KR20180088947A - 연잎 추출물 발효방법, 그에 의한 발효추출물을 이용한 항비만 육가공 소재 및 육가공제품 - Google Patents
연잎 추출물 발효방법, 그에 의한 발효추출물을 이용한 항비만 육가공 소재 및 육가공제품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 연잎 추출물 발효방법, 그에 의한 발효추출물을 이용한 항비만 육가공 소재 및 육가공제품에 관한 것으로, 원료로서의 연잎을 선별하고 이물질을 제거하도록 세척하고 건조하는 단계(S1), 상기 건조된 연잎을 추출기에서 용매에서 유효성분을 추출하는 단계(S2), 상기 단계(S2)에서 추출된 연잎 추출물에 유산균 발효 균주를 투입하여 발효시키는 단계(S3), 상기 단계(S3)에서 발효된 연잎 추출물 발효액을 살균하는 단계(S4) 및 살균이 완료된 발효액을 여과기로 여과하는 단계(S5)를 포함하며, 상기 단계(S2)에서 용매로서 정제수와 무수에탄올(EtOH)중에서 선택된 어느 하나를 사용하며, 75~85℃의 온도에서 1~5시간 동안 열수추출하며, 상기 단계(S3)에서 발효에 사용되는 유산균 발효 균주는 락토바실러스속의 균주들중에서 선택된 적어도 어느 하나의 균주를 사용하며, 연잎 추출물에서 5 시간 내지 48시간 동안 상기 유산균 발효 균주를 배양하여 연잎추출물을 발효시키는 것을 특징으로 하여 구성되며, 본 발명에 따른 연잎 발효추출물은 항비만, 합성착색료를 저감할 수 있는 효과와, 항비만 건강식품 소재로서의 가공 식품 개발에 활용할 수 있고, 종래 폐기하던 연잎을 고부가가치를 창출하도록 이용함으로써 농가 소득 증대 효과를 기대할 수 있다
Description
본 발명은 연잎으로 부터 추출한 유효성분 추출물의 발효방법에 관한 것으로, 특히 연잎 유래 항비만 활성물질인 쿼세틴(quercetin)을 포함하는 유효성분의 추출물을 수용성 액상소재 및 지용성 분말소재로 최적화하기 위한 연잎 추출물 발효방법과, 그 발효추출물을 이용한 액상 또는 분말상의 항비만 육가공 소재 및 육가공제품에 관한 것이다.
일반적으로 연(Nelumbo nucifera)은 인도와 중국을 중심으로 열대, 온대의 동부아시아를 비롯한 한국, 일본 등에 널리 분포하는 고생대의 식물로 불교에서 신성한 식물로 꽃은 관상용과 차제로 이용하여 왔으며, 잎과 뿌리는 식용하여 왔으며, 뿌리, 줄기, 잎, 열매 등 다양한 부위가 식품 또는 한약재로서 오랫동안 사용되어서 그 안전성이 상당히 입증된 식물이며, 국내에서도 널리 재배되고 있다.
이러한 연의 항노화효과는 다양한 의학문헌에 소개되고 있으며, 본초강목에서는 연은 기력을 왕성하게 하고 모든 질병을 물리치며 오래 복용하면 몸이 가벼워지고 수명을 연장한다고 기록되어 있다. 약성본초에는 연은 오장육부의 기운부족, 특히 심, 비, 신의 기운부족과 속이 상한 것을 낫게 하며 12경맥의 기혈을 크게 보하고, 쌀과 연육으로 죽을 쑤어 먹으면 몸이 가볍고 든든하여지며 또 머리칼을 검게하고 장수하게한다고 쓰여 있다. 연꽃은 주로 관상용으로 애용되고 있으나 용도는 크게 연구되지 않았으며, 특히 잎은 알칼로이드와 탄닌을 함유하고 있어 수렴 및 지혈제로 사용되거나 민간에서는 야뇨증을 치료하는데에 이용되고 있기도 하다. 땅속 줄기는 연근이라 하며 아스파라진이 들어 있어 식용하며 자양 강장약으로 쓰인다. 열매는 연방, 씨를 연자육이라고 하며 부인병에 좋다고 알려져 있다.
한방에서 연잎은 하엽(河葉)이라 하며 설사, 두통과 어지러움, 토혈, 산후 어혈치료, 야뇨증, 해독작용에 쓰이고, 서열번갈(暑熱煩渴)을 치료하며, 토혈(吐血)과 하혈(下血)에 대하여 지혈(止血) 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, 연의 뿌리와 잎이 약용과 식용으로 많이 사용되고 있으며, 특히 연근에는 수용성 섬유질이 많아 변비 완화작용이 있고 혈압 강하에도 효과적이라고 알려졌다. 또한, 당단백질인 뮤신이 함유되어 있어 혈압 강하 콜레스테롤 저하 작용이 있다고 밝혀졌으며 연근에 함유된 탄닌은 강력한 수렴 작용이 있어 지혈 효과가 탁월하고 항산화 작용도 크다고 알려졌다(Ling 등 2005).
최근에는 양파와 사과에 많이 함유되어 있으며, 강력한 항산화제로서 세포의 산화적 손상과 지방의 산패를 막아주고 항비만 효능을 갖는 쿼세틴(quercetin)이 연잎에도 함유되어 있는 것으로 알려졌다.
이러한 쿼세틴은 강력한 항산화제로서 세포의 산화적 손상 및 지방의 산패를 막아 주며 이를 통해 고혈압의 예방효과도 인정되고 있다. 쿼세틴이 이와 같은 효과를 나타내는 이유는 생체내에서 반응성이 강해 세포의 여러 성분을 손상시키는 자유 라디칼(free radical)을 제거하고, 동맥경화와 심장병의 원인인 저밀도 리포단백질 산화(low-density lipoprotein oxidation)를 줄이며, 체내 항산화제인 비타민 E(vitamin E)를 보호함과 동시에 재생시키며, 금속이온의 유해작용을 불활성화 시키는 역할을 하기 때문인 것으로 알려져 있다.
이러한 연잎에 대하여, 국내 등록특허 제10-1075852호(등록일자 2011년10월17일)에는 연잎을 이용해 1일 영양소 기준치에 비해서 열량은 높되 탄수화물과 단백질 함량이 낮은 발효추출물을 생성함으로써 다이어트 효과를 발휘할 수 있는 연잎 발효추출물의 제조방법이 개시되어 있으며, 상기 특허에서의 발효추출물의 제조방법은 연잎을 절단하여 가공하는 가공단계와, 연잎추출액을 제조하는 연잎추출액 제조단계와, 상기 가공단계에서 가공된 연잎, 상기 연잎추출액 제조단계에서 제조된 연잎추출액 및 백설탕을 용기내에 넣고 혼합하는 혼합단계와, 상기 혼합단계에서 혼합된 혼합물을 용기내에서 발효시켜 발효추출액을 생성하는 발효추출액 생성단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
그러나, 상기한 특허기술에 의한 연잎 발효추출물의 제조방법은 일반적으로 이용하고 있는 설탕을 이용하여 청을 제조하는 것과 유사한 것으로 유효성분만을 효율적으로 추출하기 어려운 문제점이 있었으며, 설탕을 이용한 연잎청 제조에 시간이 많이 소요되고, 이러한 연잎청은 과도한 설탕으로 인하여 비만을 유발하는 문제가 있었다.
본 발명의 목적은 상기한 종래 연잎 발효추출물에 대한 문제점을 해결하여 연잎 추출물을 미생물을 이용하여 발효시켜 항비만 성분의 활성도를 향상시켜 건강을 증진시키도록 개선하며, 폐기되는 연잎을 사용하여 저렴한 원재료 비용으로 제조할 수 있는 연잎 추출물 발효방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 또한 육가공시 육고기를 침지시키는 침지액에 첨가하는 육가공 소재로서 상기한 연잎 추출물을 발효시켜 얻은 발효추출물을 포함하는, 육가공 제품 섭취시 콜레스테롤을 낮추어 비만 요인을 저감시키는 육가공 소재와, 그러한 육가공 소재를 사용하여 가공한 항비만 육가공 제품을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 연잎 추출물 발효방법은,
원료로서의 연잎을 선별하고 이물질을 제거하도록 세척하고 건조하는 단계(S1),
상기 건조된 연잎을 추출기에서 용매에서 유효성분을 추출하는 단계(S2),
상기 단계(S2)에서 추출된 연잎 추출물에 유산균 발효 균주를 투입하여 발효시키는 단계(S3),
상기 단계(S3)에서 발효된 연잎 추출물 발효액을 살균하는 단계(S4) 및
살균이 완료된 발효액을 여과기로 여과하는 단계(S5)를 포함하며,
상기 단계(S2)에서 용매로서 정제수와 무수에탄올(EtOH)중에서 선택된 어느 하나를 사용하여 75~85℃의 온도에서 1~5시간 동안 열수추출하며,
상기 단계(S3)에서 발효에 사용되는 유산균 발효 균주는 락토바실러스속의 균주들중에서 선택된 적어도 어느 하나의 균주를 사용하며, 연잎 추출물에서 5 시간 내지 48시간 동안 상기 유산균 발효 균주를 배양하여 연잎추출물을 발효시키는 것을 특징으로 하여 구성된다.
상기 유산균 발효균주에 의한 발효는 단일 균주 발효시에 6종의 락토바실러스속 균주(Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bacilus subtilis , Yeast, Kazachstania unispora)들중 적어도 어느 하나의 균주를 사용하여 연잎추출물을 발효시킬 수 있다.
상기 유산균 발효균주에 의한 발효는 Lactobacillus brevis와 Lactobacillus plantarum를 MRS broth 배지에서 전배양하여 활성을 갖게 한 후 연잎 추출물에서 단계배양과 동시배양중에서 선택하여 배양하여 연잎추출물을 발효시킬 수도 있다.
상기 단계(S2)에서 용매로서 15배의 증류수를 첨가하여 75~85℃에서 3시간 동안 방치하여 연잎 추출물을 얻을 수 있다.
상기 단계(S2)에서 용매로서 30% ~ 70% 농도의 무수에탄올을 사용할 수 있다.
상기 단계(S2)에서, 상기 연잎추출물은 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시키고, 냉각된 연잎추출물에 전배양 단계를 거친 6종의 균주를 각 2%씩 연잎추출물에 접종한 후 37℃, 200 rpm에서 48 시간동안 발효시킬 수 있다.
또한, 상기 단계(S2)에서, 상기 연잎추출물은 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시키고, 냉각된 연잎추출물에 전배양 단계를 거쳐 활성화된 Lac. brevis 1%를 우선 접종한 후 배양 5시간 후 Lac. plantarum 1%를 후 접종하는 단계 배양법과 Lac. brevis와 Lac. plantarum 1%를 동시에 접종시키는 동시 배양법을 적용하여 37℃, 120 rpm에서 24 시간 발효시킬 수 있다.
연잎추출물에 과당을 질량 대비 0.5% 내지 5.0% 첨가하여 발효시키는 것이 바람직하다. 또한, 효모추출액(BactoTM Yeast Extract: Becton, Dickinson and Company)을 무게 대비 0.1% ~ 0.5%를 첨가할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따라, 상기한 연잎 추출물 발효방법에 의한 연잎 추출물을 포함하는 항비만 육가공 소재가 제공된다.
상기 항비만 육가공 소재는 연잎 발효추출물을 원심분리한 후 상등액만을 취하여 냉동조건하에서 동결시킨 후 진공동결건조시켜 얻은 분말상으로 될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라, 상기한 항비만 육가공 소재를 육고기의 염지과정에서 염지액에 연잎 발효추출물을 0.5 ~ 3.0%의 농도가 되게 첨가하여 염지하여 제조한 항비만 육가공 제품이 제공된다.
본 발명에 따라, 연잎 추출물을 미생물 발효시킴으로써 독성이 감소되고, 쿼세틴-루티노사이드와 헤스페리딘과 같은 항산화 성분의 함량이 크게 증가되는 효과와 함께, 쥐 실험을 통해 연잎 열수추출물군에 비해 연잎발효물군이 지질축척정도는 유의적으로 낮게 나타나 연잎 추출물 발효물로 3T3-L1 세포내 지질축척을 억제할 수 있고 지방구 형성 억제 효과가 있는 것으로 나타났으며, 연잎 발효물 섭취한 고지방 유도 비만 쥐의 몸무게는 고지방 유도 비만 쥐의 몸무게보다 현저하게 감소되는 효과가 있고, 간 조직내 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량이 현저하게 낮아지는 효과가 있고, 유리아미노산 함량을 비교 분석한 결과 많은 아미노산 함량이 발효 후 증가된 것으로 나타났다.
