KR102028744B1

KR102028744B1 - 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 hy7717 균주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102028744B1
Application number: KR1020180085632A
Authority: KR
Inventors: 이명희; 이하예라; 남보라; 정운희; 최일동; 장성식; 이정열; 심재헌
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2019-10-07

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주 및 그의 용도에 관한 것으로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주는 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖고 이를 포함하는 조성물은 유통 안정성을 갖는 바, 락토바실러스 플란타룸 HY7717을 포함하는 면역증강용 또는 항산화용 약학 조성물이나 식품 조성물 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주 및 그의 용도{Lactobacillus plantarum HY7717 strain having immune-enhancing activity, antioxidative activity and digestive fluid resistance and use thereof}

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주 및 이를 포함하는 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria, LAB)은 당을 발효해서 다량의 젖산을 생산하는 세균으로 유산 음료, 치즈, 된장, 김치, 탁주, 젓갈 등 전통발효식품의 제조에 이용되어 식품의 보존성을 높여온 경제적으로 중요한 의미를 지닌 미생물이다. 전 세계적으로 이용되고 있는 주요 유산균 종은 락토바실러스(Lactobacillus) 속으로 장내 정상 세균총의 유지, 면역 증강 작용 및 아토피 피부염 치료 효능 등의 기능이 보고되고 있다. 특히, 락토바실러스 플란타룸은 락토바실러스 속 유산균으로 주로 김치, 우유, 치즈, 버터 등에서 분리되며 자연계에서 가장 분포가 넓은 유산균 중 하나이다. 또한 락토바실러스 플란타룸은 김치가 발효되어 신맛이 날 때 주로 생장하는 균으로 내산성과 내담즙성이 강하며, 푸자리움(Fusarium), 슈도모나스(Pseudomonas)에 대한 항균 활성을 갖고, 항산화 및 항염증 효과를 갖고 있어 매우 유용한 균주이다.

프로바이오틱스(probiotics)는 섭취시 사람이나 동물에게 건강상의 이로움을 주는 살아있는 미생물로서 최근 김치, 젓갈 및 장류와 같은 전통발효식품에서 프로바이오틱스 기능을 갖는 유산균의 분리에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 이와 같이 전통발효식품에서 건강 기능성 유산균들이 발굴되고 있으나, 산업적 활용에 있어서는 제한적이다. 프로바이오틱스 기능을 갖는 유산균을 다양한 식품에 적용시 그 활성이 감소되거나 균체가 충분히 증식하지 못하는 경우가 있고, 제품의 품질이나 관능면에서 만족스러운 결과를 나타내지 못하는 등 제품 제조 과정에서 적용성이 떨어지기 때문이다. 따라서 현대인의 식품 소비 형태를 고려하여, 건강 기능성 효과를 보유하면서도 식품 제조시 적용도가 높은 유산균에 대한 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1239806호는 대식세포의 TNF-α의 발현을 증가시킴으로써 면역증강 활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 HY7712를 개시한다. 그러나 실제 제품으로의 적용을 위한 산업화 단계에서, 락토바실러스 플란타룸 HY7712는 소화관 생존율이 낮고, 분말 형태에서의 유통 안정성이 낮아 제품으로서의 적용에 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 HY7712보다 면역증강 활성이 뛰어나면서도, 항산화 효과를 갖고, 제품으로의 적용이 용이한 유산균에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1239806호

본 발명의 목적은 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 유산균을 포함하는 면역증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 유산균을 포함하는 항산화용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 유산균을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주를 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주는 김치에서 분리한 것으로, 한국생명공학연구원에 2018년 05월 30일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 13537BP).

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주는 그람 양성균이며, 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성이며, 포자를 형성하지 않고, 운동성이 없으며 세포의 형태는 간균이다. 또한 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균락은 볼록하게 융기된 형태를 갖고 형상은 원형이며 표면은 매끈하다.

