KR20210069887A - 천마 조성물의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천마 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 통해 제조되는 천마 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 적용하고, 상기 생물 전환 기술을 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 부원료를 배합하는 과정을 통해 제조된 천마 조성물을 제공함으로써, 생물 전환 기술을 이용하여 천마 특유의 쓴 맛을 감소시켜 맛과 향이 개선된 천마 조성물을 제공할 수 있으며, 이를 통해 천마 섭취에 대한 사용자의 거부감을 해소함과 아울러 천마 조성물의 용이한 섭취에 따라 천마가 가진 성분의 신체 흡수율을 증진시켜 혈액순환의 개선과 동맥경화, 고지혈증 등의 예방과 같은 효과를 제공할 수 있다.

Description

천마 조성물의 제조 방법{Manufacturing method for composition of gastrodia elata blume}
본 발명은 천마 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 통해 제조되는 천마 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
천마(天麻)는 참나무 종류의 썩은 그루터기에 나는 버섯의 균사에 붙어사는 여러해살이 기생식물로서, 굵고 긴 덩이줄기를 가지고 있으며 덩이줄기로부터 높이 1m쯤 되는 줄기가 자라난다.
또한, 천마의 줄기의 빛깔은 주황빛이고 전혀 잎을 가지고 있지 않으며, 꽃은 줄기 끝에 곧게 선 이삭 꼴로 모여 핀다. 또한, 천마는 3장의 꽃잎이 서로 달라붙어 불룩한 단지모양을 이루는데 주둥이 부분은 세 개로 갈라져 있으며, 꽃의 길이는 2cm 안팎이고 빛깔은 노랗다.
천마에는 게스트로딘이라는 유효성분이 다량 함유돼 있다. 이 게스트로딘 성분이 혈관 내에 쌓여 있는 노폐물을 청소해주고 이를 통해 혈압안정과 혈류량을 늘려 원활한 혈액순환을 도와준다고 알려져 있다. 특히, 천마는 뇌혈관이나 심장혈관을 더욱 튼튼하게 해주며 겨울철 특히 많이 발생되는 뇌경색, 뇌출혈 등은 물론이고 심근경색에도 좋은 음식으로 전해지고 있다.
또한, 천마는 또한 예부터 '풍을 다스리는 풀'이라고 해 '정풍초'라고도 불리며 중풍에 좋은 음식으로 알려져 있으며, 특히 혈액뇌장벽을 통과하는 물질이 함유된 유일한 한방약재라고 한다. 이 외에도, 천마는 몸 속 나쁜 콜레스테롤 수치는 낮춰 동맥경화, 고지혈증 예방에 도움을 준다.
그러나, 이러한 천마의 뛰어난 효능에도 불구하고, 천마는 고유의 비린맛과 쓴맛을 가지는 동시에 점액질이 존재하여 섭취하는데 거부감이 있어 유통이 활발하게 이루어지고 있지 않다.
따라서, 이러한 천마의 섭취를 용이하게 할 수 있도록 지원하기 위한 제품 개발이 요구되고 있다.
한국등록특허 제10-1201528호
본 발명은 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 적용하고, 상기 생물 전환 기술을 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 부원료를 배합하는 과정을 통해 제조된 천마 조성물을 제공하여, 천마의 맛과 향을 개선하여 식이편의성 개선함과 아울러 신체 흡수율을 증진시켜 다양한 효능을 가진 천마를 용이하게 섭취할 수 있도록 지원하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법은, 천마를 분쇄하여 천마 분말을 포함하는 분쇄물을 준비하는 분말화 단계와, 상기 분쇄물과 물을 1:20의 중량 비율로 혼합한 혼합물을 제조한 후 상기 혼합물에 대한 당화 작업을 통해 천마 당화액을 준비하는 당화 단계와, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus platarum)의 혼합 균주를 상기 천마 당화액의 3 ~ 7중량%로 상기 천마 당화액에 접종하여 발효하는 발효 단계 및 상기 발효 단계를 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 얻어진 천마생물전환 농축액에 하수오 농축액, 배 농축액, 홍삼 농축액 및 산양삼 추출액을 미리 설정된 비율로 첨가하여 배합한 후 살균하여 천마 조성물을 제조하는 제조 단계를 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 당화 단계는 상기 혼합물을 55℃ ~ 65℃에서 3 ~ 5 시간 당화작업하여 상기 천마 당화액을 준비하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 발효 단계는 상기 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타럼으로 이루어진 상기 혼합 균주를 맥아배지에 종균 배양한 다음 상기 천마 당화액에 접종하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 제조 단계는 상기 발효물로부터 80℃ ~ 90℃에서 23 ~ 25 시간동안 천마생물전환 추출물을 추출한 후 50Brix% ~ 55Brix%가 되도록 농축하여 천마생물전환 농축액을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 제조 단계는 상기 천마생물전환 농축액 25 ~ 35중량%에, 상기 하수오 농축액 15 ~ 25중량%, 상기 배 농축액 15 ~ 19중량%, 상기 홍삼 농축액 2~5%, 상기 산양삼 추출액 25 ~ 35중량%을 첨가하여 45Brix% ~ 50Brix%가 되도록 배합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 적용하고, 상기 생물 전환 기술을 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 부원료를 배합하는 과정을 통해 제조된 천마 조성물을 제공함으로써, 생물 전환 기술을 이용하여 천마 특유의 쓴 맛을 감소시켜 맛과 향이 개선된 천마 조성물을 제공할 수 있으며, 이를 통해 천마 섭취에 대한 사용자의 거부감을 해소함과 아울러 천마 조성물의 용이한 섭취에 따라 천마가 가진 성분의 신체 흡수율을 증진시켜 혈액순환의 개선과 동맥경화, 고지혈증 등의 예방과 같은 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법에 대한 순서도.
