KR101746208B1 - 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents
신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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- A23Y2220/77—
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Abstract
본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한것으로, 보다 상세하게는 3종의 버섯 추출물을 동량으로 혼합한 복합버섯 추출물을 비피도박테리움 비피덤 유산균을 이용하여 1차 발효시키고, 락토바실러스 사케이 LI033 유산균을 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포의 손상 및 사멸을 억제하는 신경세포보호 효과 활성을 증진시켜, 기억능력 개선 등 뇌질환 예방에 활용될 수 있는 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명인 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법은 복합버섯 추출물을 제조하는 단계; 상기 복합버섯 추출물을 최종 5 브릭스가 되도록 보당 및 희석하는 단계; 상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 추출물에 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum )을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 35~40℃에서 70~74시간 동안 혐기적으로 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 35~40℃에서 22~26시간 동안 미호기적으로 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 를 포함하며, 상기 복합버섯 추출물은 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 75~85℃에서 2~4시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체 추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명인 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법은 복합버섯 추출물을 제조하는 단계; 상기 복합버섯 추출물을 최종 5 브릭스가 되도록 보당 및 희석하는 단계; 상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 추출물에 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum )을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 35~40℃에서 70~74시간 동안 혐기적으로 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 35~40℃에서 22~26시간 동안 미호기적으로 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 를 포함하며, 상기 복합버섯 추출물은 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 75~85℃에서 2~4시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체 추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한것으로, 보다 상세하게는 3종의 버섯 추출물을 동량으로 혼합한 복합버섯 추출물을 비피도박테리움 비피덤 유산균을 이용하여 1차 발효시키고, 락토바실러스 사케이 LI033 유산균을 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포의 손상 및 사멸을 억제하는 신경세포보호 효과 활성을 증진시켜, 기억능력 개선 등 뇌질환 예방에 활용될 수 있는 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
과학과 의학 지식의 발달로 인류의 평균수명은 계속 증가하여 왔으며, 전체 인구 중 노인층이 차지하는 비율이 커져서 고령화 문제가 전세계적인 관심사로 대두되고 있다. 특히 우리나라는 저출산의 영향으로 다른 나라들에 비해 급속하게 고령화가 진행되어 노인의 삶에 대한 대책이 시급한 실정이다.
인구고령화와 함께 노인성 질환으로 인한 사회적 피해가 심화되고 있는데, 특히 치매나 인지능력퇴화에 따른 기억력 저하가 가장 치명적인 노인문제로 대두되고 있다. 치매는 점진적인 인지기능의 장애를 보이는 임상적 증후군이다. 노인의 경우에는 전신 질환의 발생빈도가 높고, 대사 상태가 변하며, 항상성 기전이 감소하고, 복합적인 약물을 복용할 가능성이 크다. 또한 노인의 뇌는 구조적, 독성 또는 대사 이상에 더 예민하게 반응하여 손상을 입을 수 있고 노화에 의한 인지장애에 더하여 치매 증상이 나타난다. 치매의 경우 치료를 할 수 없는 퇴행성 질환으로 인식되어 왔지만 초기 치매의 경우 인지기능감퇴의 속도를 현저히 줄이거나, 인지기능을 향상시키는 약제들이 나와 있다. 최근에는 치매의 고위험군으로 알려진 경도인지장애를 가지고 있는 사람에게도 효과가 있다는 연구결과가 발표되고 있다.
한편 버섯은 진균류에 속하는 담자균중 자실체를 형성하는 고등균류로서 전세계적으로 약 15,000여 종이 알려져 있다. 이중 한국에는 약 970여 종이 기록되어 있고 약 20여 종은 재배되고 있다. 버섯은 최근 약리적인 효과가 인정되어 제약분야와 함께 기능성 식품으로도 많은 주목을 받고 있다. 버섯이 의약품 및 새로운 식품소재로 관심을 끌고 있는 중요한 요인으로서는 식용이나 의료용으로 장기간 복용하여도 부작용이 거의 나타나지 않는다는 장점에 있다. 버섯의 균사체는 자실체와 마찬가지로 다양한 생리적 기능을 가지는 것으로 밝혀짐에 따라 자실체를 형성하여 식용으로 이용하는 경우를 제외하고는 균사체를 배양하여 의약품과 건강식품에 다양하게 이용하는 것이 실용적이다. 버섯은 식물성 단백질과 아미노산, 효소, 지방, 철분, 섬유소, 비타민, 미네랄 등과 같이 인체에 중용한 각종 영양성분을 함유하고 있으며 특유의 향과 맛 때문에 예로부터 사람들이 즐겨 먹었고, 지방질이 적고 식이섬유와 단백질이 풍부한 저칼로리 식품으로 알려져 있다. 또한, 여러 가지 건강기능성 물질이 많이 함유되어 있는 식재료로써 노화예방을 위한 항산화활성, 항암, 항당뇨, 체중감량, 면역력증강, 고혈압예방 등의 성인병 예방에 관한 생리활성 효과를 가지고 있어 건강기능식품 및 의약품 원료로 많이 이용되고 있으며 자실체 뿐만 아니라 균사체를 이용한 간기능, 면역력 개선 제품이 시판되고 있다.
