KR101582869B1 - 바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물 - Google Patents

바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품, 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 변비 치료제에 관한 것이다.

Description

바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물{Health food and pharmaceutical composition for preventing or improving intestinal disease comprising Bacillus subtilis strain or its culture broth as effective component}
본 발명은 바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품, 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 변비 치료제에 관한 것이다.
프로바이오틱은 최초에 릴리(Lilly) 및 스틸웰(Stillwell)에 의해 다른 개체의 생장을 자극하는 미생물에 의해 제공되는 물질로서 제안되었으나, 최근 그의 정의는 집락화되어 있는 상주 미생물총뿐만 아니라 숙주에 유익한 건강상의 효과를 제공하는 충분한 개수의 다양한 미생물을 포함하는 제제 또는 제품으로까지 수정되었다(Schrezenmeir and Michael. 2001 J Clin Nutr 73, 361S-364S). 소비자에게 건강 식품으로 인식되면서 프로바이오틱의 시장은 성장해 오고 있다. 식품 산업에서 프로바이오틱 박테리아는 위액 및 담즙염과 같은 생물학적 장벽에 대한 저항 및 장세포에서 대장균 박테리아 생장을 억제하는 접착 능력으로 인정받는다(Servin and Coconnier. 2008 AM J Clin Nutr 73, 361S-364S). 프로바이오틱 박테리아로서는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 프로피오닐박테리움(Propioniibacterium), 바실러스 속(Bacillus sp.)이 널리 공지되어 있고, 장내 균총 및 면역 조절을 제공하게 된다(Ouwehand and Salminen, 2002 Antonie Van Leeuwenhoek 82, 279-289). 또한, 당분해, 단백질가수분해 및 지질가수분해 특성은 식품에서 매우 중요하며, 프로바이오틱 박테리아에 의해 발현되는 대사 산물은 푸드 매트릭스(food matrix)뿐만 아니라 발효에 참여하는 조성도 변화시킬 수 있다(Crittenden et al. 2002 Journal of the Science of Food and Agriculture 82, 781-789).
김치(발효시킨 식물성 제품), 된장(발효시킨 대두 페이스트), 고추장(발효시킨 고추 페이스트)과 같은 한국 전통 발효 식품에서의 세균총은 박테리아, 균류, 효모가 있는 동적인 군집으로 이루어져 있다. Lim 및 In은 한국 발효 식품으로부터 프로바이오틱 유산균을 분리하려 시도했다(Lim SM and Im DS. 2009 J Microbiol Biotechnol 19, 178-186). 바실러스 속(Bacillus sp.)이 한국 발효 식품에 대량 서식하는 박테리아로 널리 공지되었다. 특히, 위장관에서 발아할 수 있는 그의 포자는 프로바이오틱으로 유용하다. 새우에 바실러스 속 투여시 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제와 같은 소화 효소들이 많아졌다. 바실러스 프로바이오틱은 항균력, 면역 기능 조절 및 혈중 지질 감소와 같은 인간 건강에 유익한 효과를 아무런 부작용없이 제공하며, 제약사에 의해 소개되기도 했다. 프로바이오틱 박테리아를 스크리닝하기 위한 유산균이 연구된 바 있다. 락토바실러스(Lactobacillus) 균주가 건강 증진 효과를 더하기 위해 스페인의 발효시킨 소세지에 적용되었다. 최근, 유산균은 치료 단백질 또는 DNA 백신의 경구용 벡터로 여겨지기도 했다. 반면에, 바실러스 프로바이오틱 박테리아에 대한 연구는 별로 없다.
한편, 한국공개특허 제2013-0114942호에서는 '신규한 바실러스 서틸리스 ＢＣＮＵ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 바실러스 서틸리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 치료제에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 마우스 모델을 대상으로 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스 CBD2 균주 및 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주를 섭취시킨 후 로페라마이드에 의해 변비를 유도하고, 상기 마우스의 배설물의 배설 빈도, 배설물 중량, 배설물의 습식 중량의 변화를 관찰하고, 위장관 수송율 및 장관의 해로운 효소 활성을 조사하여 변비 치료 정도를 확인한 결과 무처리 대조구에 비해 개선된 효과가 있는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 두 종의 바실러스 서틸리스 균주가 변비의 예방 또는 치료에 매우 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 치료제를 제공한다.
