CN101225440B - 一种钩端螺旋体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钩端螺旋体的检测方法。即基于核酸等温扩增定量检测技术。本发明通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在一系列质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行检测，可实现对微量样本的定性定量检测。本发明与现有技术相比具有的有益效果：(1)等温扩增降低非特异性扩增几率，特异性好；(2)检测速度快、灵敏度高；(3)不需要特殊的设备，成本低；(4)操作简便，易于推广。本发明适用于试验研究、临床检测、环境检测等，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于临床医学和生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种钩端螺旋体的检测方法。
背景技术
钩端螺旋体病是一种全球流行的严重自然疫源性急性传染病，且是一种典型的人畜共患传染病。我国已有多个省市发现病人或病畜及带菌动物，已查出的带菌动物约有60多种。该病多发生在夏秋多雨季节，病势急剧，感染方式和临床表现由于不同的血清型感染而具有复杂性。
钩体病临床症状复杂。且缺乏特异的症状，不易诊断，尤其是患病初期。由于误诊而耽误治疗引起重症及死亡的病例时有报道，因此钩体的病原学检测和快速诊断，对预防和控制疾病有十分重要的意义。目前钩体诊断的方法主要有直接暗视野显微镜检查法、改良渡银染色法、免疫荧光检查法、间接血凝试验、反向被动血凝试验、凝集试验及凝集素吸收试验、膨胀试验、酶联免疫吸附试验等。1985年聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的诞生极大的推动了核酸检测技术甚至整个分子生物学技术的发展，并日渐成为核酸检测技术中的重要手段。随后又不断的出现了诸如逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-PCR，RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real TimeFluorescent Quantified PCR)等一系列的核酸扩增检测技术，可实现对核酸样品的扩增及定性定量检测。但PCR方法在实际应用中易引起非特异性扩增，实验前后也极易受环境中其它外源核酸的污染，因此常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，从而极大的限制了该技术在临床检测中的应用。实时荧光定量PCR虽然在技术上有很大的改进，并能对检测样品进行定量，但其昂贵的设备及高成本的检测阻碍了该技术的大规模推广使用。
环介导的等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)技术是一种可替代PCR的廉价、快速、简便、准确的核酸检测技术，其特点是对靶基因的6个部位设定4条引物，利用链置换反应在恒温条件下使靶基因高效扩增。LAMP技术与PCR技术有着相同的灵敏度，但其技术平台却比PCR更优越。由于其反应是多种引物共同启动，提高了反应结果的特异性；由于实行的是等温扩增，使得反应在恒温水浴箱中便可完成，不仅节约了仪器成本，而且使核酸检测操作方法更简便，适用于床边诊断和大量样品同时检测。
相对于PCR反应的“变性-退火-延伸”温度循环，本发明在整个扩增检测过程中保持恒温，减少了温度变化引起的非特异性扩增几率；同时由于扩增过程为恒温，不需要热循环仪，降低了检测成本。更为重要的是，LAMP扩增反应体系要求F3、B3、FIP和BIP 4条引物完全匹配才能进行扩增，因此反应体系中的其它外源污染核酸或引物对反应的干扰很小。通过设计与2条引物哑铃状结构5’末端的单链茎环区域互补的环引物，可提高LAMP方法中DNA合成的开始位点的数量，使得LAMP反应可在30分钟内完成，从而提高了反应的速度。LAMP技术以其简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，结果判断方法灵活简便，较其它技术更适合在临床或实验室诊断中的应用，开发的LAMP钩体筛查检测技术具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、经济的钩端螺旋体的检测方法。
钩端螺旋体的核酸检测方法是通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内参检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行核酸筛查或检测；
具体步骤如下：
1)根据钩端螺旋体LipL41基因序列设计LAMP反应特异性引物；
2)提取钩端螺旋体基因组DNA；
3)扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析；
4)分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应；
5)对LAMP反应的结果进行判定；
6)对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性。
所述的提取钩端螺旋体基因组DNA的步骤为：
1)10000rpm离心5min收集培养的钩端螺旋体后加入500μl digestionbuffer和3μl的蛋白酶溶液，37℃温育30min；
2)向上述溶液中加入300μl CTAB/NaCl混匀，65℃作用10min；
3)加入等体积的平衡酚混匀后室温放置5min；
4)4℃ 10000rpm离心5min，取上清并加入等体积的氯仿混匀后室温放置5min；
5)离心后取上清并加入1/3体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1小时以上；
6)离心去除上清，将沉淀重悬于100μl的TE缓冲液中。
所述的扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析方法包括如下步骤：
1)通过PCR方法获得编码钩体主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段；
2)将该片段与pGEM-T-easy载体连接，以构建重组质粒；
