KR101520413B1 - 한약재 및 미생물을 포함하는 소화촉진용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한약재 및 미생물을 포함하는 소화촉진용 조성물, 식품 조성물 및 소화기 계통 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물들은 장기간 복용시에도 부작용이 적은 한약재와 인체에 이로운 효과를 보이는 미생물을 포함함으로써 종래 한방소화제에서 나타난 탄수화물, 단백질 등의 소화효과보다 현저히 향상된 소화효과를 가지며, 정장작용, 면역력 강화, 항염증 작용 등 종래 프로바이오틱스의 효능도 가진다.
Description
본 발명은 한약재 및 미생물을 포함하는 소화촉진용 조성물, 식품 조성물 및 소화기 계통 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
한방 소화제는 강제적으로 위장운동을 강화시키거나 단순한 분해 효소로 제조된 양방 소화제와는 달리 지각, 현호색, 자소엽, 오적골, 건강, 육계, 곽향, 목향, 백출, 사인, 산초, 정향, 지실, 필발 등 소화작용, 어혈제거, 진통작용이 있는 한약재를 적절한 비율로 섞어 제조한 것이다. 상기 한방소화제는 장기간 복용시 인체의 소화기능을 회복시키는 한약재로 인체에 부작용이 적은 것이 큰 장점이다.
한편, 프로바이오틱스는 숙주에 이로운 역할을 하는 살아 있는 미생물을 총칭한다. FAO 및 WHO의 정의에 따르면 적정한 양을 인체에 공급하면 인체에 건강을 제공하는 살아 있는 미생물을 프로바이오틱스라고 하며, 젖산균, 비피더스균(bifidobacteria), 효모 및 바실러스균(bacillus) 등이 프로바이오틱스에 해당된다.
최근 연구 결과에 따르면 프로바이오틱스는 면역력 강화, 항암, 각종 설사 치료 및 항염증 등 광범위한 효능을 지닌 것으로 보고되고 있다. 상기 효능의 구체적인 예시는 다음과 같다:
프로바이오틱스는 다양한 종류의 위장염에 효과를 보여 질병 기간을 단축시키고 설사 빈도를 감소시킨다 (Pail et al., Kor. J. Food Sci. Technol. 34:73-78, 2002). 특히, 장기적으로 항생제 치료를 받는 환자에서 장내 미생물상의 불균형으로 인해 발생하는 항생제 관련 설사(Antibiotic-associated diarrhea, AAD)의 경우 프로바이오틱스를 복용하면 설사가 감소하고 면역력이 증가하는 것으로 나타났다 (D'Souza et al., BMJ 324 : 1361, 2002). 또한 실험결과에 따르면 프로바이오틱스는 육류 조리시 생성되는 발암성 아민과 결합하여 암의 발생을 예방하며, 소화계에서 암을 유발하는 것으로 알려진 β-glucuronidase의 활성을 낮추는 것으로 보고되어 있다 (Reddy et al, In 8th Internation Symposium on Latic Acid Bacteria and Health. 9-20. Seoul, Korea. 1993). 동물 실험 결과, 프로바이오틱스는 콜레스테롤이 혈액으로 재흡수되게 하는 담즙을 분해함으로서 혈액내의 콜레스테롤 수치를 낮추며, LDL/HDL 비율을 개선하는 것으로도 보고되어 있다 (Klaver et al., Appl. Environ. Microbiol. 59:1120-1124. 1993).
프로바이오틱스는 IgA를 만드는 플라스마 세포를 증가시키고, T 임파구와 NK 세포의 비율을 증가시켜 식균 작용을 증진시킴으로서 면역력을 강화하는 것으로 알려져 있다 (Reid et al., Clin. Microbiol. Rev. 16:658-672, 2003). 임상적으로는 로타바이러스에 의한 아동의 급성 설사와 성인의 여행자 설사 치료에 효과적이었으며, Helicobater pylori에 의한 위염도 치료제와 프로바이오틱스를 함께 복용하면 효과가 상승하는 것으로 알려져 있다 (Hamilton et al., International Journal of Antimicrobial Agents 22:360-366. 2003).
