KR101918942B1 - 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료 및 그의 제조 방법을 개시한다. 즉, 본 발명은 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조함으로써, 미생물의 분해작용을 통한 발효공정을 거쳐 새로운 활성 성분의 생성, 독성 감소, 식물섬유소의 활성 증진, 풍미 향상 및 저장성을 향상시키며, 항산화 및 항염증을 개선할 수 있다.
Description
본 발명은 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 현대의학의 발달 및 경제수준의 향상으로 평균 수명이 연장되고 있으나, 환경오염 및 사회생활에 따른 다양한 스트레스 및 영양편중으로 인해 각종 성인병들의 발명이 증가함에 따라 건강에 대한 관심이 고조되고 있다.
이러한 관심의 대표적인 대상 중 쉽게 접하고 거부감이 적은 기능성 식품으로 기능성 식품의 범위는 비만 예방, 다이어트, 유해물질 중화 및 해독, 콜레스테롤 저하에서 더 나아가 질병의 예방, 치료, 회복, 생채방어 및 면역 등의 생체조절 역할까지로 확대되고 있다.
이러한 기능성 식품 중 미생물의 분해 작용을 통한 발효 공정에 의해 제조되는 기능성 식품에 대한 연구 및 활용이 필요한 시점이다.
본 발명의 목적은 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료 및 그의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 실시예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법은 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법에 있어서, 맥아배지에 의해, Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 35℃ ~ 40℃에서 45시간 ~ 50시간 동안 각각 종균배양하여 각각의 배양액을 준비하는 단계; 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 후 교반하여 혼합물을 준비하는 단계; 상기 혼합물을 환류 추출하여 액상의 추출물을 준비하는 단계; 상기 준비된 추출물을 여과하는 단계; 상기 여과된 추출물에 상기 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 각각 2.5%(v/v)씩 접종하는 단계; 및 상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 정치 발효하여 발효 음료를 준비하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 혼합물은, 전체 혼합물 성분의 중량 비율에서 상기 콩 40 중량% ~ 60 중량%, 상기 홍삼 15 중량% ~ 25 중량%, 상기 오미자 15 중량% ~ 25 중량% 및 상기 당귀 5 중량% ~ 15 중량%로 조성할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 추출물은, 상기 준비된 혼합물에 증류수를 상기 혼합물의 20 중량배를 넣고, 90℃ ~ 110℃의 온도에서 5시간 ~ 7시간 동안 환류 추출하여 획득할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 준비된 추출물을 여과하는 단계는, 0.45㎛ 멤브란스 필터(0.45 membrance filter: PVDF)로 여과하거나, 여과기에 의해 70 메쉬 ~ 130 메쉬로 여과할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 발효 음료를 준비하는 단계는, 상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 35℃ ~ 40℃에서 65시간 ~ 80시간 동안 정치 발효하여 상기 발효 음료를 준비할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료에 있어서, 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 추출한 추출물에 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 접종한 후 정치 발효하여 제조할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 추출물은, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 후 교반하여 혼합물을 준비고, 상기 혼합물을 환류 추출하여 액상의 추출물을 준비할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서 상기 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02은, 맥아배지에 의해, Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 35℃ ~ 40℃에서 45시간 ~ 50시간 동안 각각 종균배양하여 각각의 배양액을 준비할 수 있다.
본 발명은 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조함으로써, 미생물의 분해작용을 통한 발효공정을 거쳐 새로운 활성 성분의 생성, 독성 감소, 식물섬유소의 활성 증진, 풍미 향상 및 저장성을 향상시키며, 항산화 및 항염증을 개선할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 pH 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총산도 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총 페놀 함량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 Nitric Oxide(산화질소/일산화질소)의 농도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 pH 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총산도 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총 페놀 함량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 Nitric Oxide(산화질소/일산화질소)의 농도를 나타낸 도이다.
본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 제 1, 제 2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성 요소는 제 2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성 요소도 제 1 구성 요소로 명명될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 유의해야 한다.
