KR101583600B1

KR101583600B1 - 신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101583600B1
Application number: KR1020150081800A
Authority: KR
Inventors: 장영웅
Original assignee: 장영웅
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2016-01-21

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 수탁번호가 KCCM11676P인 면역활성능 및 미백 효과를 갖는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주와 상기 균주 자체, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알러지 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 개선용 화장료 조성물, 개선용 식품 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

Description

신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도{Novel Strain Bacillus megaterium, And Uses Thereof}

본 발명은 신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

알러지는 선천적이나 후천적으로 면역기능에 이상이 있어서 무해한 항원인 알러지원에 대해 과민한 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다. 알러지 반응의 면역 기작은 하기와 같다. 일단, 우리의 몸이 알러지원에 노출되면 알러지원은 순환하는 항원제시세포에 의해 인지되며, 이 항원제시세포는 알러지원 제시를 통해 Th0를 Th2 세포로 분화시킨다. 이렇게 분화된 Th2 세포는 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-8, IL-13와 같은 알러지 유발 사이토카인을 분비하며 이들은 골수에서의 산성백혈구 발달을 촉진시켜 염증이 발생한 조직으로 산성백혈구를 유도할 뿐만 아니라, B 세포에 작용하여 IgE 및 IgG1의 생성을 유도한다. 이러한 작용기전으로 생산된 IgE는 조직에서 FcεRI이라 불리는 IgE 수용체를 매개로 비만세포에 강하게 결합한다. 이후 동일한 알러지원에 재차 노출되어 알러지원이 비만세포에 결합된 IgE에 결합하면, 비만세포는 알러지성 히스타민(histamine)과 염증성 프로스타글란딘, 헤파린, 프로테아제 및 자유 라디칼 등을 분비하는데, 이들은 다양한 알러지 질환 증상을 유발시키고 이러한 반응이 지속되면 조직의 만성 염증을 유도한다(Galli et al., 2008).

현재 일반적으로 상용되는 대표적인 알러지 치료제로는 항히스타민, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증용 의약품 등이 있다. 그러나 이들은 주로 증상 치료 효과가 있고, 과도한 체액성 면역을 완화하거나 IgE 생산을 억제시키는 알러지의 근본적인 원인을 치료하는 효과는 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 부작용이 없고 알러지의 근본적인 원인을 치료할 수 있는 약제가 절실히 요구되는 실정이다.

염증 반응은 감염 또는 조직손상에 의하여 자극되는 비특이적 결과들의 복합적인 연속단계이다. 이는 대체로 잘 제어된 과정이지만, 사이토카인(cytokine)과 같은 염증매개물질들의 과도한 생성으로 각종 질병을 유발하게 된다. 또한, 염증 반응시 나타나는 과다한 브라디키닌(bradykinin)의 분비는 브라디키닌 수용체를 활성화 시킴으로써 부종, 통증 및 조직의 기능 소실 등을 유발한다. 브라디키닌은 주로 다형핵 백혈구, 대식세포, 내피세포, 윤활막 조직(synovial tissue)로 부터 비 사이토카인 및 사이토카인류의 염증반응 매개체인 PGE2, PGI2, LTs(leukotrienes), histamine, PAF, IL-1, TNF등의 분비를 유도한다. 또한, 염증성 사이토카인은 프로스타글란딘의 합성효소인 phosphololipase A2와 cyclooxygenase를 활성화시키고, 대사효소인 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase를 억제하여 프로스타글란딘의 작용을 증가시킨다.

한편, 미생물 중 유산균과 같은 일부 균은 인간의 건강에 매우 유익한 영향을 미치는 미생물로서 그 유용성이 날로 증가하고 있다. 최근에는 이러한 균주에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반 식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로서 개발되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있다.

본 발명자들은 하는 방법을 염증 및 알러지 관련 질환의 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 천연 발효물로부터 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주를 분리하였고, 상기 균주의 항염증, 항알러지 및 미백 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 염증성 질환 또는 알러지 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호가 KCCM11676P인 항염증 효과 또는 항알러지 효과를 갖는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주를 제공한다.

상기 본 발명의 균주는 서팩틴(Surfactin)을 생산하고, 염증 및 알러지를 효과적으로 억제하며, 또한 미백 효과가 우수하다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 천연 발효물에서 균주를 분리 동정하여 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014로 명명하고, 이를 2015년 03월 16일자로 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11676P).

본 명세서에서 본 발명의 균주를 분리해 낸 상기 천연 발효물을 언급하면서 사용되는 상기 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있거나 생산하는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미하고, 당업계의 어떠한 발효 방법도 포함한다.

