KR101576998B1

KR101576998B1 - 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101576998B1
Application number: KR1020130132223A
Authority: KR
Inventors: 조주현; 김정현
Original assignee: (주)휴럼
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2015-12-11
Also published as: KR20150050940A

Abstract

본 발명은 조릿대를 천연배지로 하고, 이 천연배지에 버섯종균을 접종한 후 발효시켜 획득되는 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 식품에 관한 것으로, 조릿대로부터 유래되는 기능성과 (약용)버섯으로부터 유래되는 기능성의 조합으로 다양한 기능성과 필요로 하는 효능에 적합할 수 있도록 하는 조릿대-버섯 발효물과 이를 이용한 식품을 제공할 수 있다.
이러한 본 발명인 조릿대-버섯 발효물은, 조릿대를 이용하여 제조되는 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하여 발효시켜 획득되며, 상기 버섯종균은 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 가진다. 또한, 상기 버섯종균은 영지버섯 종균을 사용함으로써 콜레스테롤에 대한 기능성을 가지도록 한다.
본 발명인 조릿대-버섯 발효물의 제조방법은, 조릿대를 이용하여 멸균과정과 수분함량이 62±3%로 조절된 조릿대 천연배지를 제조하는 단계(S10)와; 상기 단계(S10)에서 제조된 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하는 단계(S20)와; 상기 단계(S20)에서 버섯종균이 접종된 조릿대 천연배지를 발효시키는 단계(S30)를 포함하며, 상기 단계(S10)는, 증자와 건조를 포함하는 준비단계(S11)와, 상기 단계(S11) 후 수분함량이 62±3%로 조절하는 수분조절단계(S12)를 포함하고, 상기 단계(S20)에서 접종하는 버섯종균은 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 가지도록 한다.
상기의 조릿대-버섯 발효물은 정제형태로 가공된 식품으로 사용될 수 있으며, 조릿대-버섯 발효물을 이용한 식품은 조릿대-버섯 발효물 획득시 버섯종균을 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 포함하도록 한다.

Description

조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법{Sasa borealis-mushroom ferment of food and Method for the preparation}

본 발명은 조릿대를 천연배지로 하고, 이 천연배지에 버섯종균을 접종한 후 발효시켜 획득되는 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 식품에 관한 것이다.

조릿대는 대나무 중에서 가장 작은 대나무로서 우리나라 중부이남 지방의 산에 빽빽하게 무리지어 흔히 자란다.

조릿대는 동의보감, 본초강목, 신농본초경에 따르면 조릿대는 인삼을 훨씬 능가하다고 할 만큼 놀라운 약성을 지닌 약초이며, 대나무 중에서 약성이 제일 강하여 조릿대 한 가지만 써서 당뇨병, 고혈압, 위염, 위궤양, 만성 간염, 암 등의 난치병이 완치된 경우가 적지 않다고 한다.

또한, 조릿대는 열을 내리고 독을 풀며, 가래를 없애고 소변을 잘 나오게 하며, 염증을 치료하고 암세포를 억제하는 등의 효과가 있다고 알려져 있다.

조릿대는 자원 식물학적으로는 열매에 저장 전분을 많이 함유하고 있어, 예로부터 제주지방에서는 식량 기근시의 중요한 구황식물로 활용되어 왔으며, 앞으로도 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다(Kim,C.H.: Ecotypic Variation of Sasa quelpaertensis Nakai According to the Environmental Gradient of Habitats, Journal of Natural Science of Pusan Women's University, Vol 2, 21~36, 1996).

이러한 조릿대에 관한 특허문헌으로는 아래에 제공된 특허문헌 이외에도 다양한 기술들이 제공되어 있으며, 조릿대가 가지는 효능을 다양한 분야에 활용 및 이용하고자 하고 있는 실정이다.

