KR100996056B1

KR100996056B1 - 대장염 발생 예방 효능을 가진 락토바실러스 브레비스에이치와이7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품

Info

Publication number: KR100996056B1
Application number: KR1020080041729A
Authority: KR
Inventors: 안영태; 이정희; 이호용; 김동현; 허철성
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2010-11-22
Also published as: KR20090116051A

Abstract

본 발명은 대장염 발생을 예방하는 효과를 갖는 새로운 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 락토바실러스 브레비스 HY7401은 염증 유도제인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)의 처리에 의해 발생되는 산화질소(Nitric oxide)의 생성을 억제하고, 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium)으로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase) 활성을 억제하며, 대장염의 염증지표인 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine) IL-1β와 IL-6단백질 발현을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB 활성 억제 및 저해인자인 IκBα 활성을 증가시킴으로서 대장염의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 정장제, 발효식품 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

대장염, 유산균, DSS, IL-1β, IL-6, IκBα, Myeloperoxidase, NF-κB, Nitric oxide

Description

대장염 발생 예방 효능을 가진 락토바실러스 브레비스 에이치와이7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{Lactobacillus brevis HY7401 having protective effect against colitis and products containing thereof as effective component}

본 발명은 대장염 발생을 예방하는 효과를 갖는 새로운 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 염증 유도제인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, 이하 'LPS'라 함)의 처리에 의해 발생되는 산화질소(Nitric oxide)의 생성을 억제하고, 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, 이하 'DSS'라 함)로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase) 활성을 억제하며, 대장염의 염증지표인 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine) IL-1β와 IL-6 단백질 발현을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB 활성 억제 및 저해인자인 IκBα 활성을 증가시켜 대장염의 치료 및/또는 예방 효능을 가지는 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기 능식품에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 그리고 클론병(Crohn disease)의 발생 원인은 명확히 구명되지 않았지만 장내세균과 같은 항원에 대한 장내 면역반응의 조절장애(dysregulation)로 추측된다. 염증성 장질환은 장내 미생물이 많이 존재하는 회장 말단과 대장에서 흔히 발생한다. 염증성 장질환은 무균동물(germ-free animals)에서는 쉽게 발생되지 않는데, 이것은 장내 세균총이 대장 염증의 발생과 지속에서 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 궤양성 대장염의 치료는 일반적으로 항염증제, 복통치료제, 지사제, 신경안정제 등을 사용하나 단순한 증상 완화만이 가능하며 완치되기는 어려운 편이다. 스테로이드제제(prednisolone) 등의 항염증제로는 궤양부위의 축소는 가능하나, 항생제를 단독투여 혹은 병용 투여시 재발률은 거의 없는 관해(remission)가 된다. 가장 흔히 사용하며 가장 효과적인 약제는 설파살라진(sulfasalazine)으로 관해 유도와 유지에 유효한 것으로 알려져 있다. 궤양성 대장염의 치료에 항염증제보다 항생제가 유효하다는 것은 대장염 발병에 장내 세균총의 역할이 크다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고 이와 관련된 연구는 많지 않다.

정상 장내 세균총은 약 500여종의 박테리아로 이루어져 있으며, 회장과 대장에 많이 존재한다. 장내 세균총은 그람 양성균의 균체내독소(endotoxin)와 같은 독소와 세포독성물질 또는 발암물질을 생산하는 β-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase) 그리고 트립토판에이즈(tryptophanase)와 같은 유해한 효소를 생산 한다. 세포독소(cytotoxin)와 균체내독소(endotoxin)는 선천성 면역반응(innate immune response)의 잠재적 자극원으로 대장 상피세포에서 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)을 분비시켜 염증성 장질환을 유발시킨다. 염증성 장질환 환자의 장점막에서 세포외기질(extracellular matrix) 글라이코사미노글라이칸(glycosaminoglycans)의 생합성이 증가한다. 유산균은 안전한 미생물로 알려져 왔으며, 유산균은 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다.

