KR20190072923A - 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 항산화 및 면역활성 증진기능성 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 제조방법과 상기 발효액 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료와 식품 조성물을 제공한다.

Description

식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물 및 그 제조방법{Antioxidant and Immune-enhancing functional beverage and food composition comprising the extract of edible flowers fermented by lactic acid bacteria and preparation method of the same}
본 출원은 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.
활성산소와 자유 라디칼에 따른 산화적 스트레스는 지질, 단백질, DNA, 효소 등의 변성 및 파괴를 유발하고 이로 인해 노화 및 각종 질병이 발생된다는 것이 알려져 왔다. 즉 산화적 스트레스를 견딜 수 있는 항산화 물질의 생체방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소 및 자유 라디칼에 노출될 경우, 균형이 깨어져서 기질, 단백질, DNA 등이 비가역적으로 파괴되고, 그 결과 노화 및 암, 복합성 동맥경화, 관절염 및 파킨슨병 등과 같은 각종 질병이 유발되게 된다. 여기에서, 항산화 물질로 작용되는 것은 효소계와 비효소계로 나눌 수 있는데, 슈퍼옥사이드디스퓨타제(SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제 (peroxidase) 등의 항산화 효소와 비타민 C, E, 글루타치온(glutathione) 등의 비효소계 물질이 그것이다. 한편 산화적 스트레스에 기인한 질병을 예방하고 개선하기 위해서, 항산화제를 개발하거나, 또는 항산화 효소의 발현을 유도하거나 비효소계 항산화 물질을 함유하는 약학제제 및 기능성 식품을 개발하는 방향 등의 연구가 진행되어 왔다.
한편, 면역기능이 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어한다는 것은 이미 알려졌으며, 이러한 면역기능은 질병을 예방하고 치료하는 방법으로 이용되고 있고, 예방접종(vaccination) 및 항독소 이용방법 등이 가장 대표적인 방법
이다. 최근에는 상기 면역기능의 작용기작이 알려지면서 면역기능을 조절할 수 있는 면역조절 물질을 직접 이용하려는 시도가 진행되고 있다. 상기 면역조절물질은 비특이적으로 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증강시키는 것이다. 이러한 면역조절 물질로는 화학 합성물질, 미생물 조성물 또는 생물제제 등을 활용하고 있다. 그러나 상기의 면역조절 물질의 대부분은 부작용 또는 독성으로 인하여 실제 생체에 적용하기에는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 노력으로, 최근에는 면역조절물질에 대한 연구가 독성이 없는 식품소재 또는 천연물로부터 추출한 유효성분과 기존의 한방제의 이용 및 효능검증을 통해 수행되고 있으며, 실제로 이러한 연구는 노인성 또는 퇴행성 질환에 효과가 높은 것으로 입증되고 있다.
최근 건강 관련 소비자의 요구는 삶의 가치를 웰빙, 행복, 건강의 3요소를 중시하는 트랜드로 변화하고 있다. 이에 따라 건강식품에 대한 관심이 증가되고 다양한 천연 소재에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 또한, 웰빙에서 웰니스를 추구하는 건강 관련 소비자들의 니즈에 부합되는 소재로 식용꽃이 주목받고 있다. 우리나라는 언제부터 식용꽃을 이용하여 왔는지 문헌상 명확하게 표기되어 있지 않으나 국화를 국화주 제조에 이용한 것으로 보아 예로부터 꽃은 특유의 색, 향기 등으로 주류, 떡류, 전류, 화채, 차 등 전통식품 제조에 이용되어 왔음을 알 수 있다. 서양에서는 고대 인디언들이 2,800년 전부터 사막에서 자라는 꽃을 일상적으로 먹었다는 기록이 있고, 16세기 식용 꽃에 대한 관심이 최고조였던 유럽에서는 꽃 오일이나 꽃 식초가 양념으로 집집마다 사용하였다는 기록이 있다.