(KR) 공개특허공보 10-2006-0075212호인 생리활성을 갖는 제주조릿대 추출물에서는, 메탄올과 같은 유기용매를 이용하여 조릿대 추출물 획득하도록 하는 기술을 제공하고 있으며,

(KR) 공개특허공보 10-2009-0116527호인 제주조릿대 새잎을 이용한 차의 제조방법 그에 의해 제조된 제주조릿대 새잎 차와, (KR) 공개특허공보 10-2009-0122584호인 조릿대 줄기(대)와 잎을 이용한 티백 차의 제조방법 및 그에 의해 제조된 조릿대 티백 차에서는, 조릿대를 이용한 차를 제조하는 기술을 제공하고 있으며,

(KR) 공개특허공보 10-2010-0035469호인 조릿대 액기스의 제조방법 및 이에 의해 제조되는 조릿대 액기스에서는, 조릿대를 가열하여 발생하는 증기를 냉각시켜 액화하여 조릿대 액기스를 제조하는 방법을 제공하고 있으며,

(KR) 공개특허공보 10-2012-0120542호인 제주조릿대를 활용한 조릿대 선식제품에서는, 조릿대를 볶은 후 다른 곡류와 함께 미분쇄하여 혼합하여 선식제품으로 사용하도록 하는 기술을 제공하고 있으며,

(KR) 공개특허공보 10-2013-0064178호인 제주조릿대 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에서는, 조릿대 추출물을 함유하도록 함으로써 피부 보습효과를 나타내는 화장품에 관한 기술을 하고 있으며, 조릿대의 추출방법으로는 유기용매를 이용한 기술을 제공하고 있으며,

(KR) 공개특허공보 10-2013-0112517호인 조릿대 추출물 및 이를 이용한 조릿대 된장의 제조방법에서는, 셀루라제 효소를 이용하여 조릿대 추출물을 획득하도록 하는 기술과 이 조릿대 추출물을 이용하여 된장을 제조하는 방법을 제공하고 있다.

(KR) 공개특허공보 10-2006-0075212 (공개일;2006.07.04) (KR) 공개특허공보 10-2009-0116527 (공개일;2009.11.11) (KR) 공개특허공보 10-2009-0122584 (공개일;2009.12.01) (KR) 공개특허공보 10-2010-0035469 (공개일;2010.04.05) (KR) 공개특허공보 10-2012-0120542 (공개일;2012.11.02) (KR) 공개특허공보 10-2013-0112517 (공개일;2013.10.14)

본 발명은 종래에 제공하고 있는 조릿대 추출물의 추출방법 이외의 다른 추출방법인 조릿대를 천연배지로 하여 버섯종균을 발효시킴으로써 조릿대-버섯 발효물을 획득하도록 하고자 하는 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 식품을 제공하고자 한다.

즉, 본 발명의 출원인은 다양한 천연물 소재에 관한 연구를 지속적으로 하고 있으며, 그 노력 중 효능에 비하여 그 활용도가 작은 조릿대에 대한 활용도를 높이는 한편, 조릿대의 기능성 증대와 관능적으로 우수한 발효물(발효소재)를 제공하고자 한다.

또한, 면역증진 약리효과에 의하여 현재 사회적으로 대두되고 있는 약물 오남용으로 인하여 발생할 수 있는 각종 문제를 해결할 수 있도록 하고자 하는데 목적이 있다.
또한, 천연배지로 사용되는 조리대로 이루어지는 천연물이 가지는 고유의 냄새를 억제시키고, 천연배지의 환경을 향상시켜 발효물에 대한 식음성 향상 및 우수한 발효물을 획득하고자 한다.

조릿대를 천연배지로 하여 버섯종균을 발효시켜 획득되는 조릿대-버섯 발효물은 면역증진 등과 같은 다양한 약리효과를 나타낼 수 있음을 본 발명의 출원인은 실험을 통하여 확인하였다.

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명인 조릿대-버섯 발효물은, 조릿대를 이용하여 제조되는 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하여 발효시켜 획득되며,

상기 버섯종균은 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 가진다.

또한, 상기 버섯종균은 영지버섯 종균을 사용함으로써 콜레스테롤에 대한 기능성을 가지도록 한다.

