CN105535035A - 一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法，该组合物为米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和桦褐孔菌发酵产物Ⅲ，具有良好的降血脂功能。其制备包括：将米根霉种子液接入含有费菜和辣木叶的米根霉固态发酵培养基中培养，然后置于交变磁场环境中再培养，得米根霉固态发酵产物，再经亚临界水萃取，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ；将桦褐孔菌种子液接入含有萃取剩余物Ⅱ的桦褐孔菌液体发酵培养基中培养，得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ；该方法能够有效地将各原料中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。

Description

一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotusobliquus)属真菌门(Eumycota)担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)纤孔菌属，俗称桦癌褐孔菌、白桦茸、斜管纤孔菌，欧洲人称之为chaga，是一种药用价值很高、应用前景广泛的真菌，可用于治疗各种消化道癌症、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血压，还能够改善过敏体质，增强免疫力。
如今，为了得到营养特色不同和/或用途不同的桦褐孔菌产品，人们开始对桦褐孔菌传统的发酵方法进行改进或者创新，以期得到不同营养特色和/或不同用途的桦褐孔菌产品。例如：中国专利申请CN201310651781.6公开了一种桦褐孔菌发酵物，该发酵物用于治疗糖尿病，其制备方法包括：以桦褐孔菌为发酵菌，按常规方法培养发酵所得，其中桦褐孔菌由中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌种编号为1511C0001ACCC51184，其中发酵培养基，按重量体积比计(g/ml)，黄豆粉1-2.5％、葡萄糖0.5-3％、氨基酸0.05-0.5％、磷酸二氢钾0.1-0.5％，其余为水，调节pH5.5-6.0，温度25-28℃，培养8-12天后放罐收集菌丝体，通过优化的发酵条件生产获得的具有更高药效的发酵物。
中国专利申请CN201310055029.5公开了一种液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，包括桦褐孔菌菌种活化、桦褐孔菌液体菌种培养、液体深层发酵及桦褐孔菌免疫增强活性物质制备等主要步骤，其中，液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，促进剂0.9-1g/L，诱导剂3×10-5g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·2H2O0.01g/L，K2HPO40.4g/L，FeSO4·7H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CuSO4·5H2O0.02g/L，CoCl20.01g/L，MnSO4·H2O0.08g/L，pH值6.0；液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25kg/cm3，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天；桦褐孔菌免疫增强活性物质制备：将发酵产物过滤，获得菌丝体和发酵液，将菌丝体超声波破壁，干燥粉碎后得菌丝体粉，将发酵液浓缩至原体积的30％-40％后得发酵浓缩液，按1g菌丝体粉加30-40ml发酵浓缩液的比例，将菌丝体粉和发酵浓缩液混合均匀，干燥后得粉状的桦褐孔菌免疫增强活性物质。该方法获得的免疫增强活性物质含量更高，活性更好，产品更利于工业化应用。
如能开发新的桦褐孔菌产品及其制备方法，将可提高桦褐孔菌的应用范围及应用价值。
发明内容
本发明提供了一种桦褐孔菌发酵培养组合物，该组合物中活性成分的含量和活性高，具有良好的降血脂功能。
本发明发现，根据桦褐孔菌的发酵特性，通过本发明特定的真菌发酵及特定的工艺，能够有效地将辣木叶和费菜中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。
本发明采用的技术方案是：
一种桦褐孔菌发酵培养组合物的制备方法，包括步骤：
(1)取活化后的桦褐孔菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4天-15天，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于18℃-30℃孵育1h-20h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第二菌体液，将第二菌体液接种到含胆盐的液体MRS培养基中于18℃-30℃再培养2天-20天，得到桦褐孔菌种子液；
(2)取活化后的米根霉菌种接种到液体MRS培养基中培养3h-30h，离心收集第三菌体，将第三菌体悬浮在含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-30℃孵育0.5h-15h，离心收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液接种到含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-30℃培养3h-30h，得到米根霉种子液；
(3)将步骤(2)的米根霉种子液接入米根霉固态发酵培养基中，在20℃-30℃培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得米根霉固态发酵产物；所述米根霉固态发酵培养基中含有费菜和辣木叶；
(4)将步骤(3)的米根霉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ；