또한, 종래 폐기되던 연잎에서 쿼세틴을 포함한 유효 성분을 추출하여 발효시켜 발효추출물을 제조함으로써 원재료 비용을 크게 저감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 농가 소득 증대 효과도 얻을 수 있으며, 이러한 발효 추출물을 학교 급식 등에 사용하는 육가공 식품 제조에 이용함으로써 최근 사회적 관심이 점증되는 어린이의 비만을 저감시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 의한 연잎으로 부터의 추출물을 발효방법에 대한 공정도이다.
도 2는 배양 시간에 따른 생균수 변화 그래프이다.
도 3과 4는 각각 배양시간에 따른 pH 및 산도 변화 그래프이다.
도 5는 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 6은 배양 시간에 따른 생균수 변화 그래프이다.
도 7은 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 8과 9는 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 10과 11은 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 12와 13은 배양 시간에 따른 총 페놀 함량 그래프이다.
도 14와 15는 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량 그래프이다.
도 16과 17은 배양 시간에 따른 SOD 활성 상태를 보여주는 그래프이다.
도 18은 접종 균주에 따른 아질산 소거능을 보여주는 그래프이다.
도 19는 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 20은 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 21은 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 22는 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량의 변화 그래프이다.
도 23은 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 24는 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 pH값 변화 그래프이다.
도 25는 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 26은 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화 그래프이다.
도 27은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 28은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 pH값 변화 그래프이다.
도 29는 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 30은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화 그래프이다.
도 31과 32는 각각 연잎 열수추출물과 연잎 발효추출물에서의 세포 생존성을 보여주는 그래프이다.
도 33은 연잎 열수추출물과 연잎 발효추출물에서의 Oil Red O staining을 통한 지질 축척 평가를 나타내는 사진이다.
도 34는 연잎추출물로 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 지방구(Lipid droplet)의 형성과, 연잎 추출물 및 연잎발효물로 처리하였을 때 세포질 내 지방구의 형성을 보여주는 그래프이다.
도 35는 연잎 발효물에 의한 고지방 유도 비만 마우스의 몸무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 36은 연잎발효물 섭취군 고지방 유도 비만 마우스와 고지방의 먹이 섭취량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 37은 연잎 발효물의 섭취에 의한 마우스의 간 무게 및 지방 무게의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 38은 연잎 발효물의 섭취에 의한 마우스의 조직 병리학적 검사 결과 그래프이다.
도 39, 40은 각각 연잎 발효물 섭취에 의한 마우스의 간 조직내 총 콜레스테롤과 중성지방 함량에 대한 그래프이다.
도 41은 연잎 추출물 및 연잎 발효추출물의 Quercetin-rutinoside 함량 측정 결과 그래프이다.
도 42는 연잎 추출물 및 연잎 발효추출물의 헤스페리딘 함량을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 배양 시간에 따른 생균수 변화 그래프이다.
도 3과 4는 각각 배양시간에 따른 pH 및 산도 변화 그래프이다.
도 5는 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 6은 배양 시간에 따른 생균수 변화 그래프이다.
도 7은 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 8과 9는 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 10과 11은 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 12와 13은 배양 시간에 따른 총 페놀 함량 그래프이다.
도 14와 15는 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량 그래프이다.
도 16과 17은 배양 시간에 따른 SOD 활성 상태를 보여주는 그래프이다.
도 18은 접종 균주에 따른 아질산 소거능을 보여주는 그래프이다.
도 19는 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 20은 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 pH 변화 그래프이다.
도 21은 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 22는 연잎추출물 복합균주의 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량의 변화 그래프이다.
도 23은 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 24는 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 pH값 변화 그래프이다.
도 25는 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 26은 연잎추출물 복합균주의 고과당 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화 그래프이다.
도 27은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 O.D값 변화 그래프이다.
도 28은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 pH값 변화 그래프이다.
도 29는 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화 그래프이다.
도 30은 연잎추출물 복합균주의 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화 그래프이다.
도 31과 32는 각각 연잎 열수추출물과 연잎 발효추출물에서의 세포 생존성을 보여주는 그래프이다.
도 33은 연잎 열수추출물과 연잎 발효추출물에서의 Oil Red O staining을 통한 지질 축척 평가를 나타내는 사진이다.
도 34는 연잎추출물로 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 지방구(Lipid droplet)의 형성과, 연잎 추출물 및 연잎발효물로 처리하였을 때 세포질 내 지방구의 형성을 보여주는 그래프이다.
도 35는 연잎 발효물에 의한 고지방 유도 비만 마우스의 몸무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 36은 연잎발효물 섭취군 고지방 유도 비만 마우스와 고지방의 먹이 섭취량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 37은 연잎 발효물의 섭취에 의한 마우스의 간 무게 및 지방 무게의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 38은 연잎 발효물의 섭취에 의한 마우스의 조직 병리학적 검사 결과 그래프이다.
도 39, 40은 각각 연잎 발효물 섭취에 의한 마우스의 간 조직내 총 콜레스테롤과 중성지방 함량에 대한 그래프이다.
도 41은 연잎 추출물 및 연잎 발효추출물의 Quercetin-rutinoside 함량 측정 결과 그래프이다.
도 42는 연잎 추출물 및 연잎 발효추출물의 헤스페리딘 함량을 측정한 결과 그래프이다.
이하에서는 본 발명의 실시예들에 대한 설명으로 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 의한 연잎 추출물 발효방법은 도 1의 공정도에 도시된 바와 같이, 원료로서의 연잎을 선별하고 이물질을 제거하도록 세척하고 건조하는 단계(S1), 상기 건조된 연잎을 추출기에서 용매에서 유효성분을 추출하는 단계(S2), 상기 단계(S2)에서 추출된 연잎 추출물에 유산균 발효 균주를 투입하여 발효시키는 단계(S3), 상기 단계(S3)에서 발효된 연잎 추출물 발효액을 살균하는 단계(S4) 및 살균이 완료된 발효액을 여과기로 여과하는 단계(S5)를 포함한다.
상기 단계(S2)에서 용매로서 정제수나 무수에탄올(EtOH)을 사용하며, 75~85℃의 온도에서 1~5시간 동안 열수추출하며, 바람직하기로는 80℃에서 3시간 추출한다. 또한, 용매로서 무수에탄올을 사용하는 경우에는 30%, 50%, 70% 및 100%의 무수에탄올 농도를 사용하며, 바람직하기로는 50~70%의 농도의 것을 사용한다.
상기 단계(S3)에서 발효에 사용되는 유산균 발효 균주는 락토바실러스속의 균주를 사용한다. 예를들어, 단일 균주 발효시에 6종의 균주(Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bacilus subtilis , Yeast, Kazachstania unispora)를 사용하거나, 복합균주 사용시에 Lactobacillus brevis와 Lactobacillus plantarum를 MRS broth 배지에서 전배양하여 활성을 갖게 한 후 사용할 수도 있다. 이들 균주들은 동결상태의 균주들을 각각 MRS broth 배지, LB 배지에서 전배양 과정을 통해 활성도를 갖게 한 후 사용한다.
실시예:
단계(S1)에서 세척 및 건조된 연잎 2kg을 칭량한 후, 단계(S2)의 추출단계에서, 15배의 증류수를 첨가하여 80℃에서 3시간 동안 방치하여 연잎 추출물을 얻었다.
연잎 추출물 발효 단계(S3)는 상기 단계(S2)의 연잎 추출물을 배양액으로 하여 락토바실러스속에서 선택된 상기한 6종의 균주중 적어도 어느 한 균주를 배양하여 연잎 추출물을 발효시키는 것으로 아래와 같이 수행된다.
먼저, 본 발명에 의한 연잎 추출물 발효에 대한 대조군으로서 상업용 배지를 이용하여 미생물 배양을 아래와 같이 수행하였다.
재료 및 실험방법
(1) 상업용 배지를 이용한 미생물 배양
(가) 단일 균주 배양
유산균 배양
MRS broth 배지에 (재)인천경제산업정보테크노파크 바이오센터에서 보유한 유산균 균주(Lactobacillus brevis , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus sakei)를 계대배양 한 후 37℃, 120 rpm의 조건에서 10시간 배양하였다.
고초균 배양
Luria-Bertani (LB) broth 배지에 (재)인천경제산업정보테크노파크 바이오센터에서 보유한 Bacillus subtilis를 계대배양한 후 37℃, 120 rpm의 조건에서 10 시간 배양하였다.
(나) 복합 균주 배양
MRS broth 배지에 Lactobacillus sp . 3 종을 MRS broth 배지에 계대배양 한 후 표 1과 같이 Lactobacillus. sp 2 종을 혼합하여 37℃, 120 rpm의 조건에서 11 시간 배양하였다. 균의 생장을 확인하기 위하여 1 시간 간격으로 배양액을 채취하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 본 발명에 의한 연잎추출물을 이용한 미생물 배양(발효)
(가) 단일 균주 배양
(재)인천경제테크노파크 바이오센터로부터 제공받은 6종의 균(Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bacilus subtilis , Yeast, Kazachstania unispora)을 본 발명에 의해 상기 단계(S 2)에서 얻은 연잎 추출물에서 배양에 사용하였다. 동결상태의 균주들은 각각 MRS broth 배지, LB 배지에서 전배양 과정을 통해 활성도를 갖게 한 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 연잎추출물은 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시켜 준비하였다. 냉각된 연잎추출물에 전배양 단계를 거친 6종의 균주를 각 2%씩 연잎추출물에 접종한 후 37℃, 200 rpm에서 48 시간동안 발효시켰다.
(나) 복합 균주 배양
동결상태의 Lactobacillus brevis와 Lactobacillus plantarum를 MRS broth 배지에서 전배양하여 활성을 갖게 한 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 연잎추출물은 동부생약영농조합법인으로부터 제공받아 사용하였으며, 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시켜 준비하였다. 연잎 발효추출물은 준비된 연잎추출물에 활성화된 Lac. brevis 1%를 우선 접종한 후 배양 5시간 후 Lac. plantarum 1%를 후 접종한 단계 배양법과 Lac. brevis와 Lac. plantarum 1%를 동시에 접종 시킨 동시 배양법을 적용하였으며, 각 배양액은 37℃, 120 rpm에서 24 시간 발효한 연잎 발효추출물을 실험에 사용하였다.
(다) 탄소원 함량 선정
연잎추출물에 과당을 질량 대비 0%, 0.5%, 1.0%, 3.0%, 5.0% 첨가한 후 121℃에서 15 분간 멸균한 후 냉각시켜 실험에 사용하였다. 냉각된 연잎추출물에 전배양 과정을 거친 Lac. brevis와 Lac. plantarum을 각 1%씩 동시 접종시킨 후 120rpm, 37℃의 조건 하에서 24 시간동안 발효시킨 연잎 발효추출액을 실험에 사용하였다.
(라) 질소원 함량 선정
연잎추출물에 고과당을 연잎 추출액 무게 대비 0.5%를 첨가한 후 효모추출액(BactoTM Yeast Extract: Becton, Dickinson and Company)을 무게 대비 0%, 0.1%, 0.3%, 0.5% 첨가한 후 121℃에서 15 분간 멸균한 후 냉각시켜 준비하였다. 준비된 연잎추출물에 활성도를 가진 Lac. brevis 1%와 Lac. plantarum 1%를 동시에 접종시킨 후 37℃, 120 rpm에서 24시간 발효시킨 연잎 발효추출물을 실험에 사용하였다.
상기와 같이 발효시켜 얻은 발효추출물을 이화학적 분석을 통해 생균수 측정, pH 및 산도 측정, 항산화 지표로서 총 페놀 함량 측정 및 총 플라보노이드 함량을 아래와 같이 측정하였다.
(가) 생균수 측정
Lac . brevis , Lac . plantarum와 Lac . sakei의 생균수는 배양 중인 균 배양액 일정량을 채취하여 생리식염수(0.9% NaCl)에 십진 희석하여 MRS agar에 도말한 후 37℃에서 24 시간 배양한 후 균수를 계측하였다. 고초균 생균수는 채취한 고초균 배양액을 생리식염수에 희석하여 nutrient agar에 도말한 후 37℃에서 48 시간 배양한 후 균수를 계측하였다. 균수는 30~300 개가 나타나는 평판을 선택하여 산출하였다.
(나) pH 및 산도 측정
pH는 배양 중인 균 배양액을 일정량 취하여 pH meter (Orion™ Star A214-5, Thermo Fisher Scientific Ltd., Ma, USA)로 측정하였다. 균 배양액의 산도는 배양액 20 mL를 0.1 N NaOH를 가하여 최종 pH 8.4가 될 때까지 적정하였다. 적정에 사용된 0.1 N NaOH의 소비량(mL)를 다음의 계산식을 활용하여 젖산으로 환산하였다.
(다) 시료 전처리
연잎 발효추출물을 12,000 rpm, 4℃의 조건하에서 20분간 원심분리 하였으며, 원심분리 상등액을 0.45 um 주사 필터(syringe filter)로 여과한 후 여과액을 분석 시료로 사용하였다.