도 2 내지 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법 중 천마 당화액에 접종되는 혼합균주의 우수균주 분석 결과를 나타낸 도면.
도 8 내지 도 19는 본 발명의 실시예에 따른 천마 발효물의 실험 분석 결과를 나타낸 도면.
도 20 내지 도 23은 본 발명의 실시예에 따른 천마생물전환 추출물의 실험 분석 결과를 나타낸 도면.
본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 제 1, 제 2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성 요소는 제 2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성 요소도 제 1 구성 요소로 명명될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 유의해야 한다.
이하, 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법에 대해 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법에 대한 순서도이다.
우선, 천마(天麻, Gastrodia elata Blume)를 증숙 건조한 후 분쇄하여 제조된 천마 분말을 포함하는 분쇄물을 준비한다(S1).
또한, 상기 분쇄물과 물을 1:20의 중량 비율로 혼합한 혼합물을 제조한 후 상기 혼합물에 대한 당화 작업을 통해 천마 당화액을 준비한다(S2).
이때, 상기 분쇄물을 부직포에 넣고 상기 분쇄물의 20배의 물을 넣어 혼합물을 제조한 후 상기 혼합물을 55℃ ~ 65℃에서 3 ~ 5 시간 당화작업하여 상기 천마 당화액을 준비한다.
여기서, 상기 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 당화작업하여 상기 천마 당화액을 준비하는 것이 바람직하다.
또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus platarum)의 혼합 균주(또는 혼합균)를 상기 천마 당화액의 3 ~ 7중량%로 상기 천마 당화액에 접종하여 발효할 수 있으며, 이를 통해 발효물(또는 천마 발효물)을 얻을 수 있다(S3).
이때, 상기 혼합 균주를 상기 천마 당화액의 5중량%로 준비한 후 상기 천마 당화액에 접종하는 것이 바람직하며, 상기 접종은 상기 천마 당화액에 상기 천마 당화액의 5중량%에 해당하는 상기 혼합균주를 첨가하여 교반하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 혼합균주가 접종된 상기 천마 당화액을 발효하여 상기 발효물을 얻을 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타럼으로 이루어진 상기 혼합 균주를 맥아배지에 종균 배양한 다음 상기 천마 당화액에 접종할 수 있다.
또한, 상기 발효를 통해 얻어진 상기 발효물로부터 천마생물전환 추출물(또는 천마 추출물)을 추출한 후 농축하여(S4) 얻어진 천마생물전환 농축액(또는 천마 농축액)에 하수오 농축액, 배 농축액, 홍삼 농축액 및 산양삼 추출액을 미리 설정된 비율로 첨가하여 배합한 후 살균하여 천마 조성물을 제조한다(S5).
이때, 상기 발효물로부터 80℃ ~ 90℃에서 23 ~ 25 시간동안 천마생물전환 추출물을 추출한 후 50Brix% ~ 55Brix%가 되도록 농축하여 천마생물전환 농축액을 제조하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, 상기 발효물로부터 85℃에서 24시간 동안 천마생물전환 추출물을 추출한 후 54Brix%가 되도록 농축하여 천마생물전환 농축액을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 상술한 구성에서, 상기 천마생물전환 농축액 25 ~ 35중량%에, 하수오 농축액 15 ~ 25중량%, 배 농축액 15 ~ 19중량%, 홍삼 농축액 2~5%, 산양삼 추출액 25 ~ 35중량%을 첨가하여 45Brix% ~ 50Brix%가 되도록 배합하는 것이 바람직하다.
이때, 천마 생물전환 농축액 30중량%에 하수오 농축액 20중량%, 배 농축액 17중량%, 홍삼 농축액 3% 및 산양삼 추출액 30%을 첨가하여, 47Brix%가 되도록 배합하는 것이 더욱 바람직하다.
상술한 구성을 통해, 본 발명은 천마를 분쇄하여 얻어진 천마 분말에 미생물을 접종하여 발효시키는 생물 전환 기술을 적용하고, 상기 생물 전환 기술을 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 부원료를 배합하는 과정을 통해 제조된 천마 조성물을 제공함으로써, 생물 전환 기술을 이용하여 천마 특유의 쓴 맛을 감소시켜 맛과 향이 개선된 천마 조성물을 제공할 수 있으며, 이를 통해 천마 섭취에 대한 사용자의 거부감을 해소함과 아울러 천마 조성물의 용이한 섭취에 따라 천마가 가진 성분의 신체 흡수율을 증진시켜 혈액순환의 개선과 동맥경화, 고지혈증 등의 예방과 같은 효과를 제공할 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법을 통해 얻어진 천마 조성물에 대한 효과를 증명하기 위한 천마 조성물의 제조 과정에서 얻어지는 시료 또는 천마 조성물의 제조에 사용되는 시료를 이용하여 다양한 실험을 진행하였으며, 이를 이하에서 도면을 참고하여 상세히 설명한다.
도 2 내지 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 천마 조성물의 제조 방법 중 천마 당화액에 접종되는 혼합균주의 우수균주 분석 결과를 나타낸 도면이다.