(5)将步骤(1)的桦褐孔菌种子液接入桦褐孔菌液体发酵培养基中，调pH值为3-7，在15℃-25℃培养5天-25天，离心，得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ，所述桦褐孔菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物Ⅱ；
所述桦褐孔菌发酵培养组合物为米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和桦褐孔菌发酵产物Ⅲ。
本发明进行米根霉固态发酵时，直接采用经含NaCl的液体MRS培养基两步孵育处理的米根霉种子液，并向培养基中添加辣木叶和费菜，能够有效地将其营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。步骤(4)和步骤(5)中，将米根霉固态发酵产物进行亚临界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得以最大程度保留、含量得以大幅提高；再将萃取后的残渣作为桦褐孔菌液体发酵主要的培养基，且采用经含胆盐的液体MRS培养基两步孵育处理的桦褐孔菌种子液，通过一体化循环利用，使各原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中活性成分的含量和活性。
为了达到更好的效果，优选：
步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.05％-0.5％。
所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体液的接种量为5％。
步骤(2)中，所述含NaCl的液体MRS培养基中NaCl的质量百分含量为0.5％-8％。
所述第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体液的接种量为3％。
步骤(3)中，所述米根霉固态发酵培养基每1L中含有4.0g-8.5g费菜和0.2g-4.5g辣木叶。所述米根霉固态发酵培养基由费菜、辣木叶和发酵基础培养基组成，所述发酵基础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。所述费菜选用费菜全株。
所述米根霉固态发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜费菜、辣木叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将4.0g-8.5g费菜和0.2g-4.5g辣木叶用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到米根霉固态发酵培养基。
所述米根霉种子液的接入量为米根霉固态发酵培养基体积的5％-25％。
目前真菌发酵技术普遍存在发酵周期长、菌丝生长萌发慢、特征次生代谢代谢产物含量低等问题。本发明发现将变磁场处理技术应用于固态发酵中，通过特定培养时期的适当处理等外界因素有效刺激，提高真菌菌丝在费菜和辣木叶培养基料上的生长代谢，缩短发酵时间，有效促进次生代谢产物的生成。所述交变磁场环境中磁场强度为0.2mT-6mT，磁场频率为3Hz-40Hz。
步骤(4)中，所述亚临界水萃取的条件为：水料质量比为10-50:1，萃取压力在4MPa-25MPa，萃取温度为100℃-180℃，萃取时间为10min-90min。
步骤(5)中，所述桦褐孔菌液体发酵培养基每1L中含有0.2g-1g萃取剩余物Ⅱ。所述桦褐孔菌液体发酵培养基由萃取剩余物Ⅱ和发酵基础培养基组成，所述的发酵基础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。
一般发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％-3％、K2HPO40.1％-0.2％、MgSO40.05％-0.1％和余量的水。
所述桦褐孔菌液体发酵培养基的制备方法，包括：将0.2g-1g萃取剩余物Ⅱ用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到桦褐孔菌液体发酵培养基。
所述桦褐孔菌种子液的接入量为桦褐孔菌液体发酵培养基体积的3％-20％。
所述桦褐孔菌菌种可采用现有任意一种桦褐孔菌菌种，可采用市售产品，例如：桦褐孔菌(Inonotusobliquus)菌种，购于北京北纳创联生物技术研究院。
所述米根霉菌种可采用现有任意一种米根霉菌种，可采用市售产品，例如：米根霉(Rhizopusoryzae)ACCC30416菌种，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
所述液体MRS培养基采用本领域常规的液体MRS培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。一般液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。
所述PBS缓冲液即磷酸缓冲盐溶液，采用本领域常规的PBS缓冲液，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。一般1LPBS缓冲液：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加适量去离子水充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。
所述活化后的桦褐孔菌菌种、活化后的米根霉菌种在液体MRS培养基中培养的温度均为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L液体MRS培养基中接入1cm2-4cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌种菌块、活化后的米根霉菌种菌块。所述桦褐孔菌菌种或米根霉菌种的活化方法采用本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桦褐孔菌菌种或米根霉菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度20℃-30℃，培养时间3天-25天，得到活化后的桦褐孔菌菌种或活化后的米根霉菌种。所述的PDA平板培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。