다양한 버섯들로부터 면역증강 및 항암, 항바이러스 항당뇨, 항혈전, 항고혈압 등의 생리활성 효과가 밝혀져 건강식품 또는 기능성 식품으로 생산과 소비가 증가추세에 있다. 인공재배를 하는 대표적인 식용버섯으로는 표고, 느타리버섯, 양송이, 팽이버섯, 큰느타리버섯(새송이), 목이, 버들송이, 잎새버섯, 만가닥버섯, 노루궁뎅이버섯, 풀버섯 등이 있으며, 야생버섯으로는 송이, 꾀꼬리버섯, 능이, 싸리버섯, 뽕나무버섯부치, 송로 등이 있다.
또한 프로바이오틱스(probiotics)는 안티바이오틱스(antibiotics)에 대비되는 용어로서 “사람이나 동물에게 건조세포나 발효산물의 형태로 투여하여 숙주의 장내 균총을 개선하여 좋은 영향을 주는, 단일 혹은 복합 형태의 생균제”로 정의할 수 있다. 프로바이오틱스에 사용되는 균들은 건강한 사람의 장에서 흔하게 발견되는 상주균들로 흔히 “유산균”이라고 불리는 유익한 균을 포함한다. 프로바이오틱스의 주요 기능으로는 ‘식품의 상품성 향상’‘혈중 콜레스테롤 농도 저하’‘면역 증진’‘영양학적 효능’‘유해효소의 합성 억제’‘유당 불내증의 개선’‘장내 유해균의 증식 억제’‘설사치유 및 정장작용’‘장내 균총의 정상화 및 노화 방지’및 ‘피부미용효과’등을 볼 수 있다. 프로바이오틱스는 효능이 매우 다양하기 때문에 흔히 알려진 건강식품 및 의료용의 소재 외에도 다양한 분야에 응용되고 있다.
유산발효는 발효과정에서 생성되는 산미와 독특한 향, 정장작용, 부패 및 병원성 미생물의 발육억제 등의 장점 때문에 음료 및 기능성 식품개발에 많이 이용되어 왔다. 각종 식품 및 음료의 저장과 발효에 널리 이용되는 유산균은 다양한 Bacteriocin을 생성하는 것으로 알려져 있다. 유산균(Lactic acid bacteria)은 발효식품들의 관능특성에 영향을 줄 수 있는 아로마, 향미료, 효소등과 같은 물질들을 생산할 뿐만 아니라 몇몇 유산균에는 발효식품들의 물성, 조직감, 점성제, 당화, 안정성, 수분결합제, 젤화, 농축특성 등에 영향을 줄 수 있는 엑소폴리사카라이드(EPS)를 생산하는 것으로 보고되어 있다. 엑소폴리사키라이드는 산업적인 유용한 측면의 물리적인 특성뿐만 아니라 인체에 유용한 생리적 특성인 면역증진, 항궤양 활성, 혈중 콜레스테롤 감소 등의 유용한 효과를 나타낸다고 보고되어 왔으며, 일반적으로 안정한 물질로 인식되어 왔다.
하지만 세계적으로 유산균의 이용은 현재 대부분이 유가공품 및 일반식품에 치우쳐 있어, 기타 여러 우수 건강기능식품소재와의 결합을 통한 양질의 제품 개발이 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 대한민국 공개특허 제10-2015-0050940호에서는 조릿대-버섯 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 식품을 개시하고 있으나, 이는 조릿대 천연배지에 버섯종균을 접종하여 발효시킨 것으로, 조릿대 천연배지가 주요 구성물이 되므로 버섯의 구성비율이 적어져 효능이 저하될 수 있으며, 버섯종균을 이용해 발효시킴으로써 유산균 발효의 효능을 느낄 수 없다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 발명된 것으로서, 3종의 버섯 추출물을 동량으로 혼합한 복합버섯 추출물을 비피도박테리움 비피덤 유산균을 이용하여 1차 발효시키고, 락토바실러스 사케이 LI033 유산균을 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포의 손상 및 사멸을 억제하는 신경세포보호 효과 활성을 증진시켜, 기억능력 개선 등 뇌질환 예방에 활용될 수 있는 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명인 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법은 복합버섯 추출물을 제조하는 단계; 상기 복합버섯 추출물을 최종 5 브릭스가 되도록 보당 및 희석하는 단계; 상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 추출물에 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum )을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 35~40℃에서 70~74시간 동안 혐기적으로 1차 발효하는 단계; 상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종하는 단계; 상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 35~40℃에서 22~26시간 동안 미호기적으로 2차 발효하는 단계; 상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계; 를 포함하며, 상기 복합버섯 추출물은 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 75~85℃에서 2~4시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체 추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같이 제시된 본 발명에 의한 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물은 3종의 버섯 추출물을 동량으로 혼합한 복합버섯 추출물을 비피도박테리움 비피덤 유산균을 이용하여 1차 발효시키고, 락토바실러스 사케이 LI033 유산균을 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포의 손상 및 사멸을 억제하는 신경세포보호 효과 활성을 증진시켜, 기억능력 개선 등 뇌질환 예방에 활용될 수 있다는 효과가 있다.