본 발명에서 "면역증강 활성"은, 항원에 대한 생체 방어능을 증진시키는 것으로 구체적으로는 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시키는 것을 의미한다. 면역증강의 기작은 제한되지 않으나 예를 들면 대식세포 등 항원 제공 세포의 활성을 촉진하거나, 림프구에 대한 특이적인 활성을 촉진하여 이루어지는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "항산화 활성"은, 생체 내 활성산소의 생성을 방지하고 세포에 회복 불가능한 손상을 야기하는 산화현상을 방지하는 것으로, 좁은 범위로는 체내에서 생성되는 자유 라디칼, 자유 라디칼로부터 생산되는 과산화수소 또는 과산화물, 과산화수소로부터 생성되는 하이드록시 라디칼의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미하고, 넓은 범위로는 자연계에서 발생하는 산화반응의 생성을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미한다.

인체의 구조상 유산균이 섭취된 후 장에서 흡수되기 전까지 구강, 위 등의 소화관을 거치게 되므로 유산균이 유익한 효과를 발휘하기 위해서는 pH가 낮은 위와 담즙 그리고 여러 가지 소화효소 등의 환경 조건에서도 생존하여야 한다. 본 발명에서 "소화액 내성"은, 구강에 존재하는 아밀라제, 위에 존재하는 위산, 담즙 등의 소화효소를 포함하는 소화액에 의해 유산균이 사멸하지 않고 장까지 도달하여 생존할 수 있는 능력이며, 소화액 내성을 갖는 유산균은 내성을 갖지 않는 유산균보다 소화관 생존율이 높다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 면역증강 활성은 TNF-α의 발현을 증가시키는 것에 의한 것일 수 있다.

TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인(cytokine)이다. TNF-α는 세균의 세포막에 있는 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 림프구에 의해 생성되고, 많은 종류의 사이토카인 분비를 조절하는 면역반응에 있어서 가장 초기에 일차적인 매개체로 작용한다. 또한 TNF-α는 염증반응에서 백혈구들이 혈관 내피세포에 부착하는 것을 촉진하여 염증세포들의 미생물 살해능력을 증가시키며, 단핵 식균세포(mononuclear phagocytes)에 작용하여 여러 가지 염증반응에 관여하는 사이토카인을 생산하게 하여 염증반응을 촉진한다.

본 발명의 일 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.

TNF-α는 면역반응에 있어서 많은 종류의 사이토카인 분비를 조절하는 일차적인 매개체로 작용하고, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717은 TNF-α의 발현을 증가시키므로, 면역증강 활성을 갖는다.

본 발명의 면역증강용 약학 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있고, 면역질환은 자가면역질환, 바이러스 감염질환, 이식거부 질환 및 염증질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 보다 상세하게는 상기 자가면역질환은 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스관절염, 크론병 및 1형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 바이러스 감염질환은 후천성면역결핍증, B형 간염, C형 간염, 홍역, 대상포진 및 유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 염증질환은 천식, 축농증, 아토피, 치주염 및 베체트병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주는 DDPH법을 통하여 자유 라디칼의 생성을 억제하는 효능을 갖는 것으로 확인되었으므로, 항산화 활성을 갖는다.

항산화용 약학 조성물은 활성산소로 인해 발생하는 질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 활성산소로 인해 발생하는 질환은 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 약학 조성물은 유통 안정성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 "유통 안정성"은 분말제조시 및 상온에서 보관시에 유산균이 사멸하지 않고 생균으로서 유지되는 비율이 높은 것을 의미한다. 본 발명에서 "분말제조 수율"은 분말제조 후 생균수를 분말제조 전 생균수로 나눈값의 백분율을 의미하고, "상온 생존율"은 상온 보관 후의 생균수를 보관 전 생균수로 나눈값의 백분율을 의미한다. 분말제조 수율 및 상온 생존율이 높을수록 생균수의 변화가 적으므로 유산균을 포함하는 조성물은 유통 안정성을 갖는다. 일반적으로 유산균은 발효과정을 통하여 순수 배양되고 배양액으로부터 균체를 분리하여 동결 보호제 등과 혼합되어 동결 건조되며, 분쇄를 통하여 생균제로 제조되는데, 고품질의 유산균 제품을 개발하기 위해서는 유통 안정성이 있어야 하며, 유통 안정성의 유지는 제품의 기능성과 품질을 보장하는 매우 중요한 요소이며 따라서 이러한 기술은 제품의 경쟁력과 직결된다.

