KR100844185B1

KR100844185B1 - 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법

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Publication number: KR100844185B1
Application number: KR1020070008820A
Authority: KR
Inventors: 정경식; 송효남
Original assignee: 정경식
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2008-07-04

Abstract

본 발명은 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법에 관한 것으로서, 특히 유산균을 액체 배양액에 접종하여 발효조에서 28~32℃의 온도로 6~8일간 원모 배양액을 배양하는 유산균 배양 단계와; 쑥의 뿌리를 제거하고 잎과 가지를 위주로 선별한 후 세척하여 이물질과 흙을 제거한 다음, 음지에서 20~28시간 동안 자연 건조하는 쑥 건조 단계와; 상기 원모 배양액을 상기 건조된 쑥에 접종하여 발효조에서 25~35일간 1차 발효시키는 1차 발효 단계와; 상기 원모 배양액을 1차 발효된 발효쑥차에 2차 접종하여 발효조에서 25~35일간 2차 발효시키는 2차 발효 단계와; 2차 발효가 완료되면 40~60시간 동안 실온에서 자연 건조시키는 자연 건조 단계와; 자연 건조된 발효쑥차를 1~2개월간 자연 숙성시키는 자연 숙성 단계; 및 자연 숙성된 발효쑥차를 70~80℃의 건열에서 5~15분간 멸균시키는 멸균 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면 유산균 발효공법으로 발효기간은 대폭 단축하면서도 품질과 생리기능성은 더욱 향상된 새로운 발효쑥차를 개발하여 고가의 수입차에 대한 대체경쟁력을 갖도록 할 수 있다.

유산균, 배양, 접종, 발효, 쑥차

Description

유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법{THE MANFACTURING METHOD OF FERMENTATION ARTEMISIA TEA WITH LACTIC ACID}

도 1은 본 발명에 따른 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법을 설명하기 위한 공정도,

도 2는 가스 크로마토그라프를 이용한 발효전후 약쑥과 인진쑥의 지방산 크로마토그램,

도 3은 주사전자현미경으로 관찰한 발효약쑥과 인진쑥의 표면구조를 나타낸 사진,

도 4는 발효전후 쑥의 향기분석 크로마토그램,

도 5는 취문을 이용한 발효전후 쑥의 향기패턴 비교를 나타낸 그래프,

도 6은 발효 전후 쑥의 전자공여능을 나타낸 그래프,

도 7은 발효 전후 쑥의 향균효과를 나타낸 사진,

도 8은 고지혈증 흰쥐의 중성지방 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프,

도 9는 고지혈증 흰쥐의 총콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프,

도 10은 고지혈증 흰쥐의 저밀도콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프,

도 11은 고지혈증 흰쥐의 고밀도콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프

본 발명은 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 유산균 발효공법으로 발효기간은 대폭 단축하면서도 품질과 생리기능성은 더욱 향상된 새로운 발효쑥차를 제공하도록 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법에 관한 것이다.

쑥(artemisia)은 국화과(compositae)에 속하는 다년생 식물로 한방에서는 사철쑥(artemisia capillaris thunberg)을 인진호(茵蔯蒿 : artemisiae capillaris herba)라 하여 이뇨, 정혈, 해독, 소염, 진정 및 강정효과가 있는 것으로 알려져 있다.

쑥은 전통적으로 한국인에게 매우 친숙한 식품이기 때문에 국내에서의 쑥에 대한 연구는 상당히 많이 축적되어 있으며, 식품뿐만 아니라 화장품이나 의약품과 관련한 응용기술도 많이 발전되어 있다.

국외에서는 쑥의 정유성분에 주목하는 연구가 많아 정유성분의 추출방법과 이들로부터 분리한 성분들의 분석에 관한 연구가 많이 이루어져 있다.

또한, 독특한 쑥의 향기성분에 관한 분석도 많이 있으며, 기능성 연구에 대해서는 쑥의 항산화 활성과 세포독성에 관한 연구가 되어 있는 등 대체로 화학적 분석에 관한 연구가 주를 이루고 있다.

기초적으로 쑥의 품종별 영양성분의 분석 자료가 구축되어 있어 비타민 A와 C가 풍부하고 플라보노이드 성분이 다량 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다.

생리기능성 측면에서는 쑥의 항산화 활성, 항균활성 및 항암활성 등에 대한 연구가 대부분이며, 약리학적 성분의 분리정제 및 구조분석 등에 대한 연구가 있다.

조리 과학적 측면에서의 연구는 대개 쑥떡, 설기떡 등 전통 떡에의 응용과 제조방법 및 관능평가 등에 대한 보고가 주류를 이루고 있다. 국내 특허 또한 쑥차 등에 대한 제조법 등이 나와 있으나, 대부분 전통 녹차와 유사한 제다법의 일부 수정된 형태로 이루어져 있다.

한편, 현재 중국을 비롯해 한국, 대만, 일본에서 유통되고 있는 녹차, 오룡차를 비롯한 수많은 종류의 차 중에 미생물 발효를 이용한 차는 극히 드물다. 중국의 보이차, 미얀마의 라페차, 타이의 미엥 등이 그것이다.

그 중에서 보이차는 여타의 다른 차들과는 달리 길게는 약 2년 동안 오랫동안 묵혀서 공기중의 미생물이나 곰팡이에 의한 발효 과정과 숙성 과정을 거쳐 제조된다.

이러한 독특한 제다법과 발효기간이 장시간 필요하다는 단점 때문에 그 희귀성으로 인해 엄청난 가격의 최고급 차로 인식되어 있다.