한편, 유산균은 인간의 구강, 장, 질, 분변 등에 널리 분포한다. 따라서, 이들로부터 유산균을 분리하여 그 특성을 시험함으로써 원하는 성질을 갖는 유산균을 획득하는 방법이 행해지고 있으며, 특히 분변으로부터 유산균을 분리하는 방법이 유용하게 사용되고 있다. 이에 본 발명자들은 숙주 특이성의 관계에서 유산균의 유용한 효과의 극대화를 고려하여 한국인의 생리에 맞는 발효제품을 제조하는데 적합한 균주를 분리하고자 한국 성인들의 분변으로부터 유산균을 분리하여 시험하던 중, 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성이 매우 높고 에탄올과 아세트알데하이드 감소능이 우수한 특성을 가진 신규 유산균인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401을 발견하여 대한민국 특허등록 제0543115호(발명의 명칭: 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 젖산균)로 특허등록을 받았고, 이에 더하여 본 발명자들은 상기 미생물이 산화질소의 생성억제, 미엘로퍼옥시다제 활성 억제 효능 등 대장염의 치료 및 예방 효능을 가지는 것 을 새로이 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 염증 유도제인 LPS의 처리에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 억제하고, DSS로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성을 억제 하며, 대장염의 염증지표인 전염증성 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 단백질 발현을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB 활성 억제 및 저해인자인 IκBα 활성을 증가시켜 대장염의 치료 및 예방 효능을 가지는 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염증 유도제인 LPS의 처리에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 억제하고, DSS로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성을 억제하며, 대장염의 염증지표인 전염증성 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 단백질 발현을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB 활성 억제 및 저해인자인 IκBα 활성을 증가시켜 대장염의 치료 및 예방 효능을 가지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 건강한 한국인 성인의 분변을 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양후 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이렇게 형성된 균락 중에서 알콜 분해효소 활성 및 아세트알데하이드 분해효소 활성을 시험하여 본 발명의 균주를 분리하였다. 본 발명의 유산균은 2003. 10. 6.자로 국내기탁기관인 농업생명공학연구원(기탁번호: KCTC 91069) 및 2008.4.17.자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(기탁번호: KCTC 11314BP)에 기탁되었다.

본 발명에 따른 유산균의 특성은 다음과 같다.

1) 균의 형태

엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성

① 세포의 형태: 간균

② 운동성: 없음

③ 포자형성능: 없음

④ 그람(Gram) 염색: 양성

2) 균락의 형태

엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태

① 형상: 원형

② 융기: 볼록

③ 표면: 매끄러움(Smooth)

3)생리적 성질

① 생육온도: 생장가능 생육온도: 25~40℃

최적 생장온도: 36~38℃

② 생육 pH: 생장가능 생육 pH: 5.0~7.5

최적 pH: 6.0~6.5

③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성

4) 카탈라제: -

5) 가스형성여부: +

6) 15℃에서 생육: +

7) 45℃에서 생육: -

8) 인돌생산: -

9) 젖산생산: +

10) Bergey's manual의 당 발효 시험

아미그달린: -

아라비노스: +

셀로비오스: -

에스큘린: +

과당: +

갈락토스: +

포도당: +

글루코네이트: -

유당: -

말토스: +

만니톨: -

만노스: -

멜레지토스: -

멜리비오스: +

라피노스: -

리보스: +

람노스: -

살리신: -

소르비톨: -

자당: -

트레할로스: -

크실로스: -

이와 같은 균의 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 동정하였고, 본 발명자들은 이를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401로 명명하였다.

한편, 본 발명의 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 대장염 치료 및 예방용 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡술제 등과 같은 제재형태로 제제화하여 사용될 수 있다.

사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30 ㎎/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.

물론, 본 발명의 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 대장염 치료 및 예방용 약학조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 대장염 예방용 발효유는 유산균배양액, 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이 하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.

또한, 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 대장염 예방용 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성음료를 제조한다.

