CN114606161A - 复合益生菌及其在香焖黄豆制备上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合益生菌及其在香焖黄豆制备上的应用，复合益生菌包括弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5‑1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；所述弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5‑1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.12891。所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 1.12934。本发明提供了将黄豆苷元转化为雌马酚的复合益生菌菌种，以及一种在治疗更年期综合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失调疾病上具有显著效果的大豆制品。
Description
技术领域
本发明涉及为微生物技术领域，特别是一种复合益生菌及其在香焖黄豆制备上的应用，用于治疗妇女更年期综合症。
背景技术
大豆异黄酮，又称为“植物雌激素”，以大豆苷元（daidzein）和染料木素（genistein）为主要成分，其具有非常广泛的生物学活性，除了具有类雌激素功能外还具有抗氧化、调节细胞周期等功能。雌马酚为大豆苷元的肠道菌代谢产物，相对于大豆苷元和染料木素而言，雌马酚具有更高的雌激素活性和抗氧化活性。病理学研究表明雌马酚可以与雌激素受体结合，在治疗更年期综合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失调疾病上有显著疗效。
然而研究表明，由于肠道菌群、饮食结构等的不同，大约只有30%~45%的人群体内能产生雌马酚，也就是说人类通过豆科植物摄取大豆异黄酮后，并非所有人都能在体内产生雌马酚，对于非雌马酚产生者而言，摄入大豆异黄酮所产生的健康效应要相对弱于雌马酚产生者。有报道黄豆苷元的代谢产物——雌马酚在含类异黄酮的食品，例如加工的豆制品中检测不到，而且它也不能从常规饮食中摄入体内。
基于上述发现，本发明人进行了深入研究，筛选出可以生产雌马酚的菌种，以进一步生产具有高生物活性的雌马酚的大豆制品。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种复合益生菌及其在香焖黄豆制备上的应用，以解决上述技术背景中提出的问题。
中国专利2016110531735（申请人为浙江大学宁波理工学院）公开了一种弯曲乳杆菌，分类命名为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2016年8月22日，保藏号为CGMCC No.12891。该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，该菌株可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收量。本发明所用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1来自浙江大学宁波理工学院研究人员赠送。本发明所用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（保藏编号：CGMCC 1.12934）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明中该2株菌为赠送获得。
本申请人研究团队为筛选出可以将黄豆苷元转化为雌马酚的菌种，将可用于食品的菌种名单中的公布的菌种（每种菌种选择不同来源）进行单个和组合使用发现，只有联合使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1（CGMCC No.12891）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（CGMCC 1.12934）具有将黄豆苷元转化为雌马酚的效果，单独使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1或者植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）均无将黄豆苷元转化为雌马酚的效果，且使用其他株的弯曲乳杆菌和植物乳杆菌也无此效果。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一方面，本发明提供了一种复合益生菌，其包括弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatus）5-1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
所述弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.12891。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 1.12934。
另一方面，本发明提供了复合益生菌在香焖黄豆制备上的应用。
作为本发明的进一步实施方案，本发明提供了复合益生菌用于制备香焖黄豆的方法，具体包含以下步骤：
（1）分别活化：将弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌分别进行活化；
（2）将黄豆进行蒸煮、焖制处理；
（3）将步骤（2）所得焖制后黄豆放入发酵罐，并接种步骤（1）活化后的弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌组成的复合益生菌进行发酵，得到香焖黄豆。
进一步的，步骤（2）具体为：将黄豆洗净后倒入高压蒸锅中采用蒸汽进行蒸煮，蒸煮时间为15~30min，然后焖制10~20min，备用；
进一步的，步骤（3）中，当接种弯曲乳杆菌5-1时，所述弯曲乳杆菌5-1以弯曲乳杆菌菌液的形式添加，所述弯曲乳杆菌菌液中弯曲乳杆菌5-1的浓度为104~107CFU/ml；当接种植物乳杆菌时，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中植物乳杆菌的浓度为105~108CFU/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）都是安全性很高的食品用菌，安全性有保障。