본 명세서에서 본 발명의 균주를 분리해 낸 천연 발효물을 언급하면서 사용되는 상기 "발효물"은 당업계에서 발효에 의하여 생성되는 모든 물질을 포함하고, 본 발명에서는 바람직하게는 탱자 및 물엿을 발효시킨 발효물이다.

상기 발효물의 제조 과정은 다음과 같다:

상기 탱자 및 물엿은 각각 50~60 중량% 및 40~50 중량%으로 배합하는 것이 바람직하며, 이를 용기에 넣고 밀봉한 후 발효시킨다.

상기 발효는 1~3개월간 수행되는 것이 바람직하며, 1~3개월간 두면 탱자와 물엿의 배합물은 부글부글 끓으면서 발효되어 발효물이 생기며, 내용물이 우러나온 탱자는 물 위로 떠오르게 된다.

상기 발효된 발효물에서 탱자를 제거한 후 보관한다.

장기간 보관하면 발효물의 표면에 점성의 표층액이 생기게 되는데, 이는 탱자로부터 나온 독성물질이다. 상기 독성물질을 제거하기 위해 발효물의 점성의 표층액을 마대 또는 한지로 흡수시킨다.

상기 제거는 1~2년간 반복적으로 수행될 수 있으며, 독성물질이 제거된 맑은 발효물을 수득할 수 있다.

상기 발효물은 당업계의 어떠한 종류의 발효물도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 발효물질은 발효물 추출물, 발효물 엑기스, 발효물 농축액 또는 발효물 분말이고, 보다 바람직하게는 발효물 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 발효물 추출물은 발효물에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethylformamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 발효물에 처리하여 수득하고, 가장 바람직하게는 물을 처리하여 수득한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 발효물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 발효물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 발효물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알러지 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게는 상기 조성물은 유효성분으로 본 발명의 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상이며, 가장 바람직하게는 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 농축물이다.

본 명세서에서 유효성분을 언급하면서 사용되는 균주의 배양물은 상기 균주에 의한 발효물도 포함한다.

본 발명의 발효물은 당업계의 어떠한 종류의 발효물도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 발효물질은 발효물 추출물, 발효물 엑기스, 발효물 농축액 또는 발효물 분말이고, 보다 바람직하게는 발효물 추출물이다.

본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 상기 염증성 질환은 급성 또는 만성 염증질환, 건선, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 천식, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 두드러기 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유효성분으로 포함하는"이란, 본 발명의 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 상기 균주에 의한 발효물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 균주에 의한 발효물은 천연 식품으로부터 분리한 미생물 균주 또는 천연 발효물인바 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 상기 균주에 의한 발효물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.

비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 발효액은 1일 1 mg/kg 내지 10000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 그 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 피부 습윤제, 피부 밀폐제 및 세라마이드 함유 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에서, "건강기능식품"이란, 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야한다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 발효액 또는 상기 발효액 및 황토분말을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 조성물의 유효성분은 상술한 염증성 질환 또는 알러지 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물과 동일하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 균주는 염증 및 알러지 반응을 개선시키고, 미백 효과가 우수하므로, 염증성 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 균주에 의한 염증성 사이토카인 유전자들의 발현 여부를 보여준다. (1번 래인: 무항원, 2번 래인: 대조군, 3번 래인: a+ T.O 세포 0.01% 농도, 4번 래인: a+ T.O 세포 0.05% 농도, 5번 래인: a+ T.O 세포 0.1% 농도, 6번 래인: 케토티펜 100 ug/ml)
도 1b는 본 균주의 서팍틴 검출 결과를 보여준다.
도 2는 본 균주의 raw 264.7 세포에 대한 독성 결과를 보여준다.
도 3은 본 균주의 RBL-2H3 세포에 대한 독성 결과를 보여준다.
도 4는 본 균주의 히스타민 유리 결과를 보여준다.
도 5는 본 균주의 티로시나제 활성저해능 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 방법 및 재료

실험 세포주 및 배양

세포주는 시험 방법에 따라 적합한 세포를 선택하여 사용하였다. NO 어세이는 마우스 대식세포인 raw 264.7 cell(mouse macrophage cell, ATCC)을 이용하였으며, 배양접시 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 IU/ml), 스트렙토마이신 (100㎕/ml), 10% FBS를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Welgene, Korea)를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

또한, 히스타민 유리 어세이(histamine release assay)에서는 RBL-2H3 세포주를 사용하였다. RBL-2H3(rat basophilic leukemia)는 배양접시 바닥에 접종한 후 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100ug/mL), 10% FBS를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Welgene, Korea) 배지를 넣고, 37℃를 유지하여 10%이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

균주의 조제

본 균주(a+T.O cell)는 세포에 맞는 배지에 희석하여 사용하였다.

