KR20220104575A - 염증개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

염증개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 염증개선과 기력증진 음료의 조성물로 제공하여 사용품질에 대한 신뢰성을 구현할 수 있도록,
바실러스 메가테리움 균주(바실러스 메가테리움[Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합한 다음, 10 ~ 20℃에서 13 ~ 17일간 배양하여 얻는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 제조방법을 제공한다.

Description

염증개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법{Composition for improving inflammation and improving energy and manufacturing method}
본 발명은, 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 수탁번호가 KCCM11676P(바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주)와 어성초(Houttuynia cordata Thunb)농축액 및 인삼농축액을 주재료로 혼합하여 염증개선과 기력증진 음료의 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.
현대 식생활 문화는, 가공식품과 저장식품 및 냉동식품 등으로 변화되고 있는 실정이며, 사회생활과 환경오염 등으로 받는 스트레스와 오염 등과 관련하여 대사성 증후군 질환들 및 당뇨병 등과 같은 성인병이 많이 발병하고 있는 실정이다.
그러나, 종래 의료 기술로는 상기와 같은 문제점들을 해소하지 못하고 있는 실정이다.
이에 따라, 근래에는 상기와 같은 문제점들을 개선할 수 있는 각종 건강보조식품(식음료)들이 개발되어 제안되고 있다.
일 례로, 각종 열매를 발효시켜 식음료로 이용함으로써 각종 비타민 등의 영양분을 균일하게 섭취할 수 있고, 열매의 특정 영양분으로 인한 성인병과 같은 현대병의 치료와 개선효과를 얻기 위하여 다양한 열매를 이용한 발효 식음료들이 제안되고 있다.
본원 발명의 츨원인은, 한국특허등록번호 제10-1583600호(특허문헌1)에서 신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도를 제안하였으며, 한국특허등록번호 제10-1938315호(특허문헌2)에서는, 상기 특허문헌1에서 제안된 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)이 적용된 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주를 이용한 건강 식음료 제조방법과 그 식음료를 제안한 바 있다.
이러한 본원 발명의 츨원인에 의해 제안된 특허문헌1, 2에서의 바실러스 메가테리움 균주는, 염증과 알러지성 피부염 등의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 적용된다.
그리고 바실러스 메가테리움 균주를 이용한 건강식음료 제조방법은 균주를 혼합하여 발효 숙성함으로써 열매에서 발생하는 떫은맛, 텁텁한 맛, 시큼한 맛, 또는 흙 맛 등을 중화시켜 깊고 감칠 맛 그리고 부드럽고 새콤하고 산뜻한 맛을 낼 수 있도록 한 효과와, 열매의 씨앗이 발효되면서 생성되는 아미그달린이 베타글루코시데이즈라는 분해효소에 의해 시안화수소라는 유독성분으로 변한 독소를 빠른 기간 내에 제거하는 효과를 가지는 것으로 한정되고 있다.
한편, 한국특허등록번호 제10-0404146호(특허문헌3)에서는, 어성초와 함께 다수의 식물군들을 혼합하여 얻어지는 추출물을 이용한 건강보조식품이 기재되어 있다.
그러나, 이와 같은 상기 특허문헌3에서 제안된 선행기술은, 여러가지의 식물군을 단순 혼합하고 숙성하는 것으로 각각의 식물로부터 발휘되는 효능 또는 추출물로 식물의 특성을 정확하게 이용할 수 없는 단점이 있고, 다수의 혼합물들이 서로 혼합되면서 기대와 달리하는 독성을 야기할 수 있는 위험성을 가지고 있다.
그리고, 한국특허공개번호 제10-2019-0085339호(특허문헌4)에서는, 인삼을 60 ~ 90℃에서 고형분 함량이 63% 이상, 홍삼 성분 50 ~ 80mg/g이 되도록 감압 농축한 다음 여과시킨 추출액을 90 ~ 100℃에서 10 ~ 30분간 살균하고 다시 살균된 농축액을 60 ~ 70℃에서 고형분 60 ~ 70%가 될 때까지 강압 농축시켜 얻어지는 인삼 농축액 및 인삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품 조성물이 기재되어 있다.
그러나 이러한 특허문헌4의 선행기술은, 단순히 인삼뿌리와 식물을 함께 혼합하여 적용한다는 것에 불과하고 농축과정 또는 알려진 과정에 불과하다는 문제점이 있다.