본 발명인 조릿대-버섯 발효물의 제조방법은, 조릿대를 이용하여 멸균과정과 수분함량이 62±3%로 조절된 조릿대 천연배지를 제조하는 단계(S10)와; 상기 단계(S10)에서 제조된 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하는 단계(S20)와; 상기 단계(S20)에서 버섯종균이 접종된 조릿대 천연배지를 발효시키는 단계(S30)를 포함하며,

상기 단계(S10)는, 증자와 건조를 포함하는 준비단계(S11)와, 상기 단계(S11) 후 수분함량이 62±3%로 조절하는 수분조절단계(S12)를 포함하고, 상기 단계(S20)에서 접종하는 버섯종균은 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 가지도록 한다.

상기의 조릿대-버섯 발효물은 정제형태로 가공된 식품으로 사용될 수 있으며, 조릿대-버섯 발효물을 이용한 식품은 조릿대-버섯 발효물 획득시 버섯종균을 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 종균을 사용함으로써 면역증진에 효과에 대한 기능성을 포함하도록 한다.

조릿대를 천연배지로 하는 경우 당과 같은 첨가물질이 없어도 버섯종균이 생육할 수 있는 최적의 조건을 제공할 수 있으며, 이로 인하여 기능성이 우수한 조릿대-버섯 발효물(발효소재)을 획득할 수 있는 장점이 있다.
즉, 증자과정과 건조과정의 전처리과정을 포함함으로써 천연배지로 사용되는 조리대로 이루어지는 천연물이 가지는 고유의 냄새가 억제되고, 천연배지의 환경을 향상시켜 발효물에 대한 식음성 향상 및 우수한 발효물을 획득할 수 있는 장점을 가진다.

특히, 조릿대-버섯 발효물은 조릿대로부터 유래되는 기능성 외에도 (약용)버섯으로부터 유래되는 다양한 유효성분을 포함함으로써 면역증강 및 다양한 생리활성을 갖는 발효물(발효소재)를 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 실시 예를 나타낸 조릿대-버섯 발효물의 제조단계도.
도 2는 조릿대-버섯 발효물을 2주간 투여한 생쥐의 PBMC에서 Th 세포의 빈도.
도 3은 조릿대-버섯 발효물을 2주간 투여한 생쥐의 복강에서 활성 Th 림프구 세포의 빈도.
도 4는 조릿대-버섯 발효물을 2주간 투여한 생쥐의 복강에서 활성 대식세포의 빈도.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 될 것이며, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 당과 같은 첨가물질이 없어도 버섯종균이 생육할 수 있는 최적의 조건을 제공할 수 있는 조릿대를 천연배지로 하고, 이 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종한 후 조릿대 천연배지를 발효시켜 조릿대로부터 유래되는 기능성과 (약용)버섯으로부터 유래되는 기능성을 가지는 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 식품에 관한 것이다.

이러한 본 발명인 조릿대-버섯 발효물을 획득하기 위한 제조방법은 도 1과 같은 단계로 제조된다.

1. 천연배지를 제조하는 단계( S10 )

천연배지를 제조하는 단계(S10)는 크게 천연배지로 사용될 조릿대를 준비하는 준비단계(S11)과, 수분조절과 멸균을 하는 수분을 조절하는 단계(S12)로 이루어진다.

- 준비단계(S11)는 조릿대를 선별, 세척 및 절단(파쇄)한 후 증자를 시킨 후 건조시키는 단계를 포함한다.

증자단계는 생물 조릿대를 85℃~95℃에서 20~60분간 쪄 증자시키는 것으로, 천연물을 일정한 시간의 증자과정을 거친 건조물로 추출할 경우, 천연물이 가지고 있는 고유의 냄새 감소 및 천연배지의 환경을 향상시킬 수 있다.

