WO2006087913A1 - 免疫賦活用組成物 - Google Patents

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WO2006087913A1
WO2006087913A1 PCT/JP2006/301661 JP2006301661W WO2006087913A1 WO 2006087913 A1 WO2006087913 A1 WO 2006087913A1 JP 2006301661 W JP2006301661 W JP 2006301661W WO 2006087913 A1 WO2006087913 A1 WO 2006087913A1
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bifidobacteria
food
production
strain
iga
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PCT/JP2006/301661
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French (fr)
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Itaru Moro
Takashi Iwase
Kuniyasu Ochiai
Masako Yajima
Masaki Terahara
Yoshitaka Nakamura
Mamoru Totsuka
Kiyoshi Yamada
Original Assignee
Meiji Dairies Corporation
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulatory composition characterized by containing bifidobacteria belonging to bifidobacterium bifidum and / or a processed product of the bifidobacteria, and
  • the present invention relates to foods and drinks and pharmaceutical compositions useful for immunostimulation.
  • the mucous membrane surface of the bronchi, digestive tract, genitourinary system, etc. is mainly composed of secretory IgA to protect the body against many foreign antigens including microorganisms such as bacteria and viruses and food proteins.
  • secretory IgA is a dimer IgA (dimeric IgA: 2IgA'J) containing J chain and a secretory component (SC: secretory com ponent, or secretory piece). 2IgA'J'SC), which is abundant in saliva, tears, nasal discharge, milk, and secretions from the bronchi and intestinal tract.
  • mucosa-related lymphoid tissue Such lymphoid tissue on the mucosal surface is called mucosa-related lymphoid tissue and plays a central role in inducing IgA production.
  • antigen-stimulated activated B-cell force such as Peyer's patch, which is a typical mucosa-related lymphoid tissue of the intestinal tract, is returned not only to the intestinal tract but also to the exocrine glands and bronchi It is distributed on the mucosal surface of the genitourinary system and differentiates into plasma cells that are IgA-producing cells to produce dimeric IgA.
  • the dimeric IgA produced in this way is combined with secretory components produced in the mucosal epithelial cells to form secretory IgA, which is secreted from the mucosa into the lumen and ex vivo.
  • secretory component is an essential component for secreting dimeric IgA into the lumen or outside the living body.
  • a food ingredient or composition that induces and establishes the production of dimeric IgA and the production of secretory components in the mucous membranes of the bronchi, gastrointestinal tract, urogenital system, etc. It can be expected to increase the amount of secretory IgA secreted from the mucous membrane to the lumen and in vitro to enhance the defense ability.
  • such enhancement of the body defense ability by mucosal immunity is particularly useful in preventing pathogens from entering the body and preventing the development of food allergies. is there.
  • Patent Document 1 As substances that enhance the production of secretory IgA, for example, the present inventors have found a furato-oligosaccharide and a composition thereof (Patent Document 1). This furato-oligosaccharide is one of the few food ingredients reported for its effect on the production of secretory ingredients. On the other hand, it is known that bifidobacteria bifidobatterium longumya bifidobatterium breve induces IgA production in Peyer's patch cells (Patent Document 2).
  • Bifidobacterium longum OLB 6001 strain isolated from adult feces has the ability to induce IgA production (Non-patent Document 1).
  • This bifidobacteria Bifidoba cterium longum OLB 6001 strain is the same as that reported by the present inventors group as Bifidobatterium longum No. 7 (Accession No. FERM P-13610) (patent document) 3).
  • further appearance of an immunostimulatory composition having a higher immunostimulatory effect than those of bifidobacteria is still desired.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-201239
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 7-106142
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 7-69907
  • Non-special reference 1 Takahashi T., NaKagawa ⁇ ⁇ , Nara ⁇ ⁇ , Yajima ⁇ . And Kuwata T. Biosci Biotechnol Biochem 62 (1), (1998) p.10-15
  • An object of the present invention is to provide an immunostimulatory composition, and a food and drink and a pharmaceutical composition useful for immunostimulation.
  • the present inventors have found that the production of secretory components and the intestinal mucosal system among bifidobacteria belonging to Bifidobacterium bifidum.