과거부터 요구르트와 같은 식품, 영양보조제, 사료첨가제 등으로 다양하게 사용되어 온 프로바이오틱스는 최근 변비개선, 다이어트 효과, 면역력 증강 등의 효과가 보고되면서 더욱더 시장의 규모가 커져가고 있으며, 새로운 프로바이오틱스의 탐색, 분자생물학적 특성, 유전체의 규명 등에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
프로바이오틱스의 효능을 나타내면서 종래 한방 소화제보다 향상된 소화효과를 보이기 위하여, 한약재 및 미생물을 포함하는 소화촉진용 조성물, 식품 조성물, 및 약학적 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 소화촉진용 조성물, 식품 조성물, 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예는 한약재 및 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물을 제공하며, 구체적으로 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예는 한약재 및 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물을 제공하며, 구체적으로 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 한약재 및 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물을 제공하며, 구체적으로 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하는 소화기 계통 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 프로바이오틱스의 일종인 Bacillus를 대상으로 하여 분리 및 동정, 프로바이오틱스로서의 가능성 등을 측정하여 이를 이용한 조성물들을 제공하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 한약재와 미생물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 장기간 복용시에도 부작용이 적은 한약재와 인체에 이로운 효과를 보이는 미생물을 포함으로써 종래 한약재나 미생물만의 제한된 소화효과보다 현저히 향상된 소화효과를 갖는다.
일 구현예는 한약재 및 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물을 제공한다. 구체적으로 상기 조성물은 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하는 소화 촉진용 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 한약재와 미생물을 함유하는 조성물은 한약재를 분말, 용매에 용해한 용액, 한약재 추출물의 분말, 또는 한약재의 용매 추출물일 수 있다. 상기 한약재의 용매 추출물을 제조하는 용매는 예를 들어 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액일 수 있다. 또한 상기 미생물은 프로바이틱스, 즉 생균 제제로 포함하는 것이 바람직하며, 미생물 배양액 또는 미생물의 건조물 형태일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일례는 한약재의 건조분말을 미생물 배양액에 첨가한 혼합액일 수도 있다.
상기 한약재와 미생물의 함량은 향상된 소화효과를 보이기 위해 적절히 조절될 수 있다. 상기 조성물은 한약재 및 미생물의 혼합비가 건조 중량 기준으로 90:10 내지 99.9:0.01 일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 한약재는 종래 소화작용, 어혈제거, 진통작용 효능으로 알려진 것들이 바람직하다. 상기 한약재는 기가 뭉친 것을 풀어주고 비장의 기능을 강화시켜 복부창만, 트림, 구토 등에 효능이 있는 진피, 설사에 좋으며 수분이 정체되어 전신이 붓고 소화가 안될 때 수분 배설을 돕는 백출, 모든 약의 독성을 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하는 감초, 진정, 진통, 해열 등에 효능이 있는 육계, 소화촉진 작용과 혈당강하작용이 있는 맥아, 진통에 효능이 있는 향부자 등이 포함될 수 있다.
한약재는 비교적 효과가 높은 한약재를 주한약재로 명명하며, 주한약재의 구체적인 예는 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있다. 또한, 한약재에는 추가로 백복령, 용뇌, 자실, 백단향 및 박하뇌로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 보조 한약재가 포함될 수 있다.
바람직하게는, 한약재는 주한약재의 종류로서 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피가 포함될 수 있으며, 추가로 첨가되는 보조 한약재의 종류로서 백복령, 용뇌, 자실, 백단향 및 박하뇌로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 포함될 수 있다.