또한, 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 대장염 예방용 건강기능식품은 상기 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401은 염증 유도제인 리포폴리사카라이드의 처리에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 억제하고, 덱스트란 설페이트 소듐으로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성을 억제하며, 대장염의 염증지표인 전염증성 사이토카인 IL-1β와 IL-6단백질 발현을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB 활성 억제 및 저해인자인 IκBα 활성을 증가시킴으로서 대장염의 치료 및 예방을 목적으로 한 정장제, 발효식품 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말제조

본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401은 식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract, 그리고 포도당을 첨가한 액체배지를 제조하여 37℃에서 약 16시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산하였다. 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 10¹¹cfu 균수를 얻었다. 이 동결건조 분말을 대장염 치료 및 예방 소재로 사용하였다.

한편 본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401은 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.

<실시예 2>

락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제 조

본 발명의 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

정제의 제조

실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.

캡슐제의 제조

실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<실시예 3>

락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조

유산균 배양액과 본 발명의 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix^o)는 16.3~16.5%정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 × 10⁹ cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.

그 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 10~15중량%, 백설탕 3~5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10~15중량%, 펙틴 0.1~1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.05~0.15중량% 및 정제수 61.85~78.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그런 다음, 상기 유산균배양액 60~70중량%와 실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말 0.001~0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 29.9~39.999중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 대장염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유한 발효유를 제조하였다.

<실시예 4>

락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조

상기의 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 10~15중량%, 백설탕 3~5중량%, 갈색설탕 3~5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10~15중량%, 펙틴 0.1~1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.05~0.15중량% 및 정제수 58.85~73.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 29.9~39.999중량%와 실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말 0.001~0.1중량% 및 나머지 정제수 60~70중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 대장염 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 기능성음료를 제조하였다.

<실시예 5>

락토바실러스 브레비스 HY7401을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조

실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동결건조분말 0.001~0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 포함한 동 결건조분말 100중량%에 대하여 5~10중량%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2 mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.

<시험예 1>

락토바실러스 브레비스 HY7401의 LPS로 유도한 RAW264.7 세포의 산화질소(NO) 생성저해활성측정

RAW264.7 세포의 배양

RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum과 L-글루타민(glutamine)이 함유된 DMEM배지를 이용하여 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 그리고 일주일에 2~3번 정도 계대하였다.

산화질소 측정

전염증성물질인 산화질소는 면역반응지표로서 류마치스성 관절염, 대장염 및 포도막염 같은 염증성 질환과 자기 면역성 질환을 매개하는데 중요한 물질로서, superoxide(O₂ ^-)와 반응하여 peroxynitrite anion(ONOO^-)을 형성하여 단백질, 지질, 탄수화물, DNA 및 sulfhydryl group(-SH)에 산화적 손상을 유발한다. 이때 생성된 Peroxynitrite anion은 독성 산화제로서 티로신(tyrosine)의 니트로화(nitration)를 일으켜 니트로티로신(nitrotyrosine)을 생성하며, 단백질의 구조와 기능을 변형시킨다. 따라서, 산화질소의 생성억제율을 다음의 방법으로 측정하여 대장염 억제 효능을 확인하였다.

락토바실러스 브레비스 HY7401을 GAM 액상배지(Nissui, Japan)에서 16시간 배양하여 3000rpm에서 10분간 원심분리를 한 후 상등액은 제거하였다. 그런 다음, 상등액이 제거된 침전물에 칼륨인산 완충용액(PBS)을 넣고 초음파 처리하여 파쇄하고, 3000rpm에서 10분간 원심분리를 한 후, 상등액과 침전물(1㎖ PBS에 현탁)로 나누어 각각을 100배 희석하여 검체로 사용하였다. RAW 264.7 세포를 24-well plate에 6 x 10⁵cell/㎖로 분주하고, 상기 검체를 100㎕ 처리 한 후 LPS 최종 농도가 1㎍/㎖이 되도록 넣었다. 그런 다음, CO₂ 배양기에서 24시간 방치한 후 2000rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. 이렇게 원심 분리된 상등액과 Griess reagent를 동량으로 멀티웰 프레이트(multiwell plate)에 넣고 실온에서 10분간 방치한 후 540㎚에서 흡광도를 측정한 다음 질산나트륨(sodium nitrate)을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성하여 정량하였다. 유산균 시료에 의한 산화질소 생성 저해는 다음과 같이 계산하였다.