  • the present invention was completed by succeeding in obtaining a plurality of strains useful in immunostimulation, which can promote both production of dimer IgA in. That is, the present invention includes the following.
  • [0007] Secretory synthesis that increases secretory component production in intestinal epithelial cells by at least 1.2 times An immunostimulatory composition comprising bifidobacteria belonging to Bifidobacterium bifidum and / or a processed product of the bifidobacteria having an ability to induce partial production.
  • the Bifidobacterium is a strain of Bifidobacterium bifidum OLB 6377 (accession number NITE BP-
  • a food or drink comprising the immunostimulatory composition according to any one of [1] to [4] above.
  • a pharmaceutical composition comprising the immunostimulatory composition according to [1] to [4] above.
  • Bifidobacterium bifi dum OLB 6377 strain (Accession number ⁇ BP-30) or Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain (Accession number NITE BP-31) for producing immunostimulating foods and drinks or pharmaceutical compositions Use of.
  • the immunostimulatory composition of the present invention can promote the production of secretory components in epithelial cells, and bifidobacteria (Bifidobataterum longumya bifu) that have been reported to have an immunostimulatory effect. It can induce IgA production in Peyer's patch cells considerably more strongly than Idbaterium (Breve etc.). Therefore, the immunostimulatory composition of the present invention is In particular, it is very useful in stimulating mucosal immunity. Furthermore, the food / beverage products and the pharmaceutical composition of the present invention contain an immunostimulatory composition derived from bifidobacteria that humans have taken as food for many years, and therefore have less risk of causing side effects.
  • Bifidobacterium bifidum OLB 6377 strain accesion No. NITE BP-30
  • Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain accesion No. NITE BP-311
  • the ability to promote the production of secretory components can be achieved. It is possible to produce an immunologically effective composition capable of inducing IgA production several times stronger than conventional bifidobacteria.
  • FIG. 1 shows the ability to induce IgA production when a lymphocyte group derived from mouse Peyer's patches is cultured with various bifidobacteria in the presence of anti-CD3 antibody.
  • n 3, the value is expressed as the average soil standard deviation.
  • FIG. 2 Shows the effect of disrupted Bifidobacterium bifidum OLB 6377 strain on secretory component production from HT-29.
  • FIG. 3 The effect of disrupted Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain on the production of secretory components from HT-29 cells.
  • the sample was added to the medium so as to be 500 ⁇ g / ml and cultured for 48 hours.
  • n 3. The value is a relative value when the control is 1, and is expressed as an average soil standard deviation.
  • FIG. 5 shows the effect of disrupted Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain on the expression level of secretory component genes in the small and large intestines.
  • the bar is the average soil SD (standard deviation) The relative value indicated by
  • an immunostimulatory composition is produced using bifidobacteria belonging to Bifidobacterium bifidum, which have a secretory component production-inducing ability and a high IgA production-inducing ability.
  • Bifidobacterium bifidum to which the bifidobacteria used in the present invention belongs is one species of the genus Bifidobacteria.
  • Bifidobacteria classified as Bifidobacterium 'Bifidum' in the present invention can be identified according to the usual taxonomic criteria, but molecular biology techniques frequently used in recent years, for example, Bifidobacterium 'Bifidum' It can also be identified by a method using a specific DNA probe (intestinal floracin deposit 8 “molecular ecological detection and identification of intestinal flora”) or DNA homology with a standard strain.
  • secretory component production inducing ability refers to the ability to promote secretion of secretory components from mucosal epithelial cells (for example, but not limited to, intestinal epithelial cells). This ability to induce secretory component production is, for example, when the amount of secretory component secreted from mucosal epithelial cells in contact with bifidobacteria or a treated product of bifidobacteria is compared with that of a control experiment group without using bifidobacteria, etc. Of the secretory component concentration or the relative value of the secretory component amount.
  • the bifidobacteria used in the present invention is selected from among the bifidobacteria belonging to bifid butterium bifidum that can increase secretory component production in intestinal epithelial cells by at least 1.2 times. It is preferable that The amount of secretory component produced can be measured in vitro, for example, as described in the Examples below. [0025] Selection of such Bifidobacteria is not limited, but can be performed, for example, based on the Atsy method described in the Examples of the present specification.