주한약재의 함량은 예를 들어, 한약재와 미생물을 함유하는 전체 조성물의 중량기준으로 50 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 85 내지 99 중량%로 포함될 수 있다. 추가로 첨가되는 보조 한약재는 한약재와 미생물을 함유하는 전체 조성물 100중량부 기준으로 1 내지 15 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일례에서, 상기 주한약재는 한약재와 미생물을 함유하는 전체 조성물의 중량기준으로 육계 6 내지 9 중량%, 감초 11 내지 14 중량%, 건강 6 내지 9 중량%, 맥아 12 내지 14 중량%, 백두구 6 내지 9 중량%, 백출 4 내지 7 중량%, 사인 4 내지 6 중량%, 산사육 11 내지 15 중량%, 신곡 4 내지 7 중량%, 초과 4 내지 6 중량%, 향부자 7 내지 9 중량%, 정향 7 내지 9 중량%, 필발 4 내지 6 중량%, 및 진피 7 내지 10 중량%를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 미생물은 숙주에 이로운 역할을 하는 미생물을 의미하며, 일례로 이로운 역할을 하는 미생물로 알려진 젖산균, 비피더스균 (bifidobacteria), 효모, 바실러스균(bacillus) 등이 포함될 수 있다.
상기 미생물의 구체적인 예는 소화기계통의 정장작용으로 알려진 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속, 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 상기 미생물은 하기 (1) 내지 (4)의 특성 중 하나 이상의 특성을 가지는 것이 바람직하다:
(1) 글리세롤(glycerol), 리보오스(ribose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), N-아세틸글루코사민, 셀로비오스(cellobiose), 맥아당(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose), 녹말(starch), 튜라노스(turanose), 푸코스(fucose) 및 글루코네이트(Gluconate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물의 분해능;
(2) 탄소수 6개 내지 12개의 지방산 분해능 또는 단백질 분해능;
(3) 탄소수 8개를 가지는 지방산의 에스테라아제(esterase), Leucine acrylamidase, α-키모트립신(chymotrypsin), 산성포스파타아제(acid phosphatase) 또는 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드롤라제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)의 효소 활성; 및
(4) 위액 및 담즙산에 대한 내성.
더욱 바람직하게는, 상기 미생물은 Bacillus megaterium일 수 있으며, 구체적으로 기탁번호 KACC91778P일 수 있다. 상기 미생물은 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20에 주소지를 둔 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91778P를 부여받았다.
미생물의 함량은, 예를 들어, 한약재와 미생물을 함유하는 전체 조성물의 중량기준으로 10 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 미생물은 살아 있는 미생물로서, 즉 프로바이오틱스(생균)로서 작용을 하여야 소화효과 증진, 정장작용 등의 효능을 보인다. 따라서 상기 미생물은 103 내지 1010 CFU/g 의 생균수를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들면, 전체 첨가되는 미생물 총 중량기준으로 50% 중량%이상이 생균일 수 있다.
본 발명은 한약재와 미생물을 포함하는 조성물로서, 향상된 소화효과 및 정장작용으로 식품 조성물로도 사용이 가능하다.
따라서 다른 일 구현예는 한약재 및 미생물을 함유하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 한약재, 미생물 및 함량에 관한 것들은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.
또한, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스 와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 및 크실리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜을 사용할 수 있으며, 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)과 같은 천연향미제; 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제를 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 일례로 상기 식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제로 제조될 수 있다.
본 발명은 한약재와 미생물을 포함하는 조성물로서, 향상된 소화효과 및 정장작용으로 소화기 계통의 질환의 치료용 약학적 조성물로도 사용이 가능하다.
따라서 다른 일 구현예는 한약재 및 미생물을 함유하는 소화기계통 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 한약재 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 소화기계통 질환은 음식물의 소화와 흡수를 담당하는 기관의 질환을 의미하며, 구체적으로는 소화기 기관의 기능이상 또는 염증질환 등을 의미한다. 예를 들면 소화불량(dyspepsia), 위통, 위염, 변비, 설사 또는 과민성대장증후군 일 수 있다.
상기 치료용 약학적 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 치료용 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화 할 경우에는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형 등 다양한 형태로 제형화 하여 사용할 수 있으며, 경구투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에 있어서 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예컨대, 하루에 0.001 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.01 내지 30 ㎎/㎏(체중)의 양으로 투여될 수 있고, 상기 투여량은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 조성물의 투여량은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러 번 나누어 투여할 수 있다.
