CN108350508B - 雌马酚产生能力的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定被测验者是否具有雌马酚产生能力的方法。一种被测验者的雌马酚产生能力的测定方法，其特征在于，使用以下的a)～c)的3种引物组检测来自被测验者的肠内细菌的雌马酚转化酶基因。a)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对；b)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对；c)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。

Description

雌马酚产生能力的测定方法
技术领域
本发明涉及测定被测验者的雌马酚产生能力的方法。
背景技术
大豆食品中大量含有的异黄酮已知为对原因不明的身体不适等更 年期障碍的改善、骨质疏松的预防、高脂血症、动脉硬化的预防、乳 腺癌、前列腺癌的预防等有效果的功能性成分。据近年的研究已经明 确，作为异黄酮之一的黄豆苷元(Daidzein)由体内的肠内细菌代谢为 雌激素作用、抗氧化作用更强的雌马酚(Equol)(参照图1)，雌马酚 作为在体内发挥上述作用的主要的有效成分之一而备受关注。
在体内由黄豆苷元产生雌马酚并不是在所有人中同样进行，其产 生能力存在个体差异，据报告，30～50％的人具有雌马酚产生能力。 于是，大力进行了对具有雌马酚产生能力的肠内细菌(雌马酚产生菌) 的探索，作为雌马酚产生菌，已报告有卵形拟杆菌、中间链球菌、星 群链球菌、格氏乳球菌、Slackia spp.TM-30株(斯莱克氏菌属TM-30 株)、青春双歧杆菌TM-1株、短双歧杆菌JCM 1273、费氏丙酸杆菌、 乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌、唾 液乳杆菌、SNU-Julong732、gram positive bacteriumdo03(革兰氏阳性 细菌do03)、Slackia sp.YIT 11861(斯莱克氏菌属YIT 11861)(FERMBP-11231)(专利文献1)。
如上所述，雌马酚具有各种作用，可期待对于乳腺癌、前列腺癌 等性激素依赖性疾病的预防效果，因此，测定是否具有雌马酚产生能 力是很重要的。
作为测定被测验者是否具有雌马酚产生能力的方法，目前进行从 血液中或者尿中检测、测定由雌马酚产生菌从黄豆苷元代谢而成的雌 马酚的方法。然而，该方法存在由采血、尿检前的大豆摄取量的多少 而导致血液中或者尿中的黄豆苷元量、以及雌马酚量发生变化的问题。 特别是当被测验者不摄取大豆时，就无法从血液中或者尿中检测出雌 马酚，因此，存在尽管具有雌马酚产生菌，但错误地判断为不具有雌 马酚产生能力这样的危险性。
另一方面，考虑根据是否存在雌马酚产生菌来测定是否具有雌马 酚产生能力的方法，但是，能够正确检测所有雌马酚产生菌的存在的 方法尚未确立，没有关于该方法的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际专利公开第2010/098103号
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明涉及提供一种测定被测验者是否具有雌马酚产生能力的方 法。
用于解决技术问题的方法
本发明的发明人鉴于上述技术问题进行了研究，结果发现，通过 使用特定的3种引物组检测来自被测验者的肠内细菌的四氢黄豆苷元 (THD)－雌马酚转化酶基因，能够以高灵敏度测定被测验者是否具 有雌马酚产生能力。
本发明为以下的1)～7)所涉及的发明。
1)一种被测验者的雌马酚产生能力的测定方法，其特征在于，使 用以下的a)～c)的3种引物组检测来自被测验者的肠内细菌的THD －雌马酚转化酶基因。
a)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
b)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
c)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序 列对应的互补序列构成的引物对
2)如1)所记载的方法，其中，使用来自被测验者的粪便检测THD －雌马酚转化酶基因。
3)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对。