우선, 천마 생물전환 추출물의 제조를 위한 최적 조건(균주, 온도, 기간 등) 확립을 위한 실험을 진행하여, 먼저 우수균주 확보를 위해 균을 접종하지 않은 천마, 맥아배지에 종균배양한 Lactobacillus brevis(KCTC 3102, 이하, LB와 동일), Lactobacillus platarum(KCTC 21024, 이하, LP와 동일)균주, 혼합균주(LB+LP)로 균 접종량 2.5%. 온도 35℃, 0 ~ 5일 발효로 동일조건하에 실험을 진행하였다.
또한, 생물전환기술의 조건확립을 위해, 균을 접종하지 않은 천마에 선정된 혼합균주(LB+LP)를 2.5%, 5% 및 7%를 접종하고, 온도는 30℃, 35℃ 및 40℃로 설정하며, 0, 24, 48, 72, 96, 120 시간동안 조건별 생물전환 시킨 후 이화학적 특성 및 항산화 활성 등을 확인하였다.
우선, 도 2는 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마 발효물의 pH 및 산도 변화에 관한 도면이다.(천마 : 균을 첨가하지 않은 천마, 천마LB : Lactobacillus brevis균 이용 발효물, 천마LP : Lactobacillus plantarum 이용 발효물, 천마LB+LP : Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus plantarum 혼합균 이용 발효물)
발효 중 일어나는 가장 큰 변화는 젖산균에 의해 재료 내에 있는 당분이 젖산이나 유기산으로 변화하여 pH가 감소하고 산도가 증가하는 것이며 pH와 산도의 변화는 발효 정도를 짐작 할 수 있는 중요한 지표, 발효 중 pH는 초기에는 큰 차이가 없었으나 발효가 진행됨에 따라 LB:Lactobacillus brevis(KCTC 3102, LB)균, LP:Lactobacillus plantarum(KCTC 21024, LP)균을 혼합사용하여 발효한 천마가 낮아지는 결과를 나타내었다.
발효가 진행됨에 따라 LB:Lactobacillus brevis(KCTC 3102, LB)균, LP:Lactobacillus plantarum(KCTC 21024, LP)균을 혼합사용하여 발효한 천마의 산도값이 높아지는 결과를 나타내었다. 실험 결과 pH가 낮아짐에 따라 산도가 증가하는 경향을 나타내는데 이는 숙성이 진행되면서 미생물에 의해 생성된 젖산 등의 다양한 유기산 생성에 의해 기인한 것으로 판단되어진다.
도 3은 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마 발효물의 생균수 변화에 대한 도면이다.(천마 : 균을 첨가하지 않은 천마, 천마LB : Lactobacillus brevis균 이용 발효물, 천마LP : Lactobacillus plantarum 이용 발효물, 천마LB+LP : Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus plantarum 혼합균 이용 발효물)
균수의 증가의 변화를 살펴본 결과, 발효시간에 따른 pH와 산도의 변화에 비례하여 생균수가 증가하였다고 보고되어져 있으며, 본 연구에서도 발효시간에 따른 pH와 산도의 변화에 비례하여 pH 감소(도 2) 및 산도가 증가(도 3)하였으며 특히 혼합균(LB+LP)에서 높은 함량을 나타내어 균의 증식이 촉진된 것으로 사료된다.
도 4는 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 총 페놀함량에 관한 도면이다.(W : 균을 첨가하지 않은 천마, LB : Lactobacillus brevis균 이용 발효물, LP : Lactobacillus plantarum 이용 발효물, LB+LP : Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus plantarum 혼합균 이용 발효물)
발효하여 비교해 본 결과 L. brevis(Lactobacillus brevis)와 L. plantarum(Lactobacillus plantarum)의 혼합균주 사용했을 때 가장 높은 함량을 보였고, 발효가 진행됨에 3일차에 각각 527.49±65.86 mg GAE/100g(천마), 4839.82±69.33 mg GAE/100g(LB), 4963.45±13.48 mg GAE/100g(LP), 4782.51±18.97 mg GAE/100g(LB+LP), 4일차에 4508.65±66.73 mg GAE/100g(천마), 4473.04±59.51 mg GAE/100g(LB), 5169.36±66.45 mg GAE/100g(LP), 5331.05±15.63 mg GAE/100g(LB+LP)으로 총페놀 함량이 높아짐을 나타내었다.
도 5는 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 총 플라보노이드함량을 나타낸 도면이다. (W : 균을 첨가하지 않은 천마, LB : Lactobacillus brevis균 이용 발효물, LP : Lactobacillus plantarum 이용 발효물, LB+LP : Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus plantarum 혼합균 이용 발효물)
발효하여 비교해 본 결과 L. brevis와 L. plantarum의 혼합균주를 사용했을 때 가장 높은 함량을 보였고 0h-21.46±1.48 mg CE/100g, 48h-37.76±2.94 mg CE/100g으로 120h 까지 발효가 진행됨에 따라 총플라보노이드 함량이 높아짐을 나타내었다.
도 6은 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 항산화활성(DPPH, IC50(㎍/mL))을 나타낸 도면이다.