상기 소화 촉진용 조성물, 식품 조성물 및 약학적 조성물의 제조방법은 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재를 미세분말화 하는 단계; 상기 단계 후 미세분말화 된 한약재 및 Bacillus속, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속, 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 섭취의 편의성을 위하여 상기 혼합하는 단계 후에 제환기를 이용하여 환의 형상으로 성형하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 장기간 복용시에도 부작용이 적은 한약재와 인체에 이로운 효과를 보이는 미생물을 포함함으로서, 종래 일반 한방소화제에서 나타난 탄수화물, 단백질 등의 소화효과보다 현저히 향상된 소화효과를 보인다. 또한, 프로바이오틱스의 응용으로서 살아있는 미생물을 포함하고 있어 정장작용, 면역력 강화, 항염증 작용 등 종래 프로바이오틱스의 효능도 가진다.
따라서 프로바이오틱스의 또 다른 응용으로서 관련 의약 또는 건강기능식품산업에서 크게 응용될 것으로 보인다.
도 1은 실시예 1.1에 따라 분리한 균주의 16S rDNA 염기서열(서열번호 1)에 기초한 계통도를 나타낸다.
도 2는 실시예 1.3에 따라 0 내지 3 배양시간에 따른 인공위액에서의 B. megaterium KS12의 생균 수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1.4에 따라 0, 2, 24 배양시간에 측정한 B. megaterium KS12의 생균수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3.1에 따라 형성된 clear zone을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 5는 실시예 3.2에 따라 형성된 clear zone을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 6은 실시예 3.3에 따라 조성물 내의 생균수(CFU/g)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1.3에 따라 0 내지 3 배양시간에 따른 인공위액에서의 B. megaterium KS12의 생균 수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1.4에 따라 0, 2, 24 배양시간에 측정한 B. megaterium KS12의 생균수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3.1에 따라 형성된 clear zone을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 5는 실시예 3.2에 따라 형성된 clear zone을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 6은 실시예 3.3에 따라 조성물 내의 생균수(CFU/g)를 그래프로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1. 미생물의 준비 및 활성 시험
1.1 미생물의 분리 및 동정
미생물의 분리는 Nutrient Broth(NB) 평판 배지 또는 액체배지로 배양하여, 시료로 멸치젓갈(원산지: 충남 강경)을 사용하여 미생물을 분리하였다. 구체적으로 상기 시료를 0.85% 생리식염수로 희석한 후에 NB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 2일간 배양하였다. 1차적으로 무작위 선발법을 이용하여 미생물을 분리한 후에, 내생포자를 형성하는 미생물을 선발하였다.
분리한 미생물을 동정하기 위하여 형태학적, 생화학적 특성과 16S rRNA 유전자서열을 조사하였다.
형태학적 특성은 그람염색을 한 후 현미경을 관찰하여 조사하였다.
구체적으로 분리된 미생물의 균집을 선택하여 희석 평판도말법을 사용하여 순수분리한 후 크리스탈바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 3% 요오드 용액(iodine/potassium iodine)을 처리하였다. 그 후 알코올로 세척한 후 사프라닌으로 반대염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. 관찰 결과 순수 분리된 미생물은 그람양성이며 간균(bacillus)임을 확인하였다.
생화학적 특성은 API50CHL kit (BioMerieux)를 이용하여 조사하였고, 그 결과 Bacillus속에 해당함을 확인하였다.
16S rRNA 유전자서열 분석은 Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 상기 분리한 미생물의 genomic DNA를 추출한 후 16S rDNA 증폭을 위한 universal primer (27F/1492R)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로 진정세균 영역 (Eubacteria domain)에 속하는 세균 16S rDNA의 공통적인 서열을 인지하는 프라이머인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3', 서열번호 2)와 1492R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3', 서열번호 3)을 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였으며, 94℃ 8분, 48℃ 1분, 72℃ 2분 조건으로 40 cycle, 그리고 70 ℃ 에서 10분간 반응시켰다. 상기 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, ㈜ 솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
분석한 염기서열(서열번호 1)을 NCBI database에 수록된 진정세균(Bacillus megaterium)의 염기서열과 유사도를 비교하였고, 그 결과 Bacillus megaterium의 16S ribosomal RNA 염기서열 1432 bp 중 1431 bp가 일치하여 99% 유사도를 보였으며 이를 근거로 분리된 세균을 B. megaterium KS12으로 명명하였다.