한국특허등록번호 제10-1583600호 한국특허등록번호 제10-1938315호 한국특허등록번호 제10-0404146호 한국특허공개번호 제10-2019-0085339호
상기와 같이 종래의 기술들을 통한 조성물 및 조성방법들은, 염증개선과 기력증진 음료의 조성물로는 사용품질에 대한 신뢰성을 구현하기 힘든 문제점이 있었다.
본 발명은, 상기와 같은 종래의 문제점들을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은, 염증성 질환 개선과 발효열매에서 발생하는 떫은맛, 텁텁한 맛 등을 중화시켜 부드럽고 새콤하고 산뜻한 맛을 낼수 있도록 함과 함께, 열매의 씨앗이 발효되면서 생성되는 아미그달린이 베타글루코시데이즈라는 분해효소에 의해 시안화수소라는 유독성분으로 변한 독소가 형성되는 문제를 개선하는 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주와, 숙변과 해독작용 및 여성질환에 효과적인 약리물질인 쿠에르치트린(Quercitrin)으로 이뇨, 강심, 향균 및 모세혈관 강화작용을 발휘하는 어성초(Houttuynia cordata Thunb)농축액, 그리고 사포닌의 폴리페놀 및 플라보노이드가 발휘하는 면역증강복합물로 알려진 인삼을 이용한 인삼농축액을 혼합하여 염증개선과 기력증진 음료의 조성물로 제공하여 사용품질에 대한 신뢰성을 구현할 수 있는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법를 제공하는 것에 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물은, 바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%을 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 제조방법은, 바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합하여 13 ~ 17일간 온도 10 ~ 20℃에서 배양한 것을 특징으로 한다.
이와 같이 이루어지는 본 발명에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법은, 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주를 통해 염증 및 알러지 반응을 개선시키고, 미백 효과가 우수하므로, 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료에 유용한 기능을 제공하는 효과를 가진다.
아울러, 어성초 농축액을 통해 다양한 질병성 세균에 대한 탁월한 항균성을 가지며 장복하면 염증성 질병이나 피부질병을 예방 및 치유할 수 있고 건강한 피부를 유지할 수 있으며 각종 천연당과 질 좋은 유기산이 첨가됨으로써 탁월한 식감을 확보할 수 있는 효과를 가진다.
이와 더불어, 인삼농축액을 통해 면역증강, 항산화 및 항암 기능을 제공하는 효과를 가진다.
도 1 및 도 2는 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주에 의한 염증성 사이토카인 유전자들의 발현 여부를 보인 개략 예시도
도 2는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주에 의한 서팍틴 검출 결과를 보인 개략 예시도
도 3은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주의 raw 2647 세포에 대한 독성 결과를 보인 개략 예시도
도 4는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주의 RBL-2H3 세포에 대한 독성 결과를 보인 개략 예시도
도 5는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주의 RBL-2H3 세포에 대한 독성 결과를 보인 개략 예시도
도 6은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주의 히스타민 유리 결과를 보인 개략 예시도
도 7은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주의 티로시나제 활성저해능 결과를 보인 개략 예시도
도 8은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 어성초농축액이 LPS-활성화시킨 BV-2 미세아교세포에 있어서 NO 생산에 미치는 효과를 나타내는 개략 예시도
도 9는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 어성초농축액에 대한 농도 의존적 MTT 세포독성시험을 나타낸 개략 예시도
도 10은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 어성초농축액에 대한 ESR에 DPPH 방법에 의한 항산화 효과를 나타내는 그래프도
도 11은 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 어성초농축액에 대한 BV-2 미세아교 세포에 있어서 iNOS 및 Cox-2의 LPS-유도 단백질 발현에 미치는 효과를 나타내는 개략 예시도
도 12는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 어성초농축액에 대한 배양된 BV-2 세포에 있어서 사이토카인 IL-6에 미치는 효과를 나타내는 개략 예시도
도 13 및 도 14는 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 시험/검사 성적서
이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물 및 그 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 실시 예는 여러 가지 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상세히 설명하는 실시 예로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서 도면에서의 요소의 형상 등은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해서 과장되어 표현될 수 있다. 각 도면에서 동일한 부재는 동일한 참조부호로 도시한 경우가 있음을 유의하여야 한다. 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 기술은 생략된다.