이하에서는, 본 발명에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법을 도 1 내지 도 7을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법을 나타낸 흐름도이다.
먼저, 맥아배지(미도시)에서 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 35℃ ~ 40℃(일반적으로 37℃)에서 45시간 ~ 50시간(일반적으로 48시간) 동안 각각 종균배양하여 각각의 배양액을 준비한다(S110).
이후, 100 메쉬(mesh) ~ 200 메쉬의 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자, 당귀를 혼합한 후, 교반기(미도시)를 통해 20rpm ~ 40rpm의 속도(또는 회전 속도)로 20분 ~ 40분(일반적으로 30분) 동안 교반하여 혼합물을 준비한다. 이때, 상기 콩, 홍삼, 오미자, 당귀 등은 성상 검사, 변질 검사, 부패 검사, 이물질 검사 등을 통해 이상이 있는 제품은 제거된 상태이며, 열풍 건조된 상태로 영하 3℃ ~ 영하 7℃(일반적으로 영하 5℃)에서 보관된 상태일 수 있다.
여기서, 전체 혼합물 성분의 중량 비율에서 상기 콩 40 중량% ~ 60 중량%, 상기 홍삼 15 중량% ~ 25 중량%, 상기 오미자 15 중량% ~ 25 중량% 및 상기 당귀 5 중량% ~ 15 중량%로 조성(또는 구성)할 수 있다.
상기 콩(Glycine max (L.) Merrill)은 예로부터 우리나라 식사에서 중요한 단백질과 지방의 급원으로 된장, 청국장, 두부, 두유 등의 원료로 사용빈도가 높은 작물로 발효과정을 거치면서 펩타이드, 이노시톨, 이소플라본 비배당체와 같은 다양한 생리활성 물질을 제공하는 것으로 알려져 있다.
상기 홍삼(Korean Red Ginseng)은 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 인삼의 뿌리를 찐 것으로 일반적으로 6년근 수삼을 사용한다. 홍삼의 주요성분은 ginsenoside로 hydroxyl group(-OH)의 위치 및 당 결합유무에 따라 구분되며 ginsenoside Rg1, Rb1이 대표적이며 이외에도 polysaccharides, polyacetylenic alcohol, fatty acid 등이 알려져 있다. 약리작용으로는 항암효과, 혈액순환, 면역기능, 노화방지, 혈당강하 등이 보고되고 있다.
상기 오미자(Schizandra chinensis Baillon)는 목련과의 낙엽덩굴로 단맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛, 짠맛의 다섯가지 맛을 내며 antosianin에 의해 붉은 색을 나타내는 것이 특징이다. 주요성분으로는 schizandrin, schizadran, ethamigrenal, γ-schizadrin, gomisin류 등이 있으며, 약리작용으로는 진해, 진정, 혈액순환 개선, 중추신경의 기능강화, 알코올에 대한 해독작용, 혈당강하 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
상기 당귀(Angelica gigas Naki)는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 식물로서 coumarine계 물질인 decursin, nodakenin, decursinol, nodakenetin, umbelliferon 등의 성분을 포함하고 있으며, 약리작용으로는 혈액순환 개선, 면역작용, 간기능 보호효과 등의 생리활성을 보고된 바 있다(S120).
이후, 상기 준비된 혼합물에 증류수(또는 정제수/물)를 상기 혼합물의 20 중량배(또는 상기 혼합물의 중량 대비 20배의 증류수)를 넣고, 90℃ ~ 110℃(일반적으로 100℃)의 온도에서 5시간 ~ 7시간(일반적으로 6시간) 동안 환류 추출하여 액상의 추출물을 준비한다.
본 발명의 실시예에서는 상기 혼합물에 대해서 환류 추출 방식에 의해 상기 액상의 추출물을 준비하는 것을 설명하고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 혼합물에 대해서 열수 추출, 초음파 추출(예를 들어 물 초음파 추출, 주정 초음파 추출 등 포함), 주정 추출 등을 통해서 상기 추출물을 준비(또는 획득)할 수도 있다(S130).