이에 따라 단시간의 발효와 숙성을 거친 형편없는 품질의 보이차가 유통되면서 곰팡이 냄새 또는 흙냄새 등이 나며, 보이차의 명성도 훼손되고 있다.

한편, 발효쑥차는 발효하지 않은 것에 비해 독성이 완화되고, 향이 부드러워지며, 여러 가지 항균 및 항산화 효과 등의 생리활성이 증가하는 것으로 추측되고 있으나, 이와 관련한 연구는 전무한 형편이며 유통 중인 제품도 전혀 없는 상태이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 부응하여, 유산균 발효공법으로 발효기간은 대폭 단축하면서도 품질과 생리기능성은 더욱 향상된 새로운 발효쑥차를 개발하여 고가의 수입차에 대한 대체경쟁력을 갖도록 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 국내에서는 녹차, 우롱차, 홍차 등 다양하지 못한 차 제품에 대해 한국인에게 매우 친숙한 식품인 쑥을 주원료로 하는 발효쑥차를 개발하여 국내 다류시장의 다양화와 국내 차 시장의 활성화에 기여하고자 하며, 아울러 차를 즐기는 아시아 주변국들에 대한 새로운 전략적 수출품목으로 삼고자 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은,

유산균을 액체 배양액에 접종하여 발효조에서 28~32℃의 온도로 6~8일간 원모 배양액을 배양하는 유산균 배양 단계와; 쑥의 뿌리를 제거하고 잎과 가지를 위주로 선별한 후 세척하여 이물질과 흙을 제거한 다음, 음지에서 20~28시간 동안 자연 건조하는 쑥 건조 단계와; 상기 원모 배양액을 상기 건조된 쑥에 접종하여 발효 조에서 25~35일간 1차 발효시키는 1차 발효 단계와; 상기 원모 배양액을 1차 발효된 발효쑥차에 2차 접종하여 발효조에서 25~35일간 2차 발효시키는 2차 발효 단계와; 2차 발효가 완료되면 40~60시간 동안 실온에서 자연 건조시키는 자연 건조 단계와; 자연 건조된 발효쑥차를 1~2개월간 자연 숙성시키는 자연 숙성 단계; 및 자연 숙성된 발효쑥차를 70~80℃의 건열에서 5~15분간 멸균시키는 멸균 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 상기 멸균된 발효쑥차를 커터기로 분쇄하여 포장 단위로 포장하는 포장 단계를 더 포함한다.

여기에서 또한, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)속, 락토코쿠스(Lactococcus)속, 엔터코쿠스(Enterococcus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 바실러스(Bacillus)속, 페디오코쿠스(Pediococcus)속 중 선택된 어느 하나이다.

여기에서 또, 상기 원모 배양액은 pH 6.0~pH 7.0 사이의 물과, 솔잎수액으로 이루어진다.

여기에서 또, 상기 1차 발효 단계는 상기 원모 배양액을 쑥 중량 대비 40 중량%로 접종한다.

여기에서 또, 상기 2차 발효 단계는 상기 원모 배양액을 상기 1차 발효된 발효쑥차 중량 대비 10 중량%로 접종한다.

이하, 본 발명에 따른 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법을 첨부된 도면 을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법을 설명하기 위한 공정도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법은, 유산균을 액체 배양액에 접종하여 발효조에서 28~32℃의 온도로 6~8일간 원모 배양액을 배양하는 유산균 배양 단계(S100)와, 쑥의 뿌리를 제거하고 잎과 가지를 위주로 선별한 후 세척하여 이물질과 흙을 제거한 다음, 음지에서 20~28시간 동안 자연 건조하는 쑥 건조 단계(S110)와, 원모 배양액을 건조된 쑥에 접종하여 발효조에서 25~35일간 1차 발효시키는 1차 발효 단계(S120)와, 원모 배양액을 1차 발효된 발효쑥차에 2차 접종하여 발효조에서 25~35일간 2차 발효시키는 2차 발효 단계(S130)와, 2차 발효가 완료되면 40~60시간 동안 실온에서 자연 건조시키는 자연 건조 단계(S140)와, 자연 건조된 발효쑥차를 1~2개월간 자연 숙성시키는 자연 숙성 단계(S150)와, 자연 숙성된 발효쑥차를 70~80℃의 건열에서 5~15분간 멸균시키는 멸균 단계(S160)와, 멸균된 발효쑥차를 커터기로 분쇄하여 포장 단위로 포장하는 포장 단계(S170)로 이루어진다. 여기에서, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)속, 락토코쿠스(Lactococcus)속, 엔터코쿠스(Enterococcus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 바실러스(Bacillus)속, 페디오코쿠스(Pediococcus)속 중 선택된 어느 하나이고, 원모 배양액은 pH 6.0~pH 7.0 사이의 물과, 솔잎수액으로 이루어진다. 여기에서 또한, 1차 발효 단계(S120)는 원모 배양액을 쑥 중량 대비 40 중량%로 접종하고, 2차 발효 단계(S130)는 원모 배양액을 상기 1차 발효된 발효쑥차 중량 대비 10 중량%로 접종하는 것이 바람직하다.

《실험예》

이하, 본 발명의 실험예에 따른 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법에 따라 제조된 발효 쑥차의 성분 등을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

1. 원모 배양액 배양방법

원모 배양액의 배양을 위하여 30℃ 내외의 온도에서 pH 6.5 내외의 물과 솔잎수액으로 이루어진 액체 배양액에 바실러스(Bacillus)속의 유산균을 접종하여 발효조에서 1주일간 배양하였다.