산화질소 생성 저해율(%)

그리고 스트렙토 코커스(Streptococcus) sp. 50, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY115, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1275, 비피도박테리움 리베로그램(Bifidobacterium liberogram) 1272, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 3215, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 1250, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 1217, 비피도박테리움 미니멈(Bifidobacterium minimum) 506, 비피도박테리움 인펀티스(Bifidobacterium infantis) 525, 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi) 513, 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum) 321, 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum) 311, 비피도박테리움 카테눌라툼(Bifidobacterium catenulatum) 309, 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 17, 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 25, 그리고 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 27도 락토바실러 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401과 동일한 방법으로 산화질소 생성억제를 시험 하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 가로측은 스트렙토 코커스(Streptococcus) sp. 50, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY115, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1275, 비피도박테리움 리베로그 램(Bifidobacterium liberogram) 1272, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 3215, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 1250, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 1217, 비피도박테리움 미니멈(Bifidobacterium minimum) 506, 비피도박테리움 인펀티스(Bifidobacterium infantis) 525, 비피도박테리움 쿠니쿨리(Bifidobacterium cuniculi) 513, 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum) 321, 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum) 311, 비피도박테리움 카테눌라툼(Bifidobacterium catenulatum) 309, 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 17, 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 25, 그리고 비피도박테리움(Bifidobacterium) sp. 27을 각각 '50', '115', '1275', '1272', '3215', '1250', '1217', '506', '525', '513', '321', '311', '309', '17', '25', 및 '27'로 표시하였다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 브레비스 HY7401 배양액의 상등액에서는 산화질소 생성 저해율이 61%이고, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY115의 배양액의 상등액에서는 저해율이 67%으로 가장 높았으며, 락토바실러스 브레비스 HY7401 배양액의 침전물에서는 산화질소 생성 저해율이 52%이고, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 1275 배양액의 침전물에서는 저해율이 51%로 가장 높았다.

<시험예 2>

DSS로 유도한 대장염 동물모델에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의한 대장길이 축소저해와 대장조직의 염증발생 저해의 측정

산화질소(NO) 분석을 통해 산화질소생성 억제율이 가장 뛰어난 것으로 보이는 락토바실러스 플란타룸 HY115와 락토바실러스 브레비스 HY7401을 DSS로 유도한 대장염 동물모델을 이용하여 대장염 발생 억제효과를 시험하였다.

먼저, 락토바실러스 브레비스 HY7401 균주는 엠알에스 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 배양하였다. 이 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 후 생리식염수로 2회 세척하였다. 다시 동량의 생리식염수에 현탁하여 시료로 사용하였다.

마찬가지로 락토바실러스 플란타룸 HY115 균주도 상기와 같이 준비하였다.

실험동물은 (주)중앙실험동물에서 ICR mouse 4주령의 수컷 쥐를 사용하였다. 3일간 순화시킨 후 2주간 상기의 락토바실러스 브레비스 HY7401 및 락토바실러스 플란타룸 HY115를 각각 실험동물에 마우스 무게(kg)당 0.5g/kg을 경구투여 하였으며, 경구투여 시작 후 7일째부터 DSS(MP Bio)를 5%로 물에 현탁하여 상기 실험동물에게 물 대신 공급하였다. DSS를 투여한 후 7일째 되는 날 해부를 시행하였다. 실험동물을 에테르 마취하여 맹장아래 1cm되는 지점부터 대장 끝까지를 적출하고 길이를 측정하였다. 그리고 적출한 대장 조직의 염증 발생 정도를 병리조직학적 방법으로 분석하였다. 일정한 세척 및 통상적인 방법에 따라 알코올 탈수과정을 거쳐 파라핀으로 포매하고 포매된 콜론(colon) 조직은 박절편기를 이용하여 5㎛ 두께의 연속절편을 작성하여 hematoxylin-eosin(H-E) 염색을 시행한 다음 permount로 봉입 하여 영구표본을 작성한 후 병리조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다.