건조단계는 증자단계에서 증자한(찐) 조릿대를 공기가 잘 통하는 장소에서 건조시키는 것으로, 이때, 수분함량이 10%이하게 되도록 건조시킨다. 보통 수분함량은 5~10%가 되도록 건조시키되, 바람직하게는 수분함량이 8~10%가 되게 건조한다.

- 수분을 조절하는 단계(S12)는 수분조절과 고온으로 가열하여 멸균하는 과정으로, 수분함량은 62±3%로 조절한다.

2. 버섯종균을 접종하는 단계( S20 )

상기 단계(10)에서 준비된 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하는 단계로, 접종되는 버섯종균은 최적의 조건인 온도 24~30℃, 통풍량 0.3~0.8vvm, 교반속도 80~140rpm으로 4~8일간 배양된 버섯종균을 사용하며,

상기 사용되는 버섯종균은 영지버섯, 상황버섯, 붉은 동충하초, 누에 동충하초, 노루궁뎅이버섯, 아가리쿠스 브라제 표고버섯 중 1종을 선택하여 단독사용한다.

상기 접종하는 버섯종균은 조릿대 천연배지에 13~17%(w/w)로 접종을 한다.

3. 천연배지를 발효하는 단계( S30 )

상기 단계(20)에서 버섯종균이 접종된 조릿대 천연배지를 온도 24~30℃, 20~55일 동안 발효시키는 단계이다.

상기와 같은 단계의 제조방법으로 획득되는 조릿대-버섯 발효물은 조릿대로부터 유래되는 기능성과 (약용)버섯으로부터 유래되는 기능성에 의하여 다양한 약리효과를 가질 수 있음으로, 버섯의 종균에 따라 다양한 기능성 발효물(발효소재)을 제공할 수 있다.

즉, 후설되는 실험에서와 같이 면역증강 등 다양한 생리활성을 갖는 기능성 발효물(발효소재)을 제공할 수 있다.

또한, 조릿대-버섯 발효물은 음료형태 또는 캡술형태 또는 환과 같은 정제형태로 가공되어 식품으로 사용될 수 있으며, 또는 조릿대-버섯 발효물을 포함하는 다양한 식품으로 사용될 수 있다.

이하, 실시 예를 통해 조릿대를 천연배지하여 버섯종균을 접종하여 발효기켜 획득되는 조릿대-버섯 발효물의 제조방법과 이를 이용한 기능성 식품을 상세히 설명한다.

실시 예 1. 조릿대-영지버섯 발효물 제조.

- 조릿대 천연배지를 준비하는 단계 : 조릿대 선별-세척 - 파쇄 - 증자 - 건조 단계를 거쳐서 얻어진 조릿대를 수분함량이 62±3%가 되도록 2단계 조절방법에 따라 조절하여 조릿대 천연배지를 준비한다.

- 영지버섯 종균을 준비하는 단계 : 영지버섯 균을 종균(전배양액)으로 사용하기 위해, 온도 28℃, Shaking Rate 120rpm에서 4일간 배양하여 종균(전배양액)을 준비한다.

- 영지버섯균을 접종하는 단계 : 상기 단계에서 준비된 조릿대 천연배지에 준비된 영지버섯 전배양액(종균)을 15%(w/w)를 접종한다.

- 영지버섯 종균을 접종한 조릿대 천연배지를 배양 및 발효시키는 단계 : 상기 단계에서 영지버섯이 접종된 조릿대 천연배지를 최적조건(온도 : 28℃)에서 22일간 발효시킨다.

- 마지막으로 발효물(발효소재)을 수득하는 단계 : 상기 단계에서 배양(발효)이 끝난 조릿대-영지버섯 발효물을 획득한다.

실시 예 2. 조릿대-노루궁뎅이버섯 발효물 제조.

- 노루궁뎅이버섯 종균을 준비하는 단계 : 노루궁뎅이버섯 균을 종균(전배양액)으로 사용하기 위해, 온도 24℃, Shaking Rate 130rpm에서 6일간 배양하여 종균(전배양액)을 준비한다.