4)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对。
5)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序 列对应的互补序列构成的引物对。
6)以下的a)～c)的3种引物组。
a)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
b)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
c)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序 列对应的互补序列构成的引物对
7)一种用于测定被测验者的雌马酚产生能力的试剂盒，其包括以 下的a)～c)的3种引物组。
a)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
b)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
c)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序 列对应的互补序列构成的引物对
发明的效果
根据本发明的方法，无论是否摄取大豆等含有黄豆苷元的食品， 都能够以良好的灵敏度测定被测验者是否保有雌马酚产生菌、即被测 验者的雌马酚产生能力。
附图说明
图1是表示由黄豆苷元的代谢产生雌马酚的路径的图。
图2是表示各引物的定量性的图表(标准曲线)。左：A型基因群 检测用引物(SL-F2/SL-R2)、右：B型基因群检测用引物 (Eght-F2/Egkm-R1)
图3是表示各引物的定量性的图表(标准曲线)。左：C型基因群 －1检测用引物(Adht-F1/Adht-R1)、右：C型基因群－2检测用引物 (Adht-F1/Adkm-R1)
具体实施方式
在本发明的被测验者的雌马酚产生能力的测定方法中，使用以下 的a)～c)的3种引物组检测来自被测验者的肠内细菌的THD－雌马 酚转化酶基因。其中，该检测中包括定性的和定量的检测，定量的检 测中包括THD－雌马酚转化酶基因数(拷贝数)的定量。
a)由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
b)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示 的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序列对 应的互补序列构成的引物对
c)由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与该碱基序 列对应的互补序列构成的引物对
a)～c)所示的3种引物组均为用于扩增编码雌马酚转化酶E3(下 文中称为“THD－雌马酚转化酶”)的基因(下文中称为“THD－雌马 酚转化酶基因”)的引物对，上述雌马酚转化酶E3是在黄豆苷元代谢 中参与由顺式/反式－四氢黄豆苷元(THD)向雌马酚的转化反应(参 照图1)的酶。
THD－雌马酚转化酶存在若干种同源物，因此THD－雌马酚转化 酶基因也存在若干种不同的序列。本发明的发明人发现，THD－雌马 酚转化酶基因根据其碱基序列的相同性的差异而分类成3种类型(基 因群。是指后述的A型基因群、B型基因群、C型基因群)。此外，相 同基因群内的碱基序列的相同性为95～99％左右，不同的基因群之间 的碱基序列的相同性为70～80％左右。进而，本发明的发明人针对各 个类型制作了引物组。
a)所示的引物组为能够扩增Slackia sp.(斯莱克氏菌属)YIT 11861 株、Slackiaisoflavoniconvertens HE8株和Slackia sp.(斯莱克氏菌属) MC6株等产生的THD－雌马酚转化酶基因群(称为“A型基因群”) 的引物对，具体而言，包括作为由序列号1所示的碱基序列(5'- CCCGCGCATTTGTGGAGAACT-3'(SL-F2))构成的寡核苷酸的第一 引物、和作为由序列号2所示的碱基序列(5'- CGTTCCGATATCGCCGAGGTTT-3'(SL-R2))构成的寡核苷酸的第二引物。