본 발명에서는 마우스 모델을 대상으로 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스 CBD2 균주 및 바실러스 서틸리스 KMKW4 균주를 섭취시킨 후 로페라마이드에 의해 변비를 유도하고, 상기 마우스의 배설물의 배설 빈도, 배설물 중량, 배설물의 습식 중량의 변화를 관찰하고, 위장관 수송율 및 장관의 해로운 효소 활성을 조사하여 변비 치료 정도를 확인한 결과 무처리 대조구에 비해 개선된 효과가 있는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 두 종의 바실러스 서틸리스 균주는 변비의 예방 또는 치료에 매우 효과적이므로, 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품, 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 사료 첨가제 및 변비 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스에서 배설물 파라미터에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 영향을 나타낸다. 배설의 빈도(A), 배설물의 습식 중량(B) 및 배설물의 함수량(C)은 로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후 1일째에 60분 내에 제공되는 배설물 펠렛 횟수를 계수하여 평가했다(각 군마다 n=8). 배설물 분석 종료시, 마우스(각 군마다 n=5)를 희생시키고, 원위 결장 내 배설물 펠렛의 갯수(D)를 측정하기 위해 원위 결장을 떼어냈다. 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4는 로페라마이드-유도성 변비 마우스 모델에서 배설물 배출 변화에 대한 예방 효과를 가졌다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 원-웨이 ANOVA, 막대 위의 상이한 첨자들은 P<0.05에서의 유의차를 나타낸다.
도 2는 GIT에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 영향을 나타낸다. 금식 24시간 후, 바륨 설페이트 용액을 경구투여했다. 투여 15분째에, 유문으로부터 바륨 설페이트 용액 이동의 가장 먼 거리의 길이 및 유문으로부터 말단 회장까지의 길이를 측정했다(각 군마다 n=3). 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4는 로페라미드-유도 변비 마우스 모델에서 GIT의 기능장애를 예방한다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 원-웨이 ANOVA, 막대 위의 상이한 첨자들은 P<0.05에서의 유의차를 나타낸다.
도 3은 해로운 효소 활성에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 영향을 나타낸다. 로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후, 마우스(각 군마다 n=5)를 희생시키고, 맹장을 떼어냈다. β-글루코시다아제(A) 및 트립토파나아제(B)와 같은 효소 활성 검정에 맹장 현탁액을 이용했다. 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4는 변비 예방에 있어 기능성 프로바이오틱으로서 잠재적으로 유익할 것이다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 원-웨이 ANOVA, 막대 위의 상이한 첨자들은 P<0.05에서의 유의차를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 11월 08일자로 기탁하였다(바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis) CBD2 균주 기탁번호: KACC91904P, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주 기탁번호: KACC91905P).
또한, 변비 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 식품 또는 음료에 첨가할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품에서, 상기 식품은 유제품, 발효유, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 장 질환은 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 및 복부팽만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 변비일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 변비 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하여 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 올리고당, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 균주 건조 분말 또는 균주 배양액은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
시료 수집 및 균주의 분리
전통발효식품인 된장, 간장, 청국장, 김치는 지역별(경남, 경북, 전남, 충남, 충북)로 된장 8종, 간장 7종, 청국장 1종, 김치 6종을 수집하였다. 모든 시료는 1g/9㎖ 멸균수와 혼합, 마쇄하였다. 마쇄액을 10배 단계 희석한 다음, NA 고체 배지에 분주하여 37에서 1일 배양하여 생성된 콜로니를 분리하였다.
분리 균주의 동정
전통발효식품으로부터 분리한 10종의 균주는 멸균수에 현탁시킨 다음 영양 아가 (Difco, Detroit, USA) 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 콜로니 중에서 생육이 잘되고, 콜로니 모양이 선명한 우세 균주를 선별하여 계대 배양하면서 순수하게 얻어진 균주를 선발하였다. 선발한 균주는 식품원료로 사용 가능한 미생물인지 확인을 위하여 (주)솔젠트(Solgent co., Korea)에 의뢰하여 16s 리보좀 DNA 염기서열을 기초로 균주를 동정한 분석 결과를 얻었다.