所述接种量指接入的菌体液的体积与培养基体积之比的百分数。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
所述的桦褐孔菌发酵培养组合物，优选由40重量份-55重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和20重量份-35重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ组成。
本发明桦褐孔菌发酵培养组合物具有良好的降血脂功能，可用来制备具有降血脂功能的保健品或者药品。所述的保健品或者药品可以直接由所述组合物制备也可由所述组合物与本领域的辅料一起制备，产品剂型可以多种多样，例如一种包含桦褐孔菌发酵培养组合物的软胶囊，其内容物由40重量份-55重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ、20重量份-35重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ和10重量份-20重量份维生素E组成。所述软胶囊的制备采用软胶囊的常规制备方法。
费菜(SedumaizoonL.)，别称：土三七、四季还阳、景天三七、长生景天、金不换、田三七，为景天科景天属多年生草本植物，根状茎短，粗茎高可达50厘米，直立。叶互生，叶坚实，近革质。聚伞花序有多花，萼片肉质，花瓣黄色，花柱长钻形。种子椭圆形，花果期6-9月。费菜分布广，多生长于山地林缘、灌木丛中，河岸草丛、较耐阴也较耐旱、较耐寒，在北方能露地越冬，对土壤无严格选择，适应性强。费菜含有生物碱、齐敦果酸、谷甾醇、黄酮类、景天庚糖、果糖及维生素等药物成分。
辣木叶(horseradishtreeleaves)为原产于印度的多年生热带落叶乔木辣木树(又称为鼓槌树)的树叶，可食用。
米根霉(RhizopusoryzaeWentetPr.Geerl.)是中国药和酒曲中的重要霉菌之一。在土壤、空气及其他物质上亦常见。菌落疏松或稠密，最初白色后变为灰褐至黑褐色，匍匐枝爬行，无色。假根发达，指状或根状分枝。囊托楔形，菌丝形成厚垣孢子，接合孢子未见。
本发明所用的原料均可采用市售产品。
本发明的有益效果：
1、本发明进行米根霉固态发酵时，直接采用经含NaCl的液体MRS培养基两步孵育处理的米根霉种子液，并向培养基中添加辣木叶和费菜，能够有效地将其营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。步骤(4)和步骤(5)中，将米根霉固态发酵产物进行亚临界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得以最大程度保留、含量得以大幅提高；再将萃取后的残渣作为桦褐孔菌液体发酵主要的培养基，且采用经含胆盐的液体MRS培养基两步孵育处理的桦褐孔菌种子液，通过一体化循环利用，使各原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中活性成分的含量和活性。
2、本发明方法原料来源天然、质量可控，对环境无污染，适于工业化生产。
3、本发明桦褐孔菌发酵培养组合物与普通桦褐孔菌发酵产物、费菜和辣木叶提取物相比对血清中的总胆固醇和甘油三酯含量的降低更加显著，说明本发明桦褐孔菌发酵培养组合物及其软胶囊产品，能够显著降低血清中的总胆固醇和甘油三酯含量，具有显著的降血脂功能，可用来制备具有降血脂功能的保健品或者药品。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
桦褐孔菌(Inonotusobliquus)菌种，购于北京北纳创联生物技术研究院。
米根霉(Rhizopusoryzae)ACCC30416菌种，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
胆盐：3号胆盐，即胆酸钠、胆酸-脱氧胆酸钠盐混合物(北京恒业中远化工)。
实施例1
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桦褐孔菌菌种、斜面保藏的米根霉菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，分别得到活化后的桦褐孔菌菌种、活化后的米根霉菌种。
液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。
发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％、K2HPO40.1％、MgSO40.05％和余量的水。
1LPBS缓冲液：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加适量去离子水充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
二、桦褐孔菌发酵制品的制备
(1)取2cm2大小活化后的桦褐孔菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于25℃培养10天，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.2％的含胆盐的液体MRS培养基中于25℃孵育10h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第二菌体液，将第二菌体液按5％的接种量接种到胆盐质量百分含量为0.2％的含胆盐的液体MRS培养基中于22℃再培养12天，得到桦褐孔菌种子液；
其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1。