보다 구체적으로 세포노화 억제 및 기억 능력 향상에 효과가 있는 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯을 이용하여 복합버섯 추출물을 제조하고, 상기 복합버섯 추출물을 세포노화 억제 및 기억 능력 향상에 효과가 있는 비피도박테리움 비피덤을 이용하여 1차 발효시키며, 상기 1차 발효물을 김치에서 분리하여 활성이 있는 락토바실러스 사케이 LI033를 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포노화 억제 및 기억 능력 향상 효과를 현저히 증진시킬 수 있다는 효과가 있는 것이다.
세포노화 억제 및 기억 능력 향상에 효과가 뛰어난 3종의 버섯 즉, 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯 추출물을 혼합하여 복합버섯 추출물을 제조함으로써, 1종의 버섯을 이용할 때보다 효능을 더욱 증진시킬 수 있다.
아울러 버섯 추출물 100%로 구성된 복합버섯 추출물을 2차 발효시킴으로써, 버섯 및 유산발효의 효능을 현저히 증진시킬 수 있다.
이로써 일반인의 기억능력 개선 및 인구고령화에 따른 치매와 같은 노인성 질환을 예방할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물의 제조방법을 나타내는 순서도.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 ABTS 라디칼 소거 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 AChE 저해 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 H2O2 자극이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내는 그래프.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내는 그래프.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 신경세포 보호 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 발효물이 apoptosis 억제 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 caspase-3 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 z-VAD-fmk 첨가에 따른 버섯 발효물의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 버섯 추출물 및 발효물이 HO-1 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 ZnPP 첨가에 따른 버섯 발효물의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 ABTS 라디칼 소거 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 AChE 저해 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 H2O2 자극이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내는 그래프.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내는 그래프.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 신경세포 보호 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 발효물이 apoptosis 억제 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 복합버섯 추출물 및 발효물이 caspase-3 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 z-VAD-fmk 첨가에 따른 버섯 발효물의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 버섯 추출물 및 발효물이 HO-1 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 ZnPP 첨가에 따른 버섯 발효물의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 이들
실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
먼저 도 1을 참조하면, 본 발명인 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물의 제조방법은 복합버섯 추출물을 제조하는 단계(S10); 상기 복합버섯 추출물을 최종 5 브릭스가 되도록 보당 및 희석하는 단계(S20); 상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계(S30); 상기 멸균된 복합버섯 추출물에 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum )을 2%(v/v)로 접종하는 단계(S40); 상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 35~40℃에서 70~74시간 동안 혐기적으로 1차 발효하는 단계(S50); 상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계(S60); 상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계(S70); 상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종하는 단계(S80); 상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 35~40℃에서 22~26시간 동안 미호기적으로 2차 발효하는 단계(S90); 상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계(S100); 상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계(S110); 를 포함한다.
이때 상기 복합버섯 추출물은 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 75~85℃에서 2~4시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체 추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 제조한다.
또한 상기 비피도박테리움 비피덤은 MRS 액체배지를 사용하여 35~40℃인 CO2배양기에서 혐기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관하면서 사용하며,
상기 락토바실러스 사케이 LI033은 MRS 액체배지를 사용하여 35~40℃인 배양기에서 미호기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관하면서 사용한다.
이때 상기 2차 발효하는 단계와 락토바실러스 사케이 LI033이 배양되는 것은 미호기적으로 발효 또는 배양되는 것으로, 미호기적 발효 또는 배양 조건은 대기중의 산소농도 21%보다 낮은 산소농도가 2~10%인 것을 특징으로 한다. 상기 산소농도가 10%를 초과하거나 2% 미만시 미호기성 유산균인 락토바실러스 사케이 LI033의 생육이 저하되거나 사멸할 수 있으므로 산소농도를 2~10%로 유지시키는 것이 바람직하다.
이로써 세포노화 억제 및 기억 능력 향상에 효과가 있는 상황버섯, 영지버섯, 표고버섯을 이용하여 복합버섯 추출물을 제조하고, 상기 복합버섯 추출물을 세포노화 억제 및 기억 능력 향상에 효과가 있는 비피도박테리움 비피덤을 이용하여 1차 발효시키며, 상기 1차 발효물을 김치에서 분리하여 활성이 있는 락토바실러스 사케이 LI033를 이용하여 2차 발효시킴으로써, 세포노화 억제 및 기억 능력 향상 효과를 현저히 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.
<
실시예
1> 신경세포 보호활성을 갖는
복합버섯
유산균
발효물의
제조
복합버섯 추출물을 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 80℃에서 3시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체 추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 제조한다.
상기 복합버섯 추출물을 보당 및 희석하여 최종 5 브릭스(Brix)가 되도록 조정한다.
상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 121℃에서 15분간 멸균한다.
상기 멸균된 복합버섯 추출물에 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)를 사용하여 35~40℃인 CO2배양기에서 혐기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스(Sigma, USA)가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관되었던 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum )을 2%(v/v)로 접종한다.
