KR20180006551A

KR20180006551A - 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물

Info

Publication number: KR20180006551A
Application number: KR1020160086538A
Authority: KR
Inventors: 정현우; 전병관; 최찬헌; 김경윤; 김혜영
Original assignee: 김혜영; 동신대학교산학협력단
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-01-18

Abstract

본 발명의 60% 내지 90% 에탄올을 추출용매로 사용하여 열수추출하고, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa , 및 Propionibacterium acnes 로 구성된 군에서 선택되는 균주에 항균작용이 가능한 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균조성물과 피부 치료제를 제공함으로써, 상기 기재된 균주에 대해서 내성과 부작용을 거의 포함하지 않으면서 우수한 항균효과가 있을 뿐만 아니라, 상온과 고온보관에도 추출물의 물성 변화가 거의 없어 장기간 보관할 수 있는 피부개선 제품 생산이 가능하다.

Description

비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물 {Antimircrobial Composition Including a Extract Derived from Torreya nucifera}

본 발명은 피부의 상재하는 균에 대해 항균활성 작용을 하는 조성물로서, 보다 구체적으로는 국내에 자생하는 천연원료를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 항균 조성물에 관한 것이다.

현대인들의 높은 생활수준과는 대조적으로, 과다한 스트레스와 불규칙한 식습관 및 환경오염의 심화 등과 같은 복합적인 원인들에 의해 아토피 질환 및 여드름과 같은 피부 트러블은 발병률이 증가하고 있을 뿐만 아니라, 발병이 되는 나이대도 청소년부터 청장년층까지 연령과는 상관없이 증가하고 있다.

아토피 피부염은 전체 인구의 약 10%이상이 앓고 있는 발병률이 매우 높은 질병으로 재발성이 높을 뿐만 아니라, 현대 의학에서도 명확한 발병원인을 알 수 없어 치료가 매우 어려운 피부질환이다. 아토피 환자의 약 90%는 상재균인 staphylococcus aureus의 감염과 매우 관계가 깊으며, 발병기전은 균이 생산하는 초 항원 독소에 의해서 피부염이 유발 또는 악화됨으로써 이루어진다.

여드름은 피지선에서 피지 분비가 증가하거나 피지선의 모공이 좁아져 피지가 배출되지 못함에 따라, 세균이 증식하면서 염증이 생기는 피부질환을 말한다. 여드름 균인 Propionibacterium acnes는 피부내에 존재하는 염기성 상재균으로, 지방분해효소를 분비하여 피지를 유리 지방산으로 지질분해하고, 모낭벽을 자극하여 모낭 및 그 주위에 여드름을 형성하고, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus 과 같은 다른 피부 상재균이 모낭 주위에서 여드름과 여드름 합병증을 일으키기 좋은 환경을 조성하여 염증을 심화시킨다.

아토피 피부질환의 치료제는 국소 스테로이드 제제(부신피질 스테로이드제)가 함유되어 있고, 피부용 치료제는 테트라사이클린계 또는 클린다마이신 계열 및 테트라 사이클린계열의 항생제를 사용한다. 이와 같은 치료제는 가벼운 증상의 경우 국소부위에 도포하여 염증에 항균제로 작용함으로써 증상을 완화시키고, 증상이 심해질수록 경구제로 생산하여 도포와 함께 치료하는 방법을 병행하게 된다.

이와 같은 치료방법들은 높은 치료효과는 있는 반면, 장기간 사용할 경우에는 호르몬이 교란되고 항생제에 대한 내성이 발생하여 지속적으로는 사용될 수 없다. 이외에도 높은 독성을 내포하고 있을 수 있고 과민증을 유발하는 등의 다양한 부작용이 발생할 수 있는데 테트라사이클린의 경우에는 광산화하여 피부에 노란 반점을 만드는 부작용이 있다.