1.2 미생물의 생리적 특성 조사
1) 탄수화물 분해능: 상기 1.1의 과정을 통해 분리 동정된 B. megaterium KS12의 각종 탄수화물 분해능을 API50CHL kit를 통해 조사하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1은 B. megaterium KS12의 각종 탄수화물 분해능의 결과를 나타낸 것으로 '+'는 분해능이 있음, '-'는 분해능이 없음, '+/-'는 분해능이 미미함을 각각 나타낸다.
| 탄수화물(Carbohydrate) | 결과 | 탄수화물(Carbohydrate) | 결과 |
| Glycerol | + | Salicin | +/- |
| Erythritol | - | D-cellobiose | + |
| D-arabinose | - | D-maltose | + |
| L-arabinose | - | D-lactose | +/- |
| D-ribose | + | D-melibiose | - |
| D-xylose | - | D-saccharose | + |
| L-xylose | - | D-trehalose | + |
| D-adonitol | - | Inulin | - |
| Methyl-β-D-xylopyranoside | - | D-melezitose | - |
| D-galactose | - | D-raffinose | - |
| D-glucose | + | Starch | + |
| D-fructose | + | Glycogen | - |
| D-mannose | - | Xylitol | - |
| L-sorbose | - | Gentibiose | - |
| L-rhamnose | - | D-turanose | + |
| Dulcitol | - | D-lyxose | - |
| Inositol | - | D-tagatose | - |
| D-mannitol | - | D-fucose | - |
| D-sorbitol | - | L-fucose | + |
| Methyl-α-D-mannopyranoside | - | D-arabitol | - |
| Methyl-α-D-glucopyranoside | - | L-arabitol | - |
| N-acetylglucosamine | + | Gluconate | + |
| Amygdalin | - | 2-Ketogluconate | +/- |
| Arbutin | + | 5-Ketogluconate | + |
| Esculin | + |
표 1에 나타난 바와 같이, B. megaterium KS12는 글리세롤(glycerol)과 단당류인 글루코오스(glucose) 및 과당(fructose), 이당류인 셀로비오스(cellobiose), 맥아당(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose)에 대한 분해능이 우수함을 확인하였다.
2) 효소 활성: B. megaterium KS12의 각종 효소의 활성도를 API ZYM kit를 사용하여 조사하였다. 구체적으로 상기 1.1의 과정을 통해 분리 동정된 B. megaterium KS12를 MRS 고체배지에서 37℃, 16시간동안 배양한 후에 균체를 회수하여 0.085% NaCl용액에 현탁하였다. 그 후 API ZYM kit에 현탁액을 65 ul씩 분주하였고, 37℃에서 4시간 배양한 후 색깔의 변화를 관찰함으로써 효소의 활성도를 조사하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2는 B. megaterium KS12의 각종 효소 활성도의 결과를 나타낸 것으로, '+'는 분해능이 있음, '-'는 분해능이 없음, '+/-'는 분해능이 미미함을 각각 나타낸다.
| 효소 | 결과 |
| Alkaline phosphatase | - |
| Estrease (C4) | - |
| Esterase (C8) | + |
| Lipase (C14) | - |
| Leucine acrylamidase | + |
| Valine acrylamidase | +/- |
| Crystine acrylamidase | - |
| Trypsin | - |
| α-Chymotrypsin | + |
| Acid phosphatase | + |
| Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase | + |
| α-Galactosidase | - |
| β-Galactosidase | - |
| β-Glucuronidase | - |
| α-Glucosidase | - |
| β-Glucosidase | - |
| N-Acetyl-β-glucosaminidase | - |
| α-Mannosidase | - |
| α-Fucosidase | - |
표 2에 나타난 바와 같이, B. megaterium KS12는 탄소수가 8개인 지방산을 분해하는 esterase 활성을 지니고 있었으며 단백질 분해 효소의 일종인 α-chymotrypsin 활성을 지니고 있었다. 그 외 leucine acrylamidase, acid phosphatase 및 phosphohydrolase 활성도 함께 보였다.