또한, WST-1 어세이를 통하여 예비실험을 진행한 후 세포독성을 나타내지 않는 농도를 선택하였다.

시험물질은 세포 배양 배지로 희석하여 사용하였으며, 예비시험 후, 효력을 나타내는 농도를 찾아 3 개를 선정하고, 본 균주의 피부 관련 효능을 평가하였다.

양성 대조군 역시 세포 배양 배지로 희석하여 처리하였다.

염증성 사이토카인의 유전자 발현 확인

RBL-2H3 세포를 6 웰 플레이트에 5X105/ml로 씨딩(seeding)하여 배양하였다. 50 ng/ml 항-DNP IgE가 포함된 MEM 배지를 넣고 4 시간 배양 후 균주(a+T.O 세포)를 농도 별(0.01%, 0.05%, 0.1% 농도)로 20분간 처리 후 25 ng/ml DNP-BSA 20분간 반응시켰다. RBL-2H3 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 세포 펠렛(pellet)을 모아 Trizol를 사용하여 RNA를 분리한다.

추출된 RNA를 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 로딩하고 나노드롭(nanodrop)을 사용해 RNA양을 정량하였다. 5ug의 RNA양을 사용하여 cDNA synthesis kit를 이용해 cDNA를 합성하였다. cDNA 1㎕와 각각 primer와 premix를 이용해 PCR하였고, PCR 조건은 다음과 같다:

PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 염증관련 사이토카인으로 알려진 TNF-α, IL-4, IL-10, COX-2 유전자들의 발현 여부 측정하였다.

세포독성시험

본 균주의 독성을 확인하기 위하여, raw 264.7 세포와 RBL-2H3 세포에서 세포독성을 측정하였다. 96 웰 플레이트에 각각의 세포를 적당한 농도로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24 시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 검액 및 새로운 배지(serum free 배지)를 넣고, 24시간 동안 배양하였다.

또한, 본 균주 및 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 배지(serum free)에 1/10로 희석하고 이를 각 웰당 100㎕씩 처리하여 1 시간 동안 반응시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

히스타민 유리 어세이(Histamine release assay)

본 시험은 생약 한약 제제의 효력 시험 가이드라인 (2010. 6. 발행)을 바탕으로 시행하였다.

RBL-2H3 세포를 24 웰 플레이트에 알맞은 농도로 분주한 후 시료를 농도별로 처리하여 30 분간 반응시키고, A23187을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 원심분리하여 ELISA kit를 이용하여 히스타민(histamine)을 정량하였으며, 측정된 히스타민 양은 총 단백질 양으로 보정하였다.

NF-κB 루시페라제 어세이(luciferase assay)

NF-κB 유전자를 발현시킨 세포내에 전사 활성 억제를 확인고자, 염증 반응기전을 알아보기 위해 시료가 세포내 전사 단계 (transcriptional level, DNA에서 RNA로 전화하는 과정)를 조절되는지 promoter assay를 이용하여 NF-κB 유전자의 활동억제 효능을 평가하였다. NF-κB promoter 뒤에 luciferase라는 효소를 붙어 promoter가 작동하면 luciferase 효소가 활성화되고 세포가 용해(cell lysis)하게 되면 luciferase 효소는 중간물질(substrate)과 반응하여 형광을 나타내게 된다. 당업계에 공지된 방법에 따라, Lipofectamine (Invitrogen #11668-019), Dual luciferase reporter assay system (Promega #E1910), Luminometer (PerkinElmer, Victor3)을 이용하여 다음과 같이 실시하였다:

① HEK-293T 세포를 24 well plate에 7X10⁴/well로 seeding 하여 배양한다;

② 다음날 NF-kB-Luc, SV-40 DNA를 lipofectamine과 함께 transfection 한다;

③ 24시간 후 시료 a+ T.O cell 시료를 0.01%, 0.05%, 0.1% 농도별로 처리한다;

④ shaking rocker에서 20 min incubation 한 후 -70℃에서 20 min 동안 넣어두고 이것을 3번 반복한다;

⑤ lysis 후 supernatant만 취해 assay 한다. supernatant 30 ul에 luciferase substrate 20 ul를 넣고 luminometer로 측정 후 같은 방법으로 Stop&Glo substrate 20 ul도 lysate와 섞어 assay 한다.