상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 37℃에서 72시간 동안 혐기적으로 1차 발효한다.
상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 4℃에서 10,000rpm으로 5분간 원심분리한다.
상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 121℃에서 15분간 멸균한다.
상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 MRS 액체배지를 사용하여 35~40℃인 배양기에서 미호기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관되었던 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종한다.
상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 37℃에서 24시간 동안 미호기적으로 2차 발효한다.
이때 상기 2차 발효하는 단계와 락토바실러스 사케이 LI033이 배양되는 것은 미호기적으로 발효 또는 배양되는 것으로, 미호기적 발효 또는 배양 조건은 산소농도가 대기중의 산소농도 21%보다 낮은 2~10%인 것을 특징으로 한다. 따라서 상기 미호기적 발효 또는 배양 조건을 산소(O2) 5%, 이산화탄소(CO2) 10%, 질소(N2) 85%로 구성할 수 있음은 물론이다.
상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 4℃에서 10,000rpm으로 5분간 원심분리한다.
상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 121℃에서 15분간 멸균한다.
이때 하기 실험예에서 쓰이는 복합버섯 추출물, 발효물(복합버섯 1차 발효물, 복합버섯 2차 발효물)은 각각 상기 복합버섯 추출물을 멸균하는 단계 이후 동결건조되었던 것을 복합버섯 추출물로 이용하였고, 상기 복합버섯 1차 발효물을 멸균하는 단계 이후 동결건조되었던 것을 복합버섯 1차 발효물로 이용하였으며, 상기 복합버섯 2차 발효물을 멸균하는 단계 이후 동결건조되었던 것을 복합버섯 2차 발효물로 이용하였다.
<
실험예
1> 기억능력 향상 평가를 위한 시료의 활성 스크리닝
① DPPH 라디칼 소거 활성
복합버섯 추출물과 발효물을 농도별(0~10mg/mL)로 희석하여 96 well plate에 50μL 씩 분주하고 에탄올에 녹인 100μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 용액을 150μL 첨가하였다. 실온에서 차광상태로 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Dynex, USA)를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 L-ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 각 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.
다양한 자극으로부터 신경세포의 손상을 억제하고 기억능력을 향상시킬 수 있는 소재를 선발하기 위해 복합버섯 추출물과 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인한 결과는 도 2와 같다. 복합버섯 추출물은 68% 이상으로 대조구로 사용된 ascorbic acid(50μM)의 라디칼 소거 활성(66%)보다 높았다. 그러나 복합버섯 추출물은 1차, 2차 발효 과정을 거치면서 라디칼 소거 활성은 감소하는 경향을 보였다. 이는 발효 과정 중 생성되는 라디칼 소거 활성 물질의 생성량 보다 상황과 영지의 천연 항산화 물질인 폴리페놀 화합물과 비타민 C, E 등의 산화에 기인하여 활성이 저하된 것으로 사료된다. DPPH 라디칼 소거 활성을 확인한 결과, 복합버섯 추출물과 발효물의 항산화 활성이 우수 할 것으로 판단되어 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호할 수 있는 소재로 평가되었다.
② ABTS 라디칼 소거 활성
7mM ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid, Sigma, USA)와 2.4mM potasium persulfate(Sigma, USA) 용액을 혼합하여 16시간 동안 차광상태에서 ABTS+·를 형성시킨 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 630nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 희석하였다. 복합버섯 추출물과 발효물을 농도별(0~10mg/mL)로 희석하여 96 well plate에 분주하고 희석된 ABTS+·용액을 동량으로 가하여 630nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 50μM L-ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 각 시료에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.
다양한 자극으로부터 신경세포의 손상을 억제하고 기억능력을 향상시킬 수 있는 소재를 선발하기 위해 복합버섯 추출물과 유산균을 단계적으로 적용하여 발효시킨 1차, 2차 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 확인한 결과는 도 3과 같다. 복합버섯 추출물 및 발효물은 농도의존적으로 라디칼 소거 활성을 보였으며, 특히 10mg/mL의 농도에서 복합버섯 추출물은 68% 이상의 높은 라디칼 소거 활성을 보였다. 그러나 복합버섯 추출물은 1차, 2차 발효 과정을 거치면서 라디칼 소거 활성은 감소하는 경향을 보였다. 이는 DPPH 라디칼 소거 활성과 유사하게 발효 과정 중 생성되는 라디칼 소거 활성 물질의 생성량 보다 상황과 영지의 천연 항산화 물질인 폴리페놀 화합물과 비타민 C, E 등의 산화에 기인하여 활성이 저하된 것으로 사료된다. ABTS 라디칼 소거 활성을 확인한 결과, 복합버섯 추출물과 발효물의 항산화 활성이 우수 할 것으로 판단되어 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호할 수 있는 소재로 평가되었다.
③ AChE 저해 활성
복합버섯 추출물과 발효물의 AChE(Acetylcholinesterase) 저해활성을 측정하였다. AChE 저해활성 측정은 Amplite™ colorimetric acetylcholinesterase assay kit(AAT Bioquest, USA)를 이용하여 측정하였다. AChE의 농도는 300mU/mL까지 3배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였으며 대조구로 100μM donepezil(Sigma, USA)을 사용하였다. 각 시료의 AChE 저해활성은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.