동물
4 주령의 수컷 BALB/c 마우스를 Central Lab Animal Inc.(한국, 서울)에서 구입했다. 모든 동물들은 1 주간 실험 동물 설비에 적응하도록 했다. 마우스를 제어되는 온도(22±2℃) 및 55±5% 습도 하에 12시간/12시간 명/암 주기로 하여 실온에서 거주하게 했다. 사료 펠렛 및 수돗물은 자유롭게 이용하도록 했다. 모든 과정들은 Daegu Technopark Bio-Health Convergence Center Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받은 동물 프로토콜에 따랐다.
생체내 실험 디자인 및 처리
5 주령에 마우스를 무작위로 4 개의 군으로 나누고, 바실러스 서틸리스(Bacilus subtilis) CBD2, 바실러스 서틸리스 KMKW4 또는 PBS(각 군마다 n=8)를 7일간 1일 1회 경구투여했다. 정상(NOR) 군 및 변비에 걸린 대조군(CON) 군에는 200㎕ PBS를 경구투여했고; 바실러스 서틸리스 CBD2(CBD2) 군에는 바실러스 서틸리스 CBD2(200㎕ PBS 중 1×107 CFU)를 경구투여하고; 및 바실러스 서틸리스 KMKW4(KMKW4) 군에는 바실러스 서틸리스 KMKW4(200㎕ PBS 중 1×107 CFU)를 경구투여했다. 최종 투여 후 1일째에, 마우스에 로페라마이드 히드로클로라이드를 주사해 변비를 유도했다.
변비의 유도
변비는 CON, CBD2 및 KMKW4 군의 마우스에서 0.5% Tween 20(Sigma-Aldrich) 중의 로페라마이드 히드로클로라이드(4mg/kg 체중, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 5일간 1일 2회씩 피하 주사하여 유도한 한편, 비-변비 NOR 군에는 0.5% Tween 20 만을 주사했다(Shimotoyodome et al. 2000 Comp Biochem Physiok 126, 203-211).
체중 및 사료 섭취 분석
모든 마우스의 체중 및 사료 섭취에서의 변화를 제8일(바실러스 서틸리스의 최종 투여 후 1일째) 및 제13일(로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후 1일째)에 전자저울(CP423S, Sartorius AG, Goettingen, 독일)을 이용해 기록했다. 모든 측정은 정확을 기하기 위해 3회씩 수행했다.
배설물 파라미터 측정
배설물 배출을 제8일(바실러스 서틸리스의 최종 투여 후 1일째) 및 제13일(로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 투여 후 1일째)에 60분 내에 생성되는 배설물 펠렛의 갯수를 계수하여 평가했다. 동일한 시기에 배설물 펠렛 습식 및 건조 중량을 또한 측정했다(Devries et al. 2010 Front Neurosci 4, 22). 배설물 펠렛의 건조 중량은 펠렛을 24시간 동안 실험실의 건조-오븐 내 70℃에서 건조 후 측정했다. 배설물 펠렛의 함수량은 다음과 같이 산출했다: 배설물 함수량(%) =(배설물 펠렛의 습식 중량 - 배설물 펠렛의 건조 중량)/배설물 펠렛의 습식 중량 ×100. 마우스(각 군마다 n=5)를 희생시키고, 원위 결장 내 배설물 펠렛의 갯수 측정을 위해 원위 결장을 떼어냈다. 여타 마우스(각 군마다 n=3)를 위장관 수송 비율 측정에 이용했다.
위장관 수송( GIT ) 비율 측정
위장관에서의 움직임을 선행기술에 기재된 방법에 따라 측정했다(Miki et al. 2005 Diabetes 54, 1056-1063). 마우스(각 군마다 n=3)를 24시간 동안 물은 자유롭게 이용하도록 두면서 금식시켰다. 실험 당일, 마우스에게 물에 현탁시킨 25% 바륨 설페이트(Sigma-Aldrich)로 이루어진 시험 용액을 20㎕/g로 경구투여했다. 마우스를 15분 후에 희생시키고, 위장관을 신속히 떼어냈다. 유문으로부터 바륨 설페이트 용액의 가장 먼 이동 지점까지의 거리(A) 및 유문으로부터 말단 회장까지의 거리(B)를 측정했다. GIT 비율을 A 대 B의 백분율로 나타냈다.