b)所示的引物组为能够扩增Slackia equolifaciens DZE株、 Lactococcusgarvieae(格氏乳球菌)20-92株和Eggerthella sp.(埃格特 菌属)YY 7918株等产生的THD－雌马酚转化酶基因群(称为“B型 基因群”)的引物对，具体而言，包括作为由序列号3所示的碱基序列 (5'-CGCTGCCTTCGAGTCCTCTA-3'(Eght-F2))构成的寡核苷酸的 第一引物、和作为由序列号4所示的碱基序列(5'- GGTGGAGGTGAAGATGTCG-3'(Egkm-R1))构成的寡核苷酸的第二 引物。
c)所示的引物对为能够扩增Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450T株和Asaccarobactor celtus DO-03株等产生的THD－雌马酚转化 酶基因群(称为“C型基因群”)的引物对，具体而言，包括作为由序 列号5所示的碱基序列(5'-CGTTCGATACTGAGTACGACCTG-3' (Adht-F1))构成的寡核苷酸的第一引物、和作为由序列号6所示的 碱基序列(5’-ATCCTTGAG GAAATCGATGGTA-3’(Adht-R1))或 由序列号7所示的碱基序列(5'-AGTTTGCGCGATAGTGGCTGTA-3' (Adkm-R1))构成的寡核苷酸的第二引物。
在上述中，第一引物在PCR(聚合酶链式反应)等核酸扩增反应 中能够作为正向引物使用，第二引物在核酸扩增反应中能够作为与第 一引物组合的反向引物使用。
另外，本发明的引物组中包含：能够扩增A型基因群的、由与序 列号1和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；能 够扩增B型基因群的、由与序列号3和序列号4所示的碱基序列对应 的互补序列构成的引物对；能够扩增C型基因群的、由与序列号5和 序列号6或7所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
在本发明中，序列号1～7所示的碱基序列以及与该碱基序列对应 的互补序列包括一个或两个碱基缺失、取代、添加或者插入了的碱基 序列、或者相对于序列号1～7的碱基序列和/或与该碱基序列对应的互 补序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的碱基序列，对于与由 序列号1～7所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列构成的寡 核苷酸具有作为各自引物同等功能的寡核苷酸而言，与由序列号1～7 所示的碱基序列构成的寡核苷酸同等对待。
对于本发明的寡核苷酸而言，作为寡核苷酸的合成法，能够通过 本技术领域中公知的方法，例如磷酸三酯法、磷酸二酯法等，利用通 常使用的DNA自动合成装置(例如，Applied Biosystems公司制Model 394等)而合成。
这种使用a)～c)的3种引物组的THD－雌马酚转化酶基因的检 测通过进行以下工序实施：将从来自被测验者的检测体提取的DNA作 为模板，使用上述的引物组进行核酸扩增反应的工序；和检测通过核 酸扩增反应得到的扩增产物的工序。
用于检测THD－雌马酚转化酶基因的来自被测验者的检测体可以 列举包含被测验者的肠内细菌的检测体，例如粪便或肠道内容物等， 从采取容易性的观点考虑，优选使用粪便。
从粪便提取DNA能够利用与现有的基因组DNA制备的情况同样 的方法进行，例如能够从来自被测验者的检测体的全部或者一部分， 根据需要通过提取、分离、精制方法进行前处理之后，利用适当的公 知方法获得。即，能够通过过滤、离心分离、色谱法等公知的方法进 行前处理之后，通过例如“在玻璃珠等的存在下进行搅拌的物理破碎 法”、“CTAB法”、“苯酚氯仿法(PC法)”、“磁珠法”、“二氧化硅柱法” 等通用方法、或者通过组合这些方法进行提取而获得。为了得到利用 PCR的高检测灵敏度，希望获得高浓度的DNA，另一方面，来源于来 自被测验者的检测体、例如粪便的核酸提取液中混合存在有阻碍PCR 的物质，因此希望获得尽可能除去了这些阻碍物质的高纯度的DNA。 出于该目的，特别优选使用能够提取高浓度且高纯度的DNA的 FastDNA SPIN Kit for Feces(MP Biomedicals)。
作为核酸扩增法没有特别限定，可以列举利用PCR法的原理的公 知的方法。例如，可以列举PCR法、LAMP(Loop-mediated isothermal AMPlification：环介导等温扩增)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：等温和嵌合引物引发的核 酸扩增)法、RCA(Rolling Circle Amplification：滚环扩增)法、LCR (Ligase Chain Reaction：连接酶链式反应)法、SDA(Strand DisplacementAmplification：链置换扩增)法等。