인지기억 저하는 콜린성 신경세포 퇴화에 의한 acetylcholine의 부족이 중요한 원인 중 하나이며, 이러한 현상은 기억 중추와 밀접한 관련이 있는 것으로 판단되는 대뇌 변연계 내 acetylcholine 분해효소인 acetylcholinesterase(AChE)의 증가로 더욱 심화된다는 가설을 바탕으로 복합버섯 추출물과 유산균을 단계적으로 적용하여 발효시킨 1차, 2차 발효물의 AChE 저해 활성을 확인한 결과는 도 4와 같다. 복합버섯 추출물 및 발효물은 농도의존적으로 AChE 저해 활성을 보였으며 특히 5mg/mL의 농도에서 복합버섯 추출물은 52%, 1차 발효물은 54% 그리고 2차 발효물은 59%로 대조구인 100μM donepezil의 활성(65%)과 비교하여도 의미 있는 결과라고 사료된다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성과는 달리 유산균을 단계적으로 적용하여 발효시켰을 때 AChE 저해 활성이 증가되는 것을 확인하였다.
④ 세포 배양
실험에 사용된 신경세포(PC-12)는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 형태를 관찰하며 10회 이하로 계대배양한 세포를 실험에 사용하였다. PC-12 세포주는 10% horse serum(HS, Invitrogen, USA), 5% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen, USA)가 첨가된 RPMI 1640(Invitrogen, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 4~5일마다 1×105~106 cells/mL로 계대배양하며 실험에 사용하였다.
⑤ 세포 생존율
복합버섯 추출물과 발효물이 신경세포의 성장에 미치는 영향을 평가하기 위하여 PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 각각의 시료를 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 24시간 반응 후 PrestoBlueTM(Invitrogen, USA)시약을 10μL 씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였으며 각 시료에 대한 세포의 증식 정도는 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다. 대조구와 비교하여 PC-12 사멸을 일으키지 않는 안전한 농도를 신경세포 보호 활성 평가에 적용하였다.
다양한 자극으로부터 신경세포의 손상을 억제하고 기억능력을 향상시킬 수 있는 소재를 선발하기 위해 복합버섯 추출물과 유산균을 단계적으로 적용하여 발효시킨 1차, 2차 발효물이 신경세포의 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과는 도 5와 같다. 실험에 사용된 신경세포는 PC-12 세포로 계대배양 횟수는 10회를 넘지 않았다. PC-12 세포에 각각의 복합버섯 추출물과 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하여 생존율을 확인한 결과 최고 농도인 1mg/mL의 농도에서까지 대조군의 세포 생존율과 차이를 보이지 않았다. 복합버섯 추출물과 발효물이 신경세포 손상을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 PC-12 세포에 안전하다고 판단된 농도인 1mg/mL를 최고농도로 설정하여 신경세포 보호 활성을 평가하기로 결정하였다.
⑥ 산화적 스트레스 유도
H2O2에 의한 산화적 스트레스를 유도하여 복합버섯 추출물과 발효물에 의한 신경세포 보호 활성을 평가하기 위한 조건 설정을 위하여 PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. H2O2 반응 농도(0~500μM)를 달리하여 세포에 처리하고 24시간 반응 후 PrestoBlueTM(Invitrogen, USA)시약을 10μL 씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였으며 세포의 증식 정도는 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다. H2O2의 농도는 산화적 스트레스로부터 PC-12 세포 사멸율이 50% 이하인 값으로 정하였다.
복합버섯 추출물과 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호할 수 있는지 평가하기 위해 PC-12 세포에 산화적 스트레스 자극원으로 사용된 H2O2의 농도를 결정하기 위한 세포 생존율 실험 결과는 도 6과 같다. H2O2를 농도별(0~500μM)로 처리하여 24시간 반응하고 PC-12 세포의 사멸율이 50% 이하인 값을 H2O2 농도로 결정하였다. H2O2 반응 후 세포 생존율을 확인한 결과, H2O2를 처리하지 않은 대조구와 비교하여 100μM에서 75%, 200μM에서 52%, 300μM에서 45%의 생존율을 보여 버섯 추출물과 발효물의 신경세포 보호 활성을 평가하기에 200μM H2O2를 산화적 스트레스 자극원으로 이용하는 것이 적합하다고 판단하였다.
<
실험예
2>
산화적
스트레스로부터 신경세포 보호 활성
① 세포 생존율
복합버섯 추출물과 발효물의 산화적 스트레스로부터 신경세포의 보호 활성을 측정하기 위해 PrestoBlue 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 복합버섯 추출물과 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 PrestoBlueTM(Invitrogen, USA)시약을 10μL 씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였으며 각 시료에 반응한 세포의 증식 정도는 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.