대조군인 ascorbic acid의 IC50은 11.46±0.76 ㎍/mL이었으며 DPPH radical 소거능의 IC50값을 비교해 본 결과 0시간에서 214.77±1.86㎍/mL (천마), 209.11±2.05 ㎍/mL (LB), 200.46±2.04㎍/mL (LP), 199.46±1.94 ㎍/mL (LB+LP)으로 나타났으며 발효가 진행됨에 따라 IC50값이 점점 낮아져서 3일에는 104.45±0.62 ㎍/mL(천마), 108.02±2.04 ㎍/mL(LB), 109.71±2.77 ㎍/mL(LP), 102.01±1.74 ㎍/mL(LB+LP)이고 4일에는 90.46±1.96 ㎍/mL(천마), 97.74±1.83 ㎍/mL(LB), 108.07±2.04 ㎍/mL(LP), 103.79±2.13 ㎍/mL(LB+LP)로 IC50값이 낮아져 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았으며 이후 IC50값이 증가하면서 120시간에서 120.91±1.83 ㎍/mL(천마), 128.13±2.70 ㎍/mL(LB), 140.17±0.91 ㎍/mL(LP), 137.43±0.86 ㎍/mL(LB+LP)로 나타났다. 미생물 균주별로 발효하여 비교해 본 결과 L. brevis와 L. plantarum의 혼합균주를 사용하여 72h까지 발효가 진행됨에 따라 0h-199.46±1.94 ㎍/mL, 48h-159.76±1.62 ㎍/mL으로 IC50값이 가장 낮았으며 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았다.
도 7은 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 항산화활성(ABTS, IC50(㎍/mL))를 나타낸 도면이다.
대조군인 Ascorbic acid의 IC50은 10.80±1.24 ㎍/mL이었으며, ABTS radical 소거능의 IC50값을 비교해 본 결과 0시간에서 182.14±1.82 ㎍/mL (천마), 184.17±2.64 ㎍/mL (LB), 186.45±2.83 ㎍/mL (LP), 180.46±2.08 ㎍/mL (LB+LP)으로 나타났으며 발효가 진행됨에 따라 IC50값이 점점 낮아져서 3일에는 100.45±1.03 ㎍/mL(천마), 93.78±0.36 ㎍/mL(LB), 92.41±0.27 ㎍/mL(LP), 88.76±0.75 ㎍/mL(LB+LP)이고, 4일에는 90.78±1.79 ㎍/mL(천마), 80.17±078 ㎍/mL(LB), 79.46±3.71 ㎍/mL(LP), 78.46±1.46 ㎍/mL(LB+LP)로 IC50값이 낮아져 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았으며, 이후 IC50값이 증가하면서 120시간에서 132.45±0.90 ㎍/mL(천마), 129.46±0.69 ㎍/mL(LB), 130.78±0.34 ㎍/mL(LP), 111.76±1.11 ㎍/mL(LB+LP)으로 나타났다. 미생물 균주별로 발효하여 비교해 본 결과 L. brevis와 L. plantarum의 혼합균주 사용이 0h-180.46±2.08 ㎍/mL, 48h-161.78±124 ㎍/mL으로 IC50값이 가장 낮았으며 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았다.
상술한 바와 같이, 우수균주 확보를 위해 균을 접종하지 않은 천마, 맥아배지에 종균배양한 Lactobacillus brevis(KCTC 3102, LB), Lactobacillus platarum(KCTC 21024, LP)균주, 혼합균주(LB+LP)로 균 접종량 2.5%. 온도 35℃, 0 ~ 5일 발효로 동일조건하에 실험을 진행하여 천마의 이화학적 특성 및 생리활성 측정 결과 단일 균을 사용 하는 것 보다는 복합균주(혼합균주)를 사용한 것이 효과가 전반적 우수하게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
도 8은 미생물접종량과 온도에 따른 천마발효물의 pH 변화를 나타낸 도면이고, 도 9는 미생물접종량과 온도에 따른 천마발효물의 산도 변화를 나타낸 도면이고, 도 10은 미생물접종량과 온도에 따른 천마발효물의 생균수 변화를 나타낸 도면이다. (1)LB+LP:Lactobacillus brevis 및 Lactobacillus plantarum의 혼합균 이용 발효물, 2)Control:균 첨가 하지않은 천마발효물, 3)2.5% : 혼합균2.5%를 첨가한 천마발효물, 4)5% : 혼합균5%를 첨가한 천마발효물, 5)7% : 혼합균7%를 첨가한 천마발효물)
도 8에 나타난 바와 같이, 균을 첨가하지 않은 천마와 선정된 혼합균주(LB+LP)를 2.5%, 5% 및 7% 접종한 천마를 각각 30℃, 35℃ 및 40℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 120시간동안 발효하여 측정한 결과 유의적인 차이를 보인 pH는 0, 72, 120h이었으며 각 실험군 사이의 pH에서는 큰 차이는 없었으나 35℃에서 발효한 천마발효물이 그 중 가장 pH의 변화가 크며 낮았고, 발효가 진행됨에 따라 공통적으로 3일째에서 가장 낮은 pH를 나타냈고, 그 후 서서히 올라 5일째에는 높은 값을 나타냈다.