另外，核酸扩增反应后的扩增产物的检测可以使用能够特异性识 别扩增产物的公知的手段。例如，能够通过将所得到的DNA进行电泳， 根据条带的有无来特异性检测THD－雌马酚转化酶基因。另外，也能 够通过测定吸光度来特异性检测THD－雌马酚转化酶基因。另外，还 能够使放射性同位素、荧光物质、发光物质等标记物作用于在扩增反 应的过程掺入的dNTP，并检测该标记物。作为观察掺入有已标记的 dNTP的扩增产物的方法，只要是用于检测上述标记物的本技术领域中 公知的方法，则可以是任意的方法。例如，在作为标记物使用放射性 同位素的情况下，能够使用例如液体闪烁计数器、γ－计数器等计测放 射活性。另外，在作为标记物使用荧光的情况下，能够使用荧光显微 镜、荧光板分析仪等检测该荧光。
在本发明中，作为核酸扩增法，从迅速性和定量性的观点考虑， 优选为实时监控并分析PCR扩增量的实时PCR。另外，作为实时PCR， 能够采用本技术领域中通常使用的方法，例如TaqMan探针法、嵌入剂 法和循环探针法等。
PCR的条件没有特别限定，对每个PCR装置确定最适条件即可， 例如，可以列举以下的条件。
1)双链DNA向单链DNA的热变性：通常以93～95℃左右、通 常加热10秒～5分钟左右。
2)退火：通常以50～60℃左右、通常加热10秒～1分钟左右。
3)DNA延伸反应：通常以70～74℃左右、通常加热30秒～5分 钟左右。
其中，退火和DNA延伸反应也可以不分开而同时进行。
通过将上述1)～3)的反应进行通常30～50个循环左右，能够将 目标THD－雌马酚转化酶基因扩增至能够检测的程度。
这样的PCR的一系列操作能够利用市售的PCR试剂盒、PCR装 置按照其操作说明书进行。另外，实时PCR能够使用将热循环仪和荧 光分光光度计一体化而成的实时PCR专用的装置，例如ABI PRISM 7900HT sequence detection system(Applied Biosystems)进行。
另外，关于DNA量的测定，首先，对将浓度已知的标准DNA溶 液梯度稀释而得到的物质进行PCR，以该初始的DNA量为横轴，以将 其作为模板进行PCR扩增的产物量达到一定量时的循环数(threshold cycle：阈值循环；CT值)为纵轴绘图，制作标准曲线。对于未知浓度 的试样，也在相同条件下进行反应，求得CT值，根据该值和标准曲线 求出试样中的目标DNA量，由此能够进行。
本发明的a)～c)的3种引物组能够更简便地测定被测验者的雌 马酚产生能力，因此也能够制成试剂盒。本发明的试剂盒只要包含该 a)～c)的3种引物组即可，根据需要，也能够包含DNA提取用试剂、 PCR用缓冲液以及DNA聚合酶等PCR用试剂、含有作为反应的阳性对照的PCR扩增区域的DNA溶液、染色剂、电泳用凝胶等检测用试 剂、记载实施方法的说明书等。此外，能够包含于试剂盒中的试剂既 可以为溶液，也可以为冻结干燥物。
综上，通过本发明的方法，能够详尽地检测来自被测验者的肠内 细菌的THD－雌马酚转化酶基因，由此能够以高准确率测定被测验者 是否为雌马酚产生者。
实施例
实施例1以来自人的雌马酚产生菌的THD－雌马酚转化酶基因为 目标的引物的设计
图1表示通过黄豆苷元的代谢产生雌马酚的路径。作为能够检测 雌马酚产生菌的引物，将以3个类型的雌马酚转化酶基因为目标的引 物按照各自的类型进行制作。
(1)材料
(a)使用菌株
使用保存于株式会社益力多本社中央研究所的表1所示的菌株。 各菌株的初始菌数调整为1×105cells左右。
各菌株的培养条件示于表1。培养条件A～C的详细内容如下。
条件A：使用添加了1％葡萄糖的改良GAM琼脂培养基 (Nissui)，在37℃、24小时、厌氧条件下培养。之后，将琼脂培养基 上的菌落使用改良GAM肉汤(Nissui)回收。
条件B：使用添加了0.5％葡萄糖、0.1％纤维二糖、0.1％麦芽 糖和0.1％淀粉的改良GAM肉汤(Nissui)，在37℃、48小时、厌氧 条件下培养。
条件C：使用Willkins-Chalgren厌氧肉汤，在37℃、24小时、厌 氧条件下培养。
对这些菌液，通过DAPI法(J.Microbiol.Methods 37,215-221)进 行菌数测定，基于该菌数调制成为109cells/ml。将其作为各菌株的纯 培养菌液。