2. 쑥 원료의 선정 및 전처리

쑥은 인진쑥과 약쑥의 두 가지를 2005년 제천산으로 구입하여 육안으로 줄기와 뿌리를 제거하고 잎을 위주로 선별 후 세척하여 이물질과 흙을 제거하였다. 음 지에서 24시간 동안 자연 건조한 후 토기 항아리에 넣고 실온에서 저장하면서 시료로 사용하였다.

3. 유산균의 쑥 발효 제조 방법 확립

상기에서 배양한 원모 배양액을 쑥 무게의 40 중량%로 접종하여 30일간 1차 발효시켰다. 다시 쑥 무게의 10 중량%로 접종하여 동일한 방법으로 2차 발효를 시킨 후 48시간 동안 실온에서 자연 건조하였다. 건조한 발효쑥은 1~2개월 자연숙성 시킨 후 70~80℃의 건열에서 10분간 멸균시켜 최종 발효쑥 시료로 하였다.

4. 발효쑥의 영양성분 분석

인진쑥과 약쑥 2종에 대해 각각 발효전의 원료쑥과 발효쑥의 총 4종의 시료를 발효전 원료약쑥(ACM), 발효약쑥(AFM), 발효전인진쑥(ICM), 발효인진쑥(IFM)과 같이 구분하여 분석하였다.

각 시료는 와링블렌더로 조분쇄하여 사용하였고, 일부 분석은 80% 메타놀(methanol)로 추출하여 농축한 메타놀 추출물 상태로 이용하였다.

가. 수분분석

수분함량은 식품공전상의 건조 감량법중 상압가열건조법에 따라 다음과 같이 수분을 분석하고 하기의 수학식 1을 이용하여 백분율로 표시하였다. 미리 가열하여 항량으로 한 칭량접시에 쑥시료 3~5g을 정밀히 달아 뚜껑을 약간 열어 놓고 105℃ 온도의 건조기에 넣어 3~5시간 건조한 후 데시케이터 중에서 약 30분간 방냉한 후 무게를 달았다. 다시 칭량접시를 1~2시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복하였다.

여기에서, a는 칭량접시의 무게(g)이고, b는 칭량접시와 검체의 무게(g)이며, c는 건조후 항량이 되었을때의 무게(g)이다.

나. 조지방분석

조지방함량은 속슬렛(soxhlet)법에 의하여 디에틸에테르(diethylether)를 용매로 하여 쑥의 지질성분을 추출하여 정량하였다.

다. 회분분석

회분함량은 건식회화법을 이용하여 도가니에 쑥 2~3g을 정밀히 달아 200~220℃에서 탄화시킨 후 550℃ 회화로에서 회화하여 회백색이 된 재의 함량을 정량하였다.

라. 조단백, 조섬유 및 탄수화물 분석

조단백과 조섬유 함량은 모두 식품공전상의 방법에 준하여 측정하고, 탄수화물의 함량은 상기의 성분함량을 100%에서 차감하여 계산하였다.

마. 아미노태질소 함량 분석

아미노태질소함량은 전통식품표준규격의 포몰(formol) 적정법에 준하여 실시하였다. 즉, 각 시료 10g을 증류수로 10배 희석하여 30분간 교반 추출 후 3,500×g에서 10분간 원심 분리후 상징액을 취하였다. 시료액에 0.1N NaOH를 가하여 pH 8.4로 조정한 후 포름알데히드(formaldehyde) 용액(pH 8.5) 30㎖를 가하고 다시 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.4가 될 때까지 적정하였다. 동일한 조작으로 0.1N NaoH 용액의 공시험을 실시하여 아미노태질소량을 구하였다.

5. 발효전후의 기능성 성분변화 분석

가. 아미노산조성 변화

아미노산은 Heinrikson과 Meredith의 방법에 따라 Pico-Tag system(Waters Co., Milford, MA, USA)을 이용하여 분석하였다. 시료 약 10g을 정확히 칭량하여 앰플(ampule)에 넣은 후 6N HCl 15㎖를 가한 다음 질소로 치환하여 밀봉한 후 110℃ 건조기(dry oven)에서 24시간 동안 가수 분해시킨 뒤 분해액을 적당히 희석하고, 0.45㎛ 시린지 필터(syringe filter)(Millipore Co., USA)로 여과한 후 AccQ·FluorTM reagent kit(Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하여 형광성 유도체를 만들어 총 아미노산을 분석하였다. HPLC 분석시 시료는 5㎕를 주입하여 1㎖/min의 유속으로 gradeint mode로 37℃에서 AccQ·Tag column(3.9×150㎜, Waters, USA)을 통과시켜, fluorescence detector(λ_ex: 250㎚, λ_em: 395㎚)로 검출하였다. 아미노산 표준물질은 amino acid standard H(Pierce Co., USA)를 사용하였다.

나. 지방산 조성 변화

지방은 Folch 등의 방법에 의하여 추출 및 정제하였고, AOAC방법에 따라 14% BF₃-메타놀로 메틸에스테르(methyl ester)화 시킨 후 가스 크로마토그라프(gas chromatography)로 분석하였다. GC 분석에는 HP-FFAP 칼럼(column)(30mㅧ0.25㎛)을 사용하였고, 검출기는 불꽃이온화검출기(FID), 온도는 주입기 250℃, 검출기 260 ℃, 칼럼 오븐(column oven) 온도는 120℃(2min)-4℃/min-230℃(20min), 디텍터(detector) 온도는 260℃, 캐리어 가스(carrier gas)는 He을 1.5 ㎖/min의 속도로 흘려보냈다.

