CN101935696B

CN101935696B - 检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量pcr方法及其引物和检测试剂盒

Info

Publication number: CN101935696B
Application number: CN201010138082A
Authority: CN
Inventors: 丁铲; 陈鸿军; 于圣青; 宋翠萍; 仇旭升; 胡青海; 韩先干
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-04-01
Also published as: CN101935696A

Abstract

本发明提供检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒，其采用16s rRNA基因序列为设计引物，上游引物：5’-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3’；下游引物：5’-GCGGTCTACTTAATCCGT-3’。本发明基于16s rRNA基因建立了鉴定犬猫钩端螺旋体的SYBR Green I荧光定量PCR方法。在最佳反应条件下反应效率为0.98，获得的标准曲线相关系数R值达1.000，标准曲线的线性范围达到1～1×10⁷拷贝8个数量级，最低可检测到约1个目的拷贝，即1.2fg DNA。本发明建立的SYBR Green I荧光定量方法具有特异性强、灵敏度高、定量范围广的特点。

Description

检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种快速检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法，还涉及该方法用的引物和检测试剂盒。属于生物制药技术领域。

背景技术：

钩端螺旋体(简称“钩体”)，隶属于螺旋体目钩端螺旋体科钩端螺旋体属(Leptospira)，分为致病性的问号钩体(L.interrogans)和腐生性的双曲钩端螺旋体(L.biflexa)。钩体的自然宿主众多，其中作为传染源对人类危害最大的主要是鼠类、蛙类和家畜(猪、牛、犬为主)。宠物犬作为目前与人类最为密切的伴侣动物，开展对伴侣动物的钩体检测和防治工作尤为重要。钩端螺旋体病感染人或宠物后，可通过多种途径交叉感染几乎所有温血动物，在临床症状消失后，即使犬体内有较高滴度抗体时，仍可通过尿液间歇性排菌达数月至数年，使犬成为危险的带菌者。

Meyer等报道了323例犬热病，并首次分离了犬钩端螺旋体。Randall和Copper等也成功分离鉴定了犬钩体。由于钩体血清群众多(28个血清群、250余个血清型)，各血清群、型抗体之间交叉保护作用较弱或无，不同国家甚至同一国家不同地区主要流行的钩体血清群、型差异很大，而生态环境改变、自然宿主变更、人口流行增强等原因，极易导致优势血清群型更迭，导致免疫失败。因此，研究具有不同血清群、型之间有广泛交叉保护作用的免疫原，对于钩体病诊断和预防均具有极为重要的意义。迄今为止，从犬体内已分离到菌群有：黄疸出血群、犬群、七日热群、秋季群、巴达维亚群、澳洲甲群、色若群、波摩那群等。在犬的钩体感染中，最常见的是犬群，但致死性的大多是黄疸出血群。犬感染后，血清抗体可存在数年至一生。我国已从犬中分离出8个型。犬型最常见，其次为黄疸出血型及波摩那型。

钩端螺旋体传统的检测方法主要是菌株分离培养和血清学检测。但该菌不易培养，早期患畜血液中虽含病原体，但抗体滴度很低，传统的血清学检测不易检测。因此，临床检测主要依赖分子检测方法。如：DNA探针检测；PCR扩增溶血相关抗原Hapl；利用LipL32作为模板；扩增16S rRNA片段；多重PCR扩增23S rDNA片段，并酶切鉴别致病菌株和非致病菌株。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种灵敏度高、特异性强的犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其该方法用的引物和检测试剂盒，为钩端螺旋体病早期快速进行特异性检测提供新途径。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法，其采用16s rRNA基因序列为设计引物，上游引物(G1)：5’-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3’；下游引物(G2)：5’-GCGGTCTACTTAATCCGT-3’。扩增片段长度为119bp。

本发明以16s rRNA标准质粒为模板，上游、下游引物为引物，将标准质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。

其中，荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Green I 10μL，ROX ReferenceDye(50×)0.4μL，上游引物(50pmol/μL)0.2μL，下游引物(50pmol/μL)0.2μL，DNA 1μL，Dilution water 8.2μL；反应条件为：95℃10秒→(94℃5秒→60℃10秒→72℃15秒)×40。

具体地说，本发明检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

1)目的基因的扩增

以16s rRNA的基因核苷酸序列为模板，进行PCR反应，其中上游引物为：CAA TAC TCA GCG GCG AAC；下游引物为：TTT TTG AGA TTAGCT CCC C；回收PCR扩增产物；