현재 상업적으로 유용한 식용꽃에 대한 탐색과 선발이 거의 이루어지지 않아 식용꽃으로 이용되는 꽃의 종류가 적고, 이용도 제한적으로 되는 등 이에 대한 기술 수준이 낮아 발전 가능성이 크며, 식용꽃을 발효하거나 2차 가공에 대한 기술 개발이 부족한 상황으로 향후 활용 범위 확대가 기대된다.
수국(Hydrangea macrophylla)은 쌍떡잎식물 장비목 범의귀과의 낙엽관목으로 예로부터 차로 음용되어 왔고 민간에서는 해열제로 사용되기도 했다. 또한 항말라리아 작용, 면역억제 작용, 항비만이나 피부미백효과가 보고되어 있다.
맨드라미(Celosia cirstata L.)는 쌍떡잎식물 중심자목 비름과에 속하는 한해살이풀로 한방에서는 맨드라미꽃을 전통 약제로 사용해왔다. 줄기와 잎을 치질, 이질, 토혈, 코피, 두드러기 등을 치료하고 종자는 양혈과 지혈의 효능, 혈변, 이질, 눈병 등을 치료하는 효능이 알려져 있다.
캐모마일(Matricaria chamomilla)은 한해살이풀로 긴장을 완화시키고 몸을 따뜻하게 해주는 효과가 있다. 두통·편두통·신경통 등 통증과 염증에도 효능이 있으며, 위장장애가 있을 경우 차로 마시면 효과가 있고, 베개 속에 넣어두면 숙면을 취할 수 있다고 알려져 있다.
국화(Chrysanthemum morifolium)는 두통 개선, 해독, 소염작용, 해열, 눈기능 개선 등의 효능이 있는 것으로 동의보감, 본초강목 외 여러 고서를 통해 전해져 내려오고 있다.
민들레는 만성 위장병이나 위궤양에 효과가 있어 위장을 튼튼하게 하고 한약재나 강력한 소염작용과 소종작용이 있는 각종 화농성 질환과 종양 등의 치료제로 쓰이고 있다.
구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum KITAMURA)는 국화과에 속하는 다년생 초본식물. 구일초, 선모초라고도 한다. 예로부터 월경 불순·자궁 냉증·불임증 등의 부인병에 약으로 쓰여왔다.
마리골드(Calendula officinalis)는 감기로 인해 생기는 근육통을 풀어 주며, 열이 심해 땀을 내고자 할 때 마시면 효과가 있다고 알려져 있다. 또 위염이나 위궤양 등의 소화기 계통의 병을 예방하는데 저먼카모마일과 섞어 마시면 잘 맞으며 방부성이 있고 염증을 가라앉히며 건성 피부와 민감성 피부, 특히 햇볕에 탄 피부에 효과적이라고 알려져 있다.
유산균(Lactic acid bacteria)은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 유산(lactic acid)을 생성하며, 소비되는 당의 50% 이상을 대사 생산물로 생성하지 않고 부패를 방지하는 유익균이다. 유산균은 그람양성균으로 통성혐기성 또는 혐기성 미생물이며 운동성은 없고 대부분이 카탈라아제 음성이며 생육에는 각종 비타민, 아미노산, 펩티드 등을 요구한다. 일반적으로 유산균의 섭취는 장내 미생물들이 음식물의 소화, 흡수, 분해와 배설 등을 돕는 유익균의 증가를 유도하여 소화작용을 도와 소화기계 질환에 개선 효과를 나타낸다(Rolfe, 2000, J.Nutr, 130:396-402). 또한, 유산균 발효를 통해 유용 물질의 합성에 의한 영양 및 건강 증진 효과가 있으며, 정장 작용, 면역증강 작용, 간경화 개선, 항암 작용, 피부미용 효과 등 영양학적인 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명은 국화를 비롯한 다양한 식용 식물의 꽃의 추출물로부터 유산균 발효를 수행하여 항산화 및 면역 활성 기능성이 증진된 발효물을 함유한 액상 음료 등 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명과 관련된 선행기술로서 대한민국 공개특허 제 10-2011-0104251호가 있으나 이는 칡의 추출물을 함유하는 유산균 발효식품 및 그 제조방법에 관한 것이며, 대한민국 등록특허 제 10-1386879호가 있으나 이는 현미 및 모링가(Moringa
oleifera)를 주재료로 하여 복합 유산균의 발효에 의해 발효식품을 제조하는 방법에 관한 것으로, 지금까지 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드를 이용한 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 음료, 기능성 식품 조성물 및 그 제조방법과 관련된 발명은 상기 선행문헌 어디에도 공지된 바 없다.