- 노루궁뎅이버섯균을 접종하는 단계 : 상기 단계에서 준비된 조릿대 천연배지에 준비된 노루궁뎅이버섯 전배양액(종균)을 15%(w/w)를 접종한다.

- 노루궁뎅이버섯 종균을 접종한 조릿대천연배지를 배양 및 발효시키는 단계 : 상기 단계에서 영지버섯이 접종된 조릿대 천연배지를 최적조건(온도 : 24℃)에서 45일간 발효시킨다.

- 마지막으로 발효물(발효소재)을 수득하는 단계 : 상기 단계에서 배양(발효)이 끝난 조릿대-노루궁뎅이버섯 발효물을 획득한다.

실시 예 3. 조릿대-상황버섯 발효물 제조.

- 상황버섯 종균을 준비하는 단계 : 상황버섯 균을 종균(전배양액)으로 사용하기 위해, 온도 28℃, Shaking Rate 130rpm에서 5일간 배양하여 종균(전배양액)을 준비한다.

- 상황버섯균을 접종하는 단계 : 상기 단계에서 준비된 조릿대 천연배지에 준비된 상황버섯 전배양액(종균)을 15%(w/w)를 접종한다.

- 상황버섯 종균을 접종한 조릿대 천연배지를 배양 및 발효시키는 단계 : 상기 단계에서 상황버섯이 접종된 조릿대 천연배지를 최적조건(온도 : 28℃)에서 20일간 발효시킨다.

- 마지막으로 발효물(발효소재)을 수득하는 단계 : 상기 단계에서 배양(발효)이 끝난 조릿대-상황버섯 발효물을 획득한다.

상기 실시 예 1 내지 3에서 제조되는 조릿대-영지버섯 발효물, 조릿대-노루궁뎅이버섯 발효물, 조릿대-상황버섯 발효물을 각각 1㎏씩 열수환류추출하여 조릿대-영지버섯 발효물 추출분말(hurum-1) 230g, 조릿대-노루궁뎅이버섯 발효물 추출분말(hurum-2) 240g, 조릿대-상황버섯 발효물 추출분말(hurum-3) 225g을 얻었다.

실험 예 1.

조릿대-버섯 발효물 3종에 대한 관능평가

조릿대와 상기 실시 예 1 내지 3에서 얻어진 3종의 조릿대-버섯 발효물에 대하여 관능평가를 실시하였다.

상기 4개의 종류를 각각 85에서 4시간 저온추출한 추출물을 시료로 사용하였으며, 관능평가에 참여한 패널은 식품연구개발에 3년 이상 종사한 자 6인이 5점 만점으로 맛 적인 측면, 향 적인 측면 및 식품소재로서의 종합적인 측면에 대하여 평가하였다.

구 분	관 능 평 점
구 분	맛	향	종합적인 측면
조릿대	2.01/5.00	2.15/5.00	2.10/5.00
실시 예 1	3.20/5.00	3.02/5.00	3.15/5.00
실시 예 2	2.90/5.00	2.95/5.00	3.92/5.00
실시 예 3	3.00/5.00	2.90/5.00	2.95/5.00

실험 예 2.

면역증진효과 측정(1) : T 림프구 활성에 미치는 영향

실시 예 1 내지 3에서 얻어진 3종의 조릿대-버섯 발효물에 대한 면역증진효과를 검토하기 위하여 8주령의 Balb/c계 생쥐(male)에 Hurum-1시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏), Hurum-2시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏), Hurum-3시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏)를 14일간(2주간) 경구 투여하였다.

PBMC 와 비장에서 활성 T 림프구의 형광 유세포 분석

PBMC (Peripheral blood mononuclear cell)는 Hurum시료 2주간 투여 후 heparin을 처리한 3㎖ 주사기로 심장천좌법으로 채혈하였다.

미리 준비한 10㎖의 ACK용액(8.3g NH4Cl, 1g KHCO3, in 1ℓ of demineralized water + 0.1 mM EDTA)에 혼합하여 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 제거하였다.