[表1]
菌号 菌种名 株名 培养条件
1 Slackia sp.(斯莱克氏菌属) YIT 11861 条件A
2 Slackia isoflavoniconvertens HE8 条件A
3 Slackia sp.(斯莱克氏菌属) MC6 条件A
4 Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450<sup>T</sup> 条件A
5 Asaccarobactor celtus DO-03 条件A
6 Enterorhabdus mucosicola DSM 19490<sup>T</sup> 条件C
7 Slackia equolifaciens DZE 条件B
(2)方法
在制作引物之前，基于表2所示的雌马酚产生菌所具有的THD－ 雌马酚转化酶基因信息，利用Clustal X软件进行分子系统分析，结果 发现存在3种类型。于是，将各个THD－雌马酚转化酶基因分类为A 型基因群、B型基因群、C型基因群(在表2中表示各菌株具有哪一种 类型的THD－雌马酚转化酶基因)。此外，表1的雌马酚产生菌中， MC6株为本发明的发明人新分离并鉴定的菌。
对于表2所示的雌马酚产生菌8株所具有的THD－雌马酚转化酶 基因的序列，利用Clustal X软件对每个类型进行比对，基于所得到的 特异性序列，设计以各类型的基因为目标的引物。
此外，将表2所示的8株所具有的THD－雌马酚转化酶基因的序 列不按每个类型而一并利用Clustal X软件进行对比，由此尝试设计引 物，但无法发现基因序列的相同性高的特异性序列，无法制作引物。 因此，判明了在引物的制作中，发现存在3种类型是重要的。
[表2]
Figure BDA0001647407160000111
(3)结果
将所设计的引物的序列示于表3。此外，在以C型基因群为目标 的引物之中，C型基因群－1为对表2中的菌号4和5所具有的THD －雌马酚转化酶基因的序列利用Clustal X软件进行对比并基于所得到 的特异性序列而设计的引物，C型基因群－2为对表2中的菌号4～6 所具有的THD－雌马酚转化酶基因的序列利用Clustal X软件进行对比 并基于所得到的特异性序列而设计的引物。
[表3]
Figure BDA0001647407160000112
试验例1以THD－雌马酚转化酶基因为目标的引物的特异性
(1)材料
(a)使用菌株
除表1所记载的菌株以外，使用保存于株式会社益力多本社中央 研究所的表4所示的菌株。各菌株的初始菌数调整为1×105cells左右。
各菌株的培养条件示于表4。培养条件A～F的详细内容如下。
条件A：使用添加了1％葡萄糖的改良GAM肉汤(Nissui)，在 37℃、24小时、厌氧条件下培养。
条件B：使用添加了0.5％葡萄糖的改良GAM肉汤(Nissui)， 在37℃、24小时、厌氧条件下培养。
条件C：使用改良GAM肉汤(Nissui)，在37℃、24小时、厌氧 条件下培养。
条件D：使用添加了1.5％Na-Lactate的改良GAM肉汤(Nissui)， 在37℃、24小时、厌氧条件下培养。
条件E：使用添加了0.5％葡萄糖、0.1％纤维二糖、0.1％麦芽糖 和0.1％淀粉的改良GAM肉汤(Nissui)，在37℃、48小时、厌氧条 件下培养。
条件F：使用添加了1％葡萄糖的改良GAM琼脂培养基 (Nissui)，在37℃、24小时、厌氧条件下培养。之后，将琼脂培养基 上的菌落使用改良GAM肉汤(Nissui)回收。
对这些菌液，通过DAPI法进行菌数测定，根据该菌数调制为 109cells/mL。将其作为各菌株的纯培养菌液。
[表4]
Figure BDA0001647407160000131
(2)方法
特异性研究以表1和表4所示的肠内最优势菌(No.10～21)、属 于红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)的细菌(No.22～37)和来自人的 雌马酚产生菌(No.1～7)为对象。
利用公知的方法(Appl.Environ.Microbiol.70:167-73)从各菌株的 纯培养菌液提取DNA之后，进行定量的PCR，由此研究引物的特异性。