따라서 본 출원의 목적은 항산화 및 면역활성 증진 기능성 식용꽃 추출물 유산균 발효액의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 항산화 및 면역활성 증진 기능성 식용꽃 추출물 유산균 발효액을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 발효액을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 면역활성 증진기능성 음료 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 가열교반 추출시 7종의 식용꽃인 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드를 건조하고 건조된 식용꽃을 10 내지 15배(W/W), 바람직하게는 15배(W/W)로 가수하여 30℃ 내지 90℃에서, 더욱 바람직하게는 60℃에서 1 내지 3시간 동안, 가장 바람직하게는 2시간 동안 가열교반 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 출원의 초음파 추출시 초음파의 주파수는 20 내지 30kHz로, 20℃ 내지 30℃에서 1 내지 24시간 동안 초음파를 처리할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 유산균은 본 발명이 속한 기술분야에서 유산균으로서 공지된 모든 미생물이 포함될 수 있으며, 소장 유산균 뿐만 아니라 대장 유산균도 포함한다. 특히, Lactobacillus plantarum과 같은 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, and Weisella, Pediococcus 및 Bifidobacterium으로 이루어지는 군에서 선택된 속 (屬, genus)에 속하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직하게는 L. plantarum, L. brevis, E. faecium, P. acidilactici 이 사용된다.
본 출원에서 사용된 용어 '항산화'란 활성산소를 없애주는 작용으로 대표적인 활성산소의 증가요인은 스트레스, 자외선, 방사선 등이 있다. 항산화 작용을 도와주는 대표적인 성분은 베타카로틴, 안토시아닌, 폴리페놀, 코엔자임 등이 있으며, 견과류, 과일류, 채소 등에 많이 포함되어 있다. 항산화 기능의 측정방법은 총 폴리페놀 함량이나 DPPH radical 소거 활성을 통하여 측정될 수 있으나 ABTS radical을 이용하거나 환원력 측정, 금속이온 제거능 측정, 총 카로테노이드 화합물의 함량 측정, 비타민 C의 함량 측정법이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 ‘면역활성‘이란 면역기능 증진 기능을 향상시키는 것을 지칭하고 이를 측정하는 방법으로는 면역세포의 증식이나 활성 기능, 세포독성 조절기능, 산화질소(NO) 생성 조절기능, 면역원성 증진 기능, 항원 인식기능, 면역 반응 조절기능이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 음료나 식품은 기능성 향상을 위하여 과즙 및 부원료 이외에 기능성 성분을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 출원의 음료나 식품은 총 고형분 함량 100 중량부를 기준으로 7종의 식용꽃인 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드 중 선택되는 어느 하나 이상의 식용꽃 0.1 내지 100 중량부를 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 음료는 식용꽃 추출물 또는 즙액 이외에, 추가로 물 또는 용매를 추가로 함유하여 희석음료로 제조할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 음료 조성물은, 향료, 향신료, 안정제, pH 조절제, 산미료(souring agent), 조미료, 착색제, 비타민 및 항산화제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 출원에 따른 음료는 식용꽃 추출물과 식용꽃 추출물 유산균 발효액을 혼합한 혼합액으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 식용꽃 발효혼합액(식용꽃추출액 + 식용꽃유산균발효액)이 음료의 총 중량 대비 20 내지 50%(W/W)로, 더욱 바람직하게는 20%(W/W) 음료 조성물을 제조할 수 있다.