본 발명에 따른 일 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물은, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)균주와, 어성초(Houttuynia cordata Thunb)농축액, 그리고 인삼농축액을 주재료로 하여 이루어진다.
이에 따라, 상기 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주를 통해 염증 및 알러지 반응을 개선시키고, 미백 효과가 우수하므로, 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료에 유용한 기능을 제공하며, 상기 어성초 농축액을 통해 다양한 질병성 세균에 대한 탁월한 항균성을 가지며 장복하면 염증성 질병이나 피부질병을 예방 및 치유할 수 있고 건강한 피부를 유지할 수 있으며 각종 천연당과 질 좋은 유기산이 첨가됨으로써 탁월한 식감을 확보하게 되고, 상기 인삼농축액을 통해 면역증강, 항산화 및 항암 기능을 제공하게 된다.
이러한 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물은, 상기 바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 상기 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%가 혼합되어 이루어지며, 그 제조방법은, 상기 상기 바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 상기 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합하여 13 ~ 17일간(보다 바람직하게는, 약 15일간) 약 10 ~ 20℃에서 배양하여 제조하게 된다.
본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 실시예 :
바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합하여 배양 용기에서 적정온도인 10 ~ 20℃에서 13 ~ 20일간 배양하여 염증개선과 기력증증진 음료의 조성물을 수득한다.
이러한 본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물에서 이용되는 발효물 추출물을, 발효물에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있으며, 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물에서 이용되는 발효물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수도 있다.
이와 같이 이루어지는 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 상기 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주는, 천연 발효물에서 균주를 분리 동정하여 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 명명된(2015년 03월 16일자로 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터에 기탁된 기탁번호: KCCM11676P) 균주로서, 그 제조를 얻기 위한 발효물의 제조 과정은 다음과 같다.
먼저, 탱자 및 물엿을 각각 50 ~ 60 중량% 및 40 ~ 50 중량%로 배합하여 용기에 넣고 밀봉한 후 발효시킨다.
상기에서 발효는 1 ~ 3개월간 실시하는 것이 바람직하다.
이때, 발효를 1 ~ 3개월간 실시하면, 탱자와 물엿의 배합물은 부글부글 끓으면서 발효되어 발효물이 생기며, 내용물이 우러나온 탱자는 물 위로 떠오르게 되ㅁ므로 발효된 발효물에서 탱자를 제거한 후 보관한다.
상기에서 발효물을 장기간 보관하면 발효물의 표면에 점성의 표층액이 생기게 되는데, 이는 탱자로부터 나온 독성물질이다.
상기 독성물질을 제거하기 위해 발효물의 점성의 표층액을 마대 또는 한지로 흡수시켜 제거하는데, 이러한 제거는 1 ~ 2년간 반복적으로 수행함으로써, 독성물질이 제거된 맑은 발효물을 얻을 수 있다.
상기와 같이 이루어지는 천연 발효물에서 균주를 분리 동정하여 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주(2015년 03월 16일자로 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터에 기탁한 기탁번호: KCCM11676P 균주)를 얻는다
이와 같이 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)는 탱자 천연 발효물로부터 분리한다.
상기 분리된 균주는 혈액한천평판배지(BAP, Blood Agar Plate), 티오글리코레이트 브로스(Thioglycolate broth, 소디윰 티오글리코레이트가 포함된 혐기성 액체배양 배지) 배지에서 pH 7-8, 37℃ 조건에서 배양이 가능하고 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주 보존이 가능하며, 산소 요구성은 호기성이고, 16S rDNA 시퀀싱 결과 16s rDNA 염기서열은 기존의 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주와 99%의 상동성을 보였는바, 바실러스 메가테리움으로 동정한다.
상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 분자생물학적 특성은 다음과 같다.
본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 분자생물학적 특성을 조사하였다.