(라) 총 페놀 함량 측정
연잎 발효추출물을 증류수로 20배 희석하여 분석시료로 사용하였다. 각 시료 0.5 mL에 2% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA) 0.5 mL 및 10% 소듐카보네이트(Sodium carbonate)(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA) 0.5 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1 시간 동안 방치시켰다. 반응이 끝난 시료는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량곡선은 갈릭산(Gallic acid)(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA)를 0~50 ug/mL 농도로 희석하여 위와 동일한 방법으로 반응 후 흡광도를 측정하여 작성하였다.
(마) 총 플라보노이드 함량 측정
연잎 발효추출물을 증류수로 8배 희석하여 분석시료로 사용하였다. 각 시료 100 uL에 95% 에틸알콜 300 uL, 1 M 포타슘아세테이트(Potassium acetate)(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA) 20uL, 10% 알루미늄 클로라이드 헥사하이드레이트(Aluminum chloride hexahydrate)(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA) 200 uL, 증류수 560 uL를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 30 분간 방치시켰다. 반응이 끝난 시료는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량곡선은 쿼세틴(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA)을 0~150 ug/mL 농도로 희석하여 위와 동일한 방법으로 반응 후 흡광도를 측정하여 작성하였다.
(바) Superoxide dismutase(SOD) 활성 측정
연잎 발효추출물의 SOD 활성 측정은 SOD assay Kit(Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, Mo, USA)를 이용하여 측정하였다. 시료 20 uL에 WST 워킹 솔루션(working solution) 200 uL를 첨가한 후 피펫을 이용하여 혼합한 용액에 엔자임 워킹 솔루션(Enzyme working solution) 20 uL를 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 20 분간 반응시켰다. Blank 1은 시료 대신 증류수를 이용하였으며, Blank 2는 시료 반응 시 엔자임 워킹 솔루션 대신 희석 완충제를 첨가하였으며 Blank 3은 시료와 엔자임 워킹 솔루션 대신 증류수와 희석 완충제를 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 시료와 Blank 1~3은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래의 식을 이용하여 SOD 활성도(inhibition rate %)를 계산하였다.
실험 결과
(1) 상업용 배지 단일균주 배양
(가) 배양 시간에 따른 생균수 변화
미생물 4종(Bacillus subtilis , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus sakei, Lactobacillus brevis)을 상업용 배지에 각 2%씩 접종하여 배양 시간에 따른 생균수를 측정한 결과, Lac . plantatum의 접종 후 2 시간 뒤의 생균수가 23±7x10-6 CPU으로 Lac . brevis(360±146x10-6 CPU)보다 적었지만 접종 10시간 후 Lac. plantarum의 생균수는 2,085±412x10-6 CPU로 Lac. brevis(1,926±198x10-6 CPU)보다 많아졌다. Lac. brevis의 경우 배양 초기에 생균수가 급격하게 증가하는 경향을 보이는 반면 B. subtilis는 배양 2시간에서 4시간 후 생균수 증가량이 3x10-6 CPU로 초기에는 균이 잘 자라지 않다가 배양 10시간에 생균수가 845±172x10-6 CUP로 4시간째보다 약 120배가량 증가하였다. Lac . sakei의 경우 접종 2시간 후 생균수가 23±7x10-6 CPU로 Lac . plantarum과 비슷한 수의 생균수가 관찰되었으나 접종 10시간 후 생균수는 910±175x10-6 CPU로 Lac . plantarum보다는 절반가량 적은 생균수가 관찰되었다.(도 2 그래프 참조)
(나) 배양시간에 따른 pH 및 산도 변화
상업용 배지에 4종의 균을 각 2%씩 접종하여 배양시간에 따른 pH와 산도의 변화를 관찰하였다. B. subtilis의 접종 직후 pH는 7.12로 배양 4시간까지 시간이 지남에 따라 pH가 감소하는 경향을 보이다 배양 4시간 후 pH가 6.31로 최저점을 기록한 후 다시 배양 시간이 지남에 따라 pH가 증가하는 경향을 보여 배양 10시간 후 pH가 7.22로 배양 전보다 높은 pH값을 보였다. B. subtilis의 산도 측정 결과를 살펴보면 접종 직후 산도는 0.09였고 배양 2시간 후 0.12, 배양 4시간 후 0.17로 산도가 점차 증가하다가 배양 10시간 후 산도는 0.08로 접종 직후와 유사한 값을 보였다. 이러한 산도의 변화는 앞서 살펴본 pH 변화와 정반대되는 경향을 보였다. Lac. plantarum와 Lac. sakei의 경우 접종 직후 pH가 각각 5.8, 5.91이었고 시간이 지남에 따라 pH가 낮아져 배양 10시간 후 pH는 각각 3.86, 3.87로 배양 전 보다 pH가 약 2정도 낮아졌다. Lac. brevis의 배양 직후 pH는 5.49로 다른 Lactobacilli들보다 0.3정도 낮은 pH값을 보였지만 배양 10시간 후 pH는 3.93으로 다른 균들과 비슷한 pH값을 보였다. Lactobacillus균종의 산도 측정 결과를 보면 3종 모두 접종 직후 0.5 전후의 산도 값이 나타났으며 배양 2시간 후 Lac. plantarum과 Lac. brevis의 산도 값은 0.9정도인 반면 Lac. sakei의 산도는 0.45로 다른 균보다 낮은 값을 보였다. 배양 4시간 후 Lac. plantarum의 산도는 1.23으로 다른 균에 비해 높은 산도 값을 보였으며, 다른 2종의 Lactobacilli의 산도는 1.0정도로 나타났다. 배양 10시간 후 산도 값은 Lac. plantarum이 1.93으로 가장 높았고, Lac. sakei가 1.59로 두 번째, Lac. brevis가 1.46으로 Lactobacillus 균 중 가장 낮은 값을 보였다. 초기 산도와 배양 10시간 후 산도 값의 차이가 가장 많이 나는 균은 Lac. sakei로 배양 10시간 후 산도 값이 접종 직후 값보다 약 4.7배 정도 증가하였다. Lactobacillus균은 생육 시 젖산과 초산을 생성하는데 이로 인하여 배양액의 pH가 낮아지게 되는 것이다.(도 3, 4 그래프 참조)
(2) 상업용 배지 복합균주 배양
(가) 배양 시간에 따른 O.D값 변화
3종의 Lactobacilli(Lac . brevis , Lac . sakei , Lac . plantarum) 중 2종씩 선별하였으며, 선별된 그룹은 Lac . brevis+Lac . plantarum과 Lac . sakei+Lac . plantarum으로 2개의 그룹을 MRS broth배지에 배양하였다. 배양 방법은 2개의 균주를 동시에 접종하는 동시배양과 Lac . brevis 또는 Lac . sakei 1%를 우선 접종 한 후 산에 강한 Lac . plantarum을 배양 5시간 후에 접종하는 단계배양법을 실시하였다. 배양 2시간까지 모든 그룹에서 O.D값의 변화는 크게 나타나지 않았으며, 배양 3시간 후부터 크게 증가하기 시작하였다. Lac . sakei+Lac . plantarum 동시배양 그룹은 10.7배로 증가폭이 가장 크게 나타났으며, Lac . brevis+Lac. plantarum 동시배양 그룹과 단계배양 그룹의 배양 3시간 후 O.D 값이 0.55, 0.54로 배양 2시간 째 O.D값보다 약 4.2 배 정도 증가하였다. Lac . sakei+Lac . plantarum 단계배양 그룹은 배양 2시간 후 O.D 값 대비 2.2배 증가하여 증가폭이 가장 낮게 나타났다. 각 그룹의 O.D값의 차가 가장 큰 구간은 배양 후 3 시간~4시간 사이로 4개 그룹 평균 0.59의 값이 증가하였다. 특히 배양 3시간에 증가폭이 가장 낮았던 Lac. sakei+Lac . plantarum의 O.D 값의 증가량은 약 0.7로 가장 크게 증가하였다. 배양 5시간 후 단계 배양 그룹에 Lac . plantarum 1%를 접종한 후 배양 6시간 째 O.D값의 변화를 살펴보면 Lac . brevis+Lac . plantarum 그룹은 동시배양과 단계배양의 O.D값의 증가량이 차이가 나지 않은 반면 Lac . sakei+Lac . plantarum 단계배양 그룹의 O.D 값은 5시간 후 시료보다 0.23증가하여 같은 시간 때 동시배양 그룹보다 0.08정도 더 크게 증가하였다. 배양 10시간 후 4개 그룹의 O.D값을 살펴보면 Lac . brevis+Lac . plantarum 그룹은 동시 배양과 단계 배양의 O.D값의 차이가 나지 않는 반면 Lac . sakei+Lac . plantarum 그룹은 단계 배양한 그룹이 동시 배양 한 그룹보다 최종 O.D 값이 0.23정도 높게 나타났다.(도 5 그래프. 표 1 참조)
| O.D 600 nm (O.D0 h-O.Dsample) | |||||||||||
| 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 5 h | 6 h | 7 h | 8 h | 9 h | 10 h | 11 h | |
|
L.
brevis
+
L. plantarum |
0.01 | 0.13 | 0.54 | 1.12 | 1.44 | 1.61 | 1.74 | 1.79 | 1.83 | 1.88 | 1.89 |
|
L.
brevis
+
L. plantarum (5 h) |
0.01 | 0.13 | 0.55 | 1.12 | 1.49 | 1.64 | 1.76 | 1.80 | 1.88 | 1.92 | 1.92 |
|
L.
sakei
+
L. plantarum |
-0.07 | 0.03 | 0.32 | 0.84 | 1.21 | 1.36 | 1.59 | 1.65 | 1.74 | 1.79 | 1.81 |
|
L.
sakei
+
L. plantarum (5 h) |
0.01 | 0.13 | 0.29 | 0.99 | 1.35 | 1.58 | 1.81 | 1.89 | 1.98 | 2.01 | 2.04 |
(나) 배양 시간에 따른 생균수 변화
3종의 Lactobacilli균을 2종씩 선별하여 MRS broth 배지에서 동시배양과 단계배양을 실시한 후 배양 시간에 따른 생균수 변화를 관찰한 결과, 4그룹 모두 배양 2시간에서 배양 4시간으로 넘어갈 때 생균수의 변화가 가장 크게 나타났다. 배양 5시간 후 단계 배양 시료에 Lac. plantarum을 각 1%씩 접종 한 후 배양 7시간째에 생균수를 측정 한 결과, Lac. brevis+Lac. plantarum 그룹은 동시배양과 단계배양 시 생균수의 차이가 나타나지 않는 반면 Lac. sakei+Lac. plantarum 그룹은 단계배양 그룹이 동시 배양그룹보다 생균수 증가량이 더 크게 나타났다. 이는 앞서 살펴본 O.D값의 변화와 비슷한 추이를 보이는 결과이다. 배양 10시간 후 4개 그룹의 생균수를 측정한 결과 2개의 동시배양 그룹은 배양 7시간째의 생균수에서 크게 증가하지 않은 반면 2개의 단계배양 그룹은 배양 7시간째보다 생균수가 증가하는 경향을 나타내었다.(도 6 그래프 참조)
(다) 배양 시간에 따른 pH 변화
3종의 Lactobacili 혼합균주 4그룹의 접종 직후 pH는 pH 6.0전 후로 4그룹모두 비슷한 값을 나타내었다. 배양 1시간 후와 2시간 후 pH를 측정한 결과 Lac . brevis와 Lac . plantarum를 혼합한 2개 그룹은 시간 당 평균 0.3이상 pH가 감소하는 반면 Lac. sakei와 Lac. plantarum의 혼합균주 그룹들은 평균 0.1정도 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 배양 4시간 후 pH 측정 결과를 보면 Lac. brevis+Lac. plantarum 혼합균주 그룹의 pH 감소 폭은 배양 4시간에 평균 0.17로 이전보다 pH 감소폭이 절반으로 줄어든 반면 Lac . sakei + Lac . plantarum 동시배양 그룹의 배양 3시간? pH는 5.21로 2시간째보다 0.36 감소하였고, 4시간째 배양액의 pH는 4.86으로 이전보다 pH가 0.35 감소하였다. Lac. sakei+Lac. plantarum 단계배양 그룹의 pH감소폭은 동시배양 그룹보다 크게 나타났는데 배양 3시간째 pH감소폭은 0.41이었고 4시간째 배양액의 pH 감소폭은 0.6으로 가장 크게 나타났다. 배양 5시간 후 단계배양 그룹의 배양액에 Lac. plantarum 1%를 접종하였고 이후 배양 시간에 따라 pH 값의 변화를 살펴본 결과, Lac. brevis+Lac. plantarum 단계배양 그룹은 배양 9시간까지 매 시간 평균 0.1정도 pH가 감소하는 것으로 나타났고, Lac. sakei+Lac. plantarum 단계배양 그룹은 배양 6시간째에 0.2, 배양 7시간째에 0.16정도 감소하였으며, 배양 10시간까지 평균 0.15정도 pH가 감소하는 것으로 나타났다. 배양 11시간 후 4개 그룹의 pH값을 측정한 결과, Lac. brevis+Lac. plantarum 단계배양 그룹의 pH는 4.00으로 Lac. brevis+Lac. plantarum 동시배양 그룹(3.88)보다 0.12정도 높게 나타났고, Lac. sakei+Lac. plantarum 단계배양 그룹의 pH는 3.75로 Lac. sakei+Lac. plantarum 동시배양 그룹(3.79)와 비슷한 pH값을 나타내었다.(도 7 그래프 참조. 표 2 참조)
| pH | ||||||||||||
| 0 h | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 5 h | 6 h | 7 h | 8 h | 9 h | 10 h | 11 h | |
|
Lac
.