본 출원에 따른 식품은 식용꽃을 포함하는 성분 또는 상기 고제(膏劑)로 제형화된 성분에 식품 보조 첨가제를 추가하여 항산화 기능성 식품을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다. 상기 성분을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
이상 설명한 바와 같이 본 출원은 항산화 및 면역활성 증진기능성 식용꽃 추출물 유산균 발효액의 제조방법과 상기 발효액 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료와 식품 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 출원 항산화 기능성 식용꽃 추출물 제조하기 위한 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 식용꽃 추출법(가열교반 추출, 초음파 추출)에 따른 총 폴리페놀 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 식용꽃 추출법(가열교반 추출, 초음파 추출)에 따른 DPPH radical 소거 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 식용꽃 추출 온도별 총폴리페놀의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 식용꽃 추출 온도별 DPPH radical 소거 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 식용꽃 발효전 추출물 및 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 나타낸 그래프이다.
도 7은 식용꽃 발효전 추출물 및 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 RAW264.7 세포에서 식용꽃 추출물의 유산균 발효액이 세포독성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 식용꽃 추출물의 유산균 발효액이 NO 방출량에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10은 국화 음료 개발을 위한 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
본 출원은 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물과 그 제조방법물을 개시한다.
이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 출원의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예1 . 식용꽃의 가열교반 추출 및 초음파 추출
7종의 식용꽃인 수국(구입처: 갑당약초), 맨드라미(갑당약초), 캐모마일(다움농원), 국화(갑당약초), 민들레(꽃비가), 구절초(하립골), 마리골드(약초명가)를 건조하고 건조된 식용꽃을 15배(W/W) 가수하여 60℃ 에서 2시간 동안 가열교반 추출하거나 상기 건조된 식용꽃을 초음파 추출하여 2 내지 5 Brix의 식용꽃 추출물을 수득하였다.
실험예1 . 가열교반 식용꽃 추출물 및 초음파 추출물의 항산화 기능 측정
상기 실시예 1의 7종의 식용꽃인 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드의 가열교반 추출물과 초음파 추출물의 항산화 기능을 측정하기 위하여 총 폴리페놀 함량과 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법으로 측정하였다(Zhou et al., 1980). 시료 1 mL에 1N Folin-Ciocalteu's reagent 1 mL을 가하고 3분간 정치시킨 후 10% Na2CO₃용액 1 mL을 가하여 혼합한 다음 실온에서 1시간 정치시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하여 총 폴리페놀함량을 수치화하였다. DPPH 라디칼 소거능의 측정은 Biosis 등(1958)의 방법에 의해 측정하였다. 시료 0.5mL에 DPPH 5mL을 넣고 실온, 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식1에 의해 저해율을 계산하였다. 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다. DPPH radical 소거활성의 기준은 Vit.C 활성 정도의 70% 이상시 활성이 있는 것으로 평가하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
평가 결과 모두 초음파 추출시 보다 가열교반 추출시 총 폴리페놀 함량(도 2)과 DPPH radical 소거활성 기능(도 3)이 높아 식용꽃의 추출에 있어서 가열교반 추출이 바람직함을 확인하였다.
실험예2 . 가열교반 식용꽃 추출물의 온도에 따른 항산화 기능성 성분 변화
상기 실시예 1의 7종의 식용꽃인 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드의 가열교반 추출물과 초음파 추출물의 항산화 기능을 측정하기 위하여 총 폴리페놀 함량과 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 모든 7종의 식용꽃 시료에서 60℃ 추출시 가장 높게 측정되었다. 수국, 구절초, 마리골드는 224~257 mg%으로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 캐모마일, 국화, 민들레는 127~145 mg%, 맨드라미는 57 mg%로 식용꽃 종류에 따라 폴리페놀 함량 차이가 있었다(도 4).
DPPH radical 소거활성은 추출 온도에 의한 활성 차이가 크지 않았다. 마리골드는 60℃에서 75%로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 수국, 캐모마일, 구절초, 국화, 맨드라미 순으로 57~63%의 활성을 나타내었다. 민들레는 45%로 가장 낮은 활성을 나타내었다(도 5).