이후, 상기 준비된 추출물은 0.45㎛ 멤브란스 필터(0.45 membrance filter: PVDF)로 여과한다.
또한, 상기 준비된 추출물은 여과기(미도시)에 의해 70 메쉬 ~ 130 메쉬(일반적으로 100 메쉬)로 여과할 수도 있다(S140).
이후, 상기 여과된 추출물에 상기 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 각각 2.5%(v/v)씩 접종(첨가)한다.
일 예로, 상기 여과된 액상의 추출물 100ml에 상기 배양액인 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 각각 2.5ml씩 접종하여, 105ml의 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 준비한다(S150).
이후, 상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 35℃ ~ 40℃(일반적으로 37℃)에서 65시간 ~ 80시간(일반적으로 72시간) 동안 정치 발효하여 발효 음료를 준비한다(S160).
이후, 상기 준비된 발효 음료는 미리 설정된 포장 단위에 따라 포장기(미도시)를 통해 포장한다(S170).
[실험예]
본 발명의 실시예에 따라 상기 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 다음의 [표 1]과 같이 혼합하여 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물에 미리 설정된 37℃에서 48시간 동안 종균배양한 배양액인 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 각각 2.5%(v/v)씩 접종하여, 상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 37℃에서 72시간 동안 정치 발효시킨 후, 여과하여 실험에 사용하였다.
| 콩 | 홍삼 | 오미자 | 당귀 | |
| FD1 | 100% | 0% | 0% | 0% |
| FD2 | 0% | 100% | 0% | 0% |
| FD3 | 0% | 0% | 100% | 0% |
| FD4 | 0% | 0% | 0% | 100% |
| FD5 | 50% | 20% | 15% | 15% |
| FD6 | 50% | 15% | 20% | 15% |
| FD7 | 50% | 15% | 15% | 20% |
| FD8 | 50% | 10% | 20% | 20% |
| FD9 | 50% | 20% | 10% | 20% |
| FD10 | 50% | 20% | 20% | 10% |
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 pH 결과를 나타낸 도(Comparison of pH(A) of fermented drink containing medicinal plants with different Mixing ratio)이다.
상기 pH는 pH meter(미도시)를 사용하여 측정하였다.
상기 도 2에 도시된 바와 같이, 발효물(또는 발효 음료)의 pH는 FD3, FD4, FD5에서 각각 3.38, 3.53 및 3.56으로 낮았으며, FD10에서 3.71로 가장 높은 pH를 나타냈다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총산도 결과를 나타낸 도(Comparison of total acidity(B) of fermented drink containing medicinal plants with different Mixing ratio)이다.
산도 변화는 여과한 시료 10mL를 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3±0.1까지 중화시키는 데 소요된 0.1N-NaOH의 소비 mL 수를 구하고, 젖산(lactic acid) 양으로 환산하여 총 산도로 표시하였다.
상기 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 발효물(또는 발효 음료)의 총산도는 FD3, FD4, FD8에서 각각 2.02, 1.55 및 1.42 순으로 나타냈다.
도 4는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 총 페놀 함량을 나타낸 도(Total phenol contents of fermented drink containing medicinal plants with different Mixing ratio)이다.
총 페놀 함량은 Folin-Denis법을 일부 변형하여 측정하였다. 농도별 추출물 10㎕에 2% Na2CO3 용액 200㎕를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 그 후, 2N Folin-Ciocalteu phenol 시약 10㎕를 첨가 및 혼합한 후, 30℃ incubator에서 27분 동안 발색시켰다. 상기 발색된 시료는 microplate reader를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 갈산(gallic acid)을 이용하여 작성한 표준 검량곡선에 의해 값을 산출하였다.
식물계에 널리 분포된 페놀화합물은 한 분자 내 2개 이상의 phenolic hydroxyl(-OH)기를 가지고 있는 방향족 화합물들을 총칭하고 있으며, 종류가 매우 많고 각각의 화학적 구조에 따른 용해성이 매우 다양하다.