3)将连接产物转化大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆并提取质粒DNA；
4)测定抽提质粒DNA的浓度并进行梯度稀释；
5)用稀释的质粒DNA作为模板，进行LAMP反应；
6)取小量反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳出现梯形条带所需模板DNA的量而确定该LAMP反应的灵敏度。
所述的分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应为：LipL41特异性引物混合液3μl、Bst polymerase2μl和LipL41重组质粒或钩端螺旋体DNA1μl，加水至总体积为10μl，反应混合液在60-65℃反应30-60min，然后80℃放置2min以终止反应，各反应取2μl进行琼脂糖凝胶电泳。
所述的对LAMP反应结果进行判定的方法包括：1)：肉眼直接观察反应浊度，2)：DNA电泳，3)：实时浊度检测；在加入荧光染料后还可以通过4)：肉眼观察反应液颜色变化，5)：紫外照射下检测荧光，6)：实时检测荧光等上述6种方法中的一种或多种。
所述的对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性的方法为：在扩增目的片段的内部均有AluI酶切位点，将梯带状的LAMP扩增产物酶切为84bp和110bp的两个片段，通过AluI酶切鉴定该LAMP反应产物是否为特异性扩增。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：
1)简便的反应体系：在恒温条件下实现了等温扩增环节与定量检测环节的交互进行，在核酸等温扩增的同时，实现了荧光信号的积累，整个反应在一个体系中完成；
2)等温高效的扩增体系：本发明是基于具有链置换活性的Bst DNA聚合酶进行的等温扩增技术，在提供相应的反应成分的条件下，实现了待检靶基因的指数增加。在提高扩增效率的同时降低了检测仪器的成本，而且减少了反应中 不必要的非特异性扩增产物污染；
3)检测速度快；本发明的核酸检测技术，将扩增与检测两个反应过程相融合在一个反应体系中完成，整个过程没有升降温循环，节省了时间；同时通过设计与引物哑铃结构区域互补的滚环引物，可大大提高反应的速度；
4)检测灵敏度高：本发明的核酸检测技术，可在0.5-1小时的时间内实现对样本的106-109倍的扩增，最小可对10ng的核酸分子进行定量检测，提高了检测的灵敏度；
5)检测设备简单：相对于当然的核酸定量检测技术，本发明不需要特定的反应和检测仪器，只要普通的恒温水浴箱和荧光检测仪即可进行，便于应用和推广。
附图说明
图1是靶基因内参质控的LAMP反应电泳图谱；图中：M：DL2000DNAladder；1-11分别为LipL41质粒DNA梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11)液为模板进行LAMP反应的产物电泳图谱。
图2是各型钩端螺旋体LAMP反应的电泳图谱；图中：M：DNA ladder；1-15分别为各型钩体(56601、56602、56603、56604、56605、56606、56607、56608、56609、56610、56612、56615、56635、56655、56671)基因组DNA为模板进行LAMP反应产物的电泳图谱。
图3：LAMP反应产物的酶切鉴定图谱；图中：M：DNA ladder；1：LAMP反应产物；2：AluI酶切LAMP产物
具体实施方式
钩端螺旋体的核酸检测方法是通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内参检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行核酸筛查或检测；
具体步骤如下：
1)根据钩端螺旋体LipL41基因序列设计LAMP反应特异性引物如表所示；
编 名称 序列 长
号 度
F3 ATTGGAGCGGAAGCAATT 18
B3 GGAATTAACATCATACGTACTCC 23
01 FIP CCAGCTGCAACYGCATCGATGGTTACCAAAAACCTTATACAGAG 44
BIP GCAGGTTTCGCCGCTTCTATAGGTTTAGATACTGGTTCGTTTC 43
Loop B GGCAACTGGTAAAGACGTAAATACA 25
F3 GTAAATACAGGAAACGAACCA 21
B3 RCCCTTGATATAAGCAGCA 19
FIP CGCTTTTTTTACTTCCCCAGTTTCTATCTAAACCTACTGGAGTACG 46
02
BIP AGTCCTGCAAAAATTTTCAATAGCGATCCAAACCTTGTCCGAA 43
Loop F ACTTTAATGAGAGTAGCATCGAGAG 25
Loop B AGGGAATTTAGAATGTCCTTCAA 23
2)提取钩端螺旋体基因组DNA；
3)扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析；
4)分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应；LipL41特异性引物混合液3μl、Bst polymerase 2μl和LipL41重组质粒或钩端螺旋体DNA1μl，加水至总体积为10μl，反应混合液在60-65℃反应30-60min，然后80℃放置2min以终止反应，各反应取2μl进行琼脂糖凝胶电泳(结果如图1、2)。
5)对LAMP反应的结果进行判定；
6)对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性。在扩增目的片段的内部均有AluI酶切位点，将梯带状的LAMP扩增产物酶切为84bp和110bp的两个片段，通过AluI酶切鉴定该LAMP反应产物是否为特异性扩增(电泳结果如图3)。
所述的提取钩端螺旋体基因组DNA的步骤为：
1)10000rpm离心5min收集培养的钩端螺旋体后加入500μl digestionbuffer和3μl的蛋白酶溶液，37℃温育30min；
2)向上述溶液中加入300μl CTAB/NaCl混匀，65℃作用10min；
3)加入等体积的平衡酚混匀后室温放置5min；
4)4℃10000rpm离心5min，取上清并加入等体积的氯仿混匀后室温放 置5min；