실시예 2. 식용꽃 추출물의 기능성 향상을 위한 유산균 발효
상기 실시예1의 가열교반 추출된 식용꽃 추출물에 식용꽃의 유산균 발효를 위해 영양원으로 glucose 0~5%, yeast extract 0~5%를 첨가하고, 유산균 배양액(106 cfu/mL)을 1% 접종하여 37℃에서 40 내지 48시간 배양하여 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 수득하였다. 사용한 유산균 종류는 (주)웰파인에서 구입하고 다음의 GRAS급 유산균주가 사용되었다.
- Lactobacillus plantarum KCTC 13093
- Lactobacillus brevis HLI59
- Enterococcus faecium KCTC 13225
- Pediocococcus acidilactici KCTC 13734
식용꽃의 유산균 발효 조건은 유산균 발효에 의해 유산균의 수가 109 cfu/mL 이상, pH 4.5 이하가 되고, 총 폴리페놀 함량이 유산균 발효 전 대비 20% 이상 증가할 때 항산화 기능성 향상 유산균 발효 조건을 충족하는 것으로 하였다. 식용꽃의 종류별 유산균 발효 후 유산균 수 측정 결과는 표1에 기재되어 있고, 식용꽃 종류별 유산균 발효 전후의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 도 6에 나타나 있으며, 식용꽃 추출물의 유산균 발효에 의해 상기 기능성 향상 유산균 발효 조건을 충족하는 꽃의 종류와 유산균주는 하기 표3에 기재되어 있다. 식용꽃 종류별 해당 균주 외의 균주는 유산균 발효 후 유산균수가 109 cfu/mL 이하이거나 유산균 발효에 의한 총 폴리페놀 함량 증가량이 20% 이하로 나타나 기능성 향상 유산균 발효 조건에 바람직하지 않았다.
수국 맨드라미 캐모마일 국화 민들레 구절초 마리골드
L. plantarum 5.5x108 1.3x10 9 9.8x108 9.1x108 1.1x10 9 4.8x108 3.2x108
L. brevis 9.5x107 4.6x108 1.4x108 6.0x107 1.0x108 1.4x108 2.3x108
E. faecium 7.8x10 9 1.6x10 9 1.3x10 9 1.8x10 9 1.1x10 9 1.6x10 9 1.9x10 9
P. acidilactici 7.7x108 1.2x10 9 1.3x10 9 1.4x10 9 6.4x108 1.2x10 9 7.1x108
수 국 E. faecium (KCTC 13225)
맨드라미 L. plantarum (KCTC 13093), E. faecium , P. acidilactici (KCTC 13734)
캐모마일 E. faecium, P . acidilactici
국 화 E. faecium, P . acidilactici
민 들 레 L. plantarum, E . faecium
구 절 초 E. faecium, P . acidilactici
마리골드 없음
실험예 3. 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 항산화 및 면역활성 기능 측정
상기 실시예 2에서 수득한 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 항산화 활성 및 면역활성 기능을 평가하기 위하여 DPPH radical 소거활성과 NO 방출량을 측정하였다.
3-1. DPPH Radical 소거 활성 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법으로 측정하였다(Zhou et al., 1980). 이를 위해 시료 1 mL에 1N Folin-Ciocalteu's reagent 1 mL을 가하고 3분간 정치시킨 후 10% Na2CO₃용액 1 mL을 가하여 혼합한 다음 실온에서 1시간 정치시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하여 총 폴리페놀 함량을 수치화하였다. DPPH 라디칼 소거능의 측정은 Biosis 등(1958)의 방법에 의해 측정하였다. 이를 위해 시료 0.5mL에 DPPH 5mL을 넣고 실온, 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식1에 의해 저해율을 계산하였다. 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다. DPPH radical 소거활성의 기준은 Vitamin C 활성 정도의 70% 이상시 활성이 있는 것으로 평가하였다.
Figure pat00002
Vitamin C의 DPPH radical 소거활성이 82.4%이고 이 수치의 70%는 57.68% 이상이다. 이를 적용할 때 모든 식용꽃의 유산균 발효시 57.68% 이상의 활성을 나타내므로 식용꽃 유산균 발효액은 항산화 활성이 있다는 것을 확인하였다(도 7).