(2)取1cm2大小活化后的米根霉菌种接种到1L液体MRS培养基中于25℃培养15h，培养液经6000rpm离心10min收集第三菌体，将第三菌体悬浮在NaCl质量百分含量为5％的含NaCl的液体MRS培养基中于25℃孵育8h，经6000rpm离心10min收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液按3％的接种量接种到NaCl质量百分含量为5％的含NaCl的液体MRS培养基中于25℃培养15h，得到米根霉种子液；
其中，第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:1，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1。
(3)将米根霉种子液按占米根霉固态发酵培养基体积15％的接入量接入米根霉固态发酵培养基中，在25℃培养20天，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养12天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得米根霉固态发酵产物；
米根霉固态发酵培养基的制备包括：将新鲜费菜全株、辣木叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；然后将6g费菜和2g辣木叶用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到米根霉固态发酵培养基。
(4)将米根霉固态发酵产物粉碎过40目筛，经亚临界水萃取，亚临界水萃取的条件为：水料质量比为30:1，萃取压力在15MPa，萃取温度为150℃，萃取时间为60min，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ。
(5)将桦褐孔菌种子液按占桦褐孔菌液体发酵培养基体积10％的接入量接入桦褐孔菌液体发酵培养基中，调pH值为5，在20℃培养15天，经6000rpm离心10min得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ；
桦褐孔菌液体发酵培养基的制备包括：将0.6g萃取剩余物Ⅱ用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到桦褐孔菌液体发酵培养基。
桦褐孔菌发酵培养组合物由40重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和20重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ组成。
三、软胶囊产品的制备：软胶囊的填充物由40重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ、20重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ和10重量份维生素E组成。
实施例2
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桦褐孔菌菌种、斜面保藏的米根霉菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度20℃，培养时间25天，分别得到活化后的桦褐孔菌菌种、活化后的米根霉菌种。
发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖3％、K2HPO40.2％、MgSO40.1％和余量的水。
液体MRS培养基和PBS缓冲液同实施例1。
二、桦褐孔菌发酵制品的制备
(1)取1cm2大小活化后的桦褐孔菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于20℃培养15天，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.05％的含胆盐的液体MRS培养基中于18℃孵育20h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第二菌体液，将第二菌体液按5％的接种量接种到胆盐质量百分含量为0.05％的含胆盐的液体MRS培养基中于18℃再培养20天，得到桦褐孔菌种子液；
其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:2，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:2。
(2)取4cm2大小活化后的米根霉菌种接种到1L液体MRS培养基中于30℃培养3h，培养液经6000rpm离心10min收集第三菌体，将第三菌体悬浮在NaCl质量百分含量为8％的含NaCl的液体MRS培养基中于20℃孵育15h，经6000rpm离心10min收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液按3％的接种量接种到NaCl质量百分含量为8％的含NaCl的液体MRS培养基中于20℃培养30h，得到米根霉种子液；
其中，第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:3，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:3。
(3)将米根霉种子液按占米根霉固态发酵培养基体积25％的接入量接入米根霉固态发酵培养基中，在20℃培养30天，然后置于磁场强度为0.2mT、磁场频率为3Hz的交变磁场环境中再培养20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得米根霉固态发酵产物；
米根霉固态发酵培养基的制备包括：将新鲜费菜全株、辣木叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将8.5g费菜和4.5g辣木叶用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到米根霉固态发酵培养基。
(4)将米根霉固态发酵产物粉碎过40目筛，经亚临界水萃取，亚临界水萃取的条件为：水料质量比为50:1，萃取压力在25MPa，萃取温度为180℃，萃取时间为10min，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ。