brevis
+
Lac . plantarum |
5.88 | 5.58 | 5.24 | 4.94 | 4.77 | 4.34 | 4.27 | 4.16 | 4.07 | 3.97 | 3.94 | 3.88 |
|
Lac
.
brevis
+
Lac . plantarum (5 h) |
6.07 | 5.75 | 5.37 | 5.10 | 4.93 | 4.49 | 4.40 | 4.30 | 4.20 | 4.07 | 4.05 | 4.00 |
|
Lac
.
sakei
+
Lac . plantarum |
5.94 | 5.75 | 5.57 | 5.21 | 4.86 | 4.36 | 4.22 | 4.10 | 4.02 | 3.88 | 3.83 | 3.79 |
|
Lac
.
sakei
+
Lac . plantarum (5 h) |
6.02 | 6.04 | 5.92 | 5.51 | 4.91 | 4.44 | 4.24 | 4.08 | 3.98 | 3.83 | 3.78 | 3.75 |
4종의 균주(Bacillus subtilis , Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Lactobacillus plantarum)를 상업용 배지에서 배양한 결과 B. subtilis의 생장속도가 다른 균들보다 느린 것을 확인하였고, Lac. plantarum의 생장속도가 빠른다는 것을 확인하였다. 이후 진행된 복합균주 실험에서는 B.subtilis를 제외한 3종의 Lactobacilli를 각 2종씩 혼합하여 동시배양과 단계배양을 진행한 결과, Lac. sakei와 Lac. plantarum를 단계배양한 그룹의 접종 직후와 배양 종료 시 측정한 결과 값의 차이가 가장 크게 나타났다. 그러나 상업용 배지의 경우 균이 자랄 수 있는 최적의 영양조건을 형성한 것이므로 위와 같이 선별된 균종이 연잎추출물 발효에 적합한지 여부는 판단 할 수 없다고 사료된다. 따라서 상업용 배지가 아닌 실제 사용예정 배지인 연잎추출물에서의 단일균주 및 복합균주 배양을 실시하였다.
(3) 연잎추출물 단일균주 배양
(가) 배양 시간에 따른 O.D값 변화
Lactobacili 3종과 B. subtilis, Yeast, Kazachstania unispora를 연잎추출물에 배양한 후 배양 시간에 따른 O.D 값의 변화량을 측정하였다. 3종의 Lactobacilli는 배양 1시간 후 O.D 값이 증가하였다가 배양 2시간 후에는 1시간 때보다 O.D값이 낮아졌다. 그 후 O.D값은 꾸준하게 증가하였으며, Lac. plantarum의 증가폭이 가장 크게 나타났다. LB배지에 배양한 B. subtilis, Yeas, K. unispora의 배양시간에 따른 O.D 값의 변화를 살펴보면 Yeast와 K. unispora의 경우 배양 6시간 후 0.168, 0.160으로 동 시간 대 Lactobacilli 3종보다 높은 상승 값을 보였으며, 배양 48시간까지 꾸준하게 증가하는 경향을 보였다. B. subtilis의 경우 배양 24시간까지 0.073 증가하여 낮은 상승률을 보였으나 배양 48시간 후 O.D 값은 0.436으로 Lactobacilli 3종과 Yeast, K. unispora 보다 높은 값을 나타내었다.(도 8 9 그래프 참조)
(나) 배양 시간에 따른 pH 변화
균 접종 직후 연잎 추출물의 pH 값을 측정한 결과 Lactobacilli를 접종한 추출액의 pH는 4.7정도였으며, B. subtilis, Yeast, K. unispora를 접종한 추출물의 pH는 5.0정도로 측정되었다. Lactobacilli의 경우 젖산을 생성하기 때문에 균 접종에 사용되는 전배양액의 pH가 B. subtilis, Yeast, K. unispora 전배양액보다 낮기 때문에 접종 직후라도 추출액의 pH가 더 낮아지게 되는 것으로 추측된다. 배양 시간에 따른 연잎 발효추출물의 pH를 측정한 결과, Lactobacilli 3종의 경우 배양 초기(1~3 시간)에는 pH의 급격한 변화가 나타나지 않았으나 배양 4시간에 pH가 접종 직후보다 0.1이상 낮아졌으며, 배양시간이 지남에 따라 pH 또한 지속적으로 감소하여 배양 24 시간에 pH가 Lac. brevis는 4.37, Lac. casei 4.26, Lac. plantarum 4.01로 배양 초기 보다 각각 8%, 10%, 15% 낮아졌으며, Lac. brevis와 Lac. casei는 배양 48 시간에 pH가 각각 3.87, 4.09로 더 낮아진 반면 Lac. plantarum은 배양 48시간에 pH가 4.04로 24 시간 배양액과 비슷한 값을 나타내었다. B. subtilis, Yeast, K. unispora의 배양시간에 따른 pH 변화를 측정한 결과, Yeast와 K. unispora 배양 6시간에 pH 값이 4.70, 4.94로 접종 직후보다 각각 6%, 3%정도 낮아졌으며, 배양 24 시간에는 4.44, 4.40으로 접종 직후보다 11%, 13%정도 낮아졌으나 배양 48시간에 pH가 상승하여 Yeast 배양액의 경우 pH가 5.24로 추출액의 pH보다 높게 나타났다. B. subtilis의 경우 배양 24 시간까지 pH의 변화가 나타나지 않다가 배양 48시간에 3.92로 급격하게 낮아졌다. 이러한 변화는 B. subtilis의 O.D 값 측정 결과와 유사하게 배양 24 시간에서 48시간으로 넘어갈 때 큰 변화가 나타난 것으로 보아 O.D값의 변화와 pH의 변화가 서로 연관성이 있을 것이라 사료된다.(도 10, 11 그래프 참조)
(다) 배양 시간에 따른 총 페놀 함량
접종 균주 및 배양시간에 따른 연잎추출물의 총 페놀 함량 변화를 측정한 결과, Lactobacilli 3종의 경우 접종 직후 총 페놀 함량은 평균 951.7로 측정되었으며, 배양시간에 따라 총 페놀 함량은 증가하는 추세였으나, 측정 값의 기복이 크게 나타나는 편이었다. 특히 Lac. plantarum의 경우 증가와 감소가 번갈아 반복되는 값을 나타냈으며, Lac. brevis와 Lac. casei는 배양 3시간째부터 유사한 측정값을 나타내었으며, 배양 48시간째에는 초기 접종 직후 측정값과 유사한 값을 나타내었다. 이로써 Lactobacilli를 이용하여 연잎추출액을 발효할 시 발효시간을 24시간을 넘기지 않는 것이 좋을 것이라 판단하였다. B. subtilis와 Yeast, K. unispora를 이용하여 연잎추출액을 발효한 결과 3종 모두 배양 6시간에는 총 페놀함량이 증가한 것으로 나타났으나, 배양 시간이 지날수록 총 페놀 함량은 감소하여 배양 24시간째에는 접종 직후 총 페놀 함량과 유사한 값을 나타내었으며, 배양 48시간째에는 이보다 더 낮은 값을 나타내었다.(도 12, 13 참조)
(라) 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량
6종의 균을 이용하여 발효한 연잎 발효추출액의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, lactobaclili를 이용하여 발효한 경우 배양 3시간까지 증가하는 경향을 나타내다가 이후 총 플라보노이드 함량이 급격하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 배양 48시간까지 지속적으로 감소하는 추세를 나타내었다. B. subtilis와 Yeast, K. unispora를 이용하여 발효한 결과 Yeast와 K. unispora는 배양 48시간까지 감소하는 경향을 나타내었으나, B. subtili의 경우 배양 24시간까지 총플라보노이드 함량이 감소하였으나 배양 48시간째에는 증가하는 결과 값을 나타내었다. 배양 48시간 째에 O.D값과 pH 함량의 변화가 나타난 것으로 보아 B. subtilis를 이용하여 연잎 추출물을 발효하는 경우 최소 발효시간이 48시간이상 되어야 하는 것으로 추측된다.(도 14, 15 그래프 참조)
(마) 배양 시간에 따른 SOD 활성
배양 균주 및 배양 시간에 따른 항산화 활성을 살펴보기 위하여 연잎 발효추출액의 SOD 활성을 측정하였다. Lactobacili를 이용하여 연잎 추출액을 발효한 결과, Lac. plantarum의 경우 배양 4시간까지는 접종 직후보다 높은 활성 값을 나타내었으나 이후 감소하는 경향을 나타내었으며, Lac. casei의 경우 배양 직후부터 SOD 활성 값이 낮아지는 경향을 보였다. 다만 Lac. brevis를 이용하여 발효한 경우 배양 24시간까지 높은 활성값을 유지하다 배양 48시간에 값이 급격하게 감소하여 나머지 2종의 Lactobacili보다 낮은 값을 보였다. B. subtilis와 Yeast, K. unispora를 이용하여 연잎 추출액을 발효한 결과 B. subtilis 6시간 발효액 만이 접종 직후 보다 높은 값을 나타내었고 이외에는 모두 기준 값보다 낮은 활성을 보였다.(도 16, 17 그래프 참조)
(바) 접종 균주에 따른 아질산 소거능
3종의 Lactobacilli를 이용하여 연잎 추출액을 발효한 연잎 발효추출액의 아질산 소거능을 측정한 결과 3종 모두 pH 1.2에서 아질산 소거 활성이 가방 높게 나타났으며 pH가 증가함에 따라 소거활성이 낮아지는 경향을 나타내었다. 균 종에 따른 아질산 소거능을 살펴보면 Lac. plantarum를 이용한 발효액의 소거능이 pH 1.2에서 약 78%로 가장 높게 나타났으며, Lac. brevis와 Lac. casei를 이용한 발효액의 경우 pH 1.2 조건하에서 42%정도로 비슷한 값을 나타내었다.(도 18 그래프 참조)
아질산은 발색제로 사용되는 아질산염에서 유래되는 것으로 발암물질로 알려져 있는 바, 본 발명에 의한 연잎 발효추출액의 아질산 소거능으로 육가공 제품에 사용시 유해 물질을 저감시키는 효과가 있다.