따라서, 항생제의 부작용을 줄이기 위한 노력으로 천연물은 주요한 대체 제재로 주목받고 있다. 천연물 유래의 항균물질은 약리효과가 높고 부작용이 낮은 장점이 있기 때문에, 최근에는 다양한 천연물에서 각종 질병의 예방과 치료에 효과적인 유용 물질을 동정, 분리함으로써 기능성 제품 등을 개발하고 있고, 이미 일부 천연물 성분들은 제품화 되어 있다.

특히, 동양 의학에서 주로 이용되던 약용식물을 중심으로 관심이 집중되고 있다. 우리나라의 남부지방과 일본에 자생하는 비자나무(T. nucifera)는 주목과(Taxaceae)의 상록교목으로 비자나무의 성숙된 종자에서 종피(種皮)를 제거한 것을 비자(榧子)라 한다.

비자나무와 비자나무 열매는 민간적으로 식욕증진, 소화촉진, 변비 및 치질 치료 등의 약리작용을 인정받아 왔으며 십이지장충 및 구충제로 이용해 왔다. 또한 선행연구 등에 의해 비자의 살충효과 및 항균성에 관한 가능성 등이 보고되어 있어, 효과적으로 비자나무로부터 추출물을 추출할 수 있는 기술개발이 필요하다.

국내 등록특허번호 제10-0728706호에는 비자나무 추출물 또는 그로부터 분리된 아비에탄 디터페노이드계 화합물은 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라 ACAT에 대한 활성을 효과적으로 억제하고 혈청 LDL을 감소시킴과 동시에 혈중 콜레스테롤을 낮춰 주는 비자나무 추출물 또는 그로부터 분리된 아비에탄 디터페노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 심장 순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 게시되어 있다. 국내 공개특허공보 제10-2015-0149276호에는 비자나무 에센셜, 한라봉 에센셜 및 녹차 에센셜을 유효성분으로 함유하는 탁월한 항균 및 탈취 효과를 가지는 비자나무, 한라봉 및 녹차 에센셜을 유효성분으로 함유하는 항균 및 탈취 효과를 가지는 천연 조성물에 관하여 게시되어 있다. 국내 등록특허번호 제10-1002012호에는 산딸나무, 찔레나무, 비자나무, 파초 및 죽절초를 혼합한 혼합물에 추출용매를 첨가하여 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 산딸나무, 찔레나무, 비자나무, 파초, 죽절초의 일정한 혼합비로 혼합한 후, 추출용매에 침적시켜 추출한 식물 혼합추출물을 유효성분으로 함유 함으로써 엘라스타제 억제 작용, 탄력 효과 및 항염증 작용 효과가 증진된 산딸나무, 찔레나무, 비자나무, 파초 및 죽절초 혼합물의 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관하여 개시되어 있다. 국내 등록특허번호 제10-1089751호에는 항미생물제 조성물 및 방부제 조성물로서 비자나무 유래 추출물을 유효성분으로 포함하는 항미생물제 및 방부제 조성물에 관하여 개시되어 있다. 그러나 상기선행문헌은 본 발명의 60% 내지 90% 에탄올을 추출용매로 사용하여 열수추출하고, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, 및 Propionibacterium acnes 로 구성된 군에서 선택되는 균주에 항균작용이 가능한 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균조성물에 관한 구성은 개시되지 않아 차이를 보인다.

본 발명은 기존의 화학성분이 포함되어 여러 가지 부작용을 수반하는 피부 치료제를 대체할 수 있도록 천연물인 비자나무와 비자열매에서 유용 물질을 유기용매로 열수추출하고, 추출된 천연물 유래의 항균물질로 피부를 개선시킬 수 있는 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위해서 본 발명은 60% 내지 90% 에탄올을 추출용매로 사용하여 열수추출하고, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa , 및 Propionibacterium acnes 로 구성된 군에서 선택되는 균주에 항균작용이 가능한 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균조성물과 피부 치료제를 제공한다.