먼저, PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 염증관련 사이토카인으로 알려진 TNF-α, IL-4, IL-10, COX-2 유전자들의 발현 여부 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, RBL-2H3 비만세포에 a+ TO 세포 시료를 001%, 005%, 01% 농도로 처리하여 유전자 발현양을 RT-PCR로 확인했을 때, 대조군인 GAPDH(house keeping gene)는 모든 샘플에서 동일하게 발현되었고, 염증관련 사이토카인인 TNF-α, IL-4, IL-10, COX-2 유전자 발현은 대조군과 비교하여 저농도인 001%일 때 고농도인 01%일 때보다 발현양이 감소하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 001%에서 항염 효능이 가장 좋다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)가 생성하는 항균물질의 분리를 위하여, HPLC를 수행하여 본 균주의 서팩틴 생산 여부를 조사하였다
본 균주가 생성하는 항균물질을 당업계에 공지된 방법에 따라 분리하였다.
본 균주를 배지(polypeptone 10 g, glucose 10 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 05 g, pH 68)에서 30℃의 조건으로 4일 동안 배양한 다음 배양액을 원심분리하여 상등액만을 얻었다.
상기 상등액에 6N HCl를 가하여 pH를 20으로 조절한 후 6,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 침전물만을 취한 다음 침전물을 메탄올에 추출하여 본 실험에 사용하였다.
상기 메탄올에 추출된 산 침전물은 크로마토그래피에서 chloroform/methanol(6/4)의 용매조건으로 전개한 후 확인하였으며 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 펩타이드성 항균물질을 분리하였다.
HPLC 분석에 사용된 용매는 01% trifluoroacetic acid/water(4/1=v/v), flow rate는 1ml/min이고 205nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 항진균, 항미생물 활성을 갖는 것으로 알려진 서팩틴의 검출을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 특정 성분의 증가 유도를 확인하였다.
장뇌삼의 유효성분을 EtOH로 추출한 경우와 본 발명의 균주가 포함된 조성물을 이용한 발효배양액으로 추출한 경우를 비교하였다.
그 결과, 아래의 표 1에 나타낸 바와 같이, 장뇌삼에 본 발명의 균주를 접종하여 발효 배양시 유효 성분들을 탁월하게 인리치먼트(enrichment)할 수 있었다.
Figure pat00001
그리고 본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 세포 독성, 항알러지 및 항아토피 효과를 확인하였다.
상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 인 비트로 세포독성은 세포의 미토콘드리아 활성에 의존하여, 세포의 생존을 결정할 수 있는 WST-1반응액에 의해 측정되었다.
세포생존율은 raw 2647 세포와 RBL-2H3 세포에서 평가하였으며, 시료를 제외한 배양배지만 처리한 값 (control)에 대한 백분율로 나타내었다. 시료의 농도는 본 균주 원액을 100%로 간주하고 세포배지에 희석하여 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, raw 2647 세포에 대해 본 균주는 01% 이하 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다.
따라서 raw 2647 세포를 이용한 추후 시험에서 사용되는 본 균주의 최고 농도는 01%로 선택하였다.
한편, RBL-2H3 세포에 대해 본 균주는 도 4에 나타낸 바와 같이, 1% 이하 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다.
따라서 RBL-2H3 세포를 이용한 추후시험에서 사용되는 시료의 최고 농도는 1%로 선택하였다
또한 본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 아토피 개선 효능을 평가하기 위해서, 아토피의 대표적인 인자인 히스타민의 유리된 정도를 측정하였다.
본 시험은 생약 한약 제제의 효력 시험 가이드라인(2010 6 발행)을 바탕으로 시행하였다.
히스타민은 RBL-2H3 세포에서 A23178(Calcium ionophore)을 처리시에 유리되므로, 이에 본 시험에서도 RBL-2H3 세포를 이용하여 본 균주가 히스타민 유리에 미치는 영향을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, RBL-2H3 세포에서 A23178(Calcium ionophore)을 처리하였을 때, 대조군에 비하여 유리된 histamine 양이 1614% 증가함을 통해 RBL-2H3 세포에서 탈과립을 유도하여 아토피가 발생됨을 확인할 수 있었다.
한편, 양성대조군으로 사용되는 dexamethasone을 각각 100ppm 처리하였을 경우, 대조군에 비하여 유리된 histamine 양이 1174%로 A23178 (Calcium ionophore) 단독 처리군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소하였다.
또한, 본 균주를 01%, 05%, 1%로 처리한 후 유리된 histamine 양을 ELISA kit를 이용하여 측정한 결과, 대조군에 비하여 각각 1562%, 1539%, 1317%의 histamine이 유리되었다.