5)离心后取上清并加入1/3体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1小时以上；
6)离心去除上清，将沉淀重悬于100μl的TE缓冲液中。
所述的扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析方法包括如下步骤：
1)通过PCR方法获得编码钩体主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段；
2)将该片段与pGEM-T-easy载体连接，以构建重组质粒；
3)将连接产物转化大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆并提取质粒DNA；
4)测定抽提质粒DNA的浓度并进行梯度稀释；
5)用稀释的质粒DNA作为模板，进行LAMP反应；
6)取小量反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳出现梯形条带所需模板DNA的量而确定该LAMP反应的灵敏度。
所述的对LAMP反应结果进行判定的方法包括：1)肉眼直接观察反应浊度，2)DNA电泳，3)实时浊度检测；在加入荧光染料后还可以通过4)肉眼观察反应液颜色变化，5)紫外照射下检测荧光，6)实时检测荧光上述6种方法中的一种或多种。其中：
1)：肉眼直接观察反应浊度：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应液中的Mg2+的结合，产生焦磷酸镁沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。定性观察：在反应结束后，实验结果可通过肉眼观察直接判读，反应体系中未加入内参质控品时可用此法。
2)：DNA电泳：取少量反应液进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下，EB染色的凝胶中出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应阳性。
3)：实时浊度检测：通过浊度仪及配套软件，实时反映混合液中浊度的变化并进行图形处理，判定结果。
4)、5)和6)均是根据在在加入荧光染料SYBR Green I后如果含有扩增产物，反应混合液变为绿色，否则则保持SYBR Green I的橙色不变的现象进行的反应结果判定。
本发明鉴别诊断系统中的试剂包括：
1)菌株：钩端螺旋体菌株及各对照菌株、载体大肠杆菌菌株DH10B由浙江大学医学院病原生物学系保存；pGEM-T-easy载体购自Promega公司。
2)酶与试剂：连接酶、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP购自TaKaRa公司；Bst DNA聚合酶(大片段)购自NEB公司。
3)生化试剂：IPTG、X-Gal、细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司。
4)培养基：大肠杆菌培养基为LB，钩端螺旋体为EMJH或柯氏培养基。
Claims (5)
1.一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内参检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行核酸筛查或检测；
具体步骤如下：
1)根据钩端螺旋体LipL41基因序列设计如下LAMP反应特异性引物：
2)提取钩端螺旋体基因组DNA；
3)扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析；
4)分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应；
5)对LAMP反应的结果进行判定；
6)对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性；。
2.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的提取钩端螺旋体基因组DNA的步骤为：
1)10 000rpm离心5min收集培养的钩端螺旋体后加入500μl digestionbuffer和3μl的蛋白酶溶液，37℃温育30min；
2)向上述溶液中加入300μl CTAB/NaCl混匀，65℃作用10min；
3)加入等体积的平衡酚混匀后室温放置5min；
4)4℃ 10 000rpm离心5min，取上清并加入等体积的氯仿混匀后室温放置5min；
5)离心后取上清并加入1/3体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1小时以上；
6)离心去除上清，将沉淀重悬于100μl的TE缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析方法包括如下步骤：
1)通过PCR方法获得编码钩端螺旋体主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段；
2)将该片段与pGEM-T-easy载体连接，以构建重组质粒；
3)将连接产物转化大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆并提取质粒DNA；
4)测定抽提质粒DNA的浓度并进行梯度稀释；
5)用稀释的质粒DNA作为模板，进行LAMP反应；
6)取小量反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳出现梯形条带所需模板DNA的量而确定该LAMP反应的灵敏度。
4.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的对LAMP反应结果进行判定的方法包括：1)肉眼直接观察反应浊度，2)DNA电泳，3)实时浊度检测；在加入荧光染料后还包括：4)肉眼观察反应液颜色变化，5)紫外照射下检测荧光，6)实时检测荧光。
5.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性的方法为：在扩增目的片段的内部均有AluI酶切位点，将梯带状的LAMP扩增产物酶切为84bp和110bp的两个片段，通过AluI酶切鉴定该LAMP反应产物是否为特异性扩增。
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