다. 총 폴리페놀화합물의 함량변화

토탈 폴리페놀 컴파운드(Total polyphenol compound) 함량은 Folin-Denis법에 의하여 측정하였다. 즉, 시료추출물 희석액 5㎖에 2N Folin reagent 5㎖를 가하고 10% Na2CO3 용액 5㎖를 가한 후 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 분광광도계로 760㎚에서 흡광도를 측정하였고 카테킨(catechin)으로 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.

라. 총 당함량 변화

총 당함량은 phenol-sulfuric acid법으로 측정하였다. 즉, 시료희석액에 5% 페놀(phenol) 1㎖를 가하고 진탕하고 conc. H2SO4 5㎖를 가하여 다시 진탕한 후 10분간 방치한 후 30℃의 워터 배스(water bath)에서 20분간 방치한 후 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.

마. 지표물질인 스코폴레틴(scopoletin)의 분석

쑥의 지표물질인 스코폴레틴 분석은 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 다음과 같은 기기조건으로 분석하였다. HPLC(JASCO HPLC system, Japan)의 분석 컬럼(column)은 μ-Bondapak TM C18, 검출기(JASCO UV-975)는 254㎚, 모빌 페이저(mobile phase)는 0.2M phosphoric acid(pH 2.1)/ 메타놀=58/42의 혼합용매로 유량(flow rate) 1.5㎖/min, 인젝션 볼륨(injection volume) 15㎕와 같은 조건으로 분석하였고, 검량선 작성을 위한 소코폴레틴 표준물질은 시그마(Sigma)사 제품을 사용하였다.

6. 발효전후의 이화학적 특성 변화 분석

가. 색도측정

색도는 색차계(ColorQUEST II spectrocolormeter, HunterLab., USA)로 측정하였다. 헌터 시스템(Hunter system)의 3자극치인 L(lightness), a(redness), b(yellowness)값과 전체적인 색깔의 차이를 나타내주는 색차(ΔE, color difference)값을 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다. 색도측정에 사용한 표준백색판(calibration plate)은 각각 L=92.67, a=-0.83, b=0.87이었다.

나. pH 및 총가용성고형분(Total soluble solids) 함량

pH는 시료 10g을 증류수로 10배 희석한 후 pH 메터(meter)(420A, Orion Co., USA)로 측정하였다.

다. 총가용성고형분(Total soluble solids) 컨텐츠

총가용성고형분는 0.45㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과한 후 Handrefractometer(PR-101; 0-45%, Atago Co., Japan)로 측정하였다.

라. 주사전자현미경에 의한 표면구조

발효전후 쑥의 성상과 표면구조를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM; JEOL model JFC-1100E, JEOL Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 즉, 건조쑥을 이온 코터(ion coater)에서 금으로 진공증착(100Å)시킨 다음, 전압 10㎸로 종단표면을 각각 100배, 350배 및 500배로 확대 촬영하였다.

7. 전자코(electric nose)를 이용한 향기패턴 변화 분석

발효에 따른 쑥 냄새의 변화를 살펴보기 위하여 전자코로 향기패턴의 변화를 분석하였다. 전자코는 z-NOSE^TM M4100(Electronic Sensor Technology, Newbury park, CA, USA)이며, 이 전자코는 GC/SAW 전자코로서, GC quartz crystal microbalance센서(Surface Acoustic Wave : SAW)를 검출기로 장착하고 있다.

기기분석 조건은 다음과 같았다.

Sensor/Column/Valve/Inlet temp=25/30/80/80, Ramp:30 to 120 at 3/sec, Sampling time : 20sec, Run time:40sec, Column: DB-624, Room temp : 23℃

8. 생리활성 분석

가. 전자공여능에 의한 항산화효과

항산화 효과는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 유리라디칼 소거법으로 측정하였다. 즉, 시료의 80% 메타놀 추출물 1㎖에 0.2㎜ DPPH 용액 2㎖를 가하여 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 10초간 혼합한 후 실온에서 20분간 방치한 후 525㎚에서 흡광도를 측정하였고, 다음과 같은 식에 의해 전자공여능(electron donating abilities, EDA)을 아래의 수학식 2를 이용하여 계산하였으며, 초기 DPPH 농도가 50% 감소될 때까지 필요한 샘플의 농도를 EC₅₀(efficient concentration)으로 산출하였다.

나. 항균효과

발효 전후의 항균활성의 비교를 위하여 주요 식품 위해 균주를 대상으로 하여 페이퍼 디스크(paper disc)법으로 분석하였다. 실험에 사용한 균주는 Escherichia coli(KCTC 1682), Bacillus subtilis(ATCC 14593), Staphylococcus aureus (ATCC 12692), Salmonella typhimurium(ATCC 14028), Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa 등의 균주로 적정배지조건은 표 1에 나타낸 바와 같다. 이들 균주는 한국식품연구원에서 분양받아 37℃에서 18~24시간 동안 계대 배양한 후 각각의 최적생육배지로 기층용 배지(agar 1.5%)를 제조하고, 균주를 혼합한 중층용 배지(agar 0.75%)를 부어 굳혀 제조하였다. 위의 평판배지에 페이퍼 디스크(Ø8, Advantec, Toyo Roshi Co., Tokyo, Japan)를 올려 밀착시킨 후 10% 농도의 쑥 추출물을 300㎕를 점적하여 37℃의 인큐베이터(incubator)에서 16시간 동안 각각 배양한 다음 페이퍼 디스크 주위의 클리어 존(clear zone)의 직경(㎜)을 측정하였다.