(4) 연잎추출물 복합균주 배양
(가) 배양 시간에 따른 O.D값 변화
단일균주 배양 결과 선정된 Lac. brevis와 Lac. plantarum를 이용한 복합균주를 단계배양(LFY-BaP)과 동시배양(LFY-BP)을 실시한 결과, LFY-BaP의 경우 접종 직후부터 배양 34시간까지 꾸준하게 증가하는 경향을 나타내었으나 배양 48시간부터는 감소하는 경향을 보였다. LFY-BP는 배양 5시간째에 접종 직후보다 0.059 감소하였으나, 이후 지속적으로 증가하는 경향을 보였으며 배양 48시간 이후에는 LFY-BaP보다 높은 O.D 값을 나타낼 것으로 추측된다.(도 19 그래프 참조)
(나) 배양 시간에 따른 pH 변화
LFY-BaP의 접종 직후 pH는 4.81로 LFY-BP(4.64)보다 높게 측정되었다. 배양 5시간 후 LFY-BaP오 LFY-BP의 pH는 접종 직후 보다 각각 15%, 16% 감소하였으며, 배양 10시간 째에는 2종류 모두 접종 직후보다 약 26% 감소된 pH 값을 나타내었다. 2종의 연잎 발효추출액은 발효 24시간까지 감소율이 높게 나타나다 배양 34시간 이후부터는 감소폭이 줄어 pH값이 거의 평행을 이루는 것으로 나타났다. pH 값의 변화에 따른 결과를 종합해보면 단계배양과 동시배양은 별 차이가 없는 것으로 나타났으며, 배양 시간은 최대 24시간까지 설정하는 것이 효율적이라고 판단된다.(도 20 그래프 참조)
(다) 배양 시간에 따른 총 페놀 함량 변화
Lac. brevis와 Lac. plantarum를 이용하여 연잎 추출액 단계배양(LFY-BaP)와 동시배양(LFY-BP)를 실시한 후 연잎 발효추출액의 총 페놀 함량을 측정한 결과, LFY-BaP의 경우 배양 5시간에는 접종 직후보다 총 페놀 함량이 증가하였으나 이후 감소하는 추세를 보였고, LFY-BP의 경우 배양 시간에 따라 총 페놀 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나 측정값들의 분포가 1,000 ugGAE/g 내외로 모두 유사하게 나타났으며 LFY-BaP와 LFY-BP를 이용하여 발효한 연잎 발효추출액 모두 발효시간에 따라 총 페놀 함량의 변화는 없는 것으로 판단된다.(도 21 그래프 참조)
(라) 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량의 변화
Lac. brevis와 Lac. plantarum을 이용하여 연잎 추출액에 단계배양(LFY-BaP)과 동시배양(LFY-BP)을 실시한 후 배양 시간에 따른 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 접종 직후 총 플라보노이드 함량은 LFY-BaP가 775 ugQE/g, LFY-BP가 841 ugQE/g으로 LFY-BP가 높게 나타났으나, 배양 5시간 후 LFY-BaP의 총 플라보노이드 함량은 9.4%(73 ugQE/g) 증가한 반면 LFY-BP는 4.4%(38 ugQE/g) 감소하였다. 그러나 배양 10시간 후부터 LFY-BaP의 총 플라보노이드 함량 또한 감소 추세로 접어들어 겨로가적으로 배양 방법(단계배양, 동시배양)에 따른 총 플라보노이드 함량의 차이는 없는 것으로 판단된다.(도 22 그래프 참조)
(5) 연잎추출물 탄소원 비율 조건 선정
(가) 고과당 첨가 농도에 따른 O.D값 변화
연잎추출물의 탄소원 비율에 따른 균의 활성을 알아보기 위하여 접종 직후와 배양 24시간 후 O.D 값을 측정하여 비교한 결과, 발효 균주 접종 직후 대조구(0.0%)와 0.5%, 1.0% 첨가구의 O.D 값은 약 2.3으로 비슷한 반면 3.0%, 5.0% 첨가구의 O.D 값은 각각 1.93과 1.87로 낮게 나타났다. 과당 첨가량이 높을수록 탁도가 높은 연잎 추출물의 비율이 낮아져 초기 O.D 값의 차이가 나타났다고 판단된다. 24시간 발효 후 대조구와 실험구의 O.D 값을 비교한 결과 대조구는 접종 직후보다 16%가량 증가한 2.6이었고 0.5% 첨가구와 1.0% 첨가구는 각각 19%, 20% 증가하여 2.7, 2.8로 측정되었다. 3.0%첨가구와 5.0% 첨가구는 각각 36%, 37% 증가하여 발효 후 O.D 값이 2.6, 2.5로 나타났다. 증가율로 보자면 3.0%와 5.0% 첨가구가 높게 나타났고 0.5% 첨가구가 가장 낮게 나타났으나 시료들의 초기 O.D 값이 차이가 났기 때문에 정확한 판단이 차후 추가 실험을 통하여 과당 첨가 농도를 결정하는 것이 옳다고 사료된다.(도 23 그래프 참조)
(나) 고과당 첨가 농도에 따른 pH값 변화
연잎추출물에 첨가된 고과당 농도에 따른 pH 변화를 관찰한 결과, 접종 직후 대조구(0.0%)와 실험구(0.5%, 1.0%, 3.0%, 5.0%)의 평균 pH는 4.70으로 고과당 첨가 농도에 따른 차이는 없는 것으로 나타난 반면 24시간 발효 후 측정한 pH는 실험구와 대조구간의 큰 차이를 나타내었다. 대조구의 24시간 발효 후 pH는 4.28로 접종 직후 보다 약 10% 감소한 반면 고과당을 첨가한 실험구는 평균 26%정도 감소한 것으로 나타났다. 그러나 고과당 농도에 따른 pH의 변화는 미비하였다.(도 24 그래프 참조)
(다) 고과당 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화
고과당 첨가량에 따른 연잎 발효추출물의 총 페놀 함량 변화를 관찰한 결과, 접종 직후 총 페놀 함량의 경우 고과당의 첨가 농도가 증가할수록 초기 총 페놀 함량이 높게 나타났다. 24시간 발효 후 총 페놀함량을 측정한 결과, 대조구(0.0%)는 총 페놀 함량이 1.5% 정도 증가하였고, 실험구(0.5%, 1.0%, 3.0%, 5.0%)는 평균 1.0% 증가하였다. 고과당 첨가 농도에 따른 변화를 살펴보면 1.0% 첨가구의 총 페놀 증가량이 2.0%로 가장 크게 나타났고, 0.5% 첨가구의 총 페놀 증가량이 0.5%로 가장 낮게 나타났다. 이외에 3.0% 첨가구와 5.0% 첨가구는 각각 0.9%, 0.6% 증가한 것으로 나타났다.(도 25 그래프 참조)
(라) 고과당 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화
연잎 추출물에 첨가된 고과당 함량에 따른 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 접종 직후 배양액의 총 플라보노이드 함량은 5.0% 첨가구가 1,046 ugQE/mL으로 가장 낮았으며 0.5% 첨가구가 1,154 ugQE/mL으로 가장 높게 나타났다. 발효 24 시간 후 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 대조구(0.0%)와 5.0% 첨가구는 평균 4.2% 증가한 반면 0.5% 첨가구, 1.0% 첨가구, 3.0% 첨가구는 각각 16.3%, 17.6%, 8.9% 감소하였다. 하지만 발효액 내 플라보노이드 함량을 살펴보았을 때 고과당 농도에 따른 함량 차이는 크게 나타나지 않는 것으로 사료된다.(도 26 그래프 참조)
고과당 첨가 농도에 따른 연잎 발효추출물의 O.D, pH, 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 종합한 결과, 연잎 추출물에 고과당 첨가 유무에 따른 결과 값의 차이는 관찰되나, 첨가량에 따른 차이는 크게 나타나지 않는 것으로 사료된다. 따라서 발효 시 Lac. brevis와 Lac. plantarum이 생육할 수 있는 최소 농도인 0.5%를 탄소원 첨가 농도로 결정하였다.
(6) 연잎추출물 질소원 비율 조건 선정
(가) 효모추출물 첨가 농도에 따른 O.D값 변화
효모추출물 첨가 농도에 따른 연잎 발효추출물의 O.D 값의 변화를 측정한 결과, 연잎 추출물에 발효 균주를 접종한 직후 O.D 값은 효모추출물 첨가량이 증가함에 따라 O.D값 또한 증가하는 것으로 나타났다. 이는 효모추출물이 연잎 추출물에 녹지 않고 부유하기 때문에 효모추출물의 비율이 높아질수록 탁도가 높아진 것으로 판단된다. 24시간 발효 후 연잎 발효추출물의 O.D 값의 증가량은 0.1% 첨가구가 20%로 가장 높았고 대조구(0.0%)가 12%, 0.3%와 0.5% 첨가구가 각각 8%, 5%로 나타났다. 그러나 탄소원 비율 선정 실험 결과와 마찬가지로 O.D 값의 증가는 0.1%가 가장 높았으나 발효 후 최종 O.D 값은 실험구 간의 차이가 두드러지게 나타나지 않았다. 따라서 O.D 값 측정 외에 추가 실험을 통하여 효모추출물의 첨가량을 선정하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.(도 27 그래프 참조)
(나) 효모추출물 첨가 농도에 따른 pH값 변화
효모추출물 첨가량에 따른 연잎 발효추출물의 pH 변화를 살펴본 결과 접종 직후 대조구(0.0%)의 pH는 4.76으로 실험구(0.1%, 0.3%, 0.5%)의 평균 pH인 4.89보다 약 0.12정도 낮게 나타났다. 효모추출물 첨가량에 따라서는 첨가량이 높아질수록 초기 pH또한 높게 나타났으며 이는 효모추출물의 첨가량이 많아질수록 배양액의 pH를 낮추는 연잎 추출액의 함량이 낮아지기 때문이라고 판단된다. 대조구와 실험구의 24시간 발효 후 pH 측정값을 살펴보면 0.1% 첨가구의 24시간 발효액의 pH가 접종 직후 보다 28.1% 감소한 3.46으로 가장 낮게 나타났으며, 0.5% 첨가구가 24.9% 감소한 3.73으로 가장 높게 나타났다. 이는 O.D 값 측정 결과와 반대되는 결과로 Lac. brevis와 .Lac. plantrum의 생육이 활발할수록 pH값이 감소한다는 것을 보여준다.(도 28 그래프 참조)
(다) 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 페놀 함량 변화
연잎추출물에 효모추출물을 첨가한 후 Lac. brevis와 Lac. plantarum을 각 1%씩 접종하여 발효시킨 연잎 발효추출물의 총 페놀 함량을 살펴본 결과, 접종 직후 효모 추출물 첨가 유무에 따른 총 페놀 함량의 차이는 나타나지 않았으며 대조구(0.0%)와 실험구(0.1%, 0.3%, 0.5%)의 평균 총 페놀 함량은 928 ugGAE/mL)로 나타났다. 24시간 발효 후 총 페놀함량을 측정한 결과 0.1% 첨가구를 제외한 대조구와 0.3% 첨가구, 0.5% 첨가구는 발효 후 총 페놀의 함량이 증가하였으나 평균 증가율이 0.2%로 매우 미비하였다.(도 29 그래프 참조)
(라) 효모추출물 첨가 농도에 따른 총 플라보노이드 함량 변화
효모추출물 첨가량에 따른 연잎 발효추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 균 접종 직후의 대조구(0.0%)와 실험구(0.1% 0.3%, 0.5%)의 총 플라보노이드 함량은 평균 1,057 ugQE/mL였으며, 0.3% 첨가구가 1,048 ugQE/mL로 가장 낮게 측정되었고 0.1% 첨가구가 1,064 ugQE/mL로 가장 높게 나타났다. 대조구와 실험구를 24시간 발효시킨 후 총 플라보노이드 함량 변화를 살펴본 결과 대조구와 실험구 모두 발효 후 총 플라보노이드 함량이 감소하였으며 0.5% 첨가구의 감소량이 11.0%로 가장 크게 나타났으며 대조구가 8.1%로 가장 낮은 감소량을 보였다.(도 30 그래프 참조)
효모추출물 첨가 농도에 따른 연잎 발효추출물의 O.D, pH, 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 종합한 결과, 효모추출물 첨가 유무에 따른 차이는 나타나나 효모추출물의 첨가량에 따른 차이는 나타나지 않는 것으로 판단된다. 따라서 효모추출물 0.1% 첨가구가 대조구에 비하여 O.D 값의 증가와 pH 감소가 뚜렷하게 나타나고, 다른 첨가구들과 차이가 나타나지 않았으며, 경제적 상황을 고려하였을 때 접종 균주인 Lac. brevis와 Lac. plantarum 배양액 내 질소원 함량을 0.1%로 설정하는 것이 적절하다고 사료된다.
이하에서는 본 발명에 의한 연잎 추출액과 발효 추출액에 대한 세포 독성 여부를 마우스 세포에 대하여 아래와 같이 측정하였다.
(1) 세포 독성 여부 측정
마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 대한 연잎 열수추출물 및 발효물의 세포독성 여부를 위하여 MTT assay를 시행하였다. 96 well plate(Corning, NY, USA)에 1 x 105 cells/well의 농도로 세포를 DMEM 배양액에 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, 각 농도별 (400, 300, 200, 100, 50, 0 μg/ml)로 처리하였고, 24시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후 E2-Cytox Cell viability assay kit(ITSBIO, Seoul, Korea)를 사용하여 DMEM 배양액에 1/10로 희석하여 처리한 후 37oC 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였고, 생성된 포마존(formazan)을 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 오차를 구하였다.
(2) Oil Red O staining을 통한 지질 축척 평가
3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 어떠한 변화가 나타났는지 Oil red O 염색 후 광학현미경을 통해 지질축척정도를 확인하였다. 지질축척정도는 마우스 지방전구세포내에 형성된 지질덩어리와 Oil red O 용액이 반응하여 나타나는 붉은색의 정도로 표현하였다.
(3) 3T3-L1 지방전구세포의 지방과립(lipid droplet) 생성에 미치는 영향
연잎 추출물 및 연잎 발효추출물의 3T3-L1 전구지방세포의 지방구(lipid droplet) 형성에 미치는 영향 정도를 실험하였다. 지방전구세포를 분화 유도 후, 지방구(lipid droplet)만 특이적으로 염색하는 오일 레드 O (Oil red O) 염색시약을 이용하여 염색 후 현미경으로 관찰하였다. 본 발명의 각 연잎 가압추출물 및 연잎발효물의 처리 농도는 50, 100 μg/ml로 실험하였다.