본 발명의 면역증강용 또는 항산화용 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 면역증강용 또는 항산화용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 면역증강 또는 항산화 효과를 나타내기 위하여 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양상은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유 및/또는 건강기능식품 등으로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 식품은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및/또는 비타민 복합제 등이 될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 식품 조성물은 유통 안정성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 식품 조성물은 기능성 음료, 건강기능식품, 또는 발효제품인 것일 수 있다.

본 발명에서 "기능성 음료"는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 0.01 내지 10g, 바람직하게는 약 0.01 내지 1g 이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "건강기능식품"은, 영양 공급 외에도 생체조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 우수한 식품을 의미한다. 상기 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상, 및 환제를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 제형이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 "발효제품"은 요구르트, 커드(curd), 치즈, 발효유, 분유, 우유 기재의 발효 제품, 아이스크림 및/또는 발효 곡물 제품(fermented cereal based product)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주는 동결건조 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주는 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖고, 이를 포함하는 조성물은 유통 안정성을 갖는 바, 락토바실러스 플란타룸 HY7717을 포함하는 면역증강용 또는 항산화용 약학 조성물이나 식품 조성물 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 면역증강 활성이 높은 균주를 선별하기 위한, 다양한 균주들의 TNF-α의 발현에 대한 효과를 나타낸다.
도 2는 HY7712 균주, HY7717 균주, HY7718 균주 및 HY7719 균주들의 TNF-α의 발현에 대한 효과를 나타낸다.
도 3은 HY7712 균주, HY7717 균주, HY7718 균주 및 HY7719 균주의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 HY7712 균주, HY7717 균주, HY7718 균주 및 HY7719 균주의 소화관 생존율(%)을 나타낸다.
도 5는 HY7712 균주 및 HY7717 균주의 분말제조 수율(%)을 나타낸다.
도 6은 HY7712 균주 및 HY7717 균주의 상온 생존율(%)을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주 스크리닝 및 균주의 동정

<1.1> 시료 확보 및 균주의 분리

충남 보령, 충남 서천, 전북 고창, 전북 순창, 전남 담양, 전남 고흥, 전남 여수 돌산, 전남 담양, 전남 보성 벌교, 경남 하동의 웅천장, 서천장, 고창장, 고흥장 등 재래시장 내 반찬가게에서 판매자가 갓 제조한 김치 등의 발효식품을 수집하여 파쇄 및 여과에 의해 수득된 거름액을 글리세롤과 혼합하여 균주를 분리하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

수집된 시료의 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로부터 균주를 분리하기 위해 멸균생리식염수 900㎕와 글리세롤 스톡 100㎕를 혼합하여 연속 희석을 수행하였다. 10^-1내지 10^-6희석 시료를 플레이트(plate) 당 100㎕ 취하여 브롬크레졸 퍼플(bromocresol purple)이 함유된 변형 MRS-agar 배지(하기의 표 1 참조)에 평판도말 하고 37℃에서 48시간 이상 배양하였다. 배양 후 형성된 노란색 미생물 콜로니(colony)를 멸균 루프로 취하여 동일 배지와 동일 온도 조건에서 3차례 이상 계대배양을 수행하여 단일 콜로니를 확보하였다.