1.3 인공위액에 대한 미생물의 내성 시험
미생물이 소화 및 정장작용을 수행하기 위해서는 소화관내에서 생존하여야 하며 섭취된 미생물이 장에 도달하기 위해서는 강산성인 위액과 십이지장에서 분비되는 담즙에 대한 내성을 지니고 있어야 한다. 상기 1.1의 과정을 통해 분리된 B. megaterium KS12이 강산성인 위액에 대한 내성을 가지는지 확인하기 위해 인공위액을 사용하여 미생물의 내성 시험을 하였다.
인공위액은 Kobayashi et al(J. Microbiol, 29:691-698, 1974)에 기재된 방법에 따라 1N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체배지에 pepsin 1,000 uni/ml를 첨가하여 제조하였다. 상기 1.1의 과정을 통해 분리된 B. megaterium KS12를 MRS배지에서 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수한 후 상기 제조한 인공위액을 50ml으로 첨가하여 30℃에서 3시간 MRS배지에서 배양하였다. 배양 후 B. megaterium의 생균 수를 측정하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2는 0 내지 3의 배양시간에 따른 인공위액에서의 B. megaterium KS12의 생균 수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 인공위액에서 3시간이 지난 후에도 B. megaterium KS12의 생균 수는 0.36 X 108 CFU/ml를 보여 사멸하지 않고 초기 생균 수인 2.5 X 108 CFU/ml의 14.4%를 유지하였다. 순수한 위액의 pH는 2.0 정도이지만, 실제 위는 섭취한 음식물의 완충작용으로 pH 2.0 이상인 점(Shim et al., Kor. J. Food Sci. Technol. 27:101-104, 1995)을 고려한다면, B. megaterium KS12는 높은 내산성을 나타내어 위에서 생존해 소장으로 이동할 수 있다는 가능성을 보여주었다.
1.4 인공담즙에 대한 미생물의 내성 시험
정장작용 등 여러 가지 기능을 지닌 미생물로서 정상적인 기능을 수행하기 위해서는 췌장에서 분비되는 담즙에 대한 내성을 지녀 생존한 상태로 장관에 도달하여야 한다. 상기 1.1의 과정을 통해 분리된 B. megaterium KS12의 담즙에 대한 내성을 조사하기 위해 실제 장내의 담즙의 농도인 0.6 g/L 보다 높은 농도의 oxgall(Difco) 을 처리하여 생존율을 조사하였다.
인공담즙은 MRS 액체배지에 1% pancreatin을 첨가하여 멸균한 후 여과 멸균된 10% oxgall 용액을 배지의 1% 농도로 첨가하여 pH를 6.8로 조정하여 제조하였다. 상기 1.3과정을 통해 인공위액이 첨가된 배지에서 3시간동안 배양된 B. megaterium KS12를 원심분리하여 균체를 회수하였다. 그 후 상기 인공담즙을 50ml으로 첨가한 후 30℃에서 24시간 배양하면서 일정시간 간격으로 B. megaterium KS12의 생균수를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 0, 2, 24 배양시간에 측정한 B. megaterium KS12의 생균수(CFU/ml)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 인공담즙을 처리하였을 때 24시간이 지난 후에도 초기 B. megaterium KS12의 생균 수의 약 14% 정도가 생존하여 높은 담즙액 내성을 보였다. 종래 연구되는 프로바이오틱스, 예를 들어 Pedicoccus속, Leuconostoc속의 인공담즙액에서의 생존율이 10% 내외인 점(Chung et al., Kor.J.Food Preserv., 10:406-410, 2003, Lee et al, Kor.J.Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:617-622, 1997)을 고려한다면, B. megaterium KS12는 내산성과 담즙액에 대한 내성을 동시에 나타내어 프로바이오틱스로서의 기능을 갖춘 것으로 판단되었다.