(4) 연잎 발효물에 의한 마우스의 몸무게 감소 측정
연잎 발효물 및 대조군 섭취
7주령의 Rat Sprague Dawley(Male)을 오리엔트바이오(주)에서 구입하여 5일간 예비사육한 후 10마리씩 무작위로 5 그룹으로 나누었다. 먼저 1그룹은 정상사료를 섭취하여 음성대조군으로 설정하였으며, 2그룹은 고지방 식이 부형제 투여군(시험대조군)으로 설정하였으며, 3그룹은 160 mg/kg의 연잎발효물을 고지방에 섞어서 섭취하였으며, 4그룹은 240 mg/kg의 연잎발효물을 고지방에 섞어서 섭취하였으며, 5그룹은 320 mg/kg의 연잎발효물을 고지방에 섞어서 섭취하였다. 섭취기간은 1일 1회, 10주동안 주었으며 시험물질은 경구투여하였다. 투여용량은 체중 kg당 10 ml의 투여 액량으로 투여하였다.
| 그룹 | 시험동물 | 질환 유발물질 | 투여 | 투여 용량(mg/kg) | 동물 수 |
| G1 | SD Rat Male |
Control diet | Negative control | - | 10 |
| G2 | High fat diet | Vehicle control | - | 10 | |
| G3 | 연잎추출물 | 160 | 10 | ||
| G4 | 240 | 10 | |||
| G5 | 320 | 10 |
고지방 유도 비만 마우스의 몸무게 변화 측정- 시험기간 중 주 1회 개체 별 체중을 측정하였다.
(5) 마우스의 먹이 섭취량 측정
사료섭취량 측정
먹이 섭취량 조사는 정상사료를 먹고 자란 마우스와 정상사료에 연잎발효물을 섭취한 마우스와 고지방을 섭취한 고지방 유도 비만 마우스 그리고 고지방에 연잎발효물을 섭취한 고지방 유도 비만 마우스를 매일 오전 10시를 기준으로 하여 먹이 섭취량을 측정하였다. 먹이 섭취량 평균은 그룹당 10마리임으로 10로 나누어 각각의 평균먹이 섭취량으로 하였다.
(6) 연잎발효물의 지방축적 억제 효과
간 무게 및 지방 무게 측정
연잎발효물의 지방축척 억제 효과를 알아보기 위하여, 10주간의 발효물의 경구투여가 끝나고, 쥐를 희생시 일부 적출한 간, 고환, 신장, Total fat 중량 측정하였다.
(7) 연잎발효물 섭취에 의한 마우스 조직 병리학적 검사
간 조직에서 조직병리학적 관찰
연잎발효물의 지방축척 억제 효과를 알아보기 위하여, 10주간의 실험이 끝나고, 쥐를 마취하여 개체 별로 간 조직을 적출하고 10% 중성 완충 포르말린용액 (10% buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매 하여 4∼5 μm의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 Hematoxylin & Eosin 염색(H&E stain)을 실시하여 조직병리학적 소견을 관찰하였다.
간 조직에서 관찰된 조직병리학적 소견은 기준에 따라 지방증(steatosis), 염증(lobular inflammation), 간세포의 풍선확장(hepatocellular ballooning), 섬유화(fibrosis)에 대하여 병리책임자가 평가하였다. 지방간 및 섬유화 관련 이상 소견을 점수화하였고 평균 값을 산정하였다.
(8) 연잎발효물의 지방축척 억제 효과
간 조직내 중성지방함량 관찰
연잎발효물의 지방축척 억제 효과를 알아보기 위하여, 10주간의 실험이 끝나고, 간 조직내의 지질 함량을 분석하여 간 조직을 적출하였다. 1 g의 간 조직을 3 ml의 생리식염수에 담고 homogenizer를 이용하여 균질화 시킨 후 3 ml CM solution(chloroform-methanol (3:1, v/v)을 첨가 후 균질화 하였다. 균질화 된 용액을 37oC shaking incubator에서 30분간 방치한 후 3000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 chloroform 층을 수거하고, 다시 3 ml CM solution을 첨가하여 균질화 하고 chloroform을 수거하는 작업을 2회 반복하였다. 최종적으로 chloroform 층은 감압건조 과정을 거쳐 효소법을 이용한 kit(TG-kit AM1575-k, total cholesterol AM202-K, Asan pharm, Seoul, Korea)을 사용하여 총 콜레스테롤 함량, 중성지방 함량을 측정하였다.
검사결과
(1-1)세포 독성 여부 측정 결과
도 31, 32에서 확인할 수 있듯이, MTT assay를 통해 200 μg/ml 이상 연잎 열수추출물에서 연잎 발효물에서 보다 3T3-L1 세포의 생존성(viability)이 유의적으로 감소하는 것으로 부터, 연잎 발효추출물이 세포 독성 저감 효과를 나타냄을 관찰할 수 있었다. 특히, 100 μg/ml 연잎 열수추출물과 발효물이 3T3-L1 세포의 생존성에 유의적인 영향을 나타내지 않음을 확인하였으며 이를 세포 처리 농도로 결정하였다.
(2-1) Oil Red O staining을 통한 지질 축척 평가
도 33에서와 같이 미분화에 비하여 분화군의 지질축척정도가 유의적으로 높았고, 분화군의 지질축척정도는 연잎 열수추출물군에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 반면, 연잎 열수추출물군에 비해 연잎발효물군이 지질축척정도는 유의적으로 낮게 나타나 연잎발효물의 처리를 통해 3T3-L1 세포내 지질축척을 억제할 수 있는 것으로 관찰되었다.
(3-1) 3T3-L1 지방전구세포의 지방과립(lipid droplet) 생성에 미치는 영향
본 연구의 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 지방구(Lipid droplet)의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되고(샘플 100% 기준), 본 연구의 연잎 열수추출물 및 연잎발효물을 50, 100 μg/ml로 처리하였을 때 지방구형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그 결과는 도 34와 같았다. 특히, 100 μg/ml 연잎발효물을 이용한 조성물에서는 17%의 감소율을 확인하여, 지방구 형성 억제효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
(4-1) 연잎 발효물에 의한 마우스의 몸무게 감소 측정(고지방 유도 비만 마우스의 몸무게 변화 측정)
시험기간 중 주 1회 개체 별 체중 측정 결과, 비만 유도 2 주차부터 고지방 다이어트(high fat diet) 식이 부형제 투여군(이하 시험대조군, G2)의 체중이 컨트롤 다이어트(control diet) 식이 음성대조군(이하 음성대조군, G1)에 비하여 통계적으로 유의하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 체중 변화는 그림 5에서 확인할 수 있는데, 비만 유도 1주차부터 연잎발효물 160 mg/kg (이하 저농도 투여군, G3), 240 mg/kg (이하 중농도 투여군, G4) 및 320 mg/kg (이하 고농도 투여군, G5) 투여 군들의 체중은 시험대조군 (G2)군에 비하여 다소 낮은 것으로 나타났다.
한편 부검 시 체중은 시험대조군 (G2)이 650.4 g, 시험물질 저농도 (G3), 중농도 (G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들은 각각 630.8 g, 623.2 g 및 611.8 g이 었으며, 고농도 투여 군에서 시험대조군 (G2)보다 약 39 g (6%)이 적은 가장 낮은 것으로 나타났다.
실험 결과 도 35와 표 4에 나타난 바와 같이, 연잎 발효물 섭취한 고지방 유도 비만마우스의 몸무게는 고지방 유도 비만 마우스의 몸무게보다 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다.
| 그룹 | 동물 입고 몸무게 (g) | 10주차 몸무게 (g) |
| G1 | 189.6 | 577.4 |
| G2 | 190.5 | 650.4 |
| G3 | 188.5 | 630.8 |
| G4 | 188.6 | 523.2 |
| G5 | 189.3 | 611.8 |
(5-1) 마우스의 먹이 섭취량 측정
실험 결과 도 36과 표 5에 나타낸 바와 같이, 연잎발효물 섭취군 고지방 유도 비만 마우스의 먹이 섭취량과 고지방 유도 비만 마우스의 먹이섭취량간의 차이가 없음을 관찰할 수 있었다.
| 그룹 | 1 wk | 2 wk | 3 wk | 4 wk | 5 wk |
| G1 | 19.5 | 22.5 | 18.3 | 18.7 | 20.3 |
| G2 | 17.2 | 21.0 | 19.6 | 20.1 | 18.9 |
| G3 | 17.4 | 20.2 | 19.7 | 17.2 | 18.5 |
| G4 | 15.8 | 19.2 | 19.4 | 16.6 | 16.9 |
| G5 | 15.4 | 17.8 | 16.5 | 18.4 | 18.0 |
| 그룹 | 6 wk | 7 wk | 8 wk | 9 wk | 10 wk |
| G1 | 20.7 | 21.1 | 20.3 | 19.0 | 19.2 |
| G2 | 18.7 | 18.7 | 17.3 | 16.8 | 17.0 |
| G3 | 18.8 | 19.5 | 17.7 | 16.8 | 15.0 |
| G4 | 18.6 | 18.4 | 17.0 | 16.1 | 13.9 |
| G5 | 17.6 | 18.0 | 17.0 | 16.9 | 15.2 |
(6-1) 연잎발효물의 지방축적 억제 효과
연잎발효물의 지방축척 억제 효과를 알아보기 위하여, 10주간의 발효물의 경구투여가 끝나고, 마우스 희생시 일부 적출한 간의 중량 측정 결과 연잎발효물 저농도(G3), 중농도 (G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들의 간 중량은 각각 19.3 g, 17.34 g 및 17.70 g 이었다. 이는 시험대조군 (G2)의 간 중량 19.46 g에 비하여 연잎발효물 중농도와 고농도 투여군에서 약 9 ∼ 10% 낮게 나타났다 (도 37, 표 7).
고환 주변 지방 중량 측정 결과 음성대조군 (G1)은 12.46 g, 시험대조군 (G2)은 20.45 g 이며, 연잎발효물 저농도 (G3), 중농도(G4) 및 고농도(G5) 투여 군들은 각각 26.28 g, 27.76 g 및 30.31 g 이었다 (도 38, 표7).
신장 주변 지방 중량 측정 결과 음성대조군 (G1)은 18.37 g, 시험대조군 (G2)은 28.21 g이며, 연잎발효물 저농도 (G3), 중농도(G4) 및 고농도(G5) 투여 군들은 각각 26.28 g 27.76 g 및 30.31 g 이었다. (도 38 표 7).
총 지방 중량 측정 비교 결과 음성대조군 (G1)의 30.83 g에 비하여 시험대조군 (G2)이 48.66 g으로 증가되었다. 연잎추출물 저농도 (G3), 중농도(G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들의 total fat 중량은 44.50 g 46.53 g 및 49.42 g 이었다. 연잎발효물 저농도 투여 군에서 가장 낮은 것으로 나타났으며 시험대조군 (G2)에 비하여 고환 주변 지방은 약 11%, 신장 주변 지방은 약 7%, 전체 지방은 약 9% 감소한 것으로 나타났다 (도 38, 표 7).
| 그룹 | 간 무게 (g) | 상대적 간 무게(%) | 고환주변지방(g) | 신장주변지방(g) | 총 지방(g) |
| G1 | 19.98 | 3.47 | 12.46 | 18.37 | 30.83 |
| G2 | 19.46 | 2.98 | 20.45 | 28.21 | 48.66 |
| G3 | 19.37 | 3.06 | 18.22 | 26.28 | 44.50 |
| G4 | 17.34 | 2.79 | 18.77 | 27.76 | 46.53 |
| G5 | 17.70 | 2.83 | 19.11 | 30.31 | 49.42 |
7) 연잎발효물 섭취에 의한 마우스 조직 병리학적 검사
간 조직에서 관찰된 조직병리학적 소견은 기준에 따라 지방증(steatosis), 염증(lobular inflammation), 간세포의 풍선확장(hepatocellular ballooning), 섬유화(fibrosis)에 대하여 병리책임자가 평가하였다. 지방간 및 섬유화 관련 이상 소견을 점수화하였고 평균 값을 산정한 결과, 음성대조군 (G1)은 0.20, 시험대조군 (G2)은 1.90, 연잎발효물 저농도 (G3), 중농도 (G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들은 각각 1.40, 1.30 및 1.20으로 환산되었다. 음성대조군 (G1)은 지방간 및 섬유화가 거의 관찰되지 않았고, 시험대조군 (G2)에서 심한 정도의 지방간 및 섬유화가 관찰되었으며 음성대조군 (G1)에 비하여 시험대조군 (G2)에서 차이를 확인할 수 있었다. 연잎발효물 투여 군들에서는 시험대조군 (G2)에 비하여 감소하는 경향성을 보였다 (도 39, 표 8).
| 그룹 | 점수 |
| G1 | 0.20 |
| G2 | 1.90 |
| G3 | 1.40 |
| G4 | 1.30 |
| G5 | 1.20 |
8) 연잎발효물의 지방축척 억제 효과
간 조직내 중성지방함량 관찰 그 결과, 도 40, 표 9에 나타난 바와 같이, 간 조직내 triglyceride (TG) 측정 결과 음성대조군 (G1)은 154.4 mg/g liver tissue, 시험대조군 (G2)은 360.9 mg/g liver tissue, 연잎발효물 저농도 (G3), 중농도 (G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들은 각각 350.7 mg/g liver tissue, 348.5 mg/g liver tissue 및 335.6 mg/g liver tissue 이었다. 시험대조군 (G2) 간 조직 내 TG 함량이 음성대조군 (G1)에 비하여 증가한 것으로 나타났다. 연잎발효물 농도별 투여 군들에서는 TG 감소에 미약하게 영향을 미치는 것으로 나타났다.