조성	Broth(g/L)	Plate(g/L)
육추출물(Beef extract)	10.0	10.0
동물조직의 효소 분해물 (Enzymatic digest of animal tissue)	10.0	10.0
효모 추출물(Yeast extract)	5.0	5.0
인산칼슘(Potassium phosphate)	2.0	2.0
폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)	1.0	1.0
시트르산 암모늄(Ammonium citrate)	2.0	2.0
아세트산나트륨(Sodium acetate)	5.0	5.0
황산마그네슘(Magnesium sulfate)	0.1	0.1
황산망간(Manganese sulfate)	0.05	0.05
당 10 % stock	100.0	100.0
Agar	0	15.0
브로모크레졸 퍼플(Bromocresol purple)	0	0.04
증류수	864.85	849.81

<1.2> 균주의 스크리닝

면역증강 활성이 높은 균주를 선별하기 위해, <1.1>에서 분리된 균주가 TNF-α 발현에 미치는 효과를 측정하였다. TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인이다.

<1.2.1> THP-1 세포의 배양

한국세포주은행(cellbank.snu.ac.kr)에서 인간 유래 단핵 백혈구 세포주인 THP-1 세포주를 분양받아 사용하였다. 세포의 유지를 위해 85% RPMI 1640배지(Glibco#22400)와 15% FBS(Glibco#16000)가 포함된 배지에서 세포를 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 그 후에 세포를 배양한 배지를 2㎖ 정도 남긴 후 새 배지를 8㎖ 넣어 1:4의 비율로 주 1회 계대배양을 하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

<1.2.2> 균주의 준비

<1.1>에서 수집한 균주들을 분리하여, 34℃ MRS 액체배지에서 18 내지 20시간 동안 배양하였다. 배양액을 4000rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수집된 균체를 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 균체를 PBS 3㎖에 현탁시키고, 100℃에서 15분간 열처리하여 균주를 사멸시켜 사균체 시료를 제조하였다. 사균체 시료의 제조에 이용된 배양액에서 배양이 완료된 유산균을 1/10씩 희석하여 10^-7 내지 10^-9에서 MRS agar 배지를 이용하여 34℃에서 2 내지 3일간 배양해 균수를 측정하고, 이를 기준으로 하여 세포배양에 사용한 배지를 넣고 희석하여 실험에 사용하였다.

<1.2.3> TNF-α의 발현양 측정

THP-1 세포를 웰(well)당 1x10⁵수준으로 96 웰 플레이트(96 well plate)에 계대배양 한 후 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 실시예 <1.2.2>에서 준비된 사멸된 균주를 각 웰 당 1x10⁵ CFU로 처리한 후 18시간 동안 추가 배양하였다. 그 후에 각 웰에서 조심스럽게 배지를 수거한 후 원심분리하여 상층액을 취하고 TNF-α ELISA 키트(ab181421, Abcam) 를 사용하여 배지에 존재하는 TNF-α의 양을 정량 하였다.

구체적으로 제조사의 설명서에 따라 하기와 같이 분석하였다. ELISA 플레이트에 각 웰 당 50㎕의 항체 용액을 첨가하고, 바로 여기에 샘플 또는 standard 50㎕를 첨가하고 플레이트를 밀봉한 후 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 300㎕의 wash buffer로 3회 세척하고 TMB 발색 시약을 100㎕ 첨가 한 후 암소에서 10분간 반응시켰다. 발색 반응을 유도한 후 100㎕의 stop solution을 첨가하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 2회 반복하여 수행하고, 각 시료당 평균값을 계산하였다.

다양한 균주들의 TNF-α의 발현에 대한 효과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, <1.1>에서 각 지역에서 수집한 김치국물에서 분리된 균주들 중 HY7717, HY7718 및 HY7719 균주들이 다른 균주들 보다 THP-1 세포에서 TNF-α의 발현을 높게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

<1.3> 균주의 동정

<1.3.1> 16S 리보솜 RNA 유전자 서열 분석

분리한 균주의 동정 및 분류를 위해서 16S 리보솜 RNA 유전자(16S ribosomal RNA gene, 이하 16S rRNA)의 염기서열을 바이오닉스에 의뢰하여 분석하였으며, 최종적으로 분리한 균주의 16S rRNA를 이용하여 NCBI blast search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해서 상동성을 분석한 결과, 락토바실러스 플란타룸 표준 균주와 가장 우수한 상동성을 나타내는 것을 확인하였다.