실시예
2. 조성물의 제조
육계 120,000 mg, 감초 180,000 mg, 건강 102,000 mg, 맥아 180,000 mg, 백두구 102,000 mg, 백복령 17,500 mg, 백출 56,000 mg, 사인 56,000 mg, 산사육 180,000 mg, 신곡 56,000 mg, 용뇌 6,000 mg, 자실 17,500 mg, 초과 56,000 mg, 향부자 102,000 mg, 정향 102,000 mg, 필발 56,000 mg, 백단향 56,000 mg, 진피 102,000 mg, 박하뇌 6,000 mg의 한약재를 미세 분말화한 후 상기 1.1의 분리한 미생물을 포함하는 배양액 100,000mg에 상기 한약재를 혼합시켜 반고체상태로 만든 후 제환기를 이용하여 조성물을 제조하였다.
실시예
3. 조성물 효능의 비교실험
3.1 단백질 분해 활성 측정
상기 실시예 2에서 제조된 조성물(B)와 비교군인 일반 한방 소화제(A)(한의원(대전)에서 구입)를 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한 후 상등액을 얻어 0.5% NaCl, 0.3% peptone, 0.3% skim milk가 첨가된 Nutrient Agar 배지에 각각 0.1 ml씩 접종하여 형성되는 clear zone의 유무 및 크기를 관찰하여 단백질 분해 효소의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 상기 방법에 따라 접종 후 48시간 후에 형성된 clear zone 형성을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 조성물(B)과 비교군(A) 모두 clear zone이 형성되어 단백질 분해효소의 활성이 있음을 확인하였다. 그러나 조성물(B)에서 형성된 형성된 clear zone의 크기가 비교군(A)에서 형성된 clear zone 크기에 비해 20% 정도 크게 나타나 단백질 분해능이 더 우수하다는 것을 확인하였다.
3.2 탄수화물 분해 활성 측정
상기 실시예 3.1과 동일한 방법으로 얻은 상등액을 0.5% NaCl, 1.0% peptone, 0.3% soluble starch가 첨가된 Nutrient Agar 배지에 접종하여 배양한 후 그람 요오드 용액을 첨가하여 형성되는 clear zone의 유무 및 크기를 관찰하여 탄수화물 분해 효소의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 상기 방법에 따라 접종 후 48시간 후에 형성된 clear zone 형성을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 조성물(B)과 비교군(A) 모두 clear zone이 형성되어 탄수화물 분해효소의 활성이 있음을 확인하였다. 그러나 조성물(B)에서 형성된 형성된 clear zone의 크기가 비교군(A)에서 형성된 clear zone 크기에 비해 10% 정도 크게 나타나 탄수화물 분해능이 더 우수하다는 것을 확인하였다.
3.3
생균수
측정
실시예 2에서 제조된 조성물 1g을 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한 후 상등액을 취해 1/10으로 연속 희석한 후 0.1 ml씩 취하여 Nutrient Agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 나타나는 세균의 군집을 계수하여 미생물의 생균수를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 상기 방법으로 측정한 조성물 내의 생균수(CFU/g)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 조성물에서는 3.1 X 107 CFU/g의 생균이 존재하는 것으로 나타남을 확인하였다. 이는 조성물에 다수의 생균이 존재하여 정장작용에 매우 유리함을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Merede Korea Co., Ltd.