以下表示用于定量的PCR的标准曲线的制作方法。为了制作以A 型基因群为目标的引物的标准曲线，使用Slackia sp.(斯莱克氏菌属) YIT 11861作为菌株。同样，对于以B型基因群为目标的引物，使用 Slackia equolifaciens DZE，对于以C型基因群－1和－2为目标的引 物，使用Adlercreutzia equolifaciens DSM19450T。将从各菌株的纯培养 菌液提取的DNA作为模板，使用表3所示的引物进行PCR。将它们的 扩增产物利用PCR ProductPurification Kit(Roche)精制，对于该DNA 利用Life Science UV/VisSpectrophotometer DU730(BECKMAN COULTER)测定吸光度(A.280nm)，由该值计算重量。由DNA重量 和扩增产物的每1摩尔的分子量计算拷贝数。用TE buffer(pH 8.0) 稀释精制DNA，以使拷贝数成为2×108拷贝数/mL。
将拷贝数为2×108拷贝数/mL的DNA溶液作为原液，用TE buffer (pH 8.0)进行10倍梯度稀释。之后，以每1反应的拷贝数成为100～ 105拷贝数的方式将5μL的稀释DNA提供给定量PCR。以下表示定量 PCR的条件。定量PCR中，使用Ampdiret plus(SHIMADZU)。反应 液组成设为Ampdirect plus 10μL、300倍稀释后的SYBR Green 1 (LONZA)0.08μL、ROXReference Dye(Invitrogen)0.4μL、50μM Primer 1和2各0.08μL、rTaq(TaKaRa Bio.)0.08μL、Taq start antibody (Clontech)0.1μL、上述的稀释DNA溶液5μL，最后用NFW调制成 20μL液体量。PCR将94℃5分、94℃20秒、60℃20秒、72℃50 秒进行45个循环。以定量PCR中所得到的CT值为纵轴，以所对应的 每1反应的拷贝数为横轴进行绘图，制作了标准曲线。
将从表1和表4所示的各菌株的纯培养菌液提取的DNA以PCR 每一反应提供106拷贝数进行试验。将以从各菌株的纯培养菌液提取 的DNA作为模板而得到的CT值代入到标准曲线中，将拷贝数为105拷 贝数以上的判定为阳性(+)、101拷贝数以下的判定为阴性(－)、101 -105拷贝数的判定为(±)。
(3)结果
将特异性的结果示于表5。关于C型基因群－1检测用引物，虽然 没有确认到对于具有C型基因的菌号6的DNA的扩增，但是除其以外 的引物确认到了对于目标类型的雌马酚产生菌的DNA的扩增。另外， 关于所设计的全部引物，均没有确认到对于肠内最优势菌(No.10～ 21)、属于红蝽杆菌科的细菌(No.22～37)和除目标类型以外的雌马 酚产生菌的DNA的扩增。因此，各引物均具有很高的特异性，但是作 为C型基因群检测用引物，判明了与C型基因群－1检测用引物相比， C型基因群－2检测用引物的特异性更高，更优选。
[表5]
Figure BDA0001647407160000161
试验例2以THD－雌马酚转化酶基因为目标的引物的定量性
(1)方法
用于定量的PCR的标准曲线与试验例1中制作的标准曲线同等制 作而使用。另外，定量的PCR的条件也与试验例1中记载的方法同样 进行，制作了各引物的标准曲线。
(2)结果
对于全部引物，均得到了PCR每一反应在100～105拷贝数的范围 中且直线性高的标准曲线(图2)。将其换算为粪便每1g，可推定能够 检测到103拷贝数。
实施例2从粪便检测THD－雌马酚转化酶基因－1
(1)方法
(a)从粪便检测雌马酚转化酶基因
对于健康成人25名进行试验。被测验者在第一天的晚餐时饮用1 份豆浆饮料(每200mL含有约40mg异黄酮)，第二天提交粪便。按照 公知的方法(Appl.Environ.Microbiol.70:167-73)从所收集的20mg的 粪便进行DNA提取，利用100μL的TE buffer溶解所得到的DNA。
使用表3所示的3种引物组(关于C型基因群，使用C型基因群 －1)，以与试验例1和试验例2同样的方法进行PCR，进行粪便中的 雌马酚转化酶基因的检测、定量。
(b)尿中雌马酚浓度的测定
健康成人25名的被测验者在第一天的晚餐时饮用1份豆浆饮料 (每200mL含有约40mg异黄酮)，第二天提交初尿。将所收集的尿与 4000IU/mL的β-葡萄醣醛酸酶(Sigma-Aldrich Japan)溶液以1﹕1 (v/v)混合，进行37℃、24小时、脱结合反应之后，向该反应液添加 4倍量的甲醇。将对该溶液利用Centricut超mini(W-MO，KURABO) 进行过滤器过滤而得到的物质作为LC/MS分析用的尿样本。