또한, 간 조직 내 Total cholesterol (T-CHO) 측정 결과 음성대조군 (G1)은 9.5 mg/g liver tissue, 시험대조군 (G2)은 19.2 mg/g liver tissue, 연잎발효물 저농도 (G3), 중농도 (G4) 및 고농도 (G5) 투여 군들은 각각 19.1 mg/g liver tissue, 18.9 mg/g liver tissue 및 19.0 mg/g liver tissue 이었다. 시험대조군 (G2) 간 조직 내 T-CHO 함량은 음성대조군 (G1)에 비하여 증가한 것을 확인할 수 있었다. 연잎발효물 농도별 투여 군들에서는 T-CHO 감소에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 40, 표9).
| 그룹 | TG (mg/g liver tissue) | TCHO (mg/g liver tissue) |
| G1 | 154.4 | 9.5 |
| G2 | 360.9 | 19.2 |
| G3 | 350.7 | 19.1 |
| G4 | 348.5 | 18.9 |
| G5 | 335.6 | 19.0 |
위 동물실험을 통해서, 본 발명에 의한 연잎 발효추출물은 세포 독성을 저감시켜 세포 생존성이 연잎 추출물에서 보다 증가되며, 연잎발효물이 세포내 지질 축적이 억제됨과 함께 간내 지방 축적이 억제되며, 지방구 형성이 억제됨과 함께 몸무게를 감소시키는 것으로 나타났고, 지방간 및 섬유화를 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났으며, 간 조직내 triglyceride (TG)를 감소시키는 효과가 있는 것으로 나타났다.
이로써, 본 발명에 따라 종래 폐기되던 연잎을 사용함으로써 매우 저렴하게 원재료를 확보할 수 있으며, 농가의 수익 증대 효과를 얻을 수 있고, 연잎으로 부터 유효 성분을 추출하여 발효시킨 발효추출액을 저비용으로 제조하여 학교 급식용 및 일반 육고기 가공에 이용할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 연잎 발효추출액을 육가공 소재로 사용하여 육가공을 처리함으로써, 유가공 제품의 섭취에도 비만의 위험을 크게 저감시키고, 항산화 성분의 함량 증가로 건강을 증진시키는데 이용할 수 있다.
실시예
연잎추출액에 고과당과 효모추출물을 질량 대비 각각 0.5%, 0.1씩 첨가한 후 121℃에서 15 분간 멸균한 후 냉각시킨 후 배양액으로 사용하였다. 발효에 사용한 균은 Lac. brevis와 Lac. plantarum으로 동결상태의 원균을 접종 1일 전 MRS broth 배지에서 전배양과정을 거쳐 활성을 갖게 한 후 사용하였으며, 냉각된 배양액에 2종의 균을 각 1%씩 동시 접종하여 120 rpm, 37℃ 조건하에서 24시간 발효시켰다. 이와 같이 발효과정을 거쳐 제조된 연잎 발효추출물은 액상 또는 분말상으로 소고기, 돼지고기, 닭고기, 오리고기 등의 육가공용 소재로 사용할 수 있다. 상기 연잎 발효추출물의 분말은 1000x10g, 4℃조건에서 20 분간 원심분리한 후 상등액만을 취하여 4 0℃이하의 냉동조건하에서 동결시킨 후 진공동결건조시켜 얻는다.
상기 연잎 발효추출물과 연잎 추출물의 성분분석은 아래와 같다.
① 일반성분 분석
연잎 추출물과 연잎 발효추출물의 일반성분 중 조단백질, 조지방, 조회분, 탄수화물 및 당류 함량을 측정한 결과를 아래 표 10에 표시하였다. 일반성분 분석 결과 연잎 발효추출물의 조단백질 및 조지방 함량은 연잎 추출물과 차이가 나타나지 않았으나, 조회분 및 탄수화물의 경우 연잎 발효추출물이 연잎 추출물보다 각각 12%, 94% 증가하였다. 당류의 경우 연잎 추출물과 연잎 발효추출물 두 시료에서 모두 검출되지 않았다.
| 시료 | 조단백질(%) | 조지방(%) | 조회분(%) | 탄수화물 (g/100 g) |
당류 (g/100 g) |
| 연잎 추출물 | 0.33 | 0.01 | 0.17 | 0.18 | 0 |
| 연잎 발효추출물 | 0.32 | 0.01 | 0.21 | 0.35 | 0 |
② 미량원소 함량 분석
연잎 추출물 발효 유무에 따른 미량원소 함량 분석을 의뢰하여 얻은 아래 표 11에 표시된 결과값을 비교한 결과, 칼슘, 칼륨, 철 및 나트륨은 연잎 발효추출액이 연잎 추출액 보다 높게 나타난 반면, 인, 비타민 B2, 비타민 B3의 경우 연잎 추출액보다 낮게 측정되었다. 이는 발효액 제조시 첨가되는 부재료(과당, 효모추출물)로 인하여 일부 항목의 함량이 증가된 것으로 판단된다.
| 성 분 | 단위 | 연잎 열수추출물 | 연잎 발효추출물 |
| 인 | mg/100 g | 8.79 | 8.32 |
| 비타민 A | ug RE/100 g | 불검출 | 불검출 |
| 비타민 B1 | mg/100 g | 불검출 | 불검출 |
| 비타민 B2 | mg/100 g | 0.008 | 0.004 |
| 비타민 B3(나이아신) | mg/100 g | 0.163 | 0.104 |
| 비타민 C | mg/100 g | 불검출 | 불검출 |
| 칼슘 | mg/100 g | 2.77 | 3.10 |
| 칼륨 | mg/100 g | 80.85 | 87.57 |
| 철 | mg/100 g | 0.10 | 0.14 |
| 나트륨 | mg/100 g | 불검출 | 4.05 |
③ 항산화 관련 성분 함량 분석
연잎 추출물과 발효추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 비교한 결과 연잎 발효추출물의 연잎 추출물보다 총 페놀과 총 플라보노이드 함량 모두 감소한 것으로 나타났다. 이는 발효 과정 중 미생물 생육에 소모되는 것과 발효 후 살균과정을 통하여 열에 약한 일부 항산화 성분들이 파괴된 것으로 판단된다.
| 성 분 | 단위 | 연잎 열수추출물 | 연잎 발효추출물 |
| 총 페놀 | mgGE/100 g | 116.81 | 98.77 |
| 총 플라보노이드 | mg/100 g | 34.08 | 30.54 |
④ 유리아미노산 함량 분석
연잎 추출물과 연잎 발효추출물의 유리아미노산 함량을 비교 분석한 결과, 아래 표 13과 같이 serine, methionine, tyrosine, arginine을 제외한 12가지 아미노산 함량은 발효 후 증가된 것으로 나타났으며, 특히 glutamic acid의 경우 연잎 발효추출물에 들어있는 함량은 19.369 ug/mL로 연잎 추출물(6.399 ug/mL)보다 약 3배 증가한 것으로 나타났다. 이는 연잎 추출물 발효 시 추가로 첨가되는 효모추출물이 미생물에 의하여 분해되면서 생성된 것으로 추측된다.
| 유리아미노산 | 연잎 추출물 (ug/mL) | 연잎 발효추출물 (ug/mL) |
| P-Ser | 6.523 | 0.912 |
| Tau | ND | ND |
| Asp | 11.036 | 19.820 |
| Thr | 20.933 | 21.753 |
| Ser | 20.529 | 22.754 |
| Glu | 6.399 | 19.369 |
| Gly | 2.280 | 11.006 |
| Ala | 15.151 | 29.281 |
| Val | 24.547 | 35.585 |
| Met | 2.450 | 2.190 |
| Ile | 9.170 | 17.319 |
| Leu | 9.350 | 26.628 |
| Tyr | 3.678 | 1.937 |
| Phe | 12.400 | 12.400 |
| Trp | 7.157 | 9.177 |
| Lys | 15.426 | 22.107 |
| His | 5.410 | 6.632 |
| Arg | 3.035 | ND |
| Pro | 10.871 | 19.682 |
| Total | 186.345 | 278.552 |
⑤ Quercetin-rutinoside 함량 분석
연잎 발효추출물의 quercetin-rutinoside는 quercetin의 배당체로서 본 발명의 연잎 발효추출물의 대표 지표물질로 선정하여 분석을 도 41과 같이 수행하였으며, 함량을 측정한 결과, 표 14와 같이 24시간 발효액의 quercetin-rutinoside 함량은 106 mAU*s로 연잎 추출물(39.76 mAU*s)보다 약 167% 증가되었다.
| Sample | Area(mAU*s) |
| 연잎 추출물 | 39.76 |
| 연잎 발효추출물 | 106 |
⑥ 헤스페리딘 성분 함량 분석
연잎 발효추출물의 헤스페리딘 함량을 도 42와 같이 측정한 결과, 24시간 발효액의 헤스페리딘 함량이 표 15와 같이 2.697 ug/mL로 연잎 추출물(1.518 ug/mL)보다 약 77% 증가되었다.
| 농도 (ug/mL) | |
| 연잎 추출물 | 1.518 |
| 연잎 발효추출물 | 2.697 |
⑦ 유기산 함량 분석
연잎 추출물과 연잎 발효추출물의 유기산 함량을 비교한 결과, 표 16과 같이 젖산의 경우 연잎 추출물에서 불검출된 반면 연잎 발효추출물에서 4.73%로 측정되었다. 이는 발효에 이용되는 유산균이 생육함에 따라 젖산을 생성하기 때문이다. 그러나 젖산 이외에 말레산, 옥살산의 경우 발효과정을 거치면서 함량이 줄어든 것을 확인할 수 있다. 또한 구연산의 경우 연잎 발효추출물에서 더 낮은 값을 보이는데, 이는 구연산의 단위 값이 %인 관계로 구연산이 증가하였어도 젖산의 함량이 늘어남에 따라 구연산이 차지하는 비율이 감소되어 나타날 수 있다.