(5)将桦褐孔菌种子液按占桦褐孔菌液体发酵培养基体积20％的接入量接入米根霉液体发酵培养基中，调pH值为7，在25℃培养5天，经6000rpm离心10min得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ；
桦褐孔菌液体发酵培养基的制备包括：将1g萃取剩余物Ⅱ用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到桦褐孔菌液体发酵培养基。
桦褐孔菌发酵培养组合物由55重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和35重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ组成。
三、软胶囊产品的制备：软胶囊的填充物由55重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ、35重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ和20重量份维生素E组成。
实施例3
一、材料准备
PDA平板培养基、液体MRS培养基和PBS缓冲液同实施例1。
将斜面保藏的桦褐孔菌菌种、斜面保藏的米根霉菌种分别接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间3天，分别得到活化后的桦褐孔菌菌种、活化后的米根霉菌种。
发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖2％、K2HPO40.15％、MgSO40.08％和余量的水。
二、桦褐孔菌发酵制品的制备
(1)取4cm2大小活化后的桦褐孔菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于30℃培养4天，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.5％的含胆盐的液体MRS培养基中于30℃孵育1h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第二菌体液，将第二菌体液按5％的接种量接种到胆盐质量百分含量为0.5％的含胆盐的液体MRS培养基中于30℃再培养2天，得到桦褐孔菌种子液；
其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:3。
(2)取2cm2大小活化后的米根霉菌种接种到1L液体MRS培养基中于20℃培养30h，培养液经6000rpm离心10min收集第三菌体，将第三菌体悬浮在NaCl质量百分含量为0.5％的含NaCl的液体MRS培养基中于30℃孵育0.5h，经6000rpm离心10min收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液按3％的接种量接种到NaCl质量百分含量为0.5％的含NaCl的液体MRS培养基中于30℃培养3h，得到米根霉种子液；
其中，第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:2，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:2。
(3)将米根霉种子液按占米根霉固态发酵培养基体积5％的接入量接入米根霉固态发酵培养基中，在30℃培养3天，然后置于磁场强度为6mT、磁场频率为40Hz的交变磁场环境中再培养5天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得米根霉固态发酵产物；
米根霉固态发酵培养基的制备包括：将新鲜费菜全株、辣木叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将4.0g费菜和0.2g辣木叶用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到米根霉固态发酵培养基。
(4)将米根霉固态发酵产物粉碎过40目筛，经亚临界水萃取，亚临界水萃取的条件为：水料质量比为10:1，萃取压力在4MPa，萃取温度为100℃，萃取时间为90min，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ。
(5)将桦褐孔菌种子液按占桦褐孔菌液体发酵培养基体积3％的接入量接入米根霉液体发酵培养基中，调pH值为3，在15℃培养25天，经6000rpm离心10min得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ；
桦褐孔菌液体发酵培养基的制备包括：将0.2g萃取剩余物Ⅱ用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到桦褐孔菌液体发酵培养基。
桦褐孔菌发酵培养组合物由50重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和25重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ组成。
三、软胶囊产品的制备：软胶囊的填充物由50重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ、25重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ和15重量份维生素E组成。
对比例1
一、材料准备
PDA平板培养基、活化后的桦褐孔菌菌种、液体MRS培养基和发酵基础培养基均同实施例1。
二、桦褐孔菌发酵制品的制备
(1)取2cm2大小活化后的桦褐孔菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于25℃培养5天，得到桦褐孔菌液体种子液。
(2)将桦褐孔菌液体种子液按占发酵基础培养基体积15％的接入量接入发酵基础培养基中，在25℃培养10天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得桦褐孔菌发酵产物；