[표 1]- 항균효과 분석을 위한 대상균주 및 최적 배양조건

균주명	최적 배양배지	최적 배양온도
Listeria monocytogenes	Brain Heart Infusion	37℃
Bacillus subtilis	Nutrient	37℃
Staphylococcus aureus	Nutrient	37℃
Salmonella typhimurium	Nutrient	37℃
Escherichia coli	Tryptic Soy	37℃
Pseudomonas aeruginosa	Nutrient	37℃

9. 고지혈증 유발 흰쥐를 이용한 동물실험

실험동물은 체중 230g 내외의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 구입하여 환경에 적응시키기 위하여 우리에 넣고, 일주일 동안 고형사료(삼양사료 주식회사)로 예비 사육한 후 6군으로 분리하였다. 정상군, 고지혈증군, 약쑥투여군, 발효약쑥투여군, 인진쑥투여군, 발효인진쑥투여군 등의 6군이며 개체수는 모두 12마리로 나누었다. 정상군을 제외한 모든 실험쥐에는 고지방식이(돈지 11.5%, 콜레스테롤 1%)를 자유롭게 섭취하도록 하여 고지혈증을 유발시키고 4주간 사육하였고, 매일 투여하는 쑥 추출물은 사람(체중 65㎏ 기준)의 1일 2첩 복용량에 해당하는 양을 환산하여 농축물을 경구 투여하였다.

10. 연구결과 및 데이터

1). 발효전후 쑥의 영양성분 분석

약쑥과 인진쑥의 발효전후의 영양성분 변화를 분석한 결과를 표 2와 같이 나타내었다. 수분함량에 있어서 약쑥은 발효 후 감소하였고, 인진쑥은 반대로 수분함량이 더 증가하였다. 조단백질은 발효약쑥이 14.0%로 가장 많았고, 조지방은 발효인진쑥에서 6.2%로 가장 높았다. 조섬유는 약쑥보다 인진쑥이 모두 월등히 많은 것으로 나타났고, 발효후의 숙성정도를 예측할 수 있는 아미노태질소량은 발효전보다 발효후에 모두 크게 증가한 것으로 나타났다.

[표 2]- 발효 전후 약쑥과 인진쑥의 영양성분 분석표

항목	ACM	AFM	ICM	IFM
성상	미갈색	갈색	녹색	황색
수분(%)	11.9	9.6	8.5	10.3
조단백질(%)	11.1	14.0	8.1	8.5
조지방(%)	5.7	4.3	5.0	6.2
회분(%)	8.3	9.6	4.6	6.5
조섬유(%)	26.18	22.56	40.07	34.05
탄수화물(%)	36.82	39.94	33.73	34.45
아미노태질소(㎎%)	90.6	393.3	111.5	224.2

여기에서, ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

2). 발효전후의 기능성 성분변화

가. 아미노산조성 변화

아미노산의 조성은 표 3에 나타내었다. 약쑥과 인진쑥 모두 발효후에 아미노산의 총량이 증가하였는데, 일반적으로 유산균이 비타민이나 젖산을 생성시키는 외에 유리아미노산 함량을 증가시키는 등 영양학적 가치를 증진시킨다는 보고로 미루어 볼 때 쑥 시료에서도 유사한 효과를 나타내었기 때문인 것으로 사료된다. 네 가지 시료 모두에서 감칠맛을 내는 아미노산인 글루타민산이 가장 많이 존재하였으며, 함황아미노산인 시스테인은 검출되지 않는 특징을 보였다. 콩나물에도 많이 존재하는 아스파르트산은 인진쑥보다 약쑥에 더 많이 함유되어 있었다.

[표 3]- 발효전후 약쑥과 인진쑥의 아미노산조성 분석표

나. 지방산 조성 변화

발효전후 약쑥과 인진쑥의 지방산 조성을 가스 크로마토그라프(gas chromatography)로 분석한 결과를 도 2와 표 4에 각각 나타내었다. 발효전후에 따 른 지방산의 조성에는 큰 변화가 없었으나 약쑥과 인진쑥 모두 리놀레산과 리놀렌산과 같은 불포화 지방산이 특히 많이 함유되어 있었다. 즉, 이 두 지방산의 합을 살펴보면 발효전약쑥과 발효약쑥이 각각 37.4%와 38.8%였고, 발효전인진쑥과 발효인진쑥은 각각 45.3% 및 49.1%로 거의 50%에 가까운 높은 함량을 보여 영양학적으로 우수한 것으로 알려진 이들 지방산은 발효쑥에서도 유용한 효능을 나타낼 것으로 기대된다.

도 2는 가스 크로마토그라프를 이용한 발효전후 약쑥과 인진쑥의 지방산 크로마토그램이고, 도 2에서 ACM은 약쑥, AFM은 발효약쑥, ICM은 인진쑥, IFM은 발효인진쑥, STD은 지방산 standard mixture이다.

[표 4]- 발효전후 약쑥과 인진쑥의 지방산조성 분석표

다. 총 폴리페놀 및 총 당함량의 변화

페놀성 화합물은 식품계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 항산화, 항균활성 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있어 천연항산화제로서 많이 이용된다. 폴리페놀 화합물이 항산화 효능을 지니는 기작은, 체내 생체막에 존재하는 지질이 활성산소에 의해 유리기와 연쇄반응을 일으켜 산화됨으로써 인체의 노화의 원인이 되는데, 이때 폴리페놀 물질들이 이러한 유리기를 제거시키기 때문인 것으로 알려져 있다.

