KR101311989B1

KR101311989B1 - 면역 조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이 에이치와이7211를 유효성분으로 함유하는 제품

Info

Publication number: KR101311989B1
Application number: KR1020100114371A
Authority: KR
Inventors: 박세훈; 이호용; 안영태; 허철성
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2013-09-26
Also published as: KR20120053214A

Abstract

본 발명은 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 알레르기성 질환의 치료 및 예방과 더불어 면역 강화를 위한 약학적 조성물, 발효유, 건강기능 식품 등으로 이용될 수 있다.

Description

면역 조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이 에이치와이7211를 유효성분으로 함유하는 제품{Products containing Lactobacillus casei HY7211 having immuno-regulatory and immuno-stimulatory functions as effective component}

본 발명은 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알레르기성 질환의 대표적인 원인 물질인 IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피, 천식 등의 알레르기성 질환을 예방 및 치료할 수 있음과 동시에 TNF-α의 발현을 증가시킴으로서 면역증강 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품에 관한 것이다.

과면역반응의 대표적인 예로는 아토피, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 습진 등의 질병이 있다. 이러한 병증을 유발하는 물질인 알러젠(allergen)은 대식세포 및 항원제시 세포에 의해 탐지되고 단백질 분해효소에 의해 작은 펩타이드로 분해되어 세포 표면에 항원으로 제시된다. 이 항원은 B 임파구를 형질세포로 전환하며 IgE(면역글로불린 E)을 분비를 유도하며, 분비된 IgE는 다양한 면역세포의 수용체에 결합하여 알레르기 증상을 유발하는 히스타민(histamine), 프로스타글란딘(prostaglandin)과 염증세포들을 유인하는 염증성 사이토카인(cytokine)을 분비하여 알레르기 반응을 매개한다. 일반적으로 아토피를 비롯한 알레르기성 질환은 우세한 Th2 면역반응이 조절되지 않음으로서 유도되는 것으로 알려져 있으며, 실제로 Th2형 사이토카인인 IL-4는 IgE의 분비를 유도하며 Th1형 사이토카인인 IL-12는 이러한 IL-4의 분비를 억제한다.

또한 TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 전염증성(Proinflammatory) 사이토카인으로 알려져 있으며 염증반응을 유발하는 반면 면역강화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

인간의 몸 안에 있는 세포 중 약 10% 만이 인간의 세포이며 90% 이상은 다양한 미생물로 구성되어 있다. 이러한 미생물의 대부분은 장내균총을 이루고 있으며 장에 존재하는 다양한 면역세포와의 상호작용을 통해 인체의 면역조절에 영향을 미치고 있다. 장내균총에서 대표적인 이로운 균인 유산균은 유산을 분비하여 장내부패균의 증식 억제, 배변 활동 원활 등의 작용을 통해서 장내균총을 유지하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이에 더 나아가서 최근에는 유산균이 인체에서의 면역반응을 조절 또는 강화할 수 있다는 실험 결과가 많이 발표되고 있다. 예로써 유산균에 인위적으로 재조합 IL-10의 발현을 유도하였을 때, 대장염 및 천식이 완화될 수 있음을 실험적으로 보고하였다(Marinho, 2010 ; Bermudez-Humaran, 2009). 또한 L. acidophilus, L. casei , L. reuteri , Bifidobacterium bifidium , Streptococcus thermophilus의 5종의 유산균 복합체로서 마우스 모델에서 대장염, 아토피, 류마티스 관절염 등의 면역 질환이 치료/예방 될 수 있음을 보고하였다(Kwon, 2010).