<1.3.2> 균주의 특성 분석

본 발명의 HY7717 균주에 대해서 하기와 같은 균학적 특성을 확인하였다.

(1) 균의 형태(37℃, MRS 한천 평판배지에서 2일간 배양)

① 세포의 형태: 간균

② 운동성: 없음

③ 포자형성능: 없음

④ 그람(Gram) 염색: 양성

(2) 균락의 형태(37℃, MRS 한천 평판배지에서 2일간 배양)

① 형상: 원형

② 융기: 볼록

③ 표면: 매끈(smooth)

(3) 생리적 성질

① 생육 온도: 생장가능 생육온도는 13 내지 43℃, 최적생장온도는 33 내지 37℃

② 생육 pH: 생장가능 생육 pH는 4.5 내지 7.5, 최적 pH는 5.0 내지 5.5

③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성

(4) 카탈라제: -

(5) 가스 형성 여부: -

(6) 15℃ 에서 생육: +

(7) 45℃ 에서 생육: -

(8) 인돌 생산: -

(9) 젖산 생산: +

16S rRNA 서열 및 균학적 특성에 의해 본 발명의 균주를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717(이하, 'HY7717')로 명명하였으며, 이를 2018년 05월 30일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 13537BP를 부여받았다.

실시예 2: TNF-α 발현 측정

본 발명의 출원인들은 대식세포의 TNF-α의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성이 뛰어난 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7712(이하, 'HY7712')를 공지한바 있으므로(특허등록 제10-1239806호), 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주(이하, 'HY7717')의 활성을 규명하기 위하여 공지된 HY7712와 비교하여 본 발명의 HY7717 균주가 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인이다.

<2.1> THP-1 세포의 배양

실시예 <1.2.1>의 방법과 같다.

<2.2> 균주의 준비

실시예 <1.2.2>와 같은 방법으로 HY7712, HY7717, HY7718 및 HY7719 균주들의 사균체 시료를 준비한다.

<2.3> TNF-α의 발현양 측정

실시예 <1.2.3>과 같은 방법으로 THP-1 세포에서 TNF-α의 발현양을 측정한다. 도 2는 HY7712, HY7717, HY7718 및 HY7719에 의한 THP-1 세포에서의 TNF-α의 발현양을 나타낸다. 특히. HY7717과 HY7718은 기존에 공지된 HY7712 대비 2배 이상 TNF-α의 발현양을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 항산화 활성 측정

2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (DPPH)의 환원에 의한 자유 라디칼 소거능력을 이용하여 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주(이하, 'HY7717')의 항산화 활성을 측정하였다. DPPH법은 안정한 자유 라디칼인 DPPH가 수소공여체(H-donor)와 반응하는 능력을 바탕으로 측정하는 방법이다.

<3.1> 균주의 준비

HY7717, HY7718, HY7719 및 HY7712 균주를 MRS 액체배지 10㎖에 접종하여 34℃에서 18 내지 20시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 10분간 4,000rpm으로 원심분리하여 균체를 얻은 후 PBS 완충용액으로 3회 세척하였다. 세척을 완료한 균체를 PBS 3㎖에 현탁시켜 100℃에서 15분간 열처리 하여 사균체 시료를 제조하였다. 사균체 시료의 제조에 이용된 배양액에서 배양이 완료된 유산균을 1/10씩 희석하여 10^-7 내지 10^-9에서 MRS agar 배지를 이용하여 34℃에서 2 내지 3일간 배양해 균수를 측정하고 이를 기준으로 하여 세포배양에 사용한 배지를 넣고 희석하여 실험에 사용하였다.