  • bifidobacteria belonging to bifidobatterium 'bifidum are cultured in an anaerobic EG medium prepared by changing glucose to ratatoses, and the cells in the resulting culture are washed, Next, heat treatment and ultrasonic crushing are performed to obtain a crushed cell body.
  • This cell disruption product is added to a medium inoculated with a human intestinal epithelial cell-derived cell line (eg, HT-29 cells), preferably cultured at 37 ° C for 48 hours, and then secreted components in the culture supernatant. Measure the concentration.
  • a suspension of cultured cells in PBS (-) may be added directly to the above medium.
  • the Bifidobacterium strain when the relative value S1.5 obtained by performing the above-mentioned assay using a certain Bifidobacterium strain, the Bifidobacterium strain has the ability to increase the secretory component production from intestinal epithelial cells by 1.5 times. And can be selected as the bifidobacteria of the present invention. Since this culture system does not contain plasma cells (IgA-producing cells), the secretory component does not bind to IgA and is isolated alone in the culture supernatant.
  • the ability to induce secretory component production of bifidobacteria used in the present invention is also supported by the effect of increasing the expression level of the secretory component gene in the intestine.
  • the bifidobacteria used in the present invention can preferably increase the expression level of the secretory component gene by at least 2.0 times.
  • the increase in the expression level of the secretory component gene by the bifidobacteria of the present invention is as follows: zj ⁇ ⁇ ⁇ or Otsukiyasu, secreted, component component gene 5 plgR ⁇ oden olymeric immunoglobulin receptor gene; GeneiD: 18703; Shimada S. et al "J Immunol.
  • mRNA eg accession number BC013556 [international nucleotide sequence data Base]
  • the amount of mRNA derived from the plgR gene is prepared by reverse transcription PCR using oligo-dT primers using total RNA extracted from tissues of the small intestine (eg, ileum, jejunum, etc.) or large intestine (eg, proximal colon). Then, by using the obtained cDNA as a saddle and performing real-time PCR using a plgR gene-specific primer pair, it can be determined from the amount of the amplified product detected.
  • the intestinal tissue to be used for measuring the expression level of the plgR gene may be organ-cultured to make the measurement conditions uniform. It is also preferable to use GAPDH gene, / 3actin gene, etc. as an internal standard for real-time PCR. These genes can also be obtained as commercially available hybridization probes (Alied Biosystems, Stratagene, etc.), and they can be suitably used as internal standards.
  • the bifidobacteria used in the present invention can also increase the expression level of the interferon regulatory factor 1 gene (IRF-1 gene) in the intestine as well as increase the expression level of the secretory component gene as described above. It is preferable that The bifidobacteria used in the present invention can preferably increase the expression level of the IRF-1 gene in the intestinal tissue by at least 1.5 times.
  • IRF-1 gene interferon regulatory factor 1 gene
  • the increase in the expression level of the IRF-1 gene by the bifidobacteria of the present invention is specifically the IRF-1 gene (interferon regulatory factor 1; GeneID: 16362) force-expressed mRNA in the small or large intestine (for example, Session number NM008390 [International Base Sequence Data Base]) percentage (relative to total mRNA) can be confirmed as an increase.
  • the amount of mRNA derived from the RF-1 gene can be determined, for example, by using oligo dT primers with the total RNA extracted from tissues of the small intestine (eg, ileum, jejunum, etc.) or large intestine (eg, proximal large intestine) as a saddle type.
  • changes in the amount of mRNA derived from the IRF-1 gene can be analyzed using a DNA microarray using cRNA prepared using the entire RNA as a saddle type. It is.
  • the intestinal tissue used for measuring the expression level of the IRF-1 gene may be organ-cultured in order to make the measurement conditions uniform.
  • IgA production inducing ability refers to the ability to promote the secretion of IgA from plasma cells present in mucosa-related lymphoid tissues (for example, but not limited to intestinal mucosa).
  • This ability to induce IgA production is, for example, that when the amount of IgA secreted into the mucosa-associated lymphoid tissue that has been contacted with bifidobacteria or a treated product of bifidobacteria is compared with a control experiment group that does not use bifidobacteria, etc. This can be shown by the rate of increase in IgA concentration.