尿样本的测定中，使用液相色谱仪质量分析(LC/MS)。测定仪器 使用质量检测器ZQ 4000、Alliance HPLC System、Photodiode Array检 测器(日本WATERS)。分离柱使用CadenzaCD-C18 3μL(内径：3.0 mm，长度：75mm，IMTAKT)，移动相使用0.1％甲酸和乙腈混液。 雌马酚的定量使用Waters Empower 2软件(日本WATERS)。
(2)结果
25名中15名检测出A型～C型的3种类中任一种类型的THD－ 雌马酚转化酶基因(表6)。检测出任一种THD－雌马酚转化酶基因的 15名根据尿中雌马酚浓度确认为是雌马酚产生者，确定了通过使用它 们3种引物组能够从被测验者的粪便检测THD－雌马酚转化酶基因， 并且能够测定是否具有雌马酚产生能力。
[表6]
Figure BDA0001647407160000181
*画网线部分表示检测出尿中雌马酚浓度和来自粪便的THD－雌马酚转化酶基因的被测验者 (具有雌马酚产生能力的被测验者)。
ND：未检测到
实施例3从粪便检测雌马酚转化酶基因－2
(1)方法
对于健康成人35名进行试验。使用表3所示的3种引物组(关于 C型基因群，使用C型基因群－1和－2的两者)，以与试验例1和试 验例2同样的方法进行PCR，进行粪便中的雌马酚转化酶基因的检测、 定量。被测验者在第一天的晚餐时饮用1份豆浆饮料(每200mL含有 约40mg异黄酮)，在第二天提交初尿和粪便。分别将尿用于雌马酚浓 度的分析，将粪便用于雌马酚转化酶基因数的检测和定量。
尿样本的调制以与试验例2同样的方法进行。
尿中雌马酚浓度的测定以与试验例1和试验例2同样的方法进行。
(2)结果
使用表3所示的A型基因群检测用引物、B型基因群检测用引物、 C型基因群基因检测用引物(C型基因群－1和C型基因群－2)的各 引物进行健康成人35名的粪便DNA的分析。35名中13名检测出A 型～C型的3种类中任一种类型的THD－雌马酚转化酶基因(表7)。 检测出任一种雌马酚转化酶基因的13名根据尿中雌马酚浓度确认为 THD－雌马酚产生者，通过本试验也确定了通过使用3种引物组(关 于C型基因群，使用C型基因群－1或者－2中的任一种)能够从被测 验者的粪便检测THD－雌马酚转化酶基因，并且能够判断是否具有雌马酚产生能力。
[表7]
Figure BDA0001647407160000201
*画网线部分表示检测出尿中雌马酚浓度和来自粪便的THD－雌马酚转化酶基因的被测验者 (具有雌马酚产生能力的被测验者)。
ND：未检测到
参考例A型基因群检测用引物的验证
(1)方法
对于实施例1的A型基因群检测用引物，基于Slackia sp.(斯莱克 氏菌属)YIT11861和Slackia isoflavoniconvertens HE8的2株所具有的 THD－雌马酚转化酶基因的序列(即，不考虑Slackia sp.(斯莱克氏菌 属)MC6所具有的THD－雌马酚转化酶基因的序列)，制作该引物(表 8、SL-F1和SL-R1)。
使用所制作的引物(SL-F1和SL-R1)和表3记载的A型基因群 检测用引物(SL-F2和SL-R2)，对于实施例2所记载的25名的人粪便 以与实施例2同样的方法进行PCR，进行来自粪便的THD－雌马酚转 化酶基因的检测。
[表8]
引物名序列号序列号
引物名 序列(5’-3’)
SL-F1 GAAGATGATCCCAATGAGGT(序列号8)
SL-R1 TGGGAGAGGATGGACCATAC(序列号9)
(2)结果
虽然被测验者No.3的尿中雌马酚浓度高，具有雌马酚产生能力， 但是无法通过SL-F1和SL-R1的引物检测出被测验者No.3的粪便中的 THD－雌马酚转化酶基因(表9)。被测验者No.3仅通过使用本发明的 A型基因群检测用引物(SL-F2和SL-R2)可以检测出THD－雌马酚 转化酶基因(表6)，因此，可以说作为A型基因群检测用引物，必需 使用SL-F2和SL-R2。
[表9]
Figure BDA0001647407160000221
*画网线部分表示利用SL-F2和SL-R2能够检测出、而利用SL-F1和SL-R1不能检测出的被测 验者。
序列表
<110> 株式会社益力多本社
<120> 雌马酚产生能力的测定方法
<130> YK0093
<150> JP 2015-212768
<151> 2015-10-29
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
cccgcgcatt tgtggagaac t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
cgttccgata tcgccgaggt tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
cgctgccttc gagtcctcta 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
ggtggaggtg aagatgtcg 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
cgttcgatac tgagtacgac ctg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
atccttgagg aaatcgatgg ta 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
agtttgcgcg atagtggctg ta 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
gaagatgatc ccaatgaggt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
tgggagagga tggaccatac 20

Claims (4)

1.引物组在制备用于测定被测验者的雌马酚产生能力的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述引物组由以下的a）～c）的3种引物组组成，
该试剂盒使用以下的a）～c）的3种引物组检测来自被测验者的肠内细菌的THD－雌马酚转化酶基因，
a）由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号1和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
b）由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号3和序列号4所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
c）由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号5和序列号6或7所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述试剂盒使用来自被测验者的粪便检测THD－雌马酚转化酶基因。
3.一种引物组，所述引物组由以下的a）～c）的3种引物组组成：
a）由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号1和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
b）由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号3和序列号4所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
c）由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号5和序列号6或7所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
4.一种用于测定被测验者的雌马酚产生能力的试剂盒，其特征在于，包含以下的a）～c）的3种引物组：
a）由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号1和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
b）由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号3和序列号4所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对；
c）由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物对、或者由与序列号5和序列号6或7所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
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