<3.2> DDPH(2,2-디페닐-1-피크릴히드라질) 라디칼 소거활성 측정

DDPH 라디칼 소거능(%)은 Lin 및 Chang의 방법 (Lin M-Y and Chang F-J. 2000. Antioxidative Effect of Intestinal Bacteria Bifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Dig. Dis. Sci. 45:1617-1622)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

<3.1>에서 제조된 사균체 시료 240㎕, PBS 560㎕와 DPPH 용액(0.2mM) 500㎕을 혼합하여 볼텍싱하였다. 상온에서 차광하여 30분간 반응시킨 다음 시료를 5,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 취하고, 상층액의 흡광도를 517nm에서 측정하였다. PBS 용액을 blank로 하여 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능(%)은 아래와 같은 식으로 계산하였다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = 100 X (1-유산균의 흡광도/blank의 흡광도)

HY7717, HY7718, HY7719 및 HY7712의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, HY7717은 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다.

실시예 4: 동결건조 분말의 제조

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주로 발효된 발효액을 7,000rpm 이상의 고속원심분리기를 이용하여 균체만을 분리하여 포집하였다. 회수된 균체 대비 1 내지 5 중량%로 당류 및 탈지분유 성분을 동결보호제로써 포함하여 수용액으로 제조한 뒤 121℃에서 15분간 가압살균하였다. 가압살균된 동결보호제와 회수된 균체를 혼합하여 동결건조하였다.

실시예 5: 소화관 생존율 측정

본 발명의 유산균이 면역증강 활성 및 항산화 활성을 온전히 나타내기 위해서는 유산균은 섭취된 후 아밀라제, 위산, 담즙 등의 소화효소를 포함하는 소화액에 의해 사멸하지 않고 장에 도달하여 흡수될 수 있어야 하므로, 인체의 소화관 모델과 유사한 환경에서 균주의 생존율을 측정하여 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주(이하, 'HY7717')가 소화액 내성을 갖는지 여부를 살펴보았다.

<5.1> 시료의 제조

분말시료 제조시 보호제는 첨가하지 않는다는 점을 제외하고는 실시예 4의 방법과 동일하게 동결건조 분말을 제조하고, 최종농도가 10⁹ CFU/㎖이 되도록 제조한 동결건조 분말을 PBS 완충용액에 용해하였다.

<5.2> 전해질 용액 및 효소 용액의 제조

M. Minekus et al., Food Funct. 2014 Jun;5(6):1113-24의 논문에 사용된 실험법을 사용하여 소화모델에 사용되는 전해질 용액(표 2 참조)을 제조하고, Glahn, R.P et al. J Nutr. 1998 Sep;128(9):1555-61의 논문을 참고하여 효소 용액을 제조하였다.

구분	Simulated Slivary Fluid (SSF, mmol/L)	Simulated Gastric Fluid (SGF, mmol/L)	Simulated Intestinal Fluid (SIF, mmol/L)
KCl	15.1	6.9	6.8
KH₂PO₄	3.7	0.9	0.8
NaHCO₃	13.6	25	85
NaCl	-	47.2	38.4
MgCl₂(H2O)₆	0.15	0.1	0.33
(NH₄)₂CO₃	0.06	0.5	-
CaCl₂(H₂O)₂	1.5(0.75)	0.15(0.075)	0.6(0.3)

<5.3> 소화관 생존율 측정

구강단계(Oral phase)에서는 <5.2>의 시료에 <표 2>의 SSF 전해질 용액을 넣었다. 후에 인체 유래 타액의 α-아밀라제와 CaCl₂를 첨가하고 SSF:시료의 최종 부피비가 50:50가 되도록 증류수(DW)로 조절하였다. 이를 37℃, 진탕배양기(shaking incubator)에서 2분간 반응시켰다.

위 단계(Gastric phase)에서는 앞서 소화된 시료에 <표 2>의 SGF 전해질 용액을 넣었다. 후에 돼지유래 펩신과 CaCl₂를 첨가하고, pH 3.0이 되도록 하고 SGF:시료의 최종 부피비가 50:50가 되도록 증류수(DW)로 조절하였다. 이를 37℃, 진탕배양기에서 2분간 반응시켰다.