2)目的基因的克隆

将步骤1)所扩增的目的基因克隆至pGEM-T easy载体中，转化至E.coli DH5α株并扩增，碱变性法提取质粒；

3)荧光定量PCR检测

然后建立荧光定量PCR标准曲线，以阳性重组标准质粒为模板，上游、下游引物为引物，进行荧光定量PCR检测。

本发明还提供用于检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法的引物，其16s rRNA 基因序列为设计引物，上游引物：5’-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3’；下游引物：5’-GCGGTCTACTTAATCCGT-3’，扩增片段长度为119bp。

本发明进一步提供一种含所述引物的检测试剂盒。

本发明的方法具有良好的重复性。当模板浓度为10copies/μL以上时，均可扩增出特异性产物。在最佳反应条件下反应效率为0.98，获得的标准曲线相关系数R值达1.000，说明该标准品和所确定的扩增条件符合要求。标准曲线的线性范围达到1～1×10⁷拷贝8个数量级，最低可检测到约1个目的拷贝，即1.2fgDNA。

本发明选用犬型、黄疸出血型及波摩那型钩体的16S rRNA及其保守性序列设计引物进行荧光定量PCR全封闭反应，旨在对感染犬的各血清型进行流行病学调查，并对致病的犬型、黄疸出血型及波摩那型钩体等主要致病菌进行特异性检测，这将填补国内空白。

上海市地处长江三角洲，人口密度大，具备钩端螺旋体滋生和传播的良好条件，而近年来上海宠物市场潜力在不断扩大，造成整个生态结构极为复杂，因此，建立一套犬猫钩端螺旋体快速分子生物学检查技术或快速、简便的血清学检测技术及进行钩端螺旋体的流行病学调查与分析，是保障我市人民和谐生活的关键环节之一，具有非常重要的公共卫生意义。

附图说明

图1为本发明16s rRNA基因扩增结果，其中，1为阴性对照，2为目的条带；

图2为本发明荧光定量PCR检测阳性质粒pT16S，其中，1～8：依次为pT16S质粒DNA倍比稀释1～10⁸为模板；

图3为本发明荧光定量PCR标准曲线；

图4为本发明荧光定量PCR引物的融解曲线；

图5为本发明特异性检测，其中，1：钩体56601株DNA；2：其他细菌或寄生虫DNA。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

本发明以我国参考标准株黄疸出血群赖型赖株(56601)，采用苯酚-氯仿法提取上述DNA，经无DNA酶的RNA酶消化后，再次用苯酚-氯仿法提取DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。

根据Genbank中的16s rRNA的基因核苷酸序列，设计特异性引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。16s rRNA的引物为：P16F-CAA TACTCA GCG GCG AAC；P16R-TTT TTG AGA TTA GCT CCC C，大小为616bp。采用Accquire Taq HF高保真酶(购自Invitrogen公司)扩增16s rRNA基因，反应总体积为50μL，包括：20pM P16F和P16R引物，100ng DNA模板、25μL 2×高保真酶Buffer和1μL高保真酶。PCR反应参数为：94℃加热解链30s，然后54℃退火30s，72℃延伸60s，以上步骤共30个循环，再于72℃延伸10min。

1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并切胶回收目的片段，回收过程参见Qiagen琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书。

用TA克隆试剂盒(购自Promega公司)将扩增的目的片段克隆至pGEM-T easy载体中，转化至E.coli DH5α株并扩增，碱变性法提取质粒(步骤参见Qiagen质粒小提试剂盒说明书)，EcoRI(购自Takara公司)单酶切鉴定，阳性质粒应被切为3.0kb和0.6kb两条带，将阳性质粒送北京

华大基因公司利用T7Promoter测序引物测序，测序结果显示：该片段与Genbank相应的16s rRNA序列完全相同。因此，将阳性质粒命名为：pT16S。

以pT16S标准质粒为模板，以G1(ACGAAAGCGTGGGTAGTG)、G2(GCGGTCTACTTAATCCGT)为引物，选用不同的引物浓度、退火温度、延伸时间进行Real Time PCR反应，使用EppendorfRealplex荧光定量PCR仪进行反应。根据PCR反应结果，选择最佳反应条件。

将标准质粒进行适度稀释，测定其OD值，计算出标准质粒的拷贝数，并进行10倍梯度稀释。取浓度为10⁷-1copies/μL的标准质粒为模板，进行Real-Time PCR，每个浓度做3个平行样，以建立标准质粒的扩增曲线，并计算出曲线的相关系数和PCR扩增效率。

Real Time PCR扩增结束后根据扩增曲线及熔解曲线分析，有特异性产物的最低起始模板浓度，并对比常规PCR反应，即为该Real-Time PCR的灵敏度。

2结果

2.1pT16S标准质粒的构建

2.1.1 16s rRNA基因的扩增与鉴定

通过PCR扩增得到的产物，经1.2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示：从钩体56601株DNA模板中分别扩增获得预期大小的16s rRNA基因片段(图1)。分别电泳回收目的基因，连接T载体，经测序，结果显示：该患犬尿液DNA扩增获得的16s rRNA序列与赖株的序列完全相同。命名为pT16S。2.1.2 pT16S标准质粒的纯度及拷贝数的计算