（2）提供了将黄豆苷元转化为雌马酚的复合益生菌菌种；
（3）将复合益生菌应用在香焖黄豆制备上，提供了一种在治疗更年期综合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失调疾病上具有显著效果的大豆制品。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
一种复合益生菌，用于将黄豆苷元代谢转化为雌马酚的菌种，其包括弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
所述弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1的保藏编号：CGMCC No.12891。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的保藏编号：CGMCC 1.12934。
该复合益生菌用于制备香焖黄豆的方法，具体包含以下步骤：
（1）分别活化：将弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌分别进行活化；该活化培养按照本领域常规方法活化培养即可。
（2）将黄豆进行蒸煮、焖制处理；具体为：将黄豆洗净后倒入高压蒸锅中采用蒸汽进行蒸煮，蒸煮时间为15~30min，然后焖制10~20min，备用；
（3）将步骤（2）所得焖制后黄豆放入发酵罐，并接种步骤（1）活化后的弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌组成的复合益生菌进行发酵，发酵培育时间为36~72h，发酵温度为30~37℃，得到香焖黄豆。进一步的，当接种弯曲乳杆菌5-1时，所述弯曲乳杆菌5-1以弯曲乳杆菌菌液的形式添加，所述弯曲乳杆菌菌液中弯曲乳杆菌5-1的浓度为104~107CFU/ml，例如浓度为106CFU/ml；当接种植物乳杆菌时，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中植物乳杆菌的浓度为105~108CFU/ml，例如浓度为106CFU/ml。弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌的接种量为3~6ml/100g，即每100g焖制后黄豆接种3~6ml弯曲乳杆菌菌液和植物乳杆菌菌液（其中，复合益生菌中弯曲乳杆菌和植物乳杆菌菌体比例为1~2:1）。复合益生菌的制备方法为：将弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌活化后按照菌体数量1~2：1的浓度混合，调整菌液总浓度到106~107CFU/ml。
实施例2
本实施例制备香焖黄豆的方法与实施例类似，但步骤（3）不加入弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1，只加入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的保藏编号：CGMCC 1.12934。
实施例3
本实施例制备香焖黄豆的方法与实施例类似，但步骤（3）不加入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），只加入弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1；所述弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1的保藏编号：CGMCC No.12891。
实施例4
本实施例制备香焖黄豆的方法与实施例类似，但步骤（3）中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（保藏编号：CGMCC 1.12934）替换成植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（保藏编号：CGMCC 1.1856）。植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）（保藏编号：CGMCC 1.1856）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例5
本实施例制备香焖黄豆的方法与实施例类似，但步骤（2）中黄豆不进行蒸煮、焖制处理，仅浸泡4~8h。
实施例6
测试发酵前黄豆（焖制后黄豆或浸泡后黄豆）和发酵后黄豆（香焖黄豆）中黄豆苷元、雌马酚含量；具体测试方法为，将需要测试产品（焖制后黄豆或浸泡后黄豆、香焖黄豆）制成大豆粉，取大豆粉0.2g，向所得大豆粉中加入25倍于其重量的体积百分浓度为90%的甲醇溶液，于60～70℃条件下超声波处理，再离心4～6min，所得上清液通过HPLC测试，并计算得到焖制后黄豆或香焖黄豆中黄豆苷元、雌马酚含量，每个实验重复5次取平均值。结果如表1所示。
表1 不同实施例组别中发酵前黄豆和发酵后黄豆中黄豆苷元、雌马酚含量
由表1可知，（1）实施例1发酵后黄豆检测到了雌马酚，而实施例2-4均未检测到雌马酚，说明单独使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1或者植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）均无将黄豆苷元转化为雌马酚的效果，联合使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1（CGMCC No.12891）和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）（CGMCC 1.1856）也没有将黄豆苷元转化为雌马酚的效果；只有联合使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1（CGMCC No.12891）和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）（CGMCC 1.12934）具有将黄豆苷元转化为雌马酚的效果。
（2）相较于实施例5，实施例1中发酵前黄豆中黄豆苷元和发酵后黄豆中雌马酚的含量均小于实施例1，这可能是黄豆经过蒸煮、焖制处理后黄豆苷元更易提取且更易被转化为雌马酚。
实施例7
1、实验动物分组
雌性Wistar大鼠经适应性饲养后，行阴道脱落细胞学监测，筛选出动情周期正常者为受试大鼠，选定35只，体重280~300g，分为7组，各组大鼠之间无统计学差异。
第1组：空白对照组（正常大鼠）；
第2组：阳性对照组（补佳乐组）；