이에 본 발명자들은 락토바실러스 카제이 HY7211(Lactobacillus casei HY7211)가 IgE의 발현을 감소시킴과 동시에 TNF-α의 발현을 증가시킴으로서 면역조절과 면역증강 효능을 동시에 가진다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 알레르기성 질환의 대표적인 원인 물질인 IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피, 천식 등의 알레르기성 질환을 예방 및 치료 할 수 있는 면역조절 효능과 동시에 TNF-α의 발현을 증가시킴으로서 면역증강 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기성 질환의 대표적인 원인 물질인 IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피, 천식 등의 알레르기성 질환을 예방 및 치료 할 수 있는 면역조절 효능과 동시에 TNF-α의 발현을 증가시킴으로서 면역증강 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 국내 목장에서 수거한 원유를 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후, 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37%에서 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 형성된 단일 콜로니를 각각 분리하여 사용하였다. 이렇게 분리한 균주의 관찰은 MRS 한천평판 배지에서 37℃로 48시간 배양한 후 그람염색(Cowan, 1974)을 통하여 분리 균주의 크기와 형태를 광학 현미경(SAMWON, CSB-FEI)으로 관찰하였으며, 분리한 균주의 생화학적 특성은 Cowan과 Steel(1984) 그리고 Macfaddin(1984)의 방법에 따라 균주의 특성을 조사한 후 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology와 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology에 준하여 분류 및 동정하였다.

따라서, 본 발명에 따른 신규의 유산균의 특성은 다음과 같다.

1)균의 형태: 막대형

2)집락 색깔: 우유빛의 둥근 환 모양

3)생육 최적 온도: 37℃

4)운동성: 없음

5)그람(Gram) 염색: 양성

6)카탈라제: 음성

7)산소 영향: 통성 혐기성

8)당 발효 실험 및 동정

Biomerieux 사의 API 50CHL kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

당 0-24	사용 여부	당 25-49	사용 여부
0 Control	-	25 에스큘린	+
1 글리세롤	-	26 살리신	+
2 Erythritol	-	27 셀로비오스	+
3 D 아라비노스	-	28 말토스	+
4 L 아라비노스	-	29 유당	+
5 리보스	+	30 멜리비오스	-
6 D 자일로스	-	31 수크로스	+
7 L 자일로스	-	32 트레할로스	+
8 아도니톨	-	33 이눌린	+
9 β 메틸-D-크실로시드	-	34 멜레지토스	+
10 갈락토스	+	35 D 라피노스	-
11 포도당	+	36 아미돈	+
12 과당	+	37 글리코겐	-
13 만노스	+	38 자일리톨	-
14 소르보스	+	39 β겐티오비오스	+
15 람노스	-	40 D 투라노스	+
16 둘시톨	-	41 D 라이소스	-
17 이노시톨	w	42 D 타가토스	+
18 만니톨	+	43 D 푸코스	-
19 소르비톨	+	44 L 푸코스	-
20 α-메틸-D-만노시드	-	45 D 아라비톨	-
21 α-메틸-D-클루코시드	-	46 L 아라비톨	w
22 N-아세틸-글루코사민	+	47 글루코나테	w
23 아미그달린	+	48 2-케토-글루코나테	-
24 아르부틴	+	49 5-케토-글루코나테	-

+ : positive - : negative w : weak

9)16S rDNA 분석

16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법을 실시하여 본 발명의 신균주를 동정하였다.

즉, MRS 배지에 배양된 본 발명의 신균주로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 반응[(95℃,3분), 30cycles(95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 90초), 72℃, 10분]을 수행하여 1.45kbp의 증폭물을 얻은 후 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석한 결과를 표 2에 나타내었다.

하기의 표 2의 유전자 염기서열을 토대로 BLAST 검색결과, 표 3에서와 같이 락토바실러스 카제이(Lacobacillus casei) 균주임을 동정할 수 있었다( <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast>).

1 GTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA
61 CCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGA
121 ACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCG
181 TATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAG
241 GTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
301 GAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTT
361 CGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTG
421 ACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG
481 TGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTG
541 ATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAG
601 AAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCA
661 GTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGA
721 ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGT
781 TTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCA
841 AGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
901 TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAG
961 GTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
1021 GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTT
1081 GGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
1141 TCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGA
1201 GACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACT
1261 CGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTT
1321 CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAA

위와 같은 균의 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주를 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211라고 명명하고, 한국생명공학연구원에 2010년 7월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11721BP).

한편, 본 발명의 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제재화하여 사용될 수 있다.

사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.

물론, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명의 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 제조한다.

또한, 본 발명의 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 유효성분으로 함유하는 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다.

또한, 본 발명의 면역조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.