효과적인 인지기능 개선제의 경우 신경세포의 손상을 억제함으로써 환자뿐 아니라 정상인의 기억력 향상에도 도움이 될 수 있다는 가설을 바탕으로 복합버섯 추출물과 1차, 2차 발효물 처리에 의한 신경세포의 생존율을 확인한 결과는 도 7과 같다. PC-12 세포는 H2O2 자극 1시간 전에 복합버섯 추출물과 발효물에 농도별로 처리하여 반응하도록 하였다. H2O2를 처리하고 24시간 반응 후 세포 생존을 확인한 결과, 모든 시험구에서 농도의존적으로 세포의 손상 및 사멸을 억제하는 것으로 확인되었다. 200μM H2O2를 단독으로 처리한 대조구(53%)와 비교하였을 때, 1mg/mL의 농도에서 복합버섯 추출물(70%) 및 발효물(72%, 75%)이 처리된 시험구의 PC-12 세포의 생존율이 가장 크게 증가되었다. 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로 인한 신경세포 손상을 막을 수 있는 효과적인 소재임을 확인할 수 있었다.
② 세포 독성
복합버섯 추출물과 발효물의 산화적 스트레스로부터 신경세포의 보호 활성을 측정하기 위해 LDH(lactate dehydrogenase) cytotoxicity detection kit(TAKARA, Japan)를 이용하여 세포 독성을 측정하였다. PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 복합버섯 추출물과 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 배양액을 새로운 96 well plate에 50μL 씩 분주하고 배양액에 LDH reagent를 동량으로 첨가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. 반응 종료 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였다. 살아남은 세포의 LDH 값을 측정하기 위해 배양액을 제거한 후 0.5% Triton X-100 용액을 이용하여 세포벽을 깬 후 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 세포독성 저해 정도는 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 H2O2 및 각 시료에 반응한 세포 배양액으로부터 유리된 LDH의 백분율로 나타냈다.
LDH의 활성측정은 세포손상 정도를 확인하는 방법 중 하나로 세포외 LDH는 화학적으로나 생물학적으로 안정적 상태이므로 세포배양에서 방출된 LDH의 활성 정도는 세포손상 정도와 비례관계를 가지게 되므로 복합버섯 추출물과 1차, 2차 발효물의 세포 독성 저해 활성은 LDH 변화를 측정하여 확인하였다(도 8). PC-12 세포는 H2O2 자극 1시간 전에 복합버섯 추출물과 발효물을 농도별로 처리하여 반응하도록 하였다. H2O2를 처리하고 24시간 반응 후 LDH 농도를 측정한 결과, 200μM H2O2를 단독으로 처리한 대조구(52%)와 비교하였을 때, 1mg/mL의 농도에서 복합버섯 추출물(47%) 및 발효물(45%, 38%)이 처리된 시험구에서 LDH 농도가 가장 크게 감소하였다. LDH 농도 변화를 평가함으로써 복합버섯 추출물 및 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포의 세포막의 손상을 감소시킴으로써 세포를 보호한다는 것을 확인하였다.
③ 형태학적 변화(형태학적 관찰)
복합버섯 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는지 확인하기위해 형태학적인 관찰을 하였다. PC-12 세포를 6 well plate에 2×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 버섯 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 phase-contrast microscope(Leica, USA)로 H2O2 및 각 시료에 반응한 세포의 형태변화를 관찰하였다.
모든 세포는 외부 자극을 받으면 형태학적인 변화를 나타내는데 신경세포 또한 자극을 받으면 신경상해를 입음과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화를 보이게 된다. PC-12 세포는 H2O2 자극 1시간 전에 복합버섯 추출물과 발효물에 농도별로 처리하여 반응하도록 하였다. H2O2를 처리하고 24시간 반응 후 현미경 관찰을 통하여 세포의 형태학적인 변화를 확인하였다(도 9). 대조군(A)의 경우 정상적인 성장을 보이는 반면, H2O2 자극을 받은 시험구(B)의 경우 세포 독성으로 인하여 정상적인 성장이 이루어지지 않아 전체적인 세포 수 감소와 더불어 세포막이 손상되거나 세포의 크기가 줄어드는 등의 형태학적인 변화가 확인되었다. 그러나 복합버섯 추출물 및 발효물을 전처리한 시험구(C~E)에서는 H2O2 단독 투여한 시험구(B)와 비교하여 손상된 세포의 수가 현저히 적었으며 전체적인 세포의 성장도 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
이때 도 9에서 A는 대조구, B는 H2O2(200μM), C는 H2O2(200μM) + 복합버섯 추출물(1mg/mL), D는 H2O2(200μM) + 복합버섯 1차 발효물(1mg/mL), E는 H2O2(200μM) + 복합버섯 2차 발효물(1mg/mL)을 나타낸다.
④ Hoechst 염색(Apoptosis 억제)
복합버섯 발효물이 산화적 스트레스로부터 유도되는 apoptosis를 저해하고 신경세포를 보호할 수 있는지 확인하기위해 Hoechst 염색을 실시하였다. PC-12 세포를 6 well plate에 2×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 복합버섯 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 2~3회 세척 후 1μg/mL hoechst 33258(Sigma, UAS)로 10분 동안 염색하였다. 염색된 세포는 2~3회 세척 후 fluorescent microscope(Olympus, Japan)로 H2O2 및 각 시료에 반응한 세포에서 apoptotic body 및 세포의 형태변화를 관찰하였다.