| 젖산(%) | 호박산 | 말레산 (mg/kg) |
옥살산 (mg/kg) |
구연산(%) | |
| 연잎 추출물 | 불검출 | 불검출 | 57.36 | 241.36 | 0.55 |
| 연잎 발효추출물 | 4.73 | 불검출 | 48.56 | 58.57 | 0.49 |
본 발명에 의한 연잎 발효추출물을 육가공 제조에 이용하는 예로서, 훈제오리 제조공정 중 염지과정의 염지액에 연잎 발효추출물을 일정 비율 첨가하는 방식으로 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 시제품을 생산하여 시제품 관능평가와 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리의 성분 분석을 하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 시제품 관능평가
(주)신성푸드에 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리의 시제품 생산을 의뢰하여 공급받은 훈제오리 시제품의 관능평가를 진행하였다. 관능평가는 소비자가 식품을 섭취할 때 중점적으로 보는 외형, 색깔, 향미, 맛, 식감, 종합선호도를 평가항목으로 하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 시제품 1차 평가는 연잎 발효추출물의 첨가 농도는 0.0 ~ 5.0%까지 1.0%간격으로 총 6가지 시료로 시행되었다. 표 17에서와 같이, 연잎 발효 추출물 첨가 훈제오리의 경우 대조구(0.0%, 기존훈제오리)보다 향, 맛, 식감 선호도가 두드러지게 높게 나타났다. 하지만 연잎 발효추출물 첨가 농도에 따른 훈제오리의 향과 맛에 대한 평가는 첨가 농도가 높아질수록 낮아지는 결과가 나타났으며, 평가 의견으로는 첨가량이 증가할수록 시큼한 향과 신맛이 느껴진다는 의견을 보였다. 이는 연잎 발효추출물이 가지고 있는 시큼한 향과 신맛이 훈제오리의 품질에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 1차 시제품 평가를 바탕으로 연잎 발효추출물의 첨가 농도를 0.0 ~ 3.0%로 축소하여 2차 시제품 평가를 진행하였다. 2차 시제품 평가 결과 선호도가 높은 시료는 0.5 ~ 1.5% 첨가구로 2.0%와 3.0% 첨가구의 경우 다른 시료들에 비하여 낮은 선호도를 보였다. 3차 시제품은 2차 시제품 평가 결과 선호도가 높게 나타난 0.5 ~ 1.5% 첨가 범위를 구체화하여 실시하였으며, 대조구와 실험구의 차이를 세분화 하기 위하여 0.2% 첨가구를 추가하여 진행하였다. 3차 시제품 평가 결과 맛에 대한 선호도는 0.5%와 1.0%첨가구가 가장 높게 나타났으며, 식감은 1.0% 첨가구가 향에 대한 선호도는 0.2% 첨가구가 가장 높게 나타났다. 향에 대한 선호도 평가 의견을 살펴보면 연잎 발효추출물 첨가구에 대하여‘오리고기의 향과 연잎 발효추출물의 향이 조화롭다.’는 의견이 많았으며, 식감에 대한 의견으로는 연잎 발효추출물 첨가량이 높을수록 고기가 부드럽게 느껴진다는 의견이 나왔으나, 높은 농도를 첨가하였을 때 훈제오리의 살코기부분이 부드러운 반면 껍질 부분을 질긴 느낌을 받았다는 의견이 있었다. 4차 시제품 평가는 가장 높은 선호도를 보인 1.0%를 기준으로 연잎 발효추출물 첨가 농도를 세분화하기 위하여 1.2% 첨가구를 추가하여 평가를 실시하였으며 5차 시제품 평가는 4차 평가에 대한 반복 실험으로 4차 시제품 조건과 동일한 농도 조건으로 진행하였다. 4차 시제품 평가 결과 선호도가 가장 높게 나타난 농도는 1.0% 첨가구로 향을 제외한 외형, 색깔, 맛, 식감 항목에서 평가 점수가 가장 높게 나타났으며, 향의 경우 0.5% 첨가구가 가장 높은 점수를 받았다. 5차 시제품 반복 평가 결과, 색과 향에 대한 평가가 4차 평가와 다른 결과를 보였으나, 전반적인 선호도는 4차 결과와 마찬가지로 1.0% 첨가구가 가장 높게 나타났다. 1.0% 첨가구에 대한 평가의견을 살펴보면 ‘훈제오리의 살코기 부분은 부드럽고 껍질부분은 쫄깃하다.’ ‘연잎 향이 은은하게 난다.’ ‘고급 훈제오리 맛이다.’라는 의견이 나왔다.
훈제오리 및 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리의 성분 분석
시제품의 관능평가 결과 선정된 연잎 발효추출물 첨가 조건으로 (주)신성푸드에 일반 훈제오리와 함께 생산을 의뢰한 후 전달받은 시제품을 냉장포장된 상태 그대로 수원여자대학교 식품분석센터에 분석을 의뢰하였다. 분석 의뢰한 항목은 일반성분, 미량원소, 항산화 및 아질산염이며, 분석 방법은 식품 공전에 표기되어 있는 일반시험법을 준수하여 측정되었다.
① 일반성분 분석
일반훈제오리와 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리의 일반성분을 비교하여 아래 표 18과 같은 결과를 얻었다. 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리의 100 g당 열량은 267.57 kcal로 일반 훈제오리(306.40 kcal)의 87%로 낮게 나타났으며, 열량영양소인 탄수화물의 함량이 60%정도 감소하였고, 단백질이 약 7% 감소하였으며, 지방 또한 약 8% 감소된 수치를 나타내었다. 특히 콜레스테롤의 경우 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리가 일반훈제오리보다 약 22.4% 감소되어41.17 mg/100 g으로 나타났으며, 이는 고지방식이 섭취 시 체중 증가 억제에 효능이 있다고 나타난 연잎 발효추출물을 첨가하였기 때문이라고 사료된다.
| 성 분 | 단위 | 일반훈제오리 | 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 |
| 열량 | kcal/100 g | 306.40 | 267.57 |
| 탄수화물 | g/100 g | 8.23 | 3.37 |
| 당류 | g/100 g | 0 | 0.90 |
| 단백질 | g/100 g | 17.61 | 16.61 |
| 지방 | g/100 g | 22.56 | 20.85 |
| 포화지방 | g/100 g | 6.09 | 6.07 |
| 트랜스지방 | g/100 g | 0.13 | 0.11 |
| 콜레스테롤 | mg/100 g | 53.02 | 41.17 |
| 회분 | % | 1.37 | 2.95 |
| 수분 | % | 50.23 | 56.22 |
② 미량원소 함량 분석
연잎 발효추출물 첨가 유무에 따른 미량원소의 차이를 알아보았다. 표 19에 표시된 바와 같이, 연잎 발효추출물 미량원소 함량 분석에서 연잎 추출물 보다 높게 나타났던 칼륨 함량이 시제품 적용 시에도 유사하게 나타난 반면, 칼슘의 경우 오히려 시제품에 적용하였을 경우 감소된 것으로 나타났다. 또한, 연잎 발효추출물에서 감소된 것으로 나타났었던 인 함량은 시제품 적용 시 일반 훈제오리보다 2.28배 증가하였다. 나트륨의 경우 일반 훈제오리보다 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리에서 2.6배 높게 나타났는데, 이는 시제품 생산 시 기타 부재료의 침지액 배합시 오차가 난 것으로 사료된다.
| 성 분 | 단위 | 일반훈제오리 | 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 |
| 인 | mg/100 g | 209.78 | 479.76 |
| 비타민 A | ug RE/100 g | 30.36 | 7.74 |
| 비타민 B1 | mg/100 g | 0.066 | 0.079 |
| 비타민 B2 | mg/100 g | 0.073 | 0.033 |
| 비타민 B3(나이아신) | mg/100 g | 0.105 | 0.083 |
| 비타민 C | mg/100 g | 33.55 | 불검출 |
| 칼슘 | mg/100 g | 13.08 | 9.94 |
| 칼륨 | mg/100 g | 123.23 | 135.40 |
| 철 | mg/100 g | 1.69 | 1.77 |
| 나트륨 | mg/100 g | 340.80 | 883.29 |
③ 항산화 관련 성분 함량 분석
연잎 발효추출물 첨가 훈제오리와 일반 훈제오리의 항산화 성분 비교 결과 표 20과 같이, 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리가 일반 훈제오리보다 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량이 낮게 나타났다. 그러나 측정된 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량이 미량으로 첨가 유무에 따른 항산화 성분 함량 비교의 정확도가 낮은 것으로 판단된다.
| 성 분 | 단위 | 일반훈제오리 | 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 |
| 총 페놀 | mgGE/100 g | 72.45 | 56.82 |
| 총 플라보노이드 | mg/100 g | 4.42 | 불검출 |
④ 아질산이온 함량 분석
연잎 발효 추출물 첨가 훈제오리와 일반 훈제오리의 아질산이온 함량을 비교한 결과 표 21과 같이, 일반 훈제오리에서 아질산이온은 0.00 g/kg인 반면 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리에서는 0.14 g/kg이 검출되었다. 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리에서 아질산 이온이 높게 검출된 것은 앞서 미량원소 분석 결과에서도 언급했듯이 침지액 배합 시 첨가물 함량이 다르게 들어갔을 것이라 사료된다.
| 성 분 | 단위 | 일반훈제오리 | 연잎 발효추출물 첨가 훈제오리 |
| 아질산이온 | g/kg | 0.00 | 0.14 |
본 발명에 따른 연잎 발효추출물을 훈제 오리에 첨가함으로써, 항비만, 합성착색료 저감 할 수 있는 효과가 있는 점에서 다른 육가공에도 동일한 효과를 기대할 수 있고, 이러한 육가공 제품 생산시 본 발명에 따른 연잎 발효추출물을 유용성분 함유 수용성 액상소재 및 지용성 분말 소재 및 그 외 식품소재로 이용하여 항비만 건강식품 소재로서의 가공 식품 개발에 활용할 수 있고, 종래 폐기하던 연잎을 고부가가치를 창출하도록 이용함으로써 농가 소득 증대 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 연잎 유래 항비만 활성물질인 쿼세틴(quercetin)을 포함하는 유효성분의 추출물을 수용성 액상소재 및 지용성 분말소재로 최적화하기 위한 연잎 추출물 발효방법은 육가공시 육고기를 침지시키는 육가공 소재에 이용될 수 있으며, 또한, 그 발효추출물을 항비만 육가공제품에 이용할 수 있다.
Claims (12)
- 원료로서의 연잎을 선별하고 이물질을 제거하도록 세척하고 건조하는 단계(S1),
상기 건조된 연잎을 추출기에서 용매에서 유효성분을 추출하는 단계(S2),
상기 단계(S2)에서 추출된 연잎 추출물에 유산균 발효 균주를 투입하여 발효시키는 단계(S3),
상기 단계(S3)에서 발효된 연잎 추출물 발효액을 살균하는 단계(S4) 및
살균이 완료된 발효액을 여과기로 여과하는 단계(S5)를 포함하며,
상기 단계(S2)에서 용매로서 정제수와 무수에탄올(EtOH)중에서 선택된 어느 하나를 사용하여 75~85℃의 온도에서 1~5시간 동안 열수추출하며,
상기 단계(S3)에서 발효에 사용되는 유산균 발효 균주는 락토바실러스속의 균주들중에서 선택된 적어도 어느 하나의 균주를 사용하며, 연잎 추출물에서 5 시간 내지 48시간 동안 상기 유산균 발효 균주를 배양하여 연잎추출물을 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 유산균 발효균주에 의한 발효는 단일 균주 발효시에 6종의 락토바실러스속 균주(Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bacilus subtilis , Yeast, Kazachstania unispora)들중 적어도 어느 하나의 균주를 사용하여 연잎추출물을 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 유산균 발효균주에 의한 발효는 Lactobacillus brevis와 Lactobacillus plantarum를 MRS broth 배지에서 전배양하여 활성을 갖게 한 후 연잎 추출물에서 단계배양과 동시배양중에서 선택하여 배양하여 연잎추출물을 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 단계(S2)에서 용매로서 15배의 증류수를 첨가하여 75~85℃에서 3시간 동안 방치하여 연잎 추출물을 얻는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 단계(S2)에서 용매로서 30% ~ 70% 농도의 무수에탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 단계(S2)에서, 상기 연잎추출물은 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시키고, 냉각된 연잎추출물에 전배양 단계를 거친 6종의 균주를 각 2%씩 연잎추출물에 접종한 후 37℃, 200 rpm에서 48 시간동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에서,
상기 단계(S2)에서, 상기 연잎추출물은 121℃에서 15 분간 멸균 후 냉각시키고, 냉각된 연잎추출물에 전배양 단계를 거쳐 활성화된 Lac. brevis 1%를 우선 접종한 후 배양 5시간 후 Lac. plantarum 1%를 후 접종하는 단계 배양법과 Lac. brevis와 Lac. plantarum 1%를 동시에 접종시키는 동시 배양법을 적용하여 37℃, 120 rpm에서 24 시간 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항에 있어서,
연잎추출물에 과당을 질량 대비 0.5% 내지 5.0% 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 8항에 있어서,
효모추출액(BactoTM Yeast Extract: Becton, Dickinson and Company)을 무게 대비 0.1% ~ 0.5%를 첨가하는 것을 특징으로 하는 연잎 추출물 발효방법.
- 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 연잎 추출물 발효방법에 따른 연잎 발효추출물을 포함한 항비만 육가공 소재.
- 제 10항에 있어서,
상기 연잎 발효추출물을 원심분리한 후 상등액만을 취하여 냉동조건하에서 동결시킨 후 진공동결건조시켜 얻은 분말상인 것을 특징으로 하는 항비만 육가공 소재.
- 제 10항 또는 11항의 항비만 육가공 소재를 육고기의 가공시 염지과정에서 염지액에 연잎 발효추출물을 0.5 ~ 3.0%의 농도가 되게 첨가하여 제조한 항비만 육가공 제품.
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| KR1020170013236A KR20180088947A (ko) | 2017-01-30 | 2017-01-30 | 연잎 추출물 발효방법, 그에 의한 발효추출물을 이용한 항비만 육가공 소재 및 육가공제품 |
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| KR20220005148A (ko) * | 2020-07-06 | 2022-01-13 | 이지원 | 동물세포배양 고기 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101075852B1 (ko) | 2009-03-13 | 2011-10-25 | 농업회사법인 주식회사 다연 | 연잎 발효추출물의 제조방법 |
-
2017
- 2017-01-30 KR KR1020170013236A patent/KR20180088947A/ko not_active Application Discontinuation
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