三、软胶囊产品的制备：软胶囊的填充物由40重量份桦褐孔菌发酵产物和10重量份维生素E组成。
对比例2
将新鲜费菜全株、辣木叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；按料液重量比1:10加水，在沸腾状态下提取10h，过滤得一次滤液和一次滤渣，将一次滤渣按料液重量比1:5加水，在沸腾状态下提取8h，过滤得二次滤液，合并一次滤液和二次滤液，经冷冻干燥、粉碎后得到费菜和辣木叶提取物。
软胶囊产品的制备：软胶囊的填充物由40重量份费菜和辣木叶提取物和10重量份维生素E组成。
活性成分的测定
(1)多糖含量的测定
称取适量样品干粉，粉碎后过40目，置于烧杯中，按料液比1:10(质量比)加入蒸馏水，90℃浸提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，50℃下减压浓缩，浓缩液加入4倍体积无水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min、20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀用蒸馏水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即多糖含量。
(2)黄酮含量的测定
精确称取120℃条件下干燥至恒重的芦丁标准品10.0mg，用质量百分浓度70％的乙醇水溶液溶解并定容至100mL，配成0.1mg/mL标准溶液。分别取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，分别补加质量百分浓度70％乙醇水溶液至5.0mL后，加入0.3mL质量百分浓度5％的NaNO2水溶液，摇匀放置6min；再加0.4mL质量百分浓度10％的Al(NO3)3水溶液，摇匀放置6min；再加4.0mL质量百分浓度4％NaOH水溶液，质量百分浓度60％乙醇水溶液定容至刻度，摇匀放置15min，冷却至室温后在510nm处测定标准品的吸光度，以标准品溶液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。
称取适量样品干粉，粉碎后过40目，先按料液比1:30(质量比)加入质量百分浓度70％的乙醇水溶液，在70℃下提取2h，提取液离心过滤后定容至50ml，从中取1ml样品进行含量测定。
(3)三萜含量的测定
精密称取齐墩果酸对照品一定量，置容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，超声15min，并稀释至刻度，摇匀，制成0.1mg/ml的对照品溶液。分别吸取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml和1.20ml对照品溶液，于100℃水浴上蒸干后放置室温，加入0.40ml5％香草醛—冰乙酸和1.00ml高氯酸，在65℃水浴中加热15min并移入冰水浴中冷却3min,取出放置室温，再加入5.00ml冰乙酸，摇匀并置于室温。15min后用分光光度计于552±2nm波长下测定对照品溶液的吸光度。分别以浓度和吸光度绘制标准曲线。
取样品约0.50g，精密称定，置100ml容量瓶中，用约85ml乙酸乙酯溶解，超声30min，过滤，少量乙酸乙酯淋洗滤渣，定容至刻度，摇匀。吸取1ml该溶液，于100℃水浴上蒸干后放置室温，加入0.40ml5％香草醛—冰乙酸和1.0ml高氯酸，在65℃水浴加热15min并移入冰水浴中3min,取出放置室温，再加入5.00ml冰乙酸，摇匀并置于室温。15min后用分光光度计于552±2nm波长下测定样品溶液的吸光度。
表1各实施例和对比例主要成分检测结果
注：与对比例1、对比例2比较，Δ：P<0.05。
表1的数据显示，本发明桦褐孔菌发酵培养组合物，大幅度同时提高了产物中多糖、黄酮、三萜等活性成分的含量。与对比例1常规培养方法相比，采用本发明方法获得的桦褐孔菌发酵培养组合物中多糖含量提高了62.8％-64.3％，黄酮含量提高了52.4％-55.4％，三萜含量提高了45.2％-47.8％。
辅助降血脂实验
(1)实验动物分组
小鼠24-28g，雌雄各半，适应性生长1周后根据TC水平随机分组，每组10只。通过测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平判断降血脂的效果。
(2)给药方法及剂量
高脂饲料为北京华阜康生物科技有限公司的KK鼠料，粗脂肪质量百分含量16.15％，在给予高脂饲料的同时给予不同剂量的受试样品(即实施例1-3中的组合物、对比例1中的桦褐孔菌发酵产物和对比例1中的费菜辣木叶提取物)。实验设5个处理，即高、中、低3个剂量组(8.0ml/kg、16.0ml/kg、24.0ml/kg)、基础对照组和高脂对照组，高脂对照组和基础对照组均以蒸馏水灌胃，并分别给予高脂饲料和基础饲料(购自广东省医用动物场)，与剂量组同步进行。各剂量组每天灌胃1次软胶囊样品，连续饲喂30天，在给予受试样品的同时喂高脂饲料，自由进食和饮水。
(3)测定内容及方法
本实验为预防性给药，在给予高脂饲料的同时给予不同剂量的受试样品，于实验结束禁食16小时，根据总胆固醇测定试剂盒(COD-PAP法)及甘油三酯测定试剂盒(GPO-PAP法)中说明书所述，分别测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。检测结果见表2。
表2软胶囊样品对小鼠TC和TG的影响(X±S，n＝10)
组别 TC(mmol/L) TG(mmol/L)
基础对照组 1.296±0.196 1.132±0.216
高脂对照组 3.795±0.131 1.857±0.335
实施例1低剂量组 2.485±0.268△*# 1.361±0.192△*#
实施例1中剂量组 2.473±0.257△*# 1.226±0.174△*#
实施例1高剂量组 2.259±0.299△*# 1.098±0.408△*#
实施例2低剂量组 2.576±0.3256△*# 1.311±0.172△*#
实施例2中剂量组 2.282±0.154△*# 1.172±0.226△*#
实施例2高剂量组 2.154±0.407△*# 1.101±0.317△*#
实施例3低剂量组 2.513±0.299△*# 1.354±0.299△*#