이는 세 농도에서 농도의존적으로 감소하였으며, 특히, 농도 05%와 1%에서 통계적으로 유의하게 감소하였다.
따라서, 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)는 아토피 개선 효능을 갖는 것으로 나타났다
그리고 본 발명자는 상기 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 미백 효과를 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 방법에 따라, 인 비트로 티로시나제(In vitro tyrosinase) 어세이를 실시하여 티로시나제 활성저해능을 확인하였다.
상기 티로시나제는 인체 내에서 멜라닌 생성에 관여하는 효소로써, 알부틴이 대표적으로 이 효소를 억제하는 미백 성분으로 알려져 있다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 균주는 티로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 저해함으로써, 대조군인 알부틴(도 5a)과 유사한 정도의 미백 효과가 있음을 알 수 있었다.
또한, 아토피 개선 효능을 평가하기 위해서, 아토피의 대표적인 인자인 히스타민의 유리된 정도를 측정하였다.
상기와 같이 이루어지는 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 상기 어성초 농축액의 제조과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 어성초를 세척하고 잘게 썰어서 물이 담긴 용기에 넣어 85 ~ 170℃로 1 ~ 8시간 가열하여 물의 양이 최초의 양보다 2/3 ~ 2/4이 될 때까지 끓인 다음 고형물을 걸러내고 농축액만을 제조하는 공정을 통하여 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 상기 어성초 농축액을 얻는다.
상기에서 어성초(漁腥草, Houttuynia cordata Thunb)는, 삼백초와 함께(Saururus chenensis Bail) 삼백초과(Saruraceae)에 속하는 다년생 초본의 야생약초로서 높이는 25 ∼ 30㎝이고 줄기는 가늘고 붉은 보라빛을 띄며 잎은 심장 모양이고 끝이 뾰족하고, 잎은 고구마나 메밀잎과 비슷하며 잎과 줄기의 즙액에서 생선 비린내와 매우 비슷한 냄새가 있어 어성초(漁腥草)라 불린다.
이러한 어성초의 주요 성분으로는 테르페노이드(terpenoid), 지질(lipid) 및 방향족계통의 휘발성 성분과 쿼세틴(quercetin), quercetin-3-o-glycoside 계통의 후라보노이드 화합물로 알려져 있으며, 이뇨작용, 진통작용, 지혈작용, 항균작용, 항바이러스작용, 항혈관확장작용 및 소염작용 등의 다양한 약리작용으로 예로부터 생약재로 널리 이용되어 왔을 뿐만 아니라 삼백초와 더불어 유망 건강식품소재 가운데 하나이다.
구체적으로, 해열, 해독, 폐렴, 말라리아, 수종, 백대하, 치질, 피부병 등의 치료와 항균, 이뇨, 진통, 지혈, 조직 재생 촉진 등의 작용에 쓰이며, 최근에는 항산화성 헬퍼 심플렉스 바이러스 타입 1(herper simplexvirus type 1), 인간 면역결여 바이러스 타입 1(human immunodeficiency virus type 1) 및 인플루엔자 바이러스(influenza virus)에 대한 억제 효과, 항종양, 항백혈병, 고지혈 억제 효과, 카드뮴에 대한 독성억제효과, 브로모벤젠대사계에 미치는 어성초의 영향 등이 보고되었다.
한편, 성분연구로는 포화지방산이 398%, 불포화지방산이 5976%로 주로 정유 성분, 알카로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoid), 스테로이드(steroid) 등이 보고되었다.
본 발명자는 상기 어성초 농축액이 BV-2 미세아교세포에 있어서 미세아교세포 활성 및 LPS-유발 Cox-2, iNOS 단백질 발현 및 NO 생산을 억제할 수 있음을 발견하였다.
상기 미세아교세포의 활성화는 염증성 사이토카인류 및 NO를 방출하고, 이어서 이웃하는 방관자 뉴우런의 세포사멸을 유발한다.
다양한 자극원에 의해 활성화된 미세아교세포로부터의 과도한 NO 및 사이토카인 생산은 독성을 가질 수 있으며 신경 세포 치사를 매개할 수 있음이 제시된 바 있다.