상기 luciferase substrate 측정된 값을 Stop&Glo substrate 측정된 값으로 나누어 수치화하였다.

단백질양 측정법

단백질 측정법 중 Lowry method를 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit를 사용하여 측정하였다.

(1) cell lysate(상층액)을 각각 5㎕씩 96-well plate에 넣는다.

(2) protein standard 제조: 1.5mg/ml 농도의 Bovine Serum Albumin(BSA, Bio-Rad, 500-0007)을 cell lysis buffer 에 8 가지 농도로 희석하여 5㎕씩 96-well plate에 넣는다.

(3) Kit에 포함된 reagent A와 reagent S를 40:1의 비율로 섞어서 각 well에 25㎕씩 넣는다.

(4) Kit에 포함된 reagent B를 각각 200㎕씩 넣는다.

(5) 상온에서 15 분간 반응시킨 뒤 750nm에서 흡광도를 측정한다.

(6) BSA 검량선에 따라 cell의 총 단백질 양을 계산한다.

통계

모든 자료는 평균±SD로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test를 사용하였으며 유의확률 P<0.005, 양측검정을 사용하였다.

실시예 1: 신규한 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주(기탁번호: KCCM11676P)의 분리

1-1. 본 발명의 균주 분리 및 사용한 배지

균주의 분리 및 동정

본 균주는 탱자 천연 발효물로부터 분리하였다. 상기 분리된 균주는 혈액한천평판배지(BAP, Blood Agar Plate), 티오글리코레이트 브로스(Thioglycolate broth, 소디윰 티오글리코레이트가 포함된 혐기성 액체배양 배지) 배지에서 pH 7-8, 37℃ 조건에서 배양이 가능하고 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주 보존이 가능하였으며, 산소 요구성은 호기성이고, 16S rDNA 시퀀싱 결과 16s rDNA 염기서열은 기존의 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주와 99%의 상동성을 보였는바 바실러스 메가테리움으로 동정하였다.

상기 균주를 바실러스 메가테리움 LJ2014 균주로 명명하고, 국제미생물기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2015년 3월 16일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCCM11676P를 부여받았다.

1-2. 본 발명의 균주의 분자생물학적 특성

본 발명자들은 실시예 1-1에서 분리한 균주(a+T.O 세포)를 분자생물학적 특성을 조사하였다.

먼저, PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 염증관련 사이토카인으로 알려진 TNF-α, IL-4, IL-10, COX-2 유전자들의 발현 여부 측정하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, RBL-2H3 비만세포에 a+ T.O 세포 시료를 0.01%, 0.05%, 0.1% 농도로 처리하여 유전자 발현양을 RT-PCR로 확인했을 때, 대조군인 GAPDH(house keeping gene)는 모든 샘플에서 동일하게 발현되었고, 염증관련 사이토카인인 TNF-α, IL-4, IL-10, COX-2 유전자 발현은 대조군과 비교하여 저농도인 0.01%일 때 고농도인 0.1%일 때보다 발현양이 감소하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 0.01%에서 항염 효능이 가장 좋은 것으로 사료된다.

또한, 본 발명의 균주가 생성하는 항균물질의 분리를 위하여, HPLC를 수행하여 본 균주의 서팩틴 생산 여부를 조사하였다. 본 균주가 생성하는 항균물질은 당업계에 공지된 방법에 따라 분리하였다. 간략히, 본 균주를 배지(polypeptone 10 g, glucose 10 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, pH 6.8)에서 30℃로 4일 동안 배양한 다음 배양액을 원심분리하여 상등액만을 얻었다. 상등액에 6N HCl를 가하여 pH를 2.0으로 조절한 후 6,000 rpm에서 15 분 동안 원심 분리하여 침전물만을 취한 다음 침전물을 메탄올에 추출하여 본 실험에 사용하였다. 메탄올에 추출된 산 침전물은 크로마토그래피에서 chloroform/methanol(6/4)의 용매조건으로 전개한 후 확인하였으며 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 펩타이드성 항균물질을 분리하였다. HPLC 분석에 사용된 용매는 0.1% trifluoroacetic acid/water(4/1=v/v), flow rate는 1 ml/min이고 205 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 항진균, 항미생물 활성을 갖는 것으로 알려진 서팩틴의 검출을 확인하였다.

또한, 특정 성분의 증가 유도를 확인하였다.