도 9에 나타난 바와 같이, 균을 첨가하지 않은 천마와 선정된 혼합균주(LB+LP)를 2.5%, 5% 및 7% 접종한 천마를 각각 30℃, 35℃ 및 40℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 120시간동안 발효하여 측정한 결과 유의적인 차이를 보인 산도는 0, 72, 120h이었으며 각 실험 군 사이의 산도에서는 큰 차이는 없었으나 35℃에서 발효한 천마발효물이 그 중 가장 산도의 변화가 크며 높았고 발효가 진행됨에 따라 공통적으로 3일째에서 가장 높은 산도를 나타냈고 그 후 서서히 낮아져 5일째에는 낮은 값을 나타냈다. 35℃ 천마발효물의 0일에서 각각 0.72±0.83(천마), 0.70±1.14(2.5%), 0.74±0.79(5%) 및 0.74±0.79(7%)였으며 3일에서 각각 1.06±1.92(천마), 1.44±1.68(2.5%), 1.4±1.32(5%) 및 1.32±0.89(7%)으로 낮아졌으며, 그 후 5일째까지 서서히 올라 0.68±1.22(천마), 0.99±0.44(2.5%), 0.86±0.65(5%) 및 0.82±0.52(7%)을 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 발효시간에 따른 pH와 산도의 변화에 비례하여 생균수가 증가하였다고 보고되어져 있으며, 본 연구에서도 발효시간에 따른 pH와 산도의 변화에 비례하여 pH 감소 및 산도가 증가하였으며 특히 35℃에서 2.5% 접종한 발효물에서 높은 함량을 나타내어 균의 증식이 촉진된 것으로 사료된다.
또한, 도 11은 미생물접종량과 온도에 따른 천마발효물의 총 페놀함량을 나타낸 도면이고, 도 12는 미생물접종량과 온도에 따른 천마발효물의 총 플라보노이드함량을 나타낸 도면이며, 도 13은 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 항산화활성((DPPH radical scavening activity)-IC50(㎍/mL))을 나타낸 도면이고, 도 14는 미생물균주 및 발효시간에 따른 천마발효물의 항산화활성((ABTS radical scavening activity)-IC50(㎍/mL))을 나타낸 도면이다. (Control:균 첨가 하지않은 천마발효물, 2.5% : 혼합균2.5%를 첨가한 천마발효물, 5% : 혼합균5%를 첨가한 천마발효물, 7% : 혼합균7%를 첨가한 천마발효물)
도 11에 나타난 바와 같이, 발효하여 비교해 본 결과 온도 35℃에서 2.5% 혼합균주를 첨가한 천마발효물에서 가장 높은 함량을 나타내었으며 0h-2894.54±1.6 mg GAE/100g(2.5%)에서 72h-5538.51±1.97 mg GAE/100g(2.5%)을 나타내었다.
또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 발효하여 비교해 본 결과 온도 35℃에서 2.5% 혼합균주를 첨가한 천마 발효물에서 가장 높은 함량을 나타내었으며 0h-211.98±1.57 mg CE/100g (2.5%)에서 72h-25.11±2.05 mg CE/100g (2.5%)을 나타내었다.
또한, 도 13에 나타난 바와 같이, 발효하여 비교해 본 결과 온도 35℃에서 2.5% 혼합균주를 첨가한 천마 발효물에서 발효가 진행됨에 따라 0h-279.55±0.75 ㎍/mL (2.5%)에서 72h-94.35±1.52 ㎍/mL(2.5%)로 IC50값이 가장 낮았으며 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았다.
또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 발효하여 비교해 본 결과 온도 35℃에서 2.5% 혼합균주를 첨가한 천마 발효물에서 발효가 진행됨에 따라 0h-183.62±1.44 ㎍/mL (2.5%)에서 72h-175.69±0.64㎍/mL(2.5%)로 IC50값이 가장 낮았으며 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았다.
상술한 바와 같이, 생물전환기술 조건확립을 위해 균을 접종하지 않은 천마, 선정된 혼합균주(LB+LP)를 2.5%, 5% 및 7%를 접종하고, 온도는 30℃, 35℃ 및 40℃로 설정하고, 0, 24, 48, 72, 96, 120시간 동안 조건별 생물전환 시킨 후 이화학적 특성 및 항산화 활성 등을 확인하였다. pH는 35℃에서 3일째 발효한 천마발효물이 가장 pH의 변화가 크며 낮은 값을 나타내었고 산도는 35℃에서 3일째 발효한 천마발효물이 0일-0.70±1.14(2.5%), 3일-1.44±1.68(2.5%)로 그 중 가장 산도의 변화가 크며 높았다. 생균수는 발효시간에 따른 pH와 산도의 변화에 비례하여 35℃에서 2.5% 접종한 발효물에서 높은 함량을 나타내어 균의 증식이 촉진된 것으로 사료된다. 총 페놀, 플라보노이드 함량은 L. brevis와 L. plantarum의 혼합균주를 2.5% 사용하여 35℃에서 3일 발효한 천마발효물에서 높은 함량을 나타내었고 항산화활성에서도 총 페놀, 플라보노이드 함량과 비례적인 관계를 나타내었다. 측정 결과 단일 균 2.5%를 첨가한 발효물을 35℃에서 3일동안 발효한 것이 효과가 전반적 우수하게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
한편, 천마 발효 조건의 확립을 위한 실험 분석 결과를 이하 도면을 참고하여 설명한다.
우선, 증숙 건조하여 분말화 한 천마 200kg에 20배수의 물을 넣어 85℃에서 4시간동안 당화한 후 식혀 천마 당화액을 제조하고, 맥아배지에 종균 배양한 Lactobacillus brevis(KCTC 3102, LB)균주와 Lactobacillus platarum(KCTC 21024, LP)균주를 혼합한 혼합균주인 (LB+LP)균을 상기 천마 당화액의 5중량% 준비한 후 상기 천마 당화액에 첨가하여 교반한 뒤 발효탱크에서 35℃에서 3일간 발효하여 천마 발효물(또는 생물전환 천마 발효물)을 시료로서 제조한다.