또한, 식용꽃 추출물과 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 DPPH radical 소거 활성을 비교한 결과 유산균 발효 후 DPPH radical 소거 활성이 증가한 식용꽃은 표3과 같다.
수 국 없음
맨드라미 L. plantarum (KCTC 13093), E. faecium
캐모마일 E. faecium,
국 화 E. faecium ,
민 들 레 L. plantarum , L.brevis, E. faecium
구 절 초 E. faecium, P . acidilactici
마리골드 없음
결과적으로, 유산균 발효에 의해 유산균의 수가 109 cfu/mL 이상, pH 4.5 이하가 되고, 총 폴리페놀 함량이 유산균 발효 전 대비 20% 이상 증가할 때 항산화 기능성 향상 유산균 발효 조건을 충족하는 동시에 (실시예 2, 표 2) 상기 DPPH radical 소거 활성이 양성대비군 vitamin C의 70%를 능가하는 식용꽃과 유산균 발효의 조합은 하기 표 4와 같다.
수 국 없음
맨드라미 L. plantarum (KCTC 13093), E. faecium
캐모마일 E. faecium,
국 화 E. faecium ,
민 들 레 L. plantarum , E. faecium
구 절 초 E. faecium, P . acidilactici
마리골드 없음
3-2. 세포 독성 및 면역활성 기능 측정
세포 독성 및 면역 활성 기능의 측정을 위하여 사용된 RAW 264.7 세포는 RPMI 1640배지(Lonza Biowhittaker, Walkersville, MD, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penocillin과 100 ug/mL streptomycin을 첨가한 세포 배양액을 사용하여 37℃의 온도 하 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 찼을 때 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)으로 세포의 단층을 씻어내고 세포배양액을 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
세포 독성 및 면역 활성은 상기 RAW 264.7 세포를 이용하여 식용꽃 추출물의 유산균 발효액의 세포 독성 및 배지 내 NO 방출량을 측정하여 각 평가하였다.
세포독성의 평가는 RAW 264.7 세포에 LPS를 100 ng/mL 농도로 자극을 준 후 다양한 균주로 발효시킨 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 1mg/mL 농도로 처리하여 세포 생존률을 확인하였을 때 모든 식용꽃 유산균 발효액에서 80% 이상의 세포 생존률을 확인함으로써 모든 식용꽃 유산균 발효액은 독성이 없음을 알 수 있었다 (도 8).
면역 활성 측정을 위한 NO 방출량은 다음과 같이 측정하였다. 배양이 완료된 RAW 264.7 세포를 1 x 105 cell/ml의 농도로 24 well plate에 1mL씩 분주하고 5% CO2와 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 FBS를 함유하지 않은 DMEM에 LPS 100 ng/mL 및 소재를 희석하여 1mL씩 첨가한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 배양 배지와 100uL와 0.04g/mL 농도로 제조한 griess reagent 100uL를 혼합하여 실온에서 20분 반응시킨 뒤 540nm에서 흡광도를 측정하고, 아래의 계산식을 이용하여 배양 배지 내 NO 방출량을 계산하였다.
[수학식 2]
배양배지 내 NO 방출량 (%) = (시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
NO 방출량 측정결과, LPS 100 ng/mL 처리군을 100% 기준으로 모든 식용꽃 추출물의 유산균 발효액에서 그 방출량이 감소되는 것을 확인하여 면역 활성이 있음을 확인하였다. 특히, 캐모마일의 NO 방출량이 가장 감소되었으며 특히 E. faecium 을 이용한 발효시 NO 방출량이 가장 감소되었다(도 9).