쑥 시료의 총 폴리페놀 함량을 표 5를 참조하여 보면, 약쑥보다는 인진쑥의 함량이 월등히 높았다. 캐모마일 60% 알콜 추출물의 경우 약 24.98㎎/g으로 보고되어 있고, 운향이 17.07㎎/g 등인 것과 비교하면 인진쑥의 62.71~69.40㎎/g은 매우 높은 것으로 비교되나 발효공정에 따른 함량의 차이는 거의 없는 것으로 나타나 발효에 의해 폴리페놀 물질들은 파괴되지 않고 잘 보존되는 것으로 사료된다. 한편, 총 당함량은 두 종류의 쑥 모두 발효 후 크게 감소함으로써 유산균의 영양원으로 당류가 이용되어 줄어든 것으로 추측된다.

[표 5]- 발효전후 쑥의 총폴리페놀, 총당 및 스코폴레틴 함량의 변화

샘플	총폴리페놀(㎎/g)	총당 (㎎/g)	스코폴레틴 (㎎/g)
ACM	24.12㎎/g	1.58±0.39	N.D.
AFM	23.64	0.34±0.06	N.D.
ICM	69.40	2.70±0.06	5.36
IFM	62.71	1.14±0.12	6.24

여기에서, N.D.는 미검출이고, ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

라. 스코폴레틴 성분

인진쑥은 유효성분으로 여러 가지 물질을 함유하고 있으며 ρ-hydroxylacetophenone, 6,7-dimethylcoumarin 및 스코폴레틴 등과 같은 성분은 혈압강하 및 관상동맥의 혈류량 증가와 같은 효능을 지니고 있는 활성성분이다. 이중 scopoletin은 인진쑥의 주요 지표성분 중의 하나이기도 하며, 대부분의 연구에서 그 함량은 326.13㎍/g 수준으로 보고되어 있다. 그러나, 본 연구에서 분석한 인진쑥과 발효인진쑥에서는 표 5에서 보는바와 같이 5.36㎍/g 및 6.24㎍/g으로 월등히 많았으며, 발효인진쑥에서 그 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 인진쑥 및 발효인진쑥은 향후 고혈압 등과 같은 관상동맥 질환에 효능이 있는 우수한 기능성 식품의 재료로의 활용이 가능할 것으로 사료된다.

3). 발효전후의 이화학적 특성 변화 분석

가. pH, 총가용성고형분 및 색도

표 6에 나타낸 바와 같이 발효된 약쑥 및 인진쑥은 원료쑥에 비하여 pH가 크게 저하되었는데, 이는 일반적인 유산발효와 같이 젖산 등과 같은 유기산이 생성되었기 때문인 것으로 추측된다. 총가용성고형분량은 발효약쑥은 감소, 발효인진쑥은 증가하는 양상을 보였다.

색도를 보면 명도를 나타내는 L값은 발효후에 모두 다소 감소하여 색이 밝아지는 것을 알 수 있고, 붉은색의 정도를 나타내는 a값에 의하면 발효에 따라 모두 증가하여 붉은 색이 강해짐을 알수 있고, 노란색의 정도를 나타내는 b값도 감소하 는 것으로 나타났다.

[표 6]- 발효전후 쑥의 pH, 총가용성고형분 및 색도

샘플	pH	총가용성고형분(°Bx)	L	a	b	ΔE
AFM	6.4	23.0	44.63	1.50	7.99	29.44
ACM	4.6	18.6	39.91	2.19	6.91	33.81
ICM	6.0	22.4	46.81	0.01	10.44	28.07
IFM	5.1	24.0	44.60	2.34	9.78	30.09

나. 주사전자현미경에 의한 발효쑥의 표면구조 관찰

도 3은 주사전자현미경으로 관찰한 발효약쑥과 인진쑥의 표면구조를 나타낸 사진이고, 도 3에서 ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

4). 전자코를 이용한 향기성분 변화 분석

도 4에서는 30초간의 머무름시간(retention time: 가로축)에 따라 SAW 센서로부터 얻어진 진동수의 변화패턴을 미분하여 나타내었다. 약쑥은 발효전 약 11개였던 피크가 발효 후 18개 정도로 증가하여 다양한 냄새성분이 생성되었음을 알 수 있었고, 인진쑥도 발효전 17여개의 피크가 19개 정도로 증가하고 일부는 피크의 크기도 증가한 것으로 나타났다.

따라서, 발효를 함에 따라 쑥의 냄새성분들이 새롭게 형성되거나 원래 있던 냄새들이 더욱 강해지는 효과가 있음을 알 수 있었고, 약쑥과 인진쑥의 향기 패턴이 유사한 것 같으면서도 일부 피크에 명확한 차이가 나는 것은 두 쑥의 냄새가 미묘하지만 다른 냄새로 인식됨을 잘 설명해 주고 있는 것으로 분석되었다.

도 4는 발효전후 쑥의 향기분석 크로마토그램이고, 도 4에서 ACM은 약쑥이 고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

도 4의 크로마토그램에서 나타난 피크들이 어떤 성분인지는 알 수 없으나 이들 성분의 함량에 따른 차이를 취문(vaporprint)으로 이미지화하여 향의 패턴 차이를 나타낸 결과 도 5에서와 같이 약쑥과 인진쑥은 확연한 차이가 나타났고, 각 쑥의 발효전후에도 미세하지만 다른 패턴의 냄새를 지닌 것으로 분석되었다. 사람들마다 손가락의 지문이 미세한 차이를 지니고 있지만 전혀 다른 사람으로 판명되는 것처럼 취문 또한 유사한 것 같지만 미세한 패턴의 차이로도 그 냄새의 특성을 표현할 수 있는 것으로, 향기패턴이 다르다는 것은 각 냄새성분들의 종류와 조합비율이 완전히 다름을 의미하며, 이는 사람의 코로는 전혀 다른 냄새로 인식될 수 있는 것이다.