  • this IgA production-inducing ability may be indicated by the concentration of IgA produced from IgA-producing cells derived from mucosa-associated lymphoid tissue in a specific accessory system.
  • the bifidobacteria of the present invention has a higher ability to induce IgA production than the bifidobacteria that have been reported to induce IgA production. More specifically, the “high IgA production induction positive” possessed by the bifidobacteria of the present invention refers to the IgA production amount per 5 ⁇ 10 5 Peyer's patch cells in the presence of anti-CD3 antibody in an in vitro experimental system.
  • the bifidobacteria used in the present invention is, among bifidobacteria belonging to Bifidobacterium bifidum, for example IgA per 5 ⁇ 10 5 Peyer's patch cells in the presence of anti-CD3 antibody in the following Atsy system. It is preferable to select bacteria that produce at least 10 / ig / ml.
  • the assay based on the amount of IgA produced for selection of bifidobacteria is not limited, but can be performed as follows, for example, based on the description in the Examples of the present specification. Briefly, first, bifidobacteria belonging to bifidobatterium 'bifidum are cultured in an anaerobic EG medium prepared by changing the gnole course to ratatoose, and then the cells in the resulting culture After washing, the cells are fixed with, for example, 4% formalin-PBS. The fixed cells are subjected to formalin removal as necessary, and then the concentration of the bacterial solution is adjusted so that the turbidity at 660 nm is 1.6.
  • mice Lymphocytes containing T cells and B cells for example, 2% urushi fetal serum-containing RPM to 1640 medium
  • Peyer's patches collected from the mice Lymphocytes containing T cells and B cells passed through a 150 gauge sterile stainless steel sieve, washed and resuspended in medium.
  • the same control was used except that Bifidobacterium longum OLB 6001 strain or Bifidobacterium breve strain (Accession No.FERM BP-2824) was used instead of the bifidobacteria in the experimental group.
  • Bifidobacterium longum OLB 6001 strain or Bifidobacterium breve strain accesion No.FERM BP-2824
  • the amount of IgA in the culture supernatant of the control group in this control experiment group was set to 1, and the amount of IgA in the culture supernatant of the experiment group was converted to a relative value.
  • the ability of Bifidobacterium used in the present invention to induce IgA production is 2 to 10 times, preferably 2.4 to 5 times, that of IgA production in Peyer's patch cells in the presence of anti-CD3 antibody, for example, compared to Bifidobacterium longum OLB 6001 strain. It has the ability to induce IgA production.
  • Bifidobacterium strains that can be particularly preferably used in the present invention are the Bifidobacterium bifidum OLB 6377 strain and the Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain independently isolated from the feces of the infant by the present inventors. All of these strains have been identified as belonging to Bifido Batterium 'Bifidum by investigating with a strain-specific DNA probe.
  • these strains are also capable of inducing secretory component production by the above-mentioned assay, and are 2-5 times higher than conventional bifidobacteria, IgA It has been confirmed that it has a production-inducing ability.
  • mutant strains obtained from these strains can also be suitably used in the present invention as long as they have secretory component production-inducing ability and high IgA production-inducing ability.
  • a medium usually used for culture of bifidobacteria can be used. That is, any medium can be used as long as it contains a nitrogen source, inorganic substances and other nutrients in addition to the main carbon source. Even better growth is obtained when sulfur-containing amino acids such as cystine or methionine are added.
  • As the carbon source ratatoses, gnolesose, sucrose, fructose, galactose, molasses, etc. can be used according to the assimilation ability of the bacteria used.
  • the nitrogen source organic nitrogen-containing substances such as casein hydrolyzate, whey protein hydrolyzate, and soy protein hydrolyzate can be used.
  • meat extract, fish extract, yeast extract, etc. are used as growth promoters.
  • the composition containing the bifidobacteria of the present invention as described above can be used as an immunostimulatory composition.
  • a composition containing the processed product of the bifidobacteria of the present invention may be used as the immunostimulatory composition.
  • the immunostimulatory composition of the present invention induces (promotes) the production of secretory components from mucosal epithelial cells such as intestinal epithelial cells, and also produces IgA in mucosal-related lymphoid tissues including neural plate cells. To a high level.