소장단계(Intestinal phase)에서는 앞서 소화된 시료에 <표 2>의 SIF 전해질 용액을 넣었다. 후에 돼지유래 판크레아틴, 담즙산 및 CaCl₂를 첨가하고, pH 7.0이 되도록 하고 SIF:시료의 최종 부피비가 50:50가 되도록 증류수(DW)로 조절하였다. 이를 37℃, 진탕배양기에서 2분간 반응시켰다.

마지막으로 흡수단계에서 앞서 소화된 시료에 자연막소포(Brush Border Membrane Vesicles, BBMV)를 첨가하고, 37℃, 진탕배양기에서 4시간 동안 반응시킨 뒤 시료를 채취하였다.

모든 소화 흡수과정을 거친 후에 잔존하는 균수는 통상적인 생균수 측정 밥법에 따라 생균수를 분석하였으며, 균주의 소화관 생존율(%)은 소화 흡수과정을 거친 후의 생균수를 소화 흡수과정을 거치기 전의 초기 생균수로 나눈값의 백분율(=(소화 흡수과정을 거친 후의 생균수/소화 흡수과정을 거치기 전의 초기 생균수) x 100)로 계산하였다. 소화관 생존율(%)의 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, HY7717 균주의 소화관 생존율은 다른 균주 보다 3배 이상 높으므로 HY7717 균주는 소화액 내성을 갖는다.

실시예 6: 유통 안정성 조사

유통 안정성을 조사하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 HY7712(이하, 'HY7712') 및 락토바실러스 플란타룸 HY7717(이하, 'HY7717')에 대해서 분말제조 수율과 가속실험을 통한 상온 생존율을 측정하였다. HY7717는 HY7712 보다 분말제조 수율과 상온 생존율이 높아 생균수의 변화가 적으므로 HY7717을 포함하는 제품은 유통 안정성을 갖는 것으로 확인되었다.

<6.1> 분말제조 수율 측정

실시예 4의 방법으로 제조한(8000 rpm, 15분간 원심분리) 동결건조 분말에 대해서 분말제조 전후의 생균수를 비교하여 분말제조 수율을 측정하였다. 통상적인 생균수 측정방법에 따라 생균수를 측정하였고, HY7717과 HY7712의 분말제조 전후의 생균수는 표 3에 나타내었다.

분말제조 수율(%)은 분말제조 후 총 생균수를 분말제조 전 총 생균수로 나눈값의 백분율(=(분말제조 후 총 생균수/분말제조 전 총 생균수) x 100)로 계산하였다. 분말 제조 수율(%)의 결과는 표 3 및 도 5에 나타내었다. HY7717 균주의 분말제조 수율은 공지된 HY7712 균주에 비하여 2배 정도 높다.

구분	HY7717	HY7712
배양액 총 생균수	3.9x10¹³	3.9x10¹³
분말 총 생균수	2.3x10¹³	1.1x10¹³
분말 제조 수율(%)	57.8	29.2

<6.2> 상온 생존율 측정

상온 보관시의 안정성을 검토하기 위하여 가속실험을 하였다. 실시예 4의 방법으로 동결건조 분말을 제조하고 산소와 습기는 투과되지만 무균상태가 유지되는 conical tube에 2g씩 포장하여 온도 25℃, 습도 40%를 유지하여 4주 후에 균의 생존율을 측정하였다. 통상적인 생균수 측정방법에 따라 생균수를 측정하였고, 0주차와 4주차의 생균수를 표 4에 나타내었다. 상온 생존율(%)은 4주차의 생균수를 초기(0주차) 생균수로 나눈값의 백분율(=(4주차의 생균수/0주차의 생균수) x 100)로 계산하였다. 4주 후의 상온 생존율(%)을 표 4 및 도 6에 나타내었다. 4주 후의 상온 생존율(%)을 측정한 결과 공지된 HY7712 균주에 비하여 HY7717 균주의 상온 생존율은 5.2배 정도 높다.