비장을 적출하여 100mesh로 비장세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리(1700rpm)하고 세척한 후 cell strainer(FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다.

분리된 PBMC와 비장세포를 2회 1%의 FBS가 함유된 PBS(FACS buffer)로 세척한 후 cell strainer(FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 불순물을 제거하였다.

각각의 시험 관에 PBMC 세포를 5×10⁵세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD3e-PE, anti-CD25-FITC, anti-CD4-FITC, anti-CD69-FITC, anti-CD44-cy5.5-PE, anti-CTLA-4-FITC, anti-NK1.1-PE, anti-CD49b-FITC를 넣고 30분간 얼음에서 반응시킨 후 3 회 이상 PBS로 수세한 후 flow cytometry의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD4⁺CD25⁺,CD44⁺CD69⁺,CD49b⁺NK1.1⁺,그리고 CD25⁺CTLA-4⁺의 활성세포 빈도(%)로 분석하였다.

그 결과 도 2와 같은 결과를 얻었다.

즉, Hurum-1과 Hurum-2에서는 160㎎/㎏과 360㎎/㎏에서 높은 Th 면역세포 활성 빈도가 나타났고, 반대로 Hurum-3에서는 저농도인 60㎎/㎏에서 효능을 나타내어 흥미로운 결과를 나타내었으며, Hurum-1 내지 3 투여군 모두에서 양성대조약물로 투여한 홍삼 100㎎/㎏보다 현저한 Th 면역세포 활성 빈도의 증가를 나타내었다.

실험 예 3.

면역증진효과 측정(2) : 대식세포 활성에 미치는 영향

대식세포에서 산화질소 생성능 측정 :

Balb/c계 생쥐에 Hurum시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏)를 14일간 경구 투여하였다. 투여 종료 3일 전에 proteose peptone (Difco) 10% 수용액 1.5㎖을 생쥐 복강 내에 투여한 후 치사시키고 알코올로 복부를 소독하였다.

복부의 피부를 가위로 자르고 복막을 노출시킨 다음 냉각시킨 HBSS을 주사기로 복강 내에 4.5㎖ 주입하고 30초간 복부를 마사지한 후 주사기로 회수하였다.

회수한 세포를 냉각시킨 다음 동일 HBSS용액으로 2회 세척한 후 냉각된 배지(RPMI1640)에 현탁시키고, tryphan blue 염색에 의해 살아있는 세포를 계산하여 2×10⁶cells/이 되도록 조정한 후 96 well 배양접시에 200㎕씩 분주하였다.

Co2 배양기에서 1~2시간 배양하여 대식세포를 부착시킨 다음 37℃의 HBSS 용액으로 3회 세척하여 부유세포를 제거하고 100㎕의 배지(RPMI 1640)를 넣는다. Co2 배양기에서 72시간 배양 후 배양 상등액을 회수하여 냉동 보존하였다. 배양상등액 100㎕를 취하고 증류수 2㎖과 그리스(Griese) 시약I 200㎕를 혼합하였다. 신속하게 Griese 시약II 200㎕를 넣고 교반 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

복강세포군의 증식능에 미치는 영향 측정 :

Balb/c계 생쥐에 Hurum시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏)를 14일간 경구 투여하였다. 투여 종료 2일 전에 2% starch 생리식염수 현탁액 0.5㎖을 생쥐 복강 내에 주사하여 면역시킨다.

생쥐를 치사시키고 알코올로 복부를 소독한 다음 복부의 피부를 가위로 자르고 복막을 노출시킨 다음 냉각시킨 HBSS을 주사기로 복강 내에 5㎖ 주입하고 30초간 복부를 마사지한 후 주사기로 3㎖ 정도를 회수하였다.

회수한 세포를 냉각시킨 다음 동일 HBSS용액으로 2회 세척한 후 이중에 존재하는 복강 세포 수를 직접 현미경 하에서 hemocytometer로 측정하였다. 총 복강세포수의 측정이 끝난 복강 세척액을 4℃에서 400g로 10분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻어 PBS로 현탁하였다.