상기 천마 발효물의 pH 측정을 위해, 시료로부터 원심분리기(CF-10, DAIHAN Scientific Co., Ltd. Korea)를 이용하여 얻은 상등액을 pH meter (model 3510, Jenway, UK)를 사용하여 측정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
또한, 상기 천마 발효물의 총산 측정을 위해, 총산은 시료를 원심분리 후 얻은 상등액 1 mL를 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.2±2까지 중화시키는데 소요된 0.1N-NaOH의 소비 mL 수를 구하고 아래 식에서와 같이 젖산(lactic acid)양으로 총산을 환산하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
젖산 % =0.9×0.1N-NaOH 소비량(mL)/시료 채취량(1 mL)
또한, 상기 천마 발효물의 생균수 측정을 위해, 생균수 측정은 각각의 시료를 생리식염수에 단계별로 희석하여 MRSA 배지에 도말하고 30℃에서 48시간 배양 후 나타난 젖산균 특유의 colony를 측정하여 생균수(log cfu/mL)로 나타내었다. 각 실험은 3회 반복하여 수행하였으며 평균값으로 나타내었다.
도 15는 생물전환 천마발효물의 pH, 산도 및 생균수 변화를 나타낸 도면이다.(LB+LP:Lactobacillus brevis 및 Lactobacillus plantarum 5% 혼합균 이용 발효물)
앞 실험 결과에 따라 혼합균주 5%를 첨가하여 35℃에서 72h 발효한 천마를 생물전환 최적조건으로 확립하였으며. 천마(LB+LP-5%)를 첨가하여 35℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 120시간 동안 발효하여 측정한 결과 pH는 각각 4.86±0.24(0h), 4.54±0.82(24h), 4.00±0.16 48h), 3.94±049(72h),4.06±0.64(96h) 및 4.09±0.27 (120h)으로 72시까지 서서히 감소하여 발효 중 가장 낮은 값을 나타내었고 그 이후 발효 120시간까지 점차 높아짐을 나타내었다. 도는 각각 0.92±0.15(0h), 1.36±0.43(24h), 1.5±0.43(48h), 1.46±0.58(72h), 1.43±0.85(96h) 및 1.38±0.54(120h)으로 72시까지 서서히 높아져 발효 중 가장 높은 값을 나타내었고 그 이후 발효 120시간까지 점차 낮아짐을 나타내었다. 생균 수는 각각 8.86±0.55 log cfu/g(0h), 11.26±0.8 log cfu/g(24h), 12.11±0.37 log cfu/g(48h), 12.30±0.91 log cfu/g(72h), 11.02±0.11 log cfu/g(96h) 및 10.64±1.00 log cfu/g(120h)으로 발효가 진행되면서 발효 3일째인 72시간에 12.30±0.91 log cfu/g(72h)로 최대균수를 나타낸 후 10.64 log cfu/g(120h)으로 감소하였다.
상기 천마 발효물의 총페놀 함량 측정을 위해, 추출 및 발효물 10 ㎕에 2% Na2CO3 용액 200 ㎕ 첨가하여 3분간 정치시켰다. 그 다음 2N Folin-Ciocalteu phenol 시약 10 ㎕ 첨가 및 혼합한 후 30℃ incubator에서 27분 동안 발색시켰다. 발색된 시료는 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준 검량곡선에 의해 값을 산출하였다.
도 16은 생물전환 천마발효물의 총 페놀함량을 나타낸 도면으로서, 각각 3558.53±45.8 mg GAE/100g(0h), 4527.55±98.95 mg GAE/100g(24h), 5544.59±9.71 mg GAE/100g(48h), 5161.34±75.46 mg GAE/100g(72h), 4257.41±49.64 mg GAE/100g(96h) 및 3140.92±89.32 mg GAE/100g(120h)으로 발효가 진행되면서 발효 3일째인 72시간까지 활성이 점차 높아져 5161.34±75.46 mg GAE/100g(72h)로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 점차 낮아서 발효 120시간에서 3140.92±89.32 mg GAE/100g(120h)으로 나타났다.
상기 천마 발효물의 총플라보노이드 함량 측정을 위해, 추출물 및 발효물 10 ㎕, 증류수 117 ㎕, 5% NaNO2 27.5 ㎕를 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 10% Al3·6H2O 15㎕를 첨가하여 37℃에서 6분간 반응하였다. 그 후 1N NaOH 50㎕를 첨가하여 37℃에서 11분간 반응정지 시켰다. 반응정지된 시료를 microplate reader를 사용하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 카테킨(catechins)을 이용하여 작성한 표준검량곡선에 의해 값을 산출하였다.
도 17은 생물전환 천마발효물의 총 플라보노이드함량을 나타낸 도면으로서, 각각 16.27±0.69 mg CE/100g(0h), 15.29±0.71 mg CE/100g(24h), 18.35±0.24 mg CE/100g(48h), 18.22±0.99 mg CE/100g(72h), 1698±0.40 mg CE/100g(96h) 및 14.50±1.15 mg CE/100g(120h)으로 발효가 진행되면서 발효 2일째와 발효 3일째가 유의적인 차이는 없었으나 발효 3일째인 72시간까지 활성이 점차 높아져 18.22±0.99 mg CE/100g(72h)으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 점차 낮아서 발효 120시간에서 14.50±1.15 mg CE/100g(120h)으로 나타났다.