  • an immunostimulatory action such as suppression of infection with a pathogen can be imparted to a food or drink or a pharmaceutical composition.
  • the immunostimulatory composition is not limited, and may be in any form such as liquid, gel, powder, granule, solid, capsule, or tablet.
  • the bifidobacteria of the present invention used in the immunostimulatory composition of the present invention may be a living cell, a dead cell, a wet cell, or a dry cell.
  • the term “bifidobacteria” means both a strain and a cell of bifidobacteria.
  • the "processed product" of bifidobacteria is not limited, but for example, bifidobacteria suspension (suspension), culture (cells, culture supernatant and medium) Contains ingredients ), Culture supernatant (from which the solid content has been removed from the culture), fermented product (raw milk, skim milk powder or soy milk, etc.
  • the maximum number of cells contained in the processed bifidobacteria of the present invention is not particularly limited, but is usually about 4 X 10 1Q / g for the concentrate and about 5 X 10 "/ g for the dried product. Degree.
  • the secretory component secreted into the gastrointestinal tract is considered to bind to infectious Escherichia coli and toxogenic clostridium cells alone and suppress infection of these pathogenic bacteria (J. Med. Biol. 1995). , 42: 3-9; J. Med. Microbiol. 1998, 47: 879-888). Therefore, the composition for immunostimulation of the present invention has an effect of reducing the risk of infection by infectious pathogens such as infectious Escherichia coli and Toxigenic Clostridium by promoting the production of secretory components.
  • secretory IgA production from intestinal mucosal epithelial cells in vitro involves both production of IgA from plasma cells in the intestinal mucosa and production of secretory components in intestinal epithelial cells. It is known to play an important role. In fact, in experimental animals in which the gene for the secretory component is deficient, IgA that should be secreted into the intestinal lumen accumulates in the serum (J Exp Med 1999; 190: 915-22). It has also been suggested that environmental stimuli are involved in the expression of secretory components, and a decrease in the expression of secretory components due to malnutrition has been reported (Lab Invest 19 98; 78: 1255-66). The utilization composition exhibits a secretory component production-inducing ability and has a high ability to induce IgA production. It is thought that the production of A can be promoted.
  • the present invention also relates to a method for improving the immunity of a subject by administering (preferably orally administering) the immunostimulatory composition according to the present invention to the subject.
  • the immunostimulatory composition preferably, both the production of secretory component and the production of IgA are promoted in the administered subject, and as a result, the production of secretory IgA is promoted.
  • the subject to which the immunostimulatory composition is administered is the same as the subject of administration of the pharmaceutical composition described below. Examples of suitable subjects include pregnant women, lactating women, infants, the elderly, and patients with impaired immune function.
  • the dose of the immunostimulatory composition of the present application can follow the dose of the pharmaceutical composition described below.
  • the present invention also relates to a Bifidobacterium having a secretory component production-inducing ability and a high IgA production-inducing ability, to foods and drinks to which an immunostimulating composition containing bifidobacteria belonging to bifidum and Z or a processed product of the bifidobacteria is added.
  • food and beverage includes, but is not limited to, beverages, foods and functional foods.
  • the food or drink containing the immunostimulatory composition of the present invention is not particularly limited.
  • beverages containing the immunostimulatory composition of the present invention include fermented milk (such as yogurt), lactic acid bacteria beverages, milk beverages (such as coffee milk and fruit milk), tea-based beverages (such as green tea, tea and oolong tea), fruits and vegetables
  • beverages such as beverages containing fruit juices such as oranges, apples and grapes, and vegetable juices such as tomatoes and carrots, alcoholic beverages (beer, sparkling wine, wine, etc.), carbonated beverages and soft drinks be able to.
  • existing reference books such as “Latest 'Soft Drinks” (2003) (Kotsu Co., Ltd.) can be referred to.
  • the food containing the immunostimulatory composition of the present invention is not particularly limited, and may be a fresh food or a processed food.
  • a fresh food or a processed food For example, pudding, jelly, ice cream, cake, candy, pasta, udon, kamaboko, ham, soy sauce, dressing, mayonnaise, tofu, soup, bread, fish fillet, processed meat, vegetables, mushrooms Can be illustrated.