따라서, 발효에 따른 쑥의 향기는 원래쑥과는 매우 달라진 냄새로 느껴질 수 있으며 이러한 발효쑥의 달라진 냄새가 좋게 느껴지는지 아닌지의 여부는 소비자 개개인의 기호도에 따라 달라질 것으로 생각된다.

도 5는 취문을 이용한 발효전후 쑥의 향기패턴 비교를 나타낸 그래프이고, 도 5에서 ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

5). 생리활성 분석

가. 전자공여능과 항산화효과

발효 전후 쑥의 항산화 효과는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 유리라디칼 소거법에 의한 전자공여능으로 측정하여 도 6에 나타내었다. 전자공여능은 시 료의 플라보노이드(flavonoids) 및 페놀(phenol)성 물질 등에 대한 항산화 작용을 판단하는 지표이다. 이러한 물질들은 체내 활성산소에 의해 생성된 프리 라디칼(free radical)을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크다. 프리 라디칼은 인체내에서 세포의 노화를 촉진하는 인자이므로, 따라서 이러한 프리 라디칼을 환원시키거나 제거할 수 있는 물질들은 항산화 효과가 있음을 의미한다. 도 6에서 보면 항산화 효과가 가장 큰 시료는 인진쑥으로 25㎎/g의 농도에서 이미 91.61%의 높은 전자공여효과를 보여주었으며, 다음으로는 발효약쑥>약쑥> 발효인진쑥의 순서로 항산화 효과를 보여주었다.

도 6은 발효 전후 쑥의 전자공여능을 나타낸 그래프이고, 도 6에서 ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

나. 항균효과

발효전후 쑥의 항균활성은 주로 식품위생학적으로 위해한 식중독균 등을 대상으로 이들 균이 배양된 배지위에 페이퍼 디스크를 올려놓고 쑥 추출물을 점적하였을 때 그 주위로 균의 증식이 억제되어 나타나는 크린 존의 크기를 살펴보아 도 7에 나타내었다. 각각 시료의 농도는 1㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.01㎎/㎖의 농도로 점적한 결과이며, 각 시료의 왼쪽부터 높은 농도의 순서로 점적하였다. 그 결과 농도에 비례하여 항균활성이 나타났으다. 각 균에 대한 반응을 살펴보면, Psuedomonas 균에 대해서는 두 종류의 쑥 모두 항균효과가 거의 나타나지 않았고, E. coli.와 살모넬라균, Staphyllococcus, Listeria 균에 대해 약쑥은 반응이 미약했으나, 인진쑥은 뚜렷한 항균효과가 있었으며, Bacillus균에 대해서는 모두 높은 효과를 보였 다. 이외에도 특징적으로 일부 플레이트(plate)에서 파랗게 변화하는 현상이 나타났는데, 시료와 미생물이 생성한 물질과의 반응인지 또는 그 이외의 이유때문인지는 확실치 않아 향후 좀 더 심도있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

도 7은 발효 전후 쑥의 향균효과를 나타낸 사진이고, 도 7에서 ACM은 약쑥이고, AFM은 발효약쑥이며, ICM는 인진쑥이고, IFM는 발효인진쑥이다.

6). 고지혈증 유발 흰쥐를 이용한 동물실험

고지방 식이의 급여로 고지혈증이 유발된 흰쥐에 대해 쑥 추출물을 4주간 경구투여하여 지질대사에 미치는 영향을 분석하였다. 채취한 혈액에서 중성지방(triglyceride), 총콜레스테롤(total choleterol), 저밀도콜레스테롤(LDL-cholesterol), 고밀도콜레스테롤(HDL-cholesterol) 및 AST(aspartate aminotransferase; SGOT)와 ALT(alanine aminotransferase; SGPT) 효소활성 등을 분석하였다.

먼저, 도 8을 보면 쑥은 중성지방 감소효과가 뚜렷하였으며, 발효인진쑥의 효과가 가장 좋았다. 고지혈증에서는 정상인보다 혈중 지방산이 중성지방으로 전환되는 속도가 증가하여 결과적으로 혈중 중성지방 상승을 부추기는데, 이에 대해 쑥은 중성지방을 낮추는 효과가 있는 것으로 사료된다.

도 8은 고지혈증 흰쥐의 중성지방 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프이고, 도 8에서 CONTROL은 고지혈증, ACM은 약쑥투여군, AFM은 발효약쑥투여군, ICM은 인진쑥투여군, IFM은 발효인진쑥 투여군이다.

또한, 총콜레스테롤은 도 9에 도시된 바와 같이 4가지 투여군 모두 뚜렷한 효과가 있었으며, 발효전의 쑥 추출물이 효과적이었다는 점이 특기할 만하다.

도 9는 고지혈증 흰쥐의 총콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프이고, 도 9에서 CONTROL은 고지혈증, ACM은 약쑥투여군, AFM은 발효약쑥투여군, ICM은 인진쑥투여군, IFM은 발효인진쑥 투여군이다.

그리고, 저밀도콜레스테롤(도 10)에 대해서는 4가지 쑥 추출물 모두 감소효과가 있었으나, 인진쑥보다는 약쑥이 효과가 컸고, 특히 발효약쑥의 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다.