상기 천마 발효물의 DPPH 소거활성 측정을 위해, 추출물 및 발효물 시료를 96-well plate에 10 ㎕ 와 사용 직전 만든 0.2 mM DPPH용액 190 ㎕를 섞은 다음, 실온의 암실에서 30분간 반응시켜 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하여 비교하였으며 DPPH radical 소거활성은 [1-(시료첨가구의 흡광도 / 음성대조구의 흡광도)]×100으로 계산하여 백분율로 나타내었다.
도 18은 생물전환 천마발효물의 항산화활성((DPPH radical scavening activity)-IC50(㎍/mL))을 나타낸 도면이다.(LB+LP:Lactobacillus brevis 및 Lactobacillus plantarum 5%혼합균 이용 발효물)
대조군인 Ascorbic acid의 IC50은 11.46±0.76 ㎍/mL이었으며 DPPH radical 소거능의 IC50값을 비교해 본 결과 각각 252.91±2.49 ㎍/mL (0h), 189.80±2.40 ㎍/mL(24h), 186.93±4.08 ㎍/mL(48h), 163.20±4.82 ㎍/mL(72h), 237.22±8.31 ㎍/mL(96h) 및 229.45±7.80 ㎍/mL(120h)으로 3일 째에서 IC50값이 가장 낮아 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았으며, 발효가 진행됨에 따라 IC50값이 증가하면서 120시간에서 229.45±7.80 ㎍/mL(120h)로 나타났다. 발효 3일째가 163.20±4.82 ㎍/mL(72h)로 IC50값이 가장 낮았으며 DPPH radical 소거활성이 가장 좋았다.
상기 천마 발효물의 ABTS 소거활성 측정을 위해, 7 mM ABTS 용액에 2.45 mM의 potassium persulfate를 1:1로 혼합한 다음 실온의 암실에서 24시간 방치시킨 후 ABTS radical (ABTS+·)을 만들고 732 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4) buffer로 희석하여 사용하였다. 96-well plate에 ABTS radical 용액 190 ㎕와 추출물 및 발효물 시료 10 ㎕를 첨가하여 1분동안 정치시킨 다음 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하였으며 ABTS radical 소거활성은 [1-(시료첨가구의 흡광도/음성대조구의 흡광도)]×100으로 계산하여 백분율로 표시하였다.
도 19는 생물전환 천마발효물의 항산화활성((ABTS radical scavening activity)-IC50(㎍/mL))을 나타낸 도면이다.
대조군인 Ascorbic acid의 IC50은 10.41±1.20 ㎍/mL이었으며 ABTS radical 소거능의 IC50값을 비교해 본 결과 각각 169.94±6.18 ㎍/mL (0h), 152.10±3.21 ㎍/mL(24h), 133.25±5.32 ㎍/mL(48h), 125.79±4.51 ㎍/mL(72h), 136.26±6.34 ㎍/mL(96h) 및 188.33±2.37 ㎍/mL(120h)으로 3일 째에서 IC50값이 가장 낮아 ABTS radical 소거활성이 가장 좋았으며, 발효가 진행됨에 따라 IC50값이 증가하면서 120시간에서 188.33±2.37 ㎍/mL((120h)로 나타났다. 발효 3일째가 125.79±4.51 ㎍/mL(72h)로 IC50값이 가장 낮았으며 ABTS radical 소거활성이 가장 좋았다.
이하 도면은 상기 천마 발효물에서 추출한 천마생물전환 추출물(이하, 천마 추출물)의 실험 분석 결과를 나타낸 도면이다.
우선, 상기 천마 추출물의 염증활성 및 성분 분석을 위해, 본 실험에 사용된 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 세포배양을 위해 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% P/S (penicilin-streptomycin)가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)배지를 사용하였다. 배양된 RAW264.7 세포가 80% confluent 되었을 때 PBS로 세척한 후 Cell Scraper를 이용해 세포를 탈착시켜 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 2일 간격으로 계대배양하였다.
또한, 상기 천마 추출물의 Raw 264.7 cell 세포생존율 측정 (MTS assay)을 위해, 천마 추출물에 대한 세포 독성은 5-(3-carboxyme thoxyphenyl)-2H-tetraza lium inner salt(MTS)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 96-well plate에 RAW 264.7 세포를 1×105 cells/mL가 되도록 분주한 다음 24시간 동안 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 예비 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(1000 ㎍/mL)로 세포를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 이후 well당 MTS solution 20 ㎕씩 가하고 CO2 incubator에서 4시간 반응시킨 뒤 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 20은 천마 추출물의 날짜별 Raw 264.7 대식세포에서 세포생존율 측정을 나타낸 도면으로서, MTS assay를 이용한 세포 독성 결과 천마 추출물 0~7일 모두에서 90%이상의 생존율을 보였다. 따라서 LPS는 천마 추출물 1000㎍/mL 농도에서 세포에 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
또한, 상기 천마 추출물의 산화질소(Nitric oxide) 함량을 측정하기 위해, NO의 농도는 96-well plate에 1×105 cells/mL가 되도록 분주하여 24시간 동안 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양한 후, 각 시료를 1000 ㎍/mL의 농도로 2시간 전처리한 다음 LPS(Lipopolysaccharide, 400 ng/mL)를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 배양액과 동일한 양의 Griess reagent를 넣은 후 microplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 NaNO2의 농도별 표준곡선을 기준으로 계산하였다.