각각의 시험 관에 복강세포를 5×10⁵세포로 조정한 후 4℃에서 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD11b-FITC, anti-CD3-cy5.5-PE, anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC, anti-CD14-PE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시킨 후 3회 이상 PBS로 수세한 후 flow cytometry의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD11b⁺CD14⁺,CD3⁺CD4⁺,그리고 CD3⁺CD8⁺의 활성세포도(%)를 분석한 다음 총 세포수를 적용하여 복강세포군의 절대 세포수(absolute number)를 산출하였다.

[결과 1]

복강에서 활성 T 림프구의 형광 유세포 분석 :

우리의 연구결과 2주간 시료를 경구투여 후 복강(peritoneal)에서 활성 Th 림프구 세포의 빈도수(%)가 음성대조군(NC)이 8.4%로 나타났고, 홍삼 투여군은 10.5%로 음성대조군에 비하여 25% 증가를 나타내었다.

Hurum-1 투여군은 360㎎/㎏ 투여군이 음성대조군에 비하여 50% 이상 활성 Th 림프구 빈도수가 증가하였고, 60㎎/㎏ 투여군은 28% 이상 증가를 나타내었고 160㎎/㎏ 투여군은 차이가 없었다.

Hurum-2 투여군은 60㎎/㎏투여군이 63% 이상 활성 Th 림프구 빈도수가 증가하였고, Hurum-2 160㎎/㎏과 360㎎/㎏ 투여군은 음성대조군과 차이가 없었다.

Hurum-3는 160㎎/㎏과 360㎎/㎏ 투여군이 음성대조군에 비하여 각각 48%와 84% 이상 활성 Th 림프구 세포의 빈도수(%)가 증가하였다.

즉, Hurum-1과 Hurum-3에서는 360㎎/㎏에서 높은 Th 면역세포 활성 빈도가 나타났고, 반대로 Hurum-2에서는 저농도인 60㎎/㎏에서 효능을 나타내어 흥미로운 결과를 나타내었다(도 3 참조).

[결과 2]

우리의 연구결과 2주간 시료를 경구투여 후 복강(peritoneal)에서 활성 대식세포(CD11b+) 세포의 빈도수(%)가 음성대조군(NC)이 12.6%로 나타났고, 홍삼 투여군은 13.3%로 음성대조군에 비하여 약간 증가를 나타내었다.

Hurum-1 투여군은 160㎎/㎏과 360㎎/㎏ 투여군이 음성대조군에 비하여 각각 57%와 73% 이상 활성 대식세포 빈도수가 증가하였다.

Hurum-2 투여군은 160㎎/㎏과 360㎎/㎏투여군이 dir 68% 이상 활성 대식세포 빈도수가 증가하였고, Hurum-2 60㎎/㎏ 투여군은 음성대조군에 비하여 38% 증가를 나타내었다.

Hurum-3는 160㎎/㎏과 360㎎/㎏ 투여군이 음성대조군에 비하여 각각 71%와 96% 이상 활성 대식세포 빈도수(%)가 증가하였다. 또한 60㎎/㎏ 투여군은 음성대조군에 비하여 약 2배 이상 증가를 나타내었고, 고농도보다는 저농도에서 더 높은 면역세포 활성이 나타내었다.

즉, Hurum-1과 Hurum-2에서는 160mg/kd과 360㎎/㎏에서 높은 활성대식세포빈도수가 나타났고, 반대로 Hurum-3에서는 저농도인 60㎎/㎏에서 가장 큰 효능을 나타내어 흥미로운 결과를 나타내었으며, Hurum이 복강 대식세포의 활성에 관여하여 생체 내에서 면역 증진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

실험 예 4.

- 면역증진효과 측정(3) : 비장, 림프( draining lymph node , DLN ), 그리고 흉선 ( thymus )의 총세포수 측정

실시 예 1 내지 3에서 얻어진 3종의 조릿대-버섯 발효물에 대한 면역증진효과를 검토하기 위하여 8주령의 Balb/c계 생쥐(male)에 Hurum-1시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏), Hurum-2시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏), Hurum-3시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏)를 14일간 경구 투여하였다.