实施例3中剂量组 2.309±0.197△*# 1.238±0.168△*#
实施例3高剂量组 2.208±0.332△*# 1.115±0.332△*#
对比例1低剂量组 3.119±0.192 1.633±0.169
对比例1中剂量组 3.042±0.285 1.617±0.217
对比例1高剂量组 2.976±0.155 1.569±0.325
对比例2低剂量组 3.499±0.298 1.751±0.221
对比例2中剂量组 3.441±0.224 1.681±0.315
对比例2高剂量组 3.256±0.321 1.669±0.318
△表示与高脂对照组比较P＜0.05，差异显著；*表示与对比例1对应剂量组比较P＜0.05，差异显著；#表示与对比例2对应剂量组比较P＜0.05，差异显著。
表2数据显示，与对比例1普通发酵的桦褐孔菌发酵产物、对比例2费菜和辣木叶提取物相比，本发明桦褐孔菌发酵培养组合物对血清中的总胆固醇和甘油三酯含量的降低更加显著，本发明桦褐孔菌发酵培养组合物降血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的作用要明显优于对比例1普通发酵的桦褐孔菌发酵产物、对比例2费菜和辣木叶提取物，说明本发明桦褐孔菌发酵培养组合物及其软胶囊产品，能够显著降低血清中的总胆固醇和甘油三酯含量，具有显著的降血脂功能。
在本发明配方和制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响本发明桦褐孔菌发酵培养组合物及其软胶囊产品的降血脂功效和制备，因此本发明配方和制备方法中任意参数的组合均可得到桦褐孔菌发酵培养组合物及其软胶囊产品。在此不再赘述。

Claims (10)

1.一种桦褐孔菌发酵培养组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)取活化后的桦褐孔菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4天-15天，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于18℃-30℃孵育1h-20h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第二菌体液，将第二菌体液接种到含胆盐的液体MRS培养基中于18℃-30℃再培养2天-20天，得到桦褐孔菌种子液；
(2)取活化后的米根霉菌种接种到液体MRS培养基中培养3h-30h，离心收集第三菌体，将第三菌体悬浮在含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-30℃孵育0.5h-15h，离心收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液接种到含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-30℃培养3h-30h，得到米根霉种子液；
(3)将步骤(2)的米根霉种子液接入米根霉固态发酵培养基中，在20℃-30℃培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得米根霉固态发酵产物；所述米根霉固态发酵培养基中含有费菜和辣木叶；
(4)将步骤(3)的米根霉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ；
(5)将将步骤(1)的桦褐孔菌种子液接入桦褐孔菌液体发酵培养基中，调pH值为3-7，在15℃-25℃培养5天-25天，离心，得到桦褐孔菌发酵产物Ⅲ；所述桦褐孔菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物Ⅱ；
所述桦褐孔菌发酵培养组合物为米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和桦褐孔菌发酵产物Ⅲ。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述米根霉固态发酵培养基每1L中含有4.0g-8.5g费菜和0.2g-4.5g辣木叶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述桦褐孔菌液体发酵培养基每1L中含有0.2g-1g萃取剩余物Ⅱ。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.05％-0.5％；
步骤(2)中，所述含NaCl的液体MRS培养基中NaCl的质量百分含量为0.5％-8％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体液的接种量为5％；
步骤(2)中，所述第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体液的接种量为3％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述交变磁场环境中磁场强度为0.2mT-6mT，磁场频率为3Hz-40Hz；
步骤(4)中，所述亚临界水萃取的条件为：水料质量比为10-50:1，萃取压力在4MPa-25MPa，萃取温度为100℃-180℃，萃取时间为10min-90min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，米根霉种子液的接入量为米根霉固态发酵培养基体积的5％-25％；
步骤(5)中，所述桦褐孔菌种子液的接入量为桦褐孔菌液体发酵培养基体积的3％-20％。
8.一种桦褐孔菌发酵培养组合物，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的桦褐孔菌发酵培养组合物，其特征在于，所述组合物由40重量份-55重量份米根霉发酵亚临界萃取物Ⅰ和20重量份-35重量份桦褐孔菌发酵产物Ⅲ组成。
10.一种桦褐孔菌发酵培养组合物的应用，其特征在于，根据权利要求8或9所述的桦褐孔菌发酵培养组合物在制备降血脂的保健品或药品中的应用。
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