본 발명의 방법으로 열수 추출된 추출물은 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa , 및 Propionibacterium acnes 로 구성된 균주에 대해서 내성과 부작용을 거의 포함하지 않으면서 우수한 항균효과가 있을 뿐만 아니라, 상온과 고온보관에도 추출물의 물성 변화가 거의 없어 장기간 보관이 가능한 효과가 있다..

도 1은 비자나무 열수추출물의 보관 온도별 색상의 변화를 나타낸다.
도 2는 비자열매 열수추출물의 보관 온도별 색상의 변화를 나타낸다.
도 3은 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 폴리페놀 함량 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 플라보노이드 함량 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비자나무 열수추출물의 피부세포 증식률 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 비자열매 열수추출물의 피부세포 증식률 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 비자나무 추출물의 SOD 유사활성 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 비자열매 열수추출물의 SOD 유사활성 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Staphylococcus aureus균주의 disc중심에 생성된 저해환을 나타낸다.
도 10은 Staphylococcus epidermidis 균주의 disc중심에 생성된 저해환을 나타낸다.
도 11은 Pseudomonas aeruginosa 균주의 disc중심에 생성된 저해환을 나타낸다.
도 12는 Propionibacterium acnes MIC를 나타낸다.
도 13은 Staphylococcus aureus MIC를 나타낸다.

본 발명에서는 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 민감피부 개선용 조성물이 제공된다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.

1. 비자나무 및 비자열매 열수추출물 및 분획물 제조

비자나무 10g과 비자열매(종자) 25g을 증류수로 수세한 다음, 플라스크에 넣고 증류수 500mL를 가한 후, 히팅맨틀(Heating mantle)을 이용하여 환류 물 추출방법을 실시하여 105℃ 온도에서 4시간 동안 가열, 추출하였다.

추출된 용액은 400메쉬 여과포로 여과한 다음, 감압회전 농축기로 농축하였다. 여과 후 남은 잔사에 다시 동량의 증류수를 사용하여 동일과정으로 2번 더 추출, 여과 및 감압농축을 실시하였다. 농축된 열수추출물은 동결건조기(Freeze dryer)에서 동결건조 하였다.

비자나무 및 비자열매의 극성용매, 비극성용매 가용 분획물의 제조는 상기 비자나무 및 비자열매의 열수 추출물을 증류수 1L에 완전히 용해시킨 후, 분획 여두 깔대기에 넣고 추출용매인 에탄올을 500 mL를 가하여 히팅맨틀을 이용하여, 80℃에서 4시간 동안 추출하여 분획물을 얻었다.

에탄올 농도는 30%, 60%, 90% 로 농도 조건을 달리하여 추출을 진행하였다. 추출하여 얻어진 각각의 분획물을 감압여과 장치로 여과하여 농축한 후, 동결 건조하여 용매를 완전히 제거한 뒤 본 실험에 사용하였다.

2. 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 최적 추출조건 및 안정성 확인

상기의 방법으로 추출된 비자나무 및 비자열매의 열수추출물은 최적의 추출조건과 피부세포의 안정성을 확인하기 위한 테스트를 실시하였다.

2.1 비자나무 및 비자열매 열수추출물 및 분획물의 보관온도별 변화확인

추출이 완료된 시료들은 냉장보관(4℃), 상온보관, 30℃보관 등의 온도를 달리하여 4주동안 보관하였고, 보관기간 동안 pH, 색상, 향 등의 경시적 변화를 관찰하였다. 도 1은 비자나무 열수추출물의, 도2는 비자열매 열수추출물의 보관 온도별 색상의 변화를 나타낸다.