고밀도콜레스테롤(도 11)은 인진쑥 특히 발효인진쑥이 가장 효과가 높은 것으로 나타났다. 사람의 정상참고치는 고밀도콜레스테롤이 남자 30~75㎎/dL이며, 여자 35~80㎎/dL이고, 저밀도콜레스테롤은 남/녀 모두 55~165㎎/dL이다.

도 10은 고지혈증 흰쥐의 저밀도콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프이고, 도 11은 고지혈증 흰쥐의 고밀도콜레스테롤 수준에 대한 쑥의 효과를 나타낸 그래프이며, 도 10 및 도 11에서 CONTROL은 고지혈증, ACM은 약쑥투여군, AFM은 발효약쑥투여군, ICM은 인진쑥투여군, IFM은 발효인진쑥 투여군이다.

11. 결론

약쑥과 인진쑥의 발효 전후 기능성으로 항산화 효과와 항균효능을 탐색한 결과 항산화 효과가 가장 큰 시료는 인진쑥으로 25㎎/g의 농도에서 91.61%의 높은 전자공여효과를 보여주었으며, 다음으로는 발효약쑥>약쑥> 발효인진쑥의 순서로 항산화 효과가 높았다.

식품위생학적으로 유해한 균을 대상으로 항균효과를 살펴본 결과 E. coli. 와 살모넬라균, Staphyllococcus, Listeria 균에 대해 약쑥은 반응이 미약했으나, 인진쑥은 뚜렷한 항균효과가 있었으며, Bacillus균에 대해서는 모두 높은 효과를 보였다.

그리고, 실험동물을 이용한 생리활성 분석한 결과 고지혈증을 유발한 실험용 흰쥐를 대상으로 쑥 추출물을 경구투여한 결과 중성지방 감소효과가 뚜렷하였으며, 특히 발효인진쑥의 효과가 가장 좋았다. 일명 나쁜 콜레스테롤이라 일컫는 저밀도콜레스테롤에 대해서는 4가지 쑥 추출물 모두 감소효과가 있었으나, 인진쑥보다는 약쑥이 효과가 컸고, 특히 발효약쑥의 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 좋은 콜레스테롤로 알려진 고밀도콜레스테롤은 인진쑥 특히 발효인진쑥이 가장 효과가 높은 것으로 나타났다.

따라서, 자연 건조한 인진쑥이 아닌 발효 인진쑥은 생리활성 물질, 항산화 물질 등 여러 가지 기능에 효능 효과가 나타났으며, 발효 인진쑥차가 상품화되었을 경우 우리 농산물인 인진쑥의 고부가가치를 창출할 수 있어 지역경제 활성화에 기여할 뿐만 아니라 새로운 기능성 식품의 시장 개척과 더불어 수출의 기회가 증대될 수 있어 외국농산물에 대한 국가 경쟁력도 키울 수 있다.

상기와 같이 구성되는 본 발명인 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법에 따르면, 유산균 발효공법으로 발효기간은 대폭 단축하면서도 품질과 생리기능성은 더욱 향상된 새로운 발효쑥차를 개발하여 고가의 수입차에 대한 대체경쟁력을 갖도록 하고, 또한, 국내에서는 녹차, 우롱차, 홍차 등 다양하지 못한 차 제품에 대해 한 국인에게 매우 친숙한 식품인 쑥을 주원료로 하는 발효쑥차를 개발하여 국내 다류시장의 다양화와 국내 차 시장의 활성화에 기여하고자 하며, 아울러 차를 즐기는 아시아 주변국들에 대한 새로운 전략적 수출품목으로 삼을 수 있다.

본 발명은 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있으며 상기 발명의 상세한 설명에서는 그에 따른 특별한 실시 예에 대해서만 기술하였다. 하지만 본 발명은 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

유산균을 액체 배양액에 접종하여 발효조에서 28~32℃의 온도로 6~8일간 원모 배양액을 배양하는 유산균 배양 단계와;

쑥의 뿌리를 제거하고 잎과 가지를 위주로 선별한 후 세척하여 이물질과 흙을 제거한 다음, 음지에서 20~28시간 동안 자연 건조하는 쑥 건조 단계와;

상기 원모 배양액을 상기 건조된 쑥에 접종하여 발효조에서 25~35일간 1차 발효시키는 1차 발효 단계와;

상기 원모 배양액을 1차 발효된 발효쑥차에 2차 접종하여 발효조에서 25~35일간 2차 발효시키는 2차 발효 단계와;

2차 발효가 완료되면 40~60시간 동안 실온에서 자연 건조시키는 자연 건조 단계와;

자연 건조된 발효쑥차를 1~2개월간 자연 숙성시키는 자연 숙성 단계; 및

자연 숙성된 발효쑥차를 70~80℃의 건열에서 5~15분간 멸균시키는 멸균 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 멸균된 발효쑥차를 커터기로 분쇄하여 포장 단위로 포장하는 포장 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 유산균은,

락토바실러스(Lactobacillus)속, 락토코쿠스(Lactococcus)속, 엔터코쿠스(Enterococcus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 바실러스(Bacillus)속, 페디오코쿠스(Pediococcus)속 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 원모 배양액은,

pH 6.0~pH 7.0 사이의 물과, 솔잎수액으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 1차 발효 단계는,

상기 원모 배양액을 쑥 중량 대비 40 중량%로 접종하는 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 2차 발효 단계는,

상기 원모 배양액을 상기 1차 발효된 발효쑥차 중량 대비 10 중량%로 접종하는 것을 특징으로 하는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법.