도 2의 가로축 및 도 3에는 DSS를 처리 하지 않은 실험 동물군을 '대조구', DSS만 처리된 실험 동물군을 'DSS', DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 브레비스 HY7401을 투여한 실험 동물군은 '7401'및 DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 플란타룸 HY115를 투여한 실험 동물군은 '115'로 하여 표시하였다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, DSS 급여에 의해 대조구에 비하여 실험동물의 대장 길이가 축소되었으나, 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의해 대장 길이 축소가 억제되어 대조구의 대장 길이와 유사한 수준인 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).

또한, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, DSS 급여에 의해 실험동물의 대장 조직에 염증이 발생이 심하였으나, 락토바실러스 브레비스 HY7401의 투여에 의해 대장 조직의 염증 발생이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 3>

DSS로 유도한 대장염 동물모델에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의한 대장점막 조직의 Myeloperoxidase(MPO) 활성저해 측정

상기 시험예 2와 동일한 방법 및 조건으로 채취한 대장점막 조직에 0.5% hexa-decyl-trimethyl-ammonium bromide를 넣고 균질한 후 8000rpm에서 30분간 원 심분리를 하였다. 이렇게 원심 분리된 상등액 100㎕에 1.6mM tetra-methyl benzidine 100㎕, 0.1% H₂O₂ 5㎕, 증류수 795㎕를 넣고 650nm에서 time course로 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase)의 활성 변화를 측정하였다. 효소활성은 37℃에서 효소가 1μmol/㎖ 산화되는 양을 말하며, μUnit/㎎ protein으로 표시하였다. 단백질량 측정은 Bradford 방법에 준하여 시행하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 가로축에는 DSS를 처리 하지 않은 실험 동물군을 '대조구', DSS만 처리된 실험 동물군을 'DSS', DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 브레비스 HY7401을 투여한 실험 동물군은 '7401' 및 DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 플란타룸 HY115를 투여한 실험 동물군은 '115'로 하여 표시하였다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, DSS 급여에 의해 대장염의 염증 지표인 미엘로퍼옥시다제 활성이 증가하였으나, 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의해 미엘로퍼옥시다제 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.005).

<시험예 4>

DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 대장염의 염증지표인 IL-1β와 IL-6의 발현 저해 측정

상기 시험예 2와 동일한 방법 및 조건으로 대장조직을 1㎖의 ice-cold lysis 완충용액[0.5% Nonidet P40(Sigma Co.), 0.5% trition X-100, 10%(v/v) glycerol, 50mM Tris(pH 7.5), 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 10mM K₂HPO₄, 0.5% deoxycholic acid, 20mM NaF, 0.1mM PMSF, 20mM glycerol-2-phosphate, 1mM Na₃VO₄, 그리고 protease inhibitor cocktail(Boehringer/Roche, Mannheim, Germany) 함유]로 균질하였다. Lysate는 원심분리(15,000 x g, 4℃, 15분)하고 그 상등액을 96-well ELISA 플레이트에 옮겼다. IL-1β와 IL-6의 농도는 ELISA Kits(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 가로축에는 DSS를 처리 하지 않은 실험 동물군을 '대조구', DSS만 처리된 실험 동물군을 'DSS', DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 브레비스 HY7401을 투여한 실험 동물군은 '7401'및 DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 플란타룸 HY115를 투여한 실험 동물군은 '115'로 하여 표시하였다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, DSS 급여에 의해 대장염의 염증 지표인 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 발현이 증가하였으나, 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의해 IL-1β와 IL-6의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.005).