본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211은 알레르기성 질환의 대표적인 원인 물질인 IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피, 천식 등의 알레르기성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 면역조절 효능과 동시에 TNF-α의 발현을 증가시킴으로서 면역증강 효능이 매우 뛰어나므로 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211를 알레르기성 질환의 예방 또는 치료 기능을 갖는 기능성 식품 및 약학 조성물 등으로 이용될 수 있다.

도 1은 동물세포에서 락토바실러스 카제이 HY7211의 IgE의 발현량 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 동물세포에서 락토바실러스 카제이 HY7211 처리시 Th1 사이토카인인 IL-12의 발현 증가를 리얼타임 PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 동물세포에서 락토바실러스 카제이 HY7211의 TNF-α의 발현량 증가 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

락토바실러스 카제이 HY7211를 포함한 동결건조 분말 제조

본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211은 식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract, 그리고 포도당을 첨가한 액체배지를 제조하여 37℃에서 약 16시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산하였다. 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 10¹¹cfu 균수를 얻었다. 이 동결건조 분말을 면역조절 및 강화 효능 소재로 사용하였다.

한편 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211은 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.

<실시예 2>

락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조

본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

정제의 제조

상기 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.

캡슐제의 제조

상기 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<실시예 3>

락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조

유산균 배양액과 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix^o)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0×10⁹ cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.

그 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유한 발효유를 제조하였다.

<실시예 4>

락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조

본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.

<실시예 5>

락토바실러스 카제이 HY7211을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조

상기 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 락토바실러스 카제이 HY7211을 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물 100중량부에 대하여 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.

<시험예 1>

락토바실러스 카제이 HY7211의 IgE 분비 억제능 측정

인간 유래 B 세포주인 U266B1 세포를 RPMI1640(GIBCO), 15% FBS(Hyclone) 그리고 1X Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)을 혼합한 배지를 이용하여 5% CO₂와 37℃가 유지되는 인큐베이터(Incubator)에서 배양하였다. 잘 자라지 않는 세포라서 주의 깊게 관찰하면서 배양하였다.

우선, U266B1 세포를 10㎠ 세포배양 접시에서 유지 계대 배양 후 건강한 상태의 세포를 96 well plate에 1~5 X 10⁵/㎖ 농도로 계대하였다. 약 50% 정도 U266B1 세포가 증식하였을 때, 원유에서 순수 분리한 서로 다른 유산균을 서로 각각 다른 well에 10⁶/㎖의 농도로 처리하여 72시간 배양하였다. 여기서 Mock은 유산균을 처리하지 않고 세포만 배양한 후 아무처리도 하지 않은 well을 의미한다.

IgE 발현량은 배지를 수거하여 배지에 존재하는 IgE의 양을 ELISA를 통해 분석하였다. 이때 ELISA는 2회 반복 이상의 실험을 수행하였다. 즉, 96 well ELISA plate에 50㎕의 수거한 배지을 각각 넣어 주었다. Plate를 덮고, 2시간 동안 상온에서 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 50㎕의 Biotinylated Antibody 용액을 넣어주고, 1시간 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 100㎕의 Streptavidin-HRP 용액을 넣어주고, 30분 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 100㎕의 TMB Substrate를 넣어주고, 암실에서 30분간 배양하였다. 100㎕의 Stop용액을 넣고, ELISA reader 기기를 이용하여 450nm와 550nm의 흡광도를 측정하였다.

본 실험에서 양성대조군으로는 IgE 발현을 유도할 수 있는 100ng/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)를 첨가하여 유산균에 의한 IgE 발현율과 비교하고자 하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211가 IgE의 발현량을 50% 이상 감소시킴으로써 IgE의 발현량을 가장 낮추는 것을 알 수 있었다.