해로운 효소 활성의 검정
마우스를 희생시키고, 맹장을 떼어냈다. 1:10 맹장 현탁액을 차가운 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0) 중에 제조하고, 비-박테리아 찌꺼기는 6,000rpm에서 10분간의 원심분리로 제거했다. 상층액 분획을 β-글루코시다아제 및 트립토파나아제와 같은 효소 활성 검정에 이용했다.
β-글루코시다아제 활성은 800㎕의 2 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(Sigma-Aldrich) 및 200㎕의 효소 용액을 포함하는 반응 혼합물(현탁시킨 배설물 시료) 2ml에서 검정했다. 반응물을 30분간 37℃에서 인큐베이션하고, 1ml의 0.5N NaOH를 첨가해 중단했다. 이어서, 반응 혼합물을 3,000rpm에서 10분간 원심분리했다. 효소 활성을 405nm에서의 흡광도 모니터링으로 측정했다(An et al. 2011 Lipids Health Dis 10, 116).
트립토파나아제 활성을 200㎕의 완전 시약 용액(100ml의 0.05 M 칼륨 포스페이트 완충액, pH 7.5 중의, 2.75mg의 피리독살 포스페이트, 19.6mg의 디소듐 EDTA 디히드레이트 및 10mg의 소 혈청 알부민), 200㎕의 20 mM 트립토판(Sigma-Aldrich) 및 100㎕의 효소 용액으로 이루어진 반응 혼합물 2.5ml에서 검정했다. 반응물을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 2ml의 컬러 시약 용액(52ml H2SO4 및 948ml 95% 에탄올 중의 14.7g p-디메틸아미노벤즈알데히드)을 첨가하여 중단했다. 이어서, 반응 혼합물을 3,000rpm에서 10분간 원심분리했다. 효소 활성을 550nm에서 흡광도 모니터링으로 측정했다.
통계적 분석
데이터는 평균±SD로 나타냈다. 군들간 차이는 Duncan's 다중 범위 시험에 따라 변량의 원-웨이 분석(ANOVA)에 의해 분석했다. 평균들간 차이는 p<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 분석을 SPSS/Win 소프트웨어(Version 12.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 이용해 수행했다.
실시예 1. 분리 균주의 동정 및 효소 분비능 우수 균주 분리
전통발효식품으로부터 균주를 분리한 후, 생육이 잘되고 콜로니 모양이 선명한 11종의 균주를 선발하여 동정을 실시한 결과 모두 바실러스 속 미생물로 나타났으며, 이들 중 식용 가능한 미생물은 4종으로 모두 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)였으며 이들은 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 CBKW, 바실러스 서틸리스 KGC, 바실러스 서틸리스 KMKW4로 명명하였다. 이 중 생육활성 및 효소활성이 우수한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4를 선택하여 본 발명에 사용하였다.
실시예 2. 체중 및 사료 조건
체중 및 사료 섭취가 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 KMKW4 및 로페라마이드 히드로클로라이드 처리와 연관있는지 알아보기 위해, 모든 마우스에서 체중 및 사료 섭취 변화를 체크했다. 표 1에서 알 수 있듯이, 마우스의 체중은 제8일(바실러스 서틸리스의 최종 투여 후 1일째) 및 제13일(로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후 1일째) 실험군들 사이에서 유의하게 차이나지 않았다. 모든 실험 군에서 동일한 시기의 사료 섭취 역시 변화하지 않았다. 그러한 결과들은 바실러스 서틸리스 CBD2, 바실러스 서틸리스 KMKW4 및 로페라마이드 처리가 체중 및 사료 섭취에 임의의 변화를 유도하지 않음을 나타낸다.