염증성 신경퇴행 질환의 실험 모델에 있어서 가장 널리 사용되는 LPS는 전염증성 사이토카인류의 상당한 상승과 이어지는 NO 방출과 함께 미세아교세포의 활성화를 유도한다(Hou RC, Chen HL, Tzen JT,Jeng KC Effect of sesame antioxidants on LPS-induced NO production by BV2 microglial cellsNeuroreport 2003;14:1815-1819).
본 발명자의 결과는, 도 8에서 도시된 바와 같이, 상당히 증가된 NO 수준을 나타내었고, 도 12에서 도시된 바와 같이, IL-6의 사이토카인을 현저히 유발하였으며, 도 8 및 도 11와 도 12에서 도시된 바와 같이, 어성초 농출액 전처리는 BV-2 미세아교세포에 있어서 NO, 및 IL-6 생산을 상당히 완화시켰다.
이들 결과로부터, 어성초 농축액이 LPS-유도 미세아교세포 활성화에 대하여 항염증성작용을 갖는 것이 명백하다.
한편, 도 10에서 도시된 바와 같이, 어성초 농축액을 In vitro에서 항산화를 측정한 결과 농도 의존적으로free radical 소거능력이 80% 이상으로 현저하게 항산화 효과가 있음을 밝혔다.
NO는 NOS 패밀리(family) 아이소자임에 의해 발생하여 L-아르기닌을 L-시트룰린 및 NO로 전환시키는 것으로 알려져 있다(참조문헌: Nathan C Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make? J ClinInvest 1997;100:2417-2423).
iNOS 레벨은 미세아교세포에서 정상적으로 낮으나, iNOS는 LPS 처리를 포함하는 다양한 자극원에 응답하여 고도로 상승되게 조절될 수 있다.
일부 신경 독소 또는 LPS는 iNOS의 상승-조절을 유도하고, 이어지는 미세아교세포에서 NO 생산을 유도하는 반면, iNOS를 직접 억제할 경우, LPS-매개 미세아교세포의 활성화가 효율적으로 감소되었다(Hald A, Lotharius J Oxidative stress and inflammation in Parkinson's disease: is there a causal link? Exp Neurol2005;193:279-290).
본 발명자는 상기 어성초 농축액이 도 8 및 도 11에서 도시된 바와 같이, BV-2 세포에 있어서 LPS-유발 iNOS 단백질 발현 및 NO 생산을 완전히 약화시킬 수 있음을 밝혀 내었다.
축적된 결과들에 의하면, iNOS 및 많은 염증성 사이토카인류가 NF-kB를 포함하는 전자 인자들에 의해 조절됨을 나타낸다(Christman JW, Blackwell TS, Juurlink BH Redox regulation of nuclear factor kappa B:therapeutic potential for attenuating inflammatory responses Brain Pathol 2000;10:153-162).
결론적으로, 이러한 연구 결과는 미세아교세포에 있어서 항염 효과를 가지며, 상기 어성초 농축액이 NO 생산 및 BV-2 미세아교세포에 있어서 LPS에 의해 유발되는 iNOS 단백질 발현과 IL-6의 분비가 억제됨을 나타낸다.
상기 어성초 농축액의 작용 기전이 완전히 밝혀지지는 않았으나, 상기 결과는 어성초 농충액이 염증관련 신경퇴행성 질환의 유력한 치료제가 될 수 있음을 의미한다.
본 발명자는 상기 어성초 농축액이 BV-2 미세아교세포에서 LPS-유도 NO 생산을 억제하는지의 여부에 대하여 알아보고자 시험하였다.
NO의 생산은 배양 배지 중의 질산염의 축적에 의해 측정하였다. 세포 상층액을 LPS 처리 24시간 후에 수집하여 동일 용적의 Griess 시약(1% 술파닐아마이드, 01% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 및 25% 인산)과 혼합하였다.
흡광도는 플레이트 판독기(VersaMax; Molecular Devices, USA)를 사용하여 540nm에서 판독하였다.
질산 나트륨을 표준으로 사용하여 질산염의 농도를 계산하여 M으로 나타내었다
NO 생산에 대한 상기 어성초 농축액의 효과를 결정하기 위하여, BV-2 세포들을 어성초 추출물을 30분 동안 처리하고, LPS(1 ug/ml)를 첨가한 후, 24시간 후에 질산염의 농도를 배양배지 중에서 측정하였다.