Balb/c계 생쥐에 Hurum시료(60㎎/㎏, 160㎎/㎏, 360㎎/㎏)를 14일간 경구 투여하였다. 실험동물을 ethyl ether로 마취시킨 후 비장, 림프, 그리고 흉선을 분리하여 총 면역세포수를 측정하였다. Balb/c 생쥐에서 비장, 림프 그리고 흉선을 각각 적출하여 100mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리(1700 rpm)하여 2회 세척한 후 cell strainer (FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다.

이들 세포들을 ACK 용액(8.3g NH4Cl, 1g KHCO3, in 1L of demineralized water + 0.1mM EDTA)을 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 D-PBS로 2회 세척한 후 0.04% trypan blue로 염색한 후 세포수를 측정하였다.

- 조릿대를 천연배지로 한 발효소재에 대한 콜레스테롤 개선효과

실시 예 1과 같이 조릿대 천연배지에 영지버섯을 발효시켜 획득한 조릿대-영지버섯 발효물을 추출하여 동결건조한 시료에 대하여 콜레스테롤를 감소시키는 예방효과를 확인하였다.

SD Rat를 각각 6마리씩 3개군으로 나누어, 정상대조군에는 일반고형사료를, 유발대조군과 조릿대-영지버섯 발효물군에는 동물성 지방함량이 30%인 사료를 25일간 섭취시켰다. 이때 조릿대-영지버섯 발효물군에는 실험 예 2의 방법으로 제조된 Hurum시료를 150㎎/㎏ 씩 같이 투여하였다.

25일 후 채혈 후 혈장을 분리한 다음 분석 키트를 사용하여 총콜레스테롤, LDL 콜레스테롤을 측정하여 아래 표 2와 같은 결과를 얻었다.

표 2에서 나타난 혈중지질함량의 변화결과와 같이 유발대조군에 비해 조릿대-영지버섯 발효물군이 총콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 감소효과가 확인되었다.

실험군	총콜레스테롤	LDL
정상대조군	280	148
유발대조군	415	284
영지버섯 조릿대발효물군	308	165

Claims

천연물이 가지는 고유의 냄새를 감소시키고, 천연배지의 환경을 향상시키고자 생물 조릿대를 85~95℃에서 20~60분간 찌는 증자과정과 수분함량이 5~10%가 되도록 건조시키는 건조과정을 포함하는 준비단계(S11)와, 상기 단계(S11) 후 수분함량을 62±3%로 조절하는 수분조절단계(S12)를 포함하는 조릿대 천연배지를 제조하는 단계(S10)와;
상기 단계(S10)에서 제조된 조릿대 천연배지에 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 버섯종균을 접종하는 단계(S20)와;
상기 단계(S20)에서 버섯종균이 접종된 조릿대 천연배지를 온도 24~30℃, 20~55일 동안 발효시키는 단계(S30)를 포함하여 획득됨을 특징으로 하는 조릿대-버섯 발효물.
천연물이 가지는 고유의 냄새를 감소시키고, 천연배지의 환경을 향상시키고자 생물 조릿대를 85~95℃에서 20~60분간 찌는 증자과정과 수분함량이 5~10%가 되도록 건조시키는 건조과정을 포함하는 준비단계(S11)와, 상기 단계(S11) 후 수분함량을 62±3%로 조절하는 수분조절단계(S12)를 포함하는 조릿대 천연배지를 제조하는 단계(S10)와;
상기 단계(S10)에서 제조된 조릿대 천연배지에 영지버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯 중 어느 하나의 버섯종균을 접종하는 단계(S20)와;
상기 단계(S20)에서 버섯종균이 접종된 조릿대 천연배지를 온도 24~30℃, 20~55일 동안 발효시키는 단계(S30)를 포함함을 특징으로 하는 조릿대-버섯 발효물의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제