또한, 상기 페놀화합물은 항산화, 항암, 항에이즈, 고혈압 억제 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
상기 도 4에 도시된 바와 같이, 한약재 배합별 발효물의 총 페놀 함량에서 FD10이 108.14±10.02 mg GAE(gallic acid equivalents)/100g으로 가장 높게 나타났으며, FD4(91.19±7.31 mg GAE/100g), FD8(79.34±4.19 mg GAE/100g), FD6(76.22±6.55 mg GAE/100g) 순으로 나타났다.
[표 2]는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성(DPPH free radical scavenging activity) 비교 결과를 나타낸다.
상기 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거 활성은 Blois 등의 방법을 변형하여, 각 시료의 DPPH에 대한 전자공여능을 측정하였다. 농도별 시료를 96-well plate에 10㎕와 사용 직전 만든 0.2 mM DPPH 용액 190㎕를 섞은 다음, 실온의 암실에서 30분간 반응시켜 microplate reader를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Ascorbic acid)를 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거 활성은 [1-(시료첨가구의 흡광도 / 음성대조구의 흡광도)]×100으로 계산하여 백분율로 나타냈다.
| Treated conc. (ug/ml) | DPPH assay (%) | ||||
| 31.25 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | |
| FD1 | 30.35 | 32.24 | 33.03 | 35.41 | 41.73 |
| FD2 | 33.34 | 37.17 | 38.17 | 43.39 | 54.45 |
| FD3 | 33.75 | 35.41 | 34.65 | 36.94 | 39.92 |
| FD4 | 31.49 | 33.66 | 35.26 | 40.46 | 45.31 |
| FD5 | 31.4 | 33.85 | 33.35 | 34.79 | 36.6 |
| FD6 | 29.7 | 31.5 | 33.02 | 34.44 | 38.16 |
| FD7 | 30.83 | 32.22 | 33.2 | 34.34 | 37.11 |
| FD8 | 31.31 | 32.54 | 33.6 | 35.31 | 38.04 |
| FD9 | 33.62 | 34.88 | 35.66 | 36.38 | 39.98 |
| FD10 | 25.89 | 30.68 | 36.75 | 48.57 | 59.44 |
| Treated conc. | 1.5625 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 |
| Ascorbic acid | 21.65 | 36.28 | 58.63 | 85.6 | 92.29 |
상기 DPPH 라디칼 소거 활성은 짙은 자색을 띠고 있는 비교적 안전한 자유 라디칼(free radical)인 DPPH가 방향족 아민류나 항산화제 등에 의해 환원되어 탈색되는 것을 이용하여 물질의 항산화 활성을 측정하는 데 이용되고 있다.
상기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 한약재 배합별 발효물(또는 발효 음료)의 DPPH 라디칼 소거 활성에서 500 ug/mL를 처리하였을 때, FD10에서 59.44±0.22%, FD2에서 54.45±0.68%, FD4에서 45.31±0.73% 순으로 나타났으며, FD10은 125 ug/mL 농도의 아스코르브산(58.63±1.20%)과 비슷한 활성을 나타냈다.
본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 ABTS 라디칼 소거 활성(ABTS cation radical scavenging activity)을 비교하였다.
ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonic-acid) cation radical 소거 활성은 Re 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액에 2.45 mM의 potassium persulfate를 1:1로 혼합한 다음, 실온의 암실에서 24시간 방치시킨 후, ABTS radical(ABTS+.)을 만들고, 732 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4) buffer로 희석하여 사용하였다. 96-well plate에 ABTS 라디칼 용액 190㎕와 농도별 추출물(또는 발효 음료) 10㎕를 첨가하여 1분 동안 정치시킨 다음, 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거 활성은 [1-(시료첨가구의 흡광도 / 음성대조구의 흡광도)]×100으로 계산하여 백분율로 표시하였다.