DAEJEON UNIVERSITY Industry-University Cooperation Foundation
<120> COMPOSITION FOR PROMOTING DIGESTION CONTAINING MEDICINAL HERB AND
MICROORGANISM
<130> DPP20129406KR
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1486
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rDNA of B. megaterium KS12
<400> 1
aaggctgggg ggtgctataa tgcagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120
ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180
tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420
agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540
cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600
agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta 720
actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg 840
cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cctctgacaa ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat 1260
aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggagta accgtaagga gctagccgcc 1440
taaggtggga cagatgattg ggggaagtcg aacaagagcc tagttc 1486
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F(primer)
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492R(primer)
<400> 3
ggytaccttg ttacgactt 19
Claims (11)
- 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및
Bacillus megaterium, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하고,
상기 미생물은 하기의 특성을 갖는 미생물인 것인, 소화 촉진용 조성물:
(1) 글리세롤(glycerol), 리보오스(ribose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), N-아세틸글루코사민, 셀로비오스(cellobiose), 맥아당(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose), 녹말(starch), 튜라노스(turanose), 푸코스(fucose) 및 글루코네이트(Gluconate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물의 분해능;
(2) 탄소수 6개 내지 12개의 지방산 분해능 또는 단백질 분해능;
(3) 탄소수 8개를 가지는 지방산의 에스테라아제(esterase), Leucine acrylamidase, α-키모트립신(chymotrypsin), 산성포스파타아제(acid phosphatase) 또는 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드롤라제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)의 효소 활성; 및
(4) 위액 및 담즙산에 대한 내성. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 한약재 및 미생물의 혼합비가 건조 중량 기준으로 90:10 내지 99.9:0.01인 소화 촉진용 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 미생물은 기탁번호 KACC91778P을 갖는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)인 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 백복령, 용뇌, 자실, 백단향 및 박하뇌로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 보조 한약재를 추가로 포함하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 한약재는 전체 조성물의 중량기준으로 육계 6 내지 9 중량%, 감초 11 내지 14 중량%, 건강 6 내지 9 중량%, 맥아 12 내지 14 중량%, 백두구 6 내지 9 중량%, 백출 4 내지 7 중량%, 사인 4 내지 6 중량%, 산사육 11 내지 15 중량%, 신곡 4 내지 7 중량%, 초과 4 내지 6 중량%, 향부자 7 내지 9 중량%, 정향 7 내지 9 중량%, 필발 4 내지 6 중량%, 및 진피 7 내지 10 중량%를 함유하는 것인 소화 촉진용 조성물. - 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및
Bacillus megaterium, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하고,
상기 미생물은 하기의 특성을 갖는 미생물인 것인, 식품 조성물:
(1) 글리세롤(glycerol), 리보오스(ribose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), N-아세틸글루코사민, 셀로비오스(cellobiose), 맥아당(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose), 녹말(starch), 튜라노스(turanose), 푸코스(fucose) 및 글루코네이트(Gluconate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물의 분해능;
(2) 탄소수 6개 내지 12개의 지방산 분해능 또는 단백질 분해능;
(3) 탄소수 8개를 가지는 지방산의 에스테라아제(esterase), Leucine acrylamidase, α-키모트립신(chymotrypsin), 산성포스파타아제(acid phosphatase) 또는 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드롤라제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)의 효소 활성; 및
(4) 위액 및 담즙산에 대한 내성. - 제7항에 있어서,
상기 식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 것인 식품 조성물. - 육계, 감초, 건강, 맥아, 백두구, 백출, 사인, 산사육, 신곡, 초과, 향부자, 정향, 필발, 및 진피로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 한약재; 및
Bacillus megaterium, Lactobacillus속, Lactococcus속, Enterococcus속, Streptococcus속, 및 Bifidobacterium속으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 미생물을 포함하고,
상기 미생물은 하기의 특성을 갖는 미생물인 것인, 소화기계통 질환 치료용 약학적 조성물:
(1) 글리세롤(glycerol), 리보오스(ribose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), N-아세틸글루코사민, 셀로비오스(cellobiose), 맥아당(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose), 녹말(starch), 튜라노스(turanose), 푸코스(fucose) 및 글루코네이트(Gluconate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물의 분해능;
(2) 탄소수 6개 내지 12개의 지방산 분해능 또는 단백질 분해능;
(3) 탄소수 8개를 가지는 지방산의 에스테라아제(esterase), Leucine acrylamidase, α-키모트립신(chymotrypsin), 산성포스파타아제(acid phosphatase) 또는 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드롤라제(naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)의 효소 활성; 및
(4) 위액 및 담즙산에 대한 내성. - 제9항에 있어서,
상기 소화기계통 질환은 소화불량(dyspepsia), 위통, 위염, 변비, 설사 또는 과민성대장증후군인 약학적 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸인 것인 약학적 조성물.
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