NanoDrop(ND-1000)测得pT16S标准质粒为287ng/μL。根据公式：copies/μL＝Con(ng/μL)×6.02×10²³×10^-9/660×碱基数，计算标准品的拷贝数，进行10倍梯度稀释，稀释至1拷贝/μL。

2.2荧光定量PCR标准曲线的建立及溶解曲线分析

SYBR Green Real-Time PCR反应体系：2×SYBR Green I 10μL，ROXReference Dye(50×)0.4μL，G1(50pmol/ul)0.2μL，G2(50pmol/μL)0.2μL，DNA1μL，Dilution water 8.2μL。反应条件为：95℃10sec→(94℃5sec→60℃10sec→72℃15sec)×40。将标准质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行荧光定量PCR，扩增结束后，进行融解曲线分析结果显示：扩增产物中无引物二聚体，说明本发明设计的引物是特异的，且退火温度合适(图4)。根据起始模板浓度的对数值和相应的Ct值拟出标准曲线。结果显示：标准曲线的相关系数＝1.000。这表明不同梯度定量模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，标准曲线直线性好(图2、3)。

2.3重复性及灵敏度检测

对于不同浓度的模板，三组样品的扩增曲线表明，该方法具有良好的重复性。当模板浓度为10copies/μL以上时，均可扩增出特异性产物(图5)。在最佳反应条件下反应效率为0.98，获得的标准曲线相关系数R值达1.000，说明该标准品和所确定的扩增条件符合要求。标准曲线的线性范围达到1～1×10⁷拷贝8个数量级，最低可检测到约1个目的拷贝，即1.2fgDNA。

试验例1

我国参考标准株黄疸出血群赖型赖株(56601)购自中国药品生物制品检定所。钩体分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv株、牛分枝杆菌(M.bovissubsp.bovis)AF2122/97株、鸟分枝杆菌(M.avium subsp.avium)ATCC 15769株购自上海市肺科医院检验科；草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、海分枝杆菌(M.marinum)购自中国科学院微生物研究所；卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母菌、大肠杆菌、链球菌、枯草杆菌、犬隐孢子虫、犬球虫、刚地弓形虫等DNA阳性样品由中国农科学院上海兽医研究所提供。

以钩体黄疸出血群赖株56601毒株DNA作为阳性对照，钩体分枝杆菌、牛钩体杆菌、卡介苗，金黄色葡萄球菌、啤酒酵母菌、大肠杆菌、链球菌、枯草杆菌、犬隐孢子虫、犬球虫、刚地弓形虫基因组DNA和超纯水作为阴2性对照，每种样品DNA模板量为20ng/μL，并以超纯水作为对照，Real TimePCR扩增，进行特异性分析。

用于特异性检测的所有上述模板DNA浓度统一稀释为50ng/μL，反应条件和反应体系均参照上述方法进行。结果可见：钩体56601毒株模板基因组DNA为阳性(判定标准：Ct值明显小于25)；从非特异菌株基因组DNA扩增Ct值比对可见：钩体分枝杆菌、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、草分枝杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，弓形虫则的Ct值与阴性对照相当，明显大于25(图5)。结果显示：以上菌株检测显示为阴性。这表明该方法应用于检测临床样品时具有良好的特异性。

试验例2

2006-2009年间，本发明研究人员采集上海各区县犬猫血液样品103份和尿液481份，其中，尿液样品经12000rpm离心10min，沉淀分为两份，其中一份利用加有新霉素(10μg/mL)的Korthof培养基分离培养，另一份经无DNA酶的RNA酶消化后，再次用苯酚-氯仿法提取DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。经血液和尿液基因组DNA提取后，利用上述方法进行荧光定量PCR检测。以56601株DNA和pT16S DNA为阳性对照，超纯水为阴性对照。

采用已建立的SYBR Green I荧光定量PCR鉴定，扩增结果显示；103份犬猫血液样品检测为仅1份阳性，而固体培养阳性率亦为1份，符合率为100％；另外，481份犬猫尿液样品未检测到阳性，培养为阴性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

acgaaagcgt gggtagtg 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcggtctact taatccgt 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caatactcag cggcgaac 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tttttgagat tagctcccc 19

Claims

1.检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，以其16s rRNA基因序列为模板设计引物，上游引物：5’-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3’；下游引物：5’-GCGGTCTACTTAATCCGT-3’，扩增片段长度为119bp。

2.包含权利要求1所述引物的检测试剂盒。