상기 ABTS 라디칼 소거 활성은 시료 내의 항산화 물질에 의해 소거되어, 청록색에서 연한 녹색으로 탈색되는 점을 이용한 측정 방법으로 lipophilic 및 hydrophilic 물질의 항산화 활성을 측정하기 위해 사용된다.
한약재 배합별 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성에서, 모든 시료군에서 농도의존적인 활성을 나타냈으며, FD10에서 4.39±0.62% ~ 48.49±1.01%, FD4에서 3.29±0.11% ~ 36.20±2.17%, FD9에서 0.88±0.10% ~ 25.16±1.08% 순으로 활성을 나타냈다.
본 발명의 실험예에서 사용된 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 세포 배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% P/S(penicilin-streptomycin)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지를 사용하였다. 배양된 RAW264.7 세포가 80% confluent 되었을 때 PBS로 세척한 후, Cell scraper를 이용해 세포를 탈착시켜 3,000 rpm에서 4분 동안 원심분리한 후, 2일 간격으로 계대배양하였다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 세포 독성을 나타낸 도(Cell viabilities of fermented drink containing medicinal plants with different Mixing ratio)이다.
상기 한약재 배합별 발효 음료에 대한 세포 독성은 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2H-tetrazalium inner salt(MTS)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 96-well plate에 RAW264.7 세포를 1×104cells/well가 되도록 분주한 다음, 24시간 동안 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 예비 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(10, 50, 100, 200, 500 ug/mL)로 세포를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 이후, well당 MTS solution 20㎕씩 가하고, CO2 incubator에서 4시간 반응시킨 뒤, microplate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 도 5에 도시된 바와 같이, RAW264.7 세포에 농도별로 한약재 배합별 발효물을 처리한 후, 24시간 배양한 다음, MTS assay로 세포생존율을 측정한 결과에서, 발효물을 처리하지 않은 대조군의 생존율을 100%로 하였을 때, 모든 농도에서 세포생존율이 약 85% ~ 120%를 보여, RAW264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 실험예에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 Nitric Oxide(산화질소/일산화질소)의 농도를 나타낸 도(Effect of fermented drink containing medicinal plants with different Mixing ratio)이다.
도 7은 본 발명의 실험예(FD10)에 따른 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 Nitric Oxide(산화질소/일산화질소)의 농도를 나타낸 도이다.
NO의 농도는 배양액 내의 Nitrite 농도를 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 1×104cells/well가 되도록 분주하여, 24시간 동안 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양한 후, 각 시료를 10, 50, 100, 200 ug/mL의 농도로 2시간 전처리한 다음, LPS(100 ng/mL)를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 배양액과 동일한 양의 Griess reagent를 넣은 후, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 NaNO2의 농도별 표준 곡선을 기준으로 계산하였다.
NO는 NO 합성효소에 의해 L-arguinine으로부터 생성되는 무기 유리체로 신호전달기능, 체내방어기능, 신경독성 및 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있으며, 농도에 따라 세포기능 유지 또는 세포독성을 일으킨다. 특히, NO의 합성경로 중 하나인 inducible NOS(iNOS)가 염증상태에서 NO를 과잉생성하면, 혈관투과성, 부종 등 염증반응 활성화뿐만 아니라, 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시킨다고 알려져 있다.
상기 도 6에 도시된 바와 같이, 한약재 배합별 발효물을 500 ug/ml로 2시간 전처리한 후, LPG 100ng/mL를 18시간 동안 cell에 처리한 결과에서, LPS를 처리한 군에서 14.57±0.01 μM의 NO 농도를 나타냈으며, 다른 발효물에 비해 FD4(8.62±0.26μM), FD9(8.64±0.08 μM), FD10(8.02±0.34 μM)에서 NO 생성량이 적었다. 그 중 상기 도 7에 도시된 바와 같이, FD10이 8.02±0.34 μM ~ 11.53±0.05μM으로 농도의존적으로 가장 낮은 NO 생성량을 나타냈다.
