatgca 1560

gcccactcac cacgcagaga taagctttca ggatagagat acagctcttc cagacgcatg 1620

ttcatctata tctgatatta gccccgttac gtatccgatc acattaccta ttattaaaaa 1680

catttccgta actgctcatg gtatcaatct tatcgataaa tttccatcaa agttctgcag 1740

ctcttacata cccttccact acggaggcaa tgcgattaaa acccccgatg atccgggtgc 1800

gatgatgatt acctttgctt tgaagccacg ggaggaatac caacccagtg gtcatattaa 1860

cgtatccaga gcaagagaat tttatattag ttgggacacg gattacgtgg ggtctatcac 1920

tacggctgat cttgtggtat cggcatctgc tattaacttt cttcttcttc agaacggttc 1980

agctgtgctg cgttacagta cctaagtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta 2040

atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 2100

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 2160

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 2220

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tggggcgctc ttccgcttcc 2280

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 2340

aaggcggtaa tacggtatcc acagaa 2366

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 1F3(ASFV)

<400> 8

actgctcatg gtatca 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 1B3(ASFV)

<400> 9

atagcagatg ccgata 16

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 1FIP(ASFV)

<400> 10

ggtaatcatc atcgcaccat acccttccac tacg 34

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 1BIP(ASFV)

<400> 11

ttaacgtatc cagagcaaga agccgtagtg atagac 36

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 1LoopF(ASFV)

<400> 12

ttaatcgcat tgcctc 16

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 1LoopB(ASFV)

<400> 13

ttatattagt tgggacacg 19

Claims (12)

1.一种非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因。

2.一种非洲猪瘟病毒LAMP 检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物：

4F3 ACGCAGAGATAAGCTT（SEQ ID No.1）

4B3 AAGGTAATCATCATCGC（SEQ ID No.2）

内引物：

4FIP TGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC（SEQ ID No.3）

4BIP CCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT（SEQ ID No.4）

环引物

4LoopF ATAGATGAACATGCGTC（SEQ ID No.5）

4LoopB AGTTCTGCAGCTCTTA（SEQ ID No.6）。

3.权利要求1-2任一项所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组在制备非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒中的应用，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，外引物、环引物、内引物的摩尔比为4FIP：4BIP：4LoopF；4LoopB：4F3；4B3为10∶10∶4∶4∶1∶1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LAMP反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为无菌水，优选采用双蒸水、三蒸水或者DEPC水；优选的，所述阳性对照为含有p72基因的质粒DNA；更优选的，所述p72基因的序列如SEQ ID No.7所示。

9.一种非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样品DNA；

（2）环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有权利要求2所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后于63-68℃下反应30-60min；

（3）结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带，如反应管中溶液变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带则判定为阳性，否则为阴性。

10.根据权利要求9所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，其特征在于，还可以在环介导等温扩增反应体系中增加显色剂或者荧光物质，通过颜色变化或者荧光检测进行结果的判定。

11.根据权利要求9或10所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的。

12.根据权利要求1-2所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组在食品检测中的应用，其特征在于，将所述非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组用于生鲜猪肉、冷冻猪肉或者猪肉制品的检测，判断生鲜猪肉、冷冻猪肉或肉制品的原料肉是否存在非洲猪瘟病毒污染。

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