마우스에서의 체중 및 사료 섭취에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 영향
Para-
meters		 Before loperamide injection After loperamide injection
NOR CON CBD2 KMKW4 NOR CON CBD2 KMKW4
Body weight (g) 22.08±0.83 22.89±0.75 21.89±0.96 22.24±0.80 22.49±1.23 24.12±0.67 22.72±1.04 22.98±0.78
Food intake (g/day) 4.94±0.11 4.95±0.03 5.06±0.18 4.77±0.22 5.29±0.02 4.76±0.25 5.05±0.12 5.18±0.11
실시예 3. 배설물 배출 특징
로페라마이드-유도성 변비 마우스 모델에서 배설 빈도, 배설물 중량 및 배설물의 습식 중량에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 예방적 효과를 시험하기 위해, 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4를 7일간 1일 1회 경구투여했다. 이어서, 로페라마이드 히드로클로라이드를 5일간 1일 2회 주사하여 마우스에서 변비를 유도했다. 로페라마이드 히드로클로라이드(4mg/kg)는 배설 빈도, 배설물의 습식 중량 및 배설물의 함수량을 각각 NOR 군의 42.4±20.1%, 40.4±18.5% 및 33.1±11.6%로 감소시켰다(도 1A, B, C). 두 가지 종류의 바실러스 서틸리스(바실러스 서틸리스 CBD2; 바실러스 서틸리스 KMKW4)를 비교했다. 바실러스 서틸리스 CBD2는 배설 빈도, 배설물의 습식 중량 및 배설물의 함수량을 각각 CON 군의 173.8±32.9%, 126.7±14.1% 및 128.6±22.4% 수준으로 예방했다. 유사하게, 바실러스 서틸리스 KMKW4는 배설 빈도 및 배설물의 함수량을 각각 CON 군의 157.1±60.7% 및 124.1±31.3%로 예방했다. 그러나, 배설물의 습식 중량은 CON군과 비교하였을 때 바실러스 서틸리스 KMKW4에 의해 변화하지 않았다. 배설물 분석 종료시, 마우스(각 군마다 n=5)를 희생시키고, 원위 결장 내 배설물의 갯수 측정을 위해 원위 결장을 떼어냈다. 원위 결장 내 배설물 펠렛의 갯수는 CON 군에서 증가했다; 값은 NOR 군의 138.1±31.0%. CON 군에서의 원위 결장 내 배설물 펠렛 갯수의 증가는 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4에 의해 예방되었다; 값은 각각 CON 군의 68.9±21.1% 및 68.9±17.2% 였다(도 1D).
실시예 4. 위장관 수송 비율
위장관에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 영향을 측정하기 위해, 마우스에서 GIT를 측정했다(도 2). 로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후, 마우스를 24시간 동안 금식시켰다. 실험 당일, 바륨 설페이트 용액을 경구 투여했다. 투여 15분째에, 유문으로부터 바륨 설페이트 용액의 가장 먼 이동 지점까지의 길이 및 유문으로부터 말단 회장까지의 길이를 측정했다. 로페라마이드 히드로클로라이드는 GIT 시간을 줄였다; 값은 NOR 군의 68.2±9.1% 였다. 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4는 GIT를 유의하게 가속시켰다(p<0.05); 값은 각각 CON 군의 145.8±27.6% 및 140.6±23.5%였다.
실시예 5. 장관의 해로운 효소 활성
후속하여, 로페라마이드-유도성 변비 마우스 모델에서 해로운 효소 활성에 대한 바실러스 서틸리스 CBD2 및 바실러스 서틸리스 KMKW4의 효과를 시험했다(도 3). 로페라마이드 히드로클로라이드의 최종 주사 후, 마우스를 희생시키고, 맹장을 떼어냈다. β-글루코시다아제 및 트립토파나아제와 같은 효소 활성 검정에 맹장 현탁액을 이용했다. 로페라마이드 히드로클로라이드에 의해 활성화된 β-글루코시다아제 및 트립토파나아제; NOR 군에 대해 각각 값이 176.0±35.2% 및 123.7±18.0% 였다. 바실러스 서틸리스 CBD2는 NOR 군과 유사한 β-글루코시다아제 및 트립토파나아제 활성을 유지했다; 값은 각각 NOR 군의 109.7±21.7% 및 102.4±12.3% 였다. 유사하게, 바실러스 서틸리스 KMKW4는 각각 NOR 군의 141.4±30.5% 및 98.6±12.8% 로 β-글루코시다아제 및 트립토파나아제 활성을 유지했다.
농업생명공학연구원 KACC91904P 20131108 농업생명공학연구원 KACC91905P 20131108

Claims (5)

  1. 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 예방 또는 개선용 건강식품.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식품은 유제품, 발효유, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변비 예방 또는 개선용 건강식품.
  3. 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 전통발효식품으로부터 분리된 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P) 또는 이들 각 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 변비 치료제.
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