비자나무 추출물은 냉장(4℃)보관의 경우에는 pH와 냄새, 색깔이 실험기간동안 큰 변화는 없었다. 상온 보관은 2주째까지 색 변화는 없었으나, 4주째에 DW와 30% EtOH 추출물의 색이 진해지는 것을 볼 수 있었으며, DW추출의 경우에는 3주째부터 덩어리가 생기면서 pH가 급격히 높아졌고, 다른 추출물의 경우에는 큰 변화를 보이지 않았다. 30℃보관의 경우는 2주에서 DW와 30% EtOH 추출물의 색이 약간 진해졌으며, 4주째에는 DW 추출물의 색이 0주째에 비해 많이 진해지는 것을 확인하였다.

pH는 DW 추출물이 상온 보관과 유사한 패턴으로 3주째부터 급격히 증가하였으며, 다른 추출물들은 큰 영향을 미치지 않았고, 온도에 의해 색과 pH가 영향을 받았으며, 30% EtOH 추출물은 색에만 영향을 받았고, 60%와 90% EtOH 추출물은 색과 pH 모두 영향을 받지 않는 것으로 확인되어 60%이상의 에탄올 농도로 추출되는 것이 적절한 것으로 확인되었다.

비자열매 추출물은 냉장보관(4℃)한 경우 색 변화는 없었으며, pH는 4주째에 DW 추출물에서만 약간 낮아지는 경향을 보였다. 상온의 경우 4주째에 DW와 30% EtOH 추출물의 색이 살짝 진해지는 것을 확인할 수 있었으며, pH는 DW 추출물에서 낮아졌다가 높아지는 현상을 보였지만 다른 추출물의 경우에는 큰 변화를 보이지 않았다. 30℃ 보관 시 상온 보관과 유사하게 4주째에 추출물의 색이 진해지는 것을 관찰하였고, pH 또한 역시 상온과 유사한 패턴으로 DW 추출물에서 낮아졌다가 높아지는 것을 확인할 수 있었다,

전체적으로 30% EtOH 추출물의 pH는 낮아지는 경향을 보였으며, 60%와 90% EtOH 추출물은 큰 변화를 보이지 않아 비자나무 열매 역시 60% 이상의 에탄올 농도로 추출되는 것이 적절함을 확인할 수 있었다.

2.2 비자나무 및 비자열매 추출물 및 분획물의 항산화 물질 함량 확인

추출물의 성분은 검증하기 위해 비자나무 열매의 대표적 항산화물질인 포리페놀과 플라노보이드 함량을 측정함으로써 최적의 추출조건을 확인하였다. 도 3은 비자나무 및 비자열매 추출물의 폴리페놀 함량 분석결과를 나타낸 그래프이다. 비자나무 추출물과 열매 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 폴리페놀을 분석한 결과, 비자나무 추출물의 폴리페놀 함량은 DW<90%<30%<60% EtoH 용매순서로 나타났으며, 60% EtOH에서 가장 높은 함량을 보였으나 시료간 차이는 크지 않았다. 비자열매(종자) 추출물의 폴리페놀 함량은 DW<60%<90%<30% EtoH 용매순서로 나타났으며, 30% EtoH에서 가장 높았다.

도 4는 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 플라보노이드 함량 분석결과를 나타낸 그래프이다. 비자나무 추출물과 열매 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 비자나무 추출물의 플라보노이드 함량은 DW<90%<30%<60% EtoH 용매순서로 나타났으며, 60% EtoH 추출물의 함량이 가장 높았으나 시료간 차이는 크지 않았다. 비자열매 추출물의 플라보노이드 함량은 폴리페놀 결과와 같은 양상으로 DW<60%<90%<30% EtoH 용매순서로 나타났으며, 30% EtoH 추출물이 가장 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

2.3 비자나무 및 비자열매 추출물 및 분획물의 독성시험(by MTT assay)

피부세포 안전성 실험은 효능시험에 적합한 원료농도의 선정을 위해 MTT assy 방법을 실시하였다. CCD-986sk (Human / Fibroblast)세포를 배양하고, 추출물의 세포에 대한 독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay 방법으로 측정하였다.

MTT는 담황색의 기질로서, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내 효소와 반응하여 포르마잔(Formazan)을 형성하는데, 이 포르마잔을 다이메틸설폭사이드(DMSO; Dimethyl sulfoxide)에 녹여 570nm의 흡광도를 측정함으로써 세포의 생존율을 측정하였다.