도 8을 참조하여 보면, LPS 첼린지에 앞서 상기 어성초 농축액으로 전처리한 배양물 중의 NO의 양은 각각 42%(20ug/ml 어성초 농축액), 73%(40ug/ml 어성초 농축액) 및 94%(80ug/ml 어성초 농축액) 감소하였다.
첨부된 도 8은, LPS-활성화시킨 BV-2 미세아교세포에 있어서 NO 생산에 미치는 어성초 농축액의 효과를 나타내는 그래프도로써, BV-2 세포들을 LPS 처리(05 g/ml)에 앞서 정해진 농도로 30분 동안 어성초 농축액으로 전처리하였다.
LPS처리 24시간 후에 세포 배지 중의 질산염 레벨을 그리스 반응(Griess reaction)에 의해 결정하였다.
상기 어성초 농축액은, BV-2 미세아교세포에 있어서 농도-의존 방식으로 NO의 LPS-유도 생산을 상당히 감소시킨 반면, 모든 값은 3회의 독립적인 실험의 평균 SEM을 나타냈다.
*p<005 및 **LPS 단독에 비하여 p<001
첨부된 도 9를 참조하여 보면, 세포 생존능 분석 결과 세포 증식이나 세포독성이 상기 농도의 LPS 또는 어성초 농축액의 실험적 처리에 의해 영향을 받지 않은 것으로 나타났다.
본 발명자는 상기 어성초 농축액이 사이토카인에 미치는 영향을 알아보고자 시험하여 효소면역분석 (ELISA) 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
BV-2 배양물 중의 IL-6의 단백질 수준은 상업적인 ELISA 키트(R&D Systems, USA)를 제조원의 지시에 따라 측정하였다.
TNF-α의 양은 배양 상층액을 사용하여 결정하였다.
450nm에서의 흡광도는 플레이트 판독기에서 판독하고 사이토카인은 pg/ml로 나타내었다.
iNOS, IL-6의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다.
다양한 실험 조건에서 성장한 BV-2 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이어서 RIPA 완충액(PBS, 1% Nonidet P-40, 05% 소듐데옥시콜레이트, 01% SDS, 01mg/ml 페닐메틸설포닐 플루오리드, 30mg/ml 아프로티닌 및 1mM Na3VO4)에 용해시켰다.
추가의 세포 용해물의 제조물은 PVDF 멤브레인으로 전기 이동시키고, 증강된 ECL 화학발광 키트(GEHealthcare, USA)에 의한 단백질 검출을 상기한 바에 따라 수행하였다(Cho HS, Kim S, Lee SY, Park JA, KimSJ, Chun HS, Protective effect of the green tea component, L-theanine on environmental toxins-inducedeuronal cell death Neuroxoxicology 2008;29:656-662).
BV-2 세포에 있어서 어성초 추출물 및 LPS의 처리 후에 IL-6 생산의 조정 능력(modulation)을 조사하기 위하여 ELISA 분석을 수행하고, 첨부된 도 12에서 도시된 바와 같은 결과를 얻었다.
첨부된 도 10은, 배양된 BV-2 세포에 있어서 사이토카인 및 iNOS의 단백질 발현에 미치는 상기 어성초 농축액의 억제 효과를 나타내는 도면으로, 24시간을 자극하는 동안 LPS 및 상기 어성초 농축액에 대한 BV-2 세포의 반응을 ELISA에 의해 정량화하였다.
상기 어성초 농축액은 LPS-자극 BV-2 세포 모두에서 IL-1 및 IL-6 생산을 상당히 감소시켰다.
값은 4회의 독립적인 실험의 평균 SEM으로 나타냈다.
*LPS 단독에 비하여 p<005 iNOS 단백질의 발현은 16시간 LPS-자극시킨 세포에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다.
상기 어성초 농축액 전처리는 iNOS의 LPS-유도 상승 조절을 농도 의존적으로 상당히 억제하였다.
상대 농도계 밀도는 미처리 대조군의 값에 대한 비율로 평가하였다.
*LPS 단독에 비교하여 p<005
첨부된 도 11에서 나타낸 바와 같이, INOS 및 Cox-2의 LPS-유도 생산에 대한 상기 어성초 농축액의 억제 효과는 상당하였다.