Apoptosis가 일어나면 세포는 면역반응을 일으켜, 핵의 응축 및 DNA가 일정한 크기로 조각나는 형상을 비롯하여 세포질 속 세포소기관 및 세포막 등에서의 변화가 발생하여 세포가 사멸하게 되는 것으로 알려져 있다. 퇴행성 신경질환의 유발인자 중 하나로 알려진 활성산소종이 apoptosis를 유도한다는 가설을 바탕으로 복합버섯 발효물이 산화적 스트레스로부터 신경세포의 apoptosis를 억제할 수 있는지 평가하기위해 핵의 변화를 관찰할 수 있는 hoechst 염색을 실시하였다(도 10). 그 결과 H2O2 자극을 받은 시험구(B)의 경우 세포핵의 수축과 응축으로 인해 일어나는 전형적인 apoptotic body가 나타나 apoptosis 특징을 보이는 반면, 복합버섯 발효물을 전처리한 시험구(C, D)에서는 H2O2 단독 투여한 시험구(B)와 비교하여 자극에 의해 일부 세포는 손상을 받아 형태의 변화를 보이기도 하였으나 apoptotic body의 형성은 크게 감소됨을 확인하였다.
이때 도 10에서 A는 대조구, B는 H2O2(200μM), C는 H2O2(200μM) + 복합버섯 1차 발효물(1mg/mL), D는 H2O2(200μM) + 복합버섯 2차 발효물(1mg/mL)을 나타낸다.
⑤ Caspase-3 활성
복합버섯 발효물이 산화적 스트레스로부터 유도되는 apoptosis를 저해하고 신경세포를 보호하는 활성이 caspase와 관련하는지 확인하기위해 caspase-3 assay kit(abcam, USA)를 이용하여 caspase-3 활성을 측정하였다. PC-12 세포를 6 well plate에 2×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 복합버섯 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 세포를 회수하여 2~3회 세척 후 lysis buffer를 첨가하여 10분간 반응 후 원심분리하였다. 상등액 50μL를 새로운 96 well plate에 옮기고 2×reaction buffer/DTT 용액과 DEVD-pNA (caspase-3 colorimetric substrate)를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 430nm에서 흡광도를 측정하였다. H2O2 및 각 시료에 반응한 세포에서 caspase-3 활성 정도는 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.
⑥ Caspase 활성
복합버섯 발효물이 산화적 스트레스로부터 유도되는 apoptosis를 저해하고 신경세포를 보호하는 활성이 caspase와 관련하는지 확인하기위해 caspase 억제제(z-VAD-fmk, Sigma, USA)처리에 의한 신경세포의 생존율을 확인하였다. PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 10μM z-VAD-fmk와 복합버섯 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 PrestoBlueTM(Invitrogen, USA)시약을 10μL 씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader(Dynex, USA)로 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였으며 H2O2 및 각 시료에 반응한 세포의 증식 정도는 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.
Caspase-3 유전자는 세포사멸(apoptosis) 과정에 있어서 primary effector caspase 중의 하나이며 개체의 발생과 암의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. Apoptosis 유발 시 활성화된 caspase-3은 DNA의 단편화 현상을 유발시킨다는 가설을 바탕으로 H2O2에 의한 apoptosis에 대한 복합버섯 발효물의 활성이 caspase와 관련하는지 평가하였다. PC-12 세포는 H2O2 자극 1시간 전에 복합버섯 추출물 및 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하여 반응하도록 하였다. H2O2를 처리하고 24시간 반응 후 caspase-3의 활성을 평가한 결과는 도 11과 같다. 추출물과 발효물을 처리한 시험구 모두에서 농도의존적으로 caspase-3를 억제하였다. 특히 1mg/mL의 농도에서 복합버섯 2차 발효물은 24%의 caspase-3 저해 활성을 보였다. 또한 caspase 저해제인 z-VAD-fmk의 처리에 의한 세포 생존율을 확인함으로써 caspase와의 연관성을 재확인하였다(도 12). 10μM z-VAD-fmk와 복합버섯 2차 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 세포 생존율을 확인한 결과 z-VAD-fmk를 처리한 시험구에서 신경세포의 생존율이 증가되었다. 1mg/mL의 농도에서 복합버섯 2차 발효물의 경우 54%에서 68%로 세포 생존율이 증가되었다. 이는 복합버섯 추출물 및 발효물이 H2O2 자극으로 인한 apoptosis에 대하여 caspase 활성을 억제함으로써 신경세포의 손상 및 사멸을 억제하는 것으로 판단되었다.
⑦ HO-1 활성
복합버섯 발효물에 의한 heme oxygenase-1(HO-1)의 발현 여부를 확인하기 위해 PC-12 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 복합버섯 발효물을 0~1mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 1시간 후 1μg/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA) 자극을 주었다. 24시간 반응시킨 후 mouse heme oxygenase 1(HO-1) ELISA Kit(MyBioSource, USA)를 이용하여 HO-1의 발현량을 측정하였다. HO-1의 농도는 32ng/mL까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. 또한 HO-1과의 관계를 확인하기 위해 HO-1의 저해제인 10μM ZnPP(Zinc Protoporphyrin, Sigma, USA)을 처리하여 처리 전후의 세포 생존율을 비교하였다.