96well plate에 세포를 seeding 한 후 24시간 충분히 배양한 후 0.5% FBS가 함유된 배지로 교체한 후, 충분히 배양한 후 샘플을 처리하고 24시간동안 배양기에서 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

도 5는 비자나무 열수추출물의 피부세포 증식률 변화를 나타낸 그래프이다. 비자나무 추출물은 일반적으로 저농도에서는 세포가 증식되다가 고농도로 갈수록 조금씩 감소하는 경향을 보였으나 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다. 60% EtOH로 추출한 추출물의 200 ㎍/㎖ 농도에서 세포생존율이 크게 감소하는 것으로 나타났다.

도 6은 열수비자열매 추출물의 피부세포 증식률 변화를 나타낸 그래프이다. 농도 의존적으로 세포가 증식하였고, 30%와 60% EtOH의 경우에 세포 증식이 증가하다가 200 ㎍/㎖ 농도에서는 생존율이 감소하였으며, 특히 60% EtOH 추출의 경우 비자나무와 유사한 패턴을 나타내었다.

2.4 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 SOD활성 확인

SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund의 방법에 따라 활성 산소종을 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하였고, ELIZA reader를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

도 7은 비자나무 추출물을, 도 8은 비자열매 추출물의 SOD 유사활성 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. SOD 유사활성을 측정한 결과, 양성대조군인 Ascorbic acid (Vit C)는 농도 의존적으로 활성율이 증가하는 패턴을 보였고, 비자나무 추출물은 15.6∼17.7% 정도의 활성율을 보였으며, 비자열매(종자) 추출물은 16.8~20.6%로 비자나무보다 좋은 활성율을 보였으며, 특히 30% EtoH 추출물에서는 20.6%로 가장 높은 활성을 확인하였다.

3. 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 향균효능 평가

3.1 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 항균효능 평가

비자나무 및 비자열매 추출물의 항균활성을 비교하기 위하여, 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주로는 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa를 대상으로 하여 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받아 사용하였다.

항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주 배양액을 100 ㎕씩 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.5, 1.0, 2.0 ㎎이 되도록 직경 6 ㎜의 paper disc에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한 후 disc를 중심으로 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.

하기의 표 1 내지 표 3은 Staphylococcus aureus균주 , Staphylococcus epidermidis 균주, Pseudomonas aeruginosa 균주의 disc중심에 생성된 저해환의 측정값과 측정데이터의 평균과 표준편차를 나타낸다. 도 9 내지 도 11은 Staphylococcus aureus균주의 Staphylococcus epidermidis 균주, Pseudomonas aeruginosa 균주의 disc중심에 생성된 저해환을 나타낸다.

Staphylococcus aureus그룹의 disc중심에 생성된 저해환의 측정값

	2mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	7.70	7.50	7.60	0.14
나무 30E	9.20	8.50	8.85	0.49
나무 60E	8.80	8.50	8.65	0.21
나무 90E	8.00	7.40	7.70	0.42
열매 DW	9.50	9.20	9.35	0.21
열매 30E	8.70	8.60	8.65	0.07
열매 60E	8.30	8.00	8.15	0.21
열매 90E	8.30	8.00	8.15	0.21
	1mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	7.40	6.90	7.15	0.35
나무 30E	8.00	7.90	7.95	0.07
나무 60E	7.70	7.60	7.65	0.07
나무 90E	7.10	7.10	7.10	0.00
열매 DW	7.30	7.50	7.40	0.14
열매 30E	-	-	-	-
열매 60E	-	-	-	-
열매 90E	-	-	-	-
	0.5mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	-	-	-	-
나무 30E	8.40	8.00	8.20	0.28
나무 60E	8.20	7.90	8.05	0.21
나무 90E	7.40	7.20	7.30	0.14
열매 DW	-	-	-	-
열매 30E	-	-	-	-
열매 60E	-	-	-	-
열매 90E	-	-	-	-