<시험예 2>

락토바실러스 카제이 HY7211에 의한 사이토카인 IL-12의 발현량 증가 측정

Mouse T 세포주인 EL4세포를 DMEM(GIBCO), 10% FBS(GIBCO) 그리고 1X Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)을 혼합한 배지를 이용하여 5% CO₂와 37℃가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다. 즉, 우선 EL4세포를 10㎠ 세포배양 접시 유지 배양 후 건강한 상태에서 24 well plate로 계대하였다. 여기에 락토바실러스 카제이 HY7211을 10⁶/㎖의 농도로 처리하여 6시간 배양한 후, RNeasy Kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하고 흡광도를 측정하여 1.6<A₂₆₀<2.0인 RNA를 이용하였다. 이렇게 준비된 RNA를 분석직전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. cDNA를 제작하기 위하여 Superscript III (invitrogen, USA)를 사용하였다. 최초 2㎎의 RNA를 random primer, dNTPs와 함께 65℃에서 5분간 반응시켰다. 이후 얼음에서 1분간 반응시키고, cDNA Synthesis Mix를 넣고 25℃, 10분간 반응시켰다. 이후 50℃에서 50분간의 반응을 거쳐 85℃ 5분간 반응을 시키고, RNase H를 첨가하여 37℃ 20분간 반응을 시켜 cDNA를 제작하였다. ABI 7500 QRT-PCR(AB, USA)기기를 사용하여 β-actin, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ 유전자 발현정도를 비교하였다. 반응의 정확성을 위해서 triplicate로 실험을 진행하였고, 상기 방법을 통해 얻어진 2㎕의 cDNA를 주형으로 사용하였으며, primer와 더불어 SYBR Primix Ex Taq(2X)(Takara, Japan)를 사용하였다. 보다 정확한 분석을 위하여 ROX II(20X)를 사용하여 보정하였다. 반응액의 최종 부피는 최종 20㎕였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 카제이 HY7211 처리에 의해서 대표적인 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-10은 Mock과 비교하여 감소함을 알 수 있고, Th1 사이토카인인 IL-12, IFN-γ의 발현은 증가함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 카제이 HY7211은 Th-2 사이토카인의 발현은 감소시키고 동시에 Th-1 사이토카인의 발현은 증가시킴으로써 Th2의 편중된 면역반응을 Th1 방향으로 면역 조절하는 것으로 판단된다.

<시험예 3>

락토바실러스 카제이 HY7211의 면역 증강 효능 측정

상기 시험예 2에서 락토바실러스 카제이 HY7211 처리에 의하여 대표적인 면역증강 표지(marker)인 IFN-γ의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있다. 이에 HY7211 유산균 처리에 의해서 또 다른 면역증강 마커인 TNF-α의 발현이 증가되는지 여부를 확인하고자 하였다.

사용된 세포주로는 인간유래 monocyte 세포주인 THP-1 세포를 사용하였다. THP-1 세포를 RPMI1640(GIBCO), 10% FBS(Hyclone) 그리고 1X Antibiotic-Antimycotic (GIBCO)을 혼합한 배지를 5% CO₂와 37℃가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다. THP-1 세포의 경우 세포 배양 용기에 부착되지 않고 suspension culture로 배양되는 세포로서 건강하게 성장하는 세포 상태를 유지한 후 계대 배양시 1~5 X 10⁵/㎖의 농도로 희석한 후 96-well 세포배양 접시에서 배양하였다. 각각의 well에 락토바실러스 카제이 HY7211을 10⁶/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.

락토바실러스 카제이에 의한 TNF-α 발현량을 배지를 수거하여 배지에 존재하는 TNF-α의 양을 ELISA를 통해 분석하였다. 즉, 96 well ELISA plate에 50㎕의 세포 배양액을 넣어주었다. Plate를 덮고, 2 시간동안 상온에서 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 50 ㎕의 Biotinylated Antibody 용액을 넣어주고, 1시간 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 100㎕의 Streptavidin-HRP 용액을 넣어주고, 30분 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 100㎕의 TMB Substrate를 넣어주고, 암실에서 30분간 배양하였다. 100㎕의 Stop 용액을 넣고, ELISA reader 기기를 이용하여 450nm와 550nm의 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 카제이 HY7211가 다른 유산균에 비하여 10배 이상 TNF-α의 발현량을 증가시킴을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC11721BP

20100705

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면역 조절 효능 및 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
IgE(Immunoglobulin E)의 발현을 억제함으로써 면역 조절 효능 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 증가시킴으로써 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
면역 조절 효능 및 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 음료.
IgE(Immunoglobulin E)의 발현을 억제함으로써 면역 조절 효능 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 증가시킴으로써 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 음료.
면역 조절 효능 및 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
IgE(Immunoglobulin E)의 발현을 억제함으로써 면역 조절 효능 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 증가시킴으로써 면역 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7211(기탁번호: KCTC 11721BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.