본 발명의 균주의 특성을 확인하기 위하여 장뇌삼의 유효성분을 EtOH로 추출한 경우와 본 발명의 균주가 포함된 조성물을 이용한 발효배양액으로 추출한 경우를 비교하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 장뇌삼에 본 발명의 균주를 접종하여 발효 배양시 유효 성분들을 탁월하게 인리치먼트(enrichment) 할 수 있었다.

실시예 2: 본 발명에서 분리 동정한 균주의 면역활성 분석

본 발명자들은 실시예 1-1에서 분리한 균주의 세포 독성, 항알러지 및 항아토피 효과를 확인하였다.

2-1. 세포 독성

본 균주의 인 비트로 세포독성은 세포의 미토콘드리아 활성에 의존하여, 세포의 생존을 결정할 수 있는 WST-1 반응액에 의해 측정되었다. 세포생존율은 raw 264.7 세포와 RBL-2H3 세포에서 평가하였으며, 시료를 제외한 배양배지만 처리한 값 (control)에 대한 백분율로 나타내었다. 시료의 농도는 본 균주 원액을 100%로 간주하고 세포배지에 희석하여 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, raw 264.7 세포에 대해 본 균주는 0.1% 이하 농도 에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 raw 264.7 세포를 이용한 추후 시험에서 사용되는 본 균주의 최고 농도는 0.1%로 선택하였다.

한편, RBL-2H3 세포에 대해 본 균주는 도 3에 나타낸 바와 같이, 1% 이하 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 RBL-2H3 세포를 이용한 추후시험에서 사용되는 시료의 최고 농도는 1%로 선택하였다.

2-2. 히스타민 유리(Histamine release) 평가

본 균주의 아토피 개선 효능을 평가하기 위해서, 아토피의 대표적인 인자인 히스타민의 유리된 정도를 측정하였다.

본 시험은 생약 한약 제제의 효력 시험 가이드라인(2010. 6. 발행)을 바탕으로 시행하였다.

히스타민은 RBL-2H3 세포에서 A23178 (Calcium ionophore)을 처리시에 유리되므로, 이에 본 시험에서도 RBL-2H3 세포를 이용하여 본 균주가 히스타민 유리에 미치는 영향을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, RBL-2H3 세포에서 A23178 (Calcium ionophore)를 처리하였을 때, 대조군에 비하여 유리된 histamine 양이 161.4% 증가함을 통해 RBL-2H3 세포에서 탈과립을 유도하여 아토피가 발생됨을 확인할 수 있었다.

한편, 양성대조군으로 사용되는 dexamethasone을 각각 100ppm 처리하였을 경우 대조군에 비하여 유리된 histamine 양이 117.4%로 A23178 (Calcium ionophore) 단독 처리군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소하였다.

또한, 본 균주를 0.1%, 0.5%, 1%로 처리한 후 유리된 histamine 양을 ELISA kit를 이용하여 측정한 결과, 대조군에 비하여 각각 156.2%, 153.9%, 131.7%의 histamine이 유리되었다.

이는 세 농도에서 농도의존적으로 감소하였으며, 특히, 농도 0.5%와 1%에서 통계적으로 유의하게 감소하였다.

따라서, 본 발명의 균주는 아토피 개선 효능을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 3: 본 발명에서 분리 동정한 균주의 미백 효과 확인

본 발명자들은 실시예 1-1에서 분리한 균주의 미백 효과를 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 방법에 따라, 인 비트로 티로시나제(In vitro tyrosinase) 어세이를 실시하여 티로시나제 활성저해능을 확인하였다.

티로시나제는 인체 내에서 멜라닌 생성에 관여하는 효소로서 알부틴이 대표적으로 이 효소를 억제하는 미백 성분으로 알려져 있다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 본 균주는 티로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 저해함으로서 대조군인 알부틴(도 5a)과 유사한 정도의 미백 효과가 있음을 나타냈다.

한국미생물보존센터

KCCM11676P

20150316

Claims

수탁번호가 KCCM11676P인 항염증 효과 또는 항알러지 효과를 갖는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 서팩틴(Surfactin)을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 미백 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 천연 발효물에서 유래된 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항의 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는, 급성 또는 만성 염증질환, 건선, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 질환; 또는 부종, 과민증, 천식, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 두드러기 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알러지 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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제 1 항의 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는, 급성 또는 만성 염증질환, 건선, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 질환; 또는 부종, 과민증, 천식, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 두드러기 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제 1 항의 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는, 급성 또는 만성 염증질환, 건선, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 질환; 또는 부종, 과민증, 천식, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 두드러기 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 1 항의 수탁번호가 KCCM11676P인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) LJ2014 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.