Staphylococcus epidermidis그룹의 disc중심에 생성된 저해환의 측정값

	2mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	7.50	8.00	7.75	0.35
나무 30E	8.70	8.70	8.70	0.00
나무 60E	9.30	9.30	9.30	0.00
나무 90E	7.40	7.90	7.65	0.35
열매 DW	10.70	9.90	10.30	0.57
열매 30E	10.20	9.70	9.95	0.35
열매 60E	9.10	9.20	9.15	0.07
열매 90E	8.3	8.4	8.35	0.00
	1mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	7.00	7.10	7.05	0.07
나무 30E	7.90	7.90	7.90	0.00
나무 60E	8.10	8.00	8.05	0.07
나무 90E	7.20	7.10	7.15	0.07
열매 DW	9.00	8.60	8.80	0.28
열매 30E	8.70	8.70	8.70	0.00
열매 60E	8.20	7.60	7.90	0.42
열매 90E	8.00	7.50	7.75	0.00
	0.5mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	-	-	-	-
나무 30E	7.60	7.40	7.50	0.14
나무 60E	7.80	7.80	7.80	0.00
나무 90E	-	-	-	-
열매 DW	8.40	7.70	8.05	0.49
열매 30E	8.40	7.30	7.85	0.78
열매 60E	7.40	7.10	7.25	0.21
열매 90E	6.90	6.60	6.75	0.00

Pseudomonas aeruginosa그룹의 disc중심에 생성된 저해환의 측정값

	2mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	-	-	-	-
나무 30E	-	-	-	-
나무 60E	-	-	-	-
나무 90E	-	-	-	-
열매 DW	10.40	10.00	10.20	0.28
열매 30E	8.40	8.70	8.55	0.21
열매 60E	8.00	8.40	8.20	0.28
열매 90E	7.50	7.90	7.70	0.00
	1mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	-	-	-	-
나무 30E	-	-	-	-
나무 60E	-	-	-	-
나무 90E	-	-	-	-
열매 DW	7.90	7.50	7.70	0.28
열매 30E	-	-	-	-
열매 60E	-	-	-	-
열매 90E	-	-	-	-
	0.5mg/disc		평균	표준편차
나무 DW	-	-	-	-
나무 30E	-	-	-	-
나무 60E	-	-	-	-
나무 90E	-	-	-	-
열매 DW	-	-	-	-
열매 30E	-	-	-	-
열매 60E	-	-	-	-
열매 90E	-	-	-	-

S. aureus에 대한 항균활성은 나무 추출물이 전반적으로 더 강한 것으로 나타났으며, 특히 나무 30% 에탄올 추출물의 활성이 낮은 농도에서도 높게 확인되었다. 높은 시료 농도(2 mg/disc)에서는 열매 열수 추출물이 가장 높은 활성을 보인 것은 추가적인 확인이 필요할 것으로 판단된다. S. peidermidis와 P. aerusinosa에 대한 항균활성에서는 나무 추출물보다 열매 추출물에서 상대적으로 강한 항균활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 특히 열매의 열수 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈다.

3.2 in-vitro 상에서 비자나무 및 비자열매 열수추출물의 항균효능 평가

비자열매 열수추출물, 30% 에탄올 추출물, 60% 에탄올 추출물, 90% 에탄올 추출물의 피부 관련 균주인 Propionibacterium acnes, S aureus , S epidemidis에 대한 항균력에 대한 최소생장농도를 결정하기 위하여 MIC(Minimal Inhibitroy concentration) 시험법으로 확인하였다. 시료는 모두 순수한 물에 녹여 사용하였으며, Propionibacterium acnes KCTC 3314, Staphylococcus aureus KCTC6538, KCTC1917 균주를 사용하여 항균테스트를 시험하였다.