HO-1은 NADPH와 산소를 이용하여 heme을 산화적으로 파괴하여 heme에 내포되었던 철분을 유리하고 일산화탄소(CO)와 biliverdin을 생성하는 heme의 산화를 촉매하는 과정의 초기 속도 조절 효소이다. 생성된 biliverdin은 세포 내에서 항산화 역할을 하는 bilirubin으로 변하고 bilirubin은 유리기들을 무독화 시켜 자극받은 세포를 보호하는 작용을 한다는 가설을 바탕으로 H2O2에 의한 세포 손상 및 사멸에 대한 버섯 발효물의 세포 보호 활성이 HO-1과 관련하는지 평가하였다. PC-12 세포는 H2O2 자극 1시간 전에 복합버섯 추출물 및 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하여 반응하도록 하였다. H2O2를 처리하고 24시간 반응 후 HO-1의 활성을 평가한 결과는 도 13과 같다. 추출물과 발효물을 처리한 시험구 모두에서 농도의존적으로 HO-1의 활성이 증가되었다. 특히 1mg/mL의 농도에서 복합버섯 2차 발효물은 2배 이상의 HO-1의 활성을 증가시켰다. 또한 HO-1 저해제인 ZnPP의 처리에 의한 세포 생존율을 확인함으로써 HO-1과의 연관성을 재확인하였다(도 14). 10μM ZnPP와 복합버섯 2차 발효물을 농도별(0~1mg/mL)로 처리하고 1시간 후 200μM H2O2로 산화적 스트레스를 유도하였다. 24시간 반응 후 세포 생존율을 확인한 결과 ZnPP를 처리한 시험구에서 신경세포의 생존율을 감소시켰다. 1mg/mL의 농도에 복합버섯 2차 발효물의 경우 74%에서 65%로 세포 생존율이 감소되었다. 이는 복합버섯 추출물 및 발효물이 H2O2 자극에 대하여 HO-1의 활성을 유도하여 신경세포를 보호하는 것으로 판단되었다.
Claims (5)
- 상황버섯 자실체, 영지버섯 자실체, 표고버섯 자실체 각각에 20배의 물을 가하여 75~85℃에서 2~4시간 동안 추출한 뒤, 수득된 각각의 상황버섯 자실체추출물, 영지버섯 자실체 추출물, 표고버섯 자실체 추출물을 1:1:1의 비율로 혼합하여 복합버섯 추출물을 제조하는 단계(S10);
상기 복합버섯 추출물을 최종 5 브릭스가 되도록 보당 및 희석하는 단계(S20);
상기 보당 및 희석된 복합버섯 추출물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는단계(S30);
상기 멸균된 복합버섯 추출물에 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacteriumbifidum)을 2%(v/v)로 접종하는 단계(S40);
상기 비피도박테리움 비피덤이 접종된 복합버섯 추출물을 35~40℃에서 70~74시간 동안 혐기적으로 1차 발효하는 단계(S50);
상기 1차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 1차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계(S60);
상기 원심분리된 복합버섯 1차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계(S70);
상기 멸균된 복합버섯 1차 발효물에 락토바실러스 사케이 LI033(Lactobacillus sakei subsp. LI033)을 2%(v/v)로 접종하는 단계(S80);
상기 락토바실러스 사케이 LI033이 접종된 복합버섯 1차 발효물을 35~40℃에서 22~26시간 동안 미호기적으로 2차 발효하는 단계(S90);
상기 2차 발효하는 단계를 통해 수득된 복합버섯 2차 발효물을 3~5℃에서 9,000~11,000rpm으로 4~6분간 원심분리하는 단계(S100); 및
상기 원심분리된 복합버섯 2차 발효물을 120~125℃에서 13~17분간 멸균하는 단계(S110); 를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 비피도박테리움 비피덤은,
MRS 액체배지를 사용하여 35~40℃인 CO2 배양기에서 혐기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관하면서 사용하며,
상기 락토바실러스 사케이 LI033은,
MRS 액체배지를 사용하여 35~40℃인 배양기에서 미호기적으로 배양되되, 보존을 위해 MRS 액체배지에 3회 계대배양 한 후 2%의 락토오스가 함유된 배지를 제조하여 혼합하고, 1.5mL씩 분주하여 동결건조하고 냉동보관하면서 사용하는 것을 특징으로 하며,
상기 2차 발효하는 단계는,
미호기적으로 발효하는 것으로, 산소농도가 2~10%인 것을 특징으로 하는 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물의 제조방법.
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- 제1항의 방법에 따라 제조되는 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물.
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| KR1020150074961A KR101746208B1 (ko) | 2015-05-28 | 2015-05-28 | 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법 |
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| KR1020150074961A KR101746208B1 (ko) | 2015-05-28 | 2015-05-28 | 신경세포 보호활성을 갖는 복합버섯 유산균 발효물 및 이의 제조방법 |
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