<시험예 5>

DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의 한 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB의 저해 및 저해인자인 IκBα의 활성 측정

상기 시험예 2와 동일한 방법 및 조건으로 대장조직을 조심스럽게 균질한 다음, 1㎖의 ice-cold PBS 완충용액에 분산시킨 후 원심분리(800 x g, 4℃, 10분)하였다. 그리고 A 완충용액(10mM HEPES pH 7.9, 10% glycerol, 10mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 0.5mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 10mM NaF, 그리고 protease inhibitor cocktail 함유)으로 세척하였다. 상기 세척된 대장조직 균질액을 원심분리한 후 0.2㎖의 A 완충용액(2㎕의 12.5%(v/v) Nonidet P40 추가 첨가)에 분산시킨 다음, 얼음에 잠깐 방치하고 다시 원심분리(800 x g, 4℃, 10분)하였다. 이렇게 원심분리된 상등액은 세포질(cytosolic) 분획으로 사용하였다. 원심분리된 침전물은 A 완충용액(2㎕의 12.5%(v/v) Nonidet P40 추가 첨가)으로 세척한 다음 원심분리(800 x g, 4℃, 10분)하고 다시 0.04㎖의 B 완충용액(20mM HEPES pH 7.9, 400mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 10mM NaF, protease inhibitor cocktail)에 분산시켰다. 그런 다음 1시간 동안 4℃에서 진탕배양하였다. 이렇게 진탕배양된 시료를 원심분리(800 x g, 4℃, 10분)하여 그 상등액을 핵(nucleic) 분획으로 사용하였다. 이렇게 회수된 세포의 단백질을 8~10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 옮겼다. 세포질 분획의 IkBα와 β-actin 그리고 핵 분획의 p65 NK-kB을 각각의 항체를 이용하여 신 등(Shin YW, Bae EA, Kim SS, Lee YC, Kim DH. 2005. Effect of ginsenoside b1 and compound K in chronic oxazolone-induced mouse dermatitis. Int. Immunopharmacol. 5:1183-1191)의 방법에 따라 분석하였다. 면역탐색(Immunodetection)은 enhanced chemiluminescence detection kit를 이용하여 수행하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6의 가로축에는 DSS를 처리 하지 않은 실험 동물군을 '대조구', DSS만 처리된 실험 동물군을 'DSS, DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 브레비스 HY7401을 투여한 실험 동물군은 '7401'및 DSS가 처리된 실험동물에게 락토바실러스 플란타룸 HY115를 투여한 실험 동물군은 '115'로 하여 표시하였다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, DSS 급여에 의해 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB는 활성화되고 저해인자인 IκBα는 저해되었으나, 락토바실러스 브레비스 HY7401 투여에 의해 전사인자인 NF-κB가 저해되고 저해인자인 IκBα는 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 LPS로 유도한 RAW264.7 세포의 산화질소 생성저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 대장길이 축소 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 염증발생 저해를 나타내는 대장의 조직학적 사진이다.

도 4는 DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase) 활성 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 대장염의 염증지표인 IL-1β와 IL-6의 발현 저해를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 DSS로 유도한 대장염 실험동물에서 락토바실러스 브레비스 HY7401 처리에 의한 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 전사인자인 NF-κB의 저해와 저해인자인 IκBα의 활성화를 측정한 결과를 나타낸 사진이다.

Claims

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염증 유도제인 리포폴리사카라이드(LPS)의 처리에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401(기탁번호: KCTC 11314BP).
덱스트란 설페이트 소듐(DSS)으로 유도한 대장염 실험동물모델에서 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401(기탁번호: KCTC 11314BP).
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상기 제2항 또는 제3항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 치료 및 예방용 약학적 조성물.
삭제
상기 제2항 또는 제3항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401을 유효성분으로 포함하고, 유산균배양액, 혼합과즙시럽을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방용 발효유.
삭제
상기 제2항 또는 제3항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401을 유효성분으로 포함하고, 혼합과즙시럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방용 음료.
삭제
상기 제2항 또는 제3항의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401을 유효성분으로 포함하고, 올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방용 건강기능식품.