상기 균주는 Propionibacterium acnes KCTC 3314, Staphylococcus aureus KCTC6538, Staphylococcus epidemidis KCTC1917 균주를 GAM(Gifu Anaerobic Medium) 배지로 혐기성 상태에서 배양하여 O.D가 0.8정도 까지 배양하였다. 그 후 10ml의 GAM 배지에 Propionibacterium acnes KCTC 3314, Staphylococcus aureus KCTC6538, Staphylococcus epidemidis KCTC1917 균주를 7⁷ CFU/ml로 접종하고, 농도별로 희석된 각 시료를 넣고 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다.

P. acnes , S aureus , S epidemidis 균의 경우는 혐기성 세균으로써 배양 시 혐기성 상태를 유지하기 위하여, jar에 활성탄소 가스팩을 넣어 혐기성 상태를 유지시켜 배양하였다. 시험은 duplicate로 하였으며, 시료의 항균활성의 정도는 18시간 후의 O.D값을 측정함으로써 최소 저해농도를 확인하였다. 대조군으로는 시료를 녹인 순수한 물을 사용하였다.

도 12는 Propionibacterium acnes MIC를 나타낸다. 4가지 시료에 대한 최소생육저지농도를 결정하기 위하여 각 시료를 2mg/ml, 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml로 serial dilution 하여 시험하였다. P. acnes 균에서의 MIC는 비자 열매추출물 DW, 30E, 60E, 90E의 2 mg/ml의 농도에서 고르게 약 32~39% 정도 고르게 생육 저지를 하였으며, 농도 의존적으로 향균 효과를 나타남을 확인할 수 있었다.

도 13은 Staphylococcus aureus MIC를 나타낸다. 4가지 시료에 대한 최소생육저지농도를 결정하기 위하여 각 시료를 2mg/ml, 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml로 serial dilution 하여 시험하였다. S. aureus 균에서의 MIC는 비자 열매추출물 DW, 30E 에서만 2 mg/ml 약 47%, 1 mg/ml 약 40% 정도 생육 저지를 하였으며, 농도 의존적으로 향균 효과를 나타남을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 토대로 살펴보면, Paper disc법을 활용한 항균활성 결과에서 S. aureus에 대해서는 나무 30E → 나무 60E → 열매 DW 시료 순으로 항균력이 높게 나타났고, S. epidermidis에 대해서는 열매 DW → 열매 30E → 나무 60E 시료 순으로 항균력이 높은 것으로 사료된다.

또한, 두 균 S. epidermidis , S. aureus에 공통적으로 높은 항균력을 보인 열매 추출물들을 대상으로 Broth dilution assay를 변형한 MIC test를 진행한 결과, S. epidermidis에서만 열매 DW 추출물 → 30E 추출물이 비교적 농도 의존적인 것으로 사료된다.

여드름의 주요 원인균으로 알려진 P. acnes 균주에 대한 MIC test에서는 다른 피부질환 원인균과 다르게 열매 DW, 열매 30E, 열매 60E, 열매 90E에서 상대적으로 강하고 농도의존적인 항균력을 나타내는 것으로 사료된다. 종합적으로 Paper disc 법과 MIC test 항균 테스트 결과로 열매 DW, 열매 30E의 시료가 모든 종류의 피부질환 원인균에 대해 일정 수준 이상의 항균력을 가지는 것으로 확인되었으며, 특히 열매 DW 추출물 유효한 활성을 가질 것으로 사료된다.

본 발명의 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물은 천연물 유래로 원료를 자연에서 수득하기 때문에 친환경적이고, 통상의 피부치료제보다 내성과 부작용이 거의 없어 제품 안정성에 관심이 많은 현대인에게 높은 수요를 보일 것으로 예상되어 제품생산에 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물
제 1항에 있어서, 상기 열수추출물은 60% 내지 90% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물
제 1항에 있어서, 상기 항균작용이 이루어지는 균주는 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, 및 Propionibacterium acnes 로구성된 군에서 선택되는 균주인 것을 특징으로 하는 비자나무 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 항균 조성물
비자나무 추출물 및 비자열매 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 치료제