도 21은 천마 추출물의 조건별 Raw 264.7 대식세포에서 LPS에 의한 산화질소 생성 효과를 나타낸 도면으로서, RAW264.7 세포에 1000 ㎍/mL 농도의 추출물을 넣은 후 2시간 후 LPS를 첨가하여 처리하였다. NO assay 결과는 도 21에 나타난 바와 같이 LPS 단독으로 처리된 세포에서는 10.15±0.31 μM 의 NO 생성을 나타내었는데 1000 ㎍/mL 농도에서는 3일과 7일이 비교적 높은 억제율을 보였다. LPS 처리를 하지 않은 세포의 경우 0.65 μM의 NO 분비량을 나타내었으며, 72, 76%의 NO 생성 억제 효과를 나타내었다. RAW 세포에서 LPS로 유도로 증가한 NO생성물이 천마 추출물로 인해 억제되는 것을 확인하였다. 7일이 경과한 천마추출물은 다른 날에 비해 높은 NO를 억제 하였으나 강한 신맛으로 사용이 불가하였고, 3일 처리한 것을 추출물을 사용하였다.
상기 천마 추출물의 성분 분석을 위해, 도 22에 도시된 바와 같이, 표준물질(Gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol) HPLC 분석을 실시 하였으며, 시료의 제조는 추출물 분말을 정확한 양을 취하여 증류수에 용해시켜 membrane filter로 여과하여 사용하였으며 본 과제에서는 50 mg/mL 농도로 제작하여 시료로 사용하였다. 지표성분은 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ㎍/mL의 농도로 MeOH에 녹여 만든 후 표준곡선 작성 및 정량시 표준용액으로 사용하였다. HPLC 분석기기는 Waters allience e2695 system(2998 photodiode array detector)을 사용하였고, 컬럼은 Luna(5um, 4.6×250mm, phenomenex Co.)를 사용하였으며, 이동상은 용매 A는 acetonitrile을 사용하였고, 용매 B는 증류수와 0.1% formic acid를 혼합하여 gradient program으로 하여 UV 흡광도 280 nm에서 측정하였다. 정량분석은 표준물질 Gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol의 peak area와 retention time을 비교하였다.
도 23은 천마 추출물의 표준물질 함량비교를 나타낸 도면으로서, 천마 추출물의 날짜별 표준 물질 함량 변화를 보면 Gastrodin의 경우 3일까지 함량이 조금씩 증가하였고 이후에는 함량이 감소하였다. 4-hydroxybenzyl alcohol 4일을 제외하고는 조금씩 증가하는 경향을 보였다.
상술한 바를 통해, 혼합균주 5%를 첨가하여 35℃에서 72h 발효한 천마를 생물전환 최적조건으로 확립하였으며. 천마(LB+LP, 5%)를 첨가하여 35℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 120시간 동안 발효하여 측정한 결과 pH는 서서히 감소하여 3일째 3.94±049로 가장 낮은 값을 나타내었고 산도는 3일 째 1.46±0.58로 가장 높은 값을 나타내었다. 생균수 역시 산도와 비례하여 3일에 12.30±0.91 log cfu/g의 값을 보여 최대균수를 나타내었다.
총 페놀과 플라보노이드 함량을 비교해 본 결과 35℃에서 혼합균주 5%를 사용하여 발효한 발효물은 3일째때 가장 높은 함량을 보였고 ABTS radical와 DPPH radical 역시 3일 째에서 IC50값이 가장 낮아 소거활성이 가장 좋았다.
전술된 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 천마를 분쇄하여 천마 분말을 포함하는 분쇄물을 준비하는 분말화 단계;
    상기 분쇄물과 물을 1:20의 중량 비율로 혼합한 혼합물을 제조한 후 상기 혼합물에 대한 당화 작업을 통해 천마 당화액을 준비하는 당화 단계;
    락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus platarum)의 혼합 균주를 상기 천마 당화액의 3 ~ 7중량%로 상기 천마 당화액에 접종하여 발효하는 발효 단계; 및
    상기 발효 단계를 통해 얻어진 발효물로부터 천마생물전환 추출물을 추출한 후 농축하여 얻어진 천마생물전환 농축액에 하수오 농축액, 배 농축액, 홍삼 농축액 및 산양삼 추출액을 미리 설정된 비율로 첨가하여 배합한 후 살균하여 천마 조성물을 제조하는 제조 단계
    를 포함하는 천마 조성물의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 당화 단계는 상기 혼합물을 55℃ ~ 65℃에서 3 ~ 5 시간 당화작업하여 상기 천마 당화액을 준비하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천마 조성물의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 발효 단계는
    상기 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타럼으로 이루어진 상기 혼합 균주를 맥아배지에 종균 배양한 다음 상기 천마 당화액에 접종하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천마 조성물의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 제조 단계는 상기 발효물로부터 80℃ ~ 90℃에서 23 ~ 25 시간동안 천마생물전환 추출물을 추출한 후 50Brix% ~ 55Brix%가 되도록 농축하여 천마생물전환 농축액을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천마 조성물의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 제조 단계는 상기 천마생물전환 농축액 25 ~ 35중량%에, 상기 하수오 농축액 15 ~ 25중량%, 상기 배 농축액 15 ~ 19중량%, 상기 홍삼 농축액 2~5%, 상기 산양삼 추출액 25 ~ 35중량%을 첨가하여 45Brix% ~ 50Brix%가 되도록 배합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천마 조성물의 제조 방법.
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