상기 어성초 농축액은 IL-6 생산을 감소시켰다.
iNOS 단백질의 레벨은 웨스턴블롯 분석에 의해 검출하였다.
첨부된 도 11에서 나타낸 바와 같이, 상기 어성초 농축액 전처리는 iNOS 단백질 발현을 농도 의존적 방식으로 일관된 감소를 유도하였다.
농도계 분석에 의하면 LPS 처리전에 어성초 추출물(10 ∼ 80ug/ml)으로 전처리한 배양물에 있어서 iNOS단백질 레벨이 각각 38%(40ug/ml 어성초 추출물), 및 77%(80ug/ml 어성초 추출물) 감소하였음을 나타낸다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 상기 어성초 농축액을 포함하는 조성물은 BV-2 세포에 있어서 LPS-유발 유도성 질소 산화물 합성(iNOS) mRNA 발현 및 NO 생산을 완전히 약화시킬 수 있으므로 효율적인 항염증제 및 신경퇴행성 질환의 치료제로 효과적으로 사용될 수 있다.
이와 같이 이루어지는 본 발명의 실시 예에 의한 염증개선과 기력증진 음료의 조성물을 구성하는 상기 인삼농축액의 제조 과정은 다음과 같다.
먼저, 무농약 재배된 인삼의 뿌리, 줄기, 꽃, 및 잎을 원료로 사용하여, 추출용매 정제수에서 고형분 함량이 43% 이상, 홍삼 성분 50 ~ 80mg/g이 되도록 감압 농축시켜 농축액을 여과시키고, 여과된 추출액을 90 ~ 100℃에서 10 ~ 30분간 살균하고, 살균된 농축액을 60 ~ 70℃에서 고형분 60 ~ 70%가 될 때까지 강압 농축함으로 얻어지는 인삼 농축액을 얻는다.
상기 인삼은 무농약 재배되어 사포닌 성분이 다량 포함된 무농약 재배된 인삼의 뿌리, 줄기, 꽃, 및 잎을 사용하여 인삼 농축액을 제조할 수 있으며, 인삼 전부를 사용함으로써 고가의 뿌리를 원료로 할 때에 비하여 비용을 절감할 수 있는 효과와, 인삼의 뿌리, 줄기, 꽃, 및 잎을 사용하여 사포닌 성분이 다량 포함된 인삼 농축액을 얻고 다량의 사포닌은 면역증강, 항산화 및 항암 효과를 가짐으로써 건강기능식품의 기능성 원료로 사용될 수 있다
상기에서 인삼의 뿌리, 줄기, 꽃, 및 잎을 사용하여 제조된 인삼 농축액은 인삼 농축액 제조에 사용된 “인삼”은 백삼, 홍삼, 수삼, 흑삼, 미삼, 산삼, 장뇌삼 및 산양삼과 같은 다양한 종류를 포함하는 의미이며, 이러한 원료의 주요 성분은 아래의 표2와 같음은 주지되고 있다.
Figure pat00002
상기 '발효물'은 당업계의 어떠한 종류의 '발효물'도 포함하며 본 발명에서 이용되는 발효물질은 발효물 추출물, 발효물 엑기스, 발효물 농축액 또는 발효물 분말인데, 보다 바람직하게는 '발효물 추출물'이다.
이상에서 설명된 본 발명의 일 실시 예는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시 예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (4)

  1. 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물은, 바실러스 메가테리움 균주[바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서;
    상기 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주 75중량%와, 상기 어성초농축액 20중량%와, 상기 인삼농축액 5%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물.
  3. 바실러스 메가테리움 균주(바실러스 메가테리움[Bacillus megaterium) LJ2014로 기탁번호: KCCM11676P] 70 ~ 80 중량%와, 어성초 농축액 15 ~ 25 중량%와, 그리고 인삼농축액 5 ~ 7중량%를 혼합한 다음,
    10 ~ 20℃에서 13 ~ 17일간 배양하여 얻는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서;
    상기 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주 75중량%와, 상기 어성초농축액 20중량%와, 상기 인삼농축액 5%를 혼합한 다음,
    10 ~ 20℃에서 13 ~ 17일간 배양하여 얻는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선과 기력증진 음료의 조성물의 제조방법.
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