제조예1. 식용꽃 추출물과 식용꽃 추출물 유산균 발효액의 혼합 음료 제조
상기 실시예1의 가열교반 추출된 식용꽃 추출물과 실시예2의 식용꽃 추출물 유산균 발효액를 최적의 조건으로 배합하고 품질 및 기호성이 우수한 식용꽃 음료를 제공하기 위하여 도 10에 모식된 방법으로 국화를 이용한 식용꽃 발효 혼합액 배합비를 설정하고 기호도를 조사하였다(표 5). 기호도는 맛의 차이식별 능력이 있는 20~40대 여성 30명을 대상으로 실시하였고, 맛, 향, 색, 종합적 기호도에 대한 관능검사를 수행하여 그 결과를 비교하였다. 각 항목에 대하여 7단계 평점법(7점 : 대단히 좋다. 6점 : 좋다. 5점 : 조금 좋다. 4점 : 보통이다. 3점 : 조금 싫다. 2점 : 싫다. 1점 : 대단히 싫다.)으로 평점하고, 상기 평점 결과를 평균하여 관능검사 결과를 얻는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 표 5로 나타내었다. 조사 결과 국화 추출액은 95% 이상 첨가될 경우 국화의 향과 맛에 기호도가 높게 나타났다.
항목 국화추출액 : 국화추출발효액(%, W/W)
95 : 5 90 : 10 85 : 15 80 : 20
6.07 5.53 5.43 4.73
6.13 5.07 5.10 4.53
6.43 6.07 5.30 4.50
전체 기호도 6.27 5.23 4.83 4.23
하기 표 6의 배합비율대로 제조된 국화음료의 관능평가를 실시한 결과를 표 7에 나타내었다. 향은 국화 발효 혼합액 20~30% 일 때 6점대, 40~50%일 때 5점대로 나타났다.
맛은 국화 발효 혼합액 20% 일 때 가장 높았고, 30% 이상일 때는 4~5점대로 낮게 나타났다. 색은 국화 혼합 발효액이 50% 이상일 때 3점대로 가장 낮게 나타났으며, 종합적인 기호도는 국화혼합발효액 20%일 때 6.4점으로 가장 높은 점수를 나타냈으며, 30%일 때 5.6점, 40%일 때 4.8점, 50%일 때 3.2점으로 나타났다. 조사 결과, 국화 음료 제조시 국화발효혼합액은 20% 내외가 가장 바람직하였다 (표 6, 표 7).
원료명(%) A B C D
국화발효혼합액
(국화추출액+국화추출발효액)
20 30 40 50
프락토올리고당 10 10 10 10
사과농축액 5 5 5 5
레몬과즙 2 2 2 2
비타민C 1 1 1 1
정제수 62 52 42 32
합계(%) 100 100 100 100
항목 A B C D
6.47 6.37 5.63 5.03
6.37 5.67 5.00 4.03
6.53 6.10 5.33 3.90
전체 기호도 6.40 5.63 4.80 3.20
본 출원은 식용꽃 추출물 유산균 발효액과 그 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 건강 기능성 음료 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 수국, 맨드라미, 캐모마일, 국화, 민들레, 구절초, 마리골드 중 선택되는 어느 하나 이상의 식용꽃을 건조하는 단계; 상기 건조된 식용꽃을 가수하여 가열교반 추출하는 단계; 상기 추출된 식용꽃 추출물을 유산균 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 식용꽃 추출물 유산균 발효액의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가수는 건조된 식용꽃의 10 내지 15배(W/W)의 수용액을 이용하고, 상기 가열교반 추출의 온도는 60℃ 내지 90℃로 2시간 실시하는 것이 특징인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유산균 발효는 L. plantarum , L. brevis , E. faecium, P . acidilactici 중 어느 하나에서 선택되는 유산균을 사용하는 것이 특징인 제조방법
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 항산화 및 면역활성 증진 기능성 식용꽃 추출물 유산균 발효액.
  5. 제4항의 식용꽃 추출물 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식용꽃 발효 혼합액이 총 중량 대비 20 내지 50%(W/W)인 것이 특징인 음료 조성물.
  7. 제4항의 식용꽃 추출물 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 식품 조성물.


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KR20220094233A (ko) * 2020-12-28 2022-07-06 건국대학교 글로컬산학협력단 마리골드 추출물에 모유 유산균으로 생물전환 시킨 성분을 함유하는 항균, 항산화 및 항염증 활성을 갖는 조성물

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