본 발명의 실시예는 앞서 설명된 바와 같이, Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조하여, 미생물의 분해작용을 통한 발효공정을 거쳐 새로운 활성 성분의 생성, 독성 감소, 식물섬유소의 활성 증진, 풍미 향상 및 저장성을 향상시키며, 항산화 및 항염증을 개선할 수 있다.
전술된 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명은 Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 맥아배지에서 종균배양하여 배양액을 준비하고, 분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 혼합물을 열수 추출하여 추출물을 준비하고, 상기 준비된 추출물에 상기 준비된 배양액을 접종한 후 발효하여 발효 음료를 제조함으로써, 미생물의 분해작용을 통한 발효공정을 거쳐 새로운 활성 성분의 생성, 독성 감소, 식물섬유소의 활성 증진, 풍미 향상 및 저장성을 향상시키며, 항산화 및 항염증을 개선할 수 있는 것으로, 한약재 활용 분야, 발효 음료 분야 등에서 광범위하게 이용될 수 있다.
Claims (8)
- 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법에 있어서,
맥아배지에 의해, Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 35℃ ~ 40℃에서 45시간 ~ 50시간 동안 각각 종균배양하여 각각의 배양액을 준비하는 단계;
분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 후 교반하여 혼합물을 준비하는 단계;
상기 혼합물을 환류 추출하여 액상의 추출물을 준비하는 단계;
상기 준비된 추출물을 여과하는 단계;
상기 여과된 추출물에 상기 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 각각 2.5%(v/v)씩 접종하는 단계; 및
상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 정치 발효하여 발효 음료를 준비하는 단계를 포함하되,
상기 혼합물은,
전체 혼합물 성분의 중량 비율에서 상기 콩 40 중량% ~ 60 중량%, 상기 홍삼 15 중량% ~ 25 중량%, 상기 오미자 15 중량% ~ 25 중량% 및 상기 당귀 5 중량% ~ 15 중량%로 조성하되 홍삼과 오미자의 중량은 동일하고 당귀는 홍삼 중량의 절반인 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
상기 준비된 혼합물에 증류수를 상기 혼합물의 20 중량배를 넣고, 90℃ ~ 110℃의 온도에서 5시간 ~ 7시간 동안 환류 추출하여 획득하는 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 준비된 추출물을 여과하는 단계는,
0.45㎛ 멤브란스 필터(0.45 membrance filter: PVDF)로 여과하거나, 여과기에 의해 70 메쉬 ~ 130 메쉬로 여과하는 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 발효 음료를 준비하는 단계는,
상기 종균배양된 배양액이 첨가된 추출물을 35℃ ~ 40℃에서 65시간 ~ 80시간 동안 정치 발효하여 상기 발효 음료를 준비하는 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료의 제조 방법. - 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료에 있어서,
콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 추출한 추출물에 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02을 접종한 후 정치 발효하여 제조하되,
상기 추출물은,
분말 형태의 콩, 홍삼, 오미자 및 당귀를 혼합한 후 교반하여 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물을 환류 추출하여 액상의 추출물을 준비하며,
상기 혼합물은,
전체 혼합물 성분의 중량 비율에서 상기 콩 40 중량% ~ 60 중량%, 상기 홍삼 15 중량% ~ 25 중량%, 상기 오미자 15 중량% ~ 25 중량% 및 상기 당귀 5 중량% ~ 15 중량%로 조성하되 홍삼과 오미자의 중량은 동일하고 당귀는 홍삼 중량의 절반인 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료. - 삭제
- 제 6 항에 있어서,
상기 종균배양된 Lactobacillus plantarum P1201과 Lactobacillus brevis WCP02은,
맥아배지에 의해, Lactobacillus plantarum P1201 균주와 Lactobacillus brevis WCP02 균주를 35℃ ~ 40℃에서 45시간 ~ 50시간 동안 각각 종균배양하여 각각의 배양액을 준비하는 것을 특징으로 하는 콩과 한방 성분을 이용한 발효 음료.
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