구분	HY7717	HY7712
0주차의 총 생균수	6.90 x10¹¹	6.00 x10¹¹
4주차의 총 생균수	1.83 x10¹¹	3.00E x10¹⁰
상온 생존율(%)	26.4	5.0

실시예 7: 약학적 조성물의 제조

<7.1> 액제의 제조

실시예 4의 동결건조 분말 100㎎, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음, 정제수를 가하여 전체가 100㎖가 되도록 조절하고 이를 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

<7.2> 캡슐제의 제조

실시예 4의 동결건조 분말 100㎎에 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 약전 제제총칙 중 캡슐제 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

실시예 8: 식품 조성물의 제조

<8.1> 기능성 음료의 제조

먼저 액상과당 13 중량%, 백설탕 2.5 중량%, 갈색설탕 2.5 중량%, 혼합과즙농축액 56 Brix⁰10.9 중량%, 펙틴 1.0 중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1 중량% 및 정제수 70 중량%를 30 내지 35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여, 혼합과즙시럽을 제조하였다.

상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4 중량%와 실시예 4의 동결건조 분말 0.1 중량% 및 나머지를 정제수 69.5 중량%로 조합하여 150 bar에서 균질화한 후 10℃ 이하로 냉각하여 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주를 포함하는 기능성 음료를 제조하였다.

<8.2> 건강기능식품의 제조

실시예 4의 동결건조 분말 0.1 중량%에 영양보조성분(비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E, 초산 에스테르 및 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 실시예 4의 동결건조 분말 100 중량부 대비 10 중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기의 혼합물에 멸균 정제수 10 중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1 내지 2㎜의 과립상으로 성형하였다. 성형된 과립을 40 내지 50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12 내지 14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 제조된 과립을 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 만들거나 경질 캡슐에 충전하여 경질 캡슐 제품으로 제조하였다.

<8.3> 발효제품의 제조

원유 95.36 중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6 중량%를 교반하여 15℃에서의 비중이 1.0473 내지 1.0475, 적정산도는 0.2 내지 0.22%, pH는 6.55 내지 6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix⁰)는 16.3 내지 16.5% 정도가 되도록 혼합하여 유산균 배양액을 제조하였다. 그 후에 유산균 배양액을 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02 중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP(Bromocresol purple) 배지에서 총 유산균 수가 1.0 x 10⁹CFU/㎖ 이상, 적정산도가 0.89 내지 0.91%, pH는 4.55 내지 4.65가 되도록 하였다. 그 후에 액상과당 13 중량%, 백설탕 5 중량%, 혼합과즙농축액 56 Brix⁰10.9 중량%, 펙틴 1.0 중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1 중량% 및 정제수 70 중량%를 30 내지 35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 혼합과즙시럽을 제조하였다.

상기의 유산균 배양액 69.5 중량%와 실시예 4의 동결건조 분말 0.1 중량% 및 상기의 혼합과즙시럽 30.4 중량%를 조합하여 150 bar 에서 균질화한 후 10℃ 이하로 냉각하여 락토바실러스 플란타룸 HY7717 균주를 포함하는 발효유를 제조하였다.

한국생명공학연구원

KCTC13537BP

20180530

Claims

면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖고,
상기 면역증강 활성은 TNF-α의 발현을 증가시키는 것에 의한 것이며,
수탁번호는 KCTC 13537BP인 것인,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 동결건조 분말로 제조시 분말제조 수율이 50% 이상이고,
상기 분말제조 수율은 분말 제조 후 총 생균수를 분말제조 전 총 생균수로 나눈값의 백분율인 것인,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하는 면역증강용 약학 조성물.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하고, 활성산소로 인해 발생하는 질환으로서 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염 및 아토피성 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
삭제
제 1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717을 포함하는 식품 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 식품 조성물은 유통 안정성을 갖는 것인 식품 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 식품 조성물은 기능성 음료, 건강기능식품 또는 발효제품인 것인 식품 조성물.