第3组：阴性对照组
第4组：实施例2所得香焖黄豆（弯曲乳杆菌5-1）处理组
第5组：实施例3所得香焖黄豆（植物乳杆菌CGMCC 1.12934）处理组；
第6组：实施例1所得香焖黄豆（弯曲乳杆菌5-1 +植物乳杆菌CGMCC 1.12934）处理组
第7组：实施例4所得香焖黄豆（弯曲乳杆菌5-1 +植物乳杆菌CGMCC 1.1856）处理组。每组大鼠5 只。其中，正常大鼠组作为空白对照，阳性对照组、阴性对照组、处理组均使用卵巢早衰（POF）大鼠造模成功大鼠。所述植物乳杆菌（保藏编号为CGMCC 1.1856），该菌株购买和保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2、卵巢早衰（POF）大鼠造模方法：造模30只雌性Wistar大鼠，每只雌性Wistar大鼠用雷公藤多苷片（10mg/片），每天0.6mg/（100g．d）体重，灌胃1次/d，连续9天，建立POF大鼠模型，每日进行阴道涂片，观察动情周期变化；当模型组雌鼠动情周期紊乱、动情间期延长、无动情周期或动情期，表示大鼠卵巢早衰造模成功，通过卵泡数、激素水平、发情周期和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。造模成功的30只卵巢早衰（POF）大鼠，按第2-7组给药，另外5只同批次的大鼠不作任何处理，按第1组处理，作为正常组，
建模成功后，空白对照组和阴性对照组不给药，正常喂养；阳性对照组给予补佳乐的混悬液进行灌胃，根据药品用药指导转换成大鼠用药量，补佳乐的混悬液中补佳乐浓度为0.1mg/ml。处理组给予香焖黄豆悬浮液灌胃（香焖黄豆磨成粉，制成悬浮液），不同组别给与相应香焖黄豆悬浮液灌胃灌胃处理，处理组每只大鼠0.1g香焖黄豆/（100g．d）体重，根据用量灌入相应量的悬浮液；所有组别均连续处理20天，第21天收集血清及卵巢组织数据。
3、血清检测：处理20天后，第21天对大鼠眼眶静脉取血，收集血液于EP管中，分离血清，取上层血清，按照检测试剂盒所述的Elisa法检验大鼠血清中的雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、抗苗勒氏管激素（AMH）的水平。试验结果如表2所示。
表2 不同组别大鼠治疗后血清检测参数表
通过表3可以发现，相较于阴性对照组（第3组）和第4、5、7组，第6组中采用实施例1所制备的香焖黄豆的E2和AMH均明显升高，FSH均明显下降，接近正常大鼠水平，说明本发明所得香焖黄豆能够有效改善卵巢早衰症状。
4、大鼠卵巢组织的卵泡计数
将大鼠麻醉处理，取大鼠左侧卵巢组织于4％多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚5μm，进行HE染色，显微镜下观察卵巢组织中各级卵泡。发现：相较于阴性对照组（第3组）和第4、5、7组，第6组中采用实施例1所制备的香焖黄豆，该组大鼠卵巢组织中初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数也均明显的恢复，闭锁卵泡数明显减少，接近正常大鼠水平，说明本发明配方能够有效改善卵巢早衰症状。
综上所述，本发明人在研究和实践过程中，发现联合使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1（CGMCC No.12891）和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）（CGMCC 1.12934）作为发酵菌种进行黄豆发酵，具有将其黄豆苷元转化为雌马酚的效果，可以有效增强对妇女更年期综合症（卵巢早衰）的治疗效果。弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 1.12934都是安全性很高的食品用菌，安全性有保障，其用于制备的香焖黄豆在治疗更年期综合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失调疾病上很有前景。而使用弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1和其他的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）如实施例4列出的植物乳杆菌CGMCC 1.1856则没有这种效果。推测这两株菌在代谢过程中出现了代谢物或者次代谢物正好激发了某些基因的表达，从而达到此效果，具体原理有待进一步研究。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.复合益生菌，其特征在于，其包括弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）5-1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatus）5-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.12891。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 1.12934。
4.权利要求1-3任一种复合益生菌在香焖黄豆制备上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，复合益生菌用于制备香焖黄豆的方法，具体包含以下步骤：
（1）分别活化：将弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌分别进行活化；
（2）将黄豆进行蒸煮、焖制处理；
（3）将步骤（2）所得焖制后黄豆放入发酵罐，并接种步骤（1）活化后的弯曲乳杆菌5-1和植物乳杆菌组成的复合益生菌进行发酵，得到香焖黄豆。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）具体为：将黄豆洗净后倒入高压蒸锅中采用蒸汽进行蒸煮，蒸煮时间为15~30min，然后焖制10~20min，备用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，当接种弯曲乳杆菌5-1时，所述弯曲乳杆菌5-1以弯曲乳杆菌菌液的形式添加，所述弯曲乳杆菌菌液中弯曲乳杆菌5-1的浓度为104~107CFU/ml；当接种植物乳杆菌时，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中植物乳杆菌的浓度为105~108CFU/ml。
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