  • Particularly preferred foods in the present invention include fermented milk and lactic acid bacteria beverages that can deliver the bifidobacteria of the present invention to the intestines alive.
  • Functional food is particularly preferred as a food or drink containing the immunostimulatory composition of the present invention.
  • Preferred functional foods of the present invention further include supplements for infants and infants with immature immune function development, and maternal supplements for breastfeeding for the purpose of enhancing or restoring immune functions, Includes elderly and sick supplements
  • the functional food of the present invention is preferably useful for immunostimulation.
  • Functionality of the present invention Food is an indicator of improved immune function, preferably improved intestinal immunity (mucosal immunity) (for example, increased production of IgA, increased production of secretory components, increased amount of secretory IgA, The increase in the number of spheres etc.) may be useful for immunostimulation.
  • the functional food of the present invention may be intended primarily for uses other than immunostimulation.
  • the functional food of the present invention preferably, food for specified health use or conditional tokuho [food for specified health use]
  • the functional food of the present invention is in the form of solid preparations such as tablets, granules, powders, pills and capsules, liquid preparations such as liquids, suspensions and syrups, or preparations such as gels. It may be in the form of a normal food or drink (for example, beverage, powdered tea leaves, confectionery, etc.).
  • the amount of the immunostimulatory composition of the present invention added to food or drink is not particularly limited, and may vary depending on the case.
  • the specific blending amount can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of food and drink, the desired taste and texture.
  • the immunostimulation is such that the total amount of bifidobacteria and / or processed products of the bifidobacteria in the added immunostimulatory composition is S, 0.001 to 100% by mass, especially 0.1 to 100% by mass.
  • the blending amount of the composition for use is appropriate.
  • the immunostimulating composition of the present invention may be contained in a food or drink by any appropriate method available to those skilled in the art. For example, after preparing the immunostimulatory composition of the present invention in a liquid, gel, solid, powder or granule, it may be blended with food or drink. Alternatively, the immunostimulatory composition of the present invention may be directly mixed or dissolved in the raw material of food and drink. The immunostimulatory composition of the present invention may be applied, coated, penetrated or sprayed on food and drink. The immunostimulatory composition of the present invention may be uniformly dispersed in food or drink, or may be unevenly distributed. Capsules containing the immunostimulating composition of the present invention may be prepared.
  • the immunostimulating composition of the present invention is wrapped with an edible film or an edible coating agent. May be embedded. Moreover, after adding an appropriate excipient
  • Additives include, but are not limited to, color formers (sodium nitrite, etc.), coloring agents (gardenia pigment, red 102, etc.), flavorings (orange flavors, etc.), sweeteners (stevia, astel palm, etc.) , Preservatives (sodium acetate, sorbic acid, etc.), emulsifiers (sodium chondroitin sulfate, propylene glycol fatty acid esters, etc.), antioxidants (EDTA disodium, vitamin C, etc.), pH regulators (taenoic acid, etc.), chemical Seasonings (such as sodium inosinate), thickeners (such as xanthan gum), swelling agents (such as calcium carbonate), antifoaming agents (such as phosphate phosphate), binders (such as sodium polyphosphate), nutrition enhancement Agents (calcium fortifier,
  • the present invention relates to a pharmaceutical comprising, as an active ingredient, an immunostimulatory composition containing bifidobacteria belonging to bifidobacterium bifidum having secretory component production-inducing ability and high IgA production-inducing ability and / or a processed product of the bifidobacteria. It also relates to a composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a carrier or additive acceptable in pharmaceutical preparations.
  • carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, water-soluble dextrin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention further contains other pharmacological ingredients. May be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered orally or parenterally, particularly orally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention to be administered orally is an agent such as a solid preparation such as a tablet, granule, powder, pill or capsule, a gel preparation, or a liquid preparation such as a solution, suspension or syrup. It may be in shape. When used as a liquid preparation, when using the pharmaceutical composition of the present invention, it may be supplied as a dry product intended to be redissolved.
  • the oral solid preparation may contain additives such as binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents and the like generally used in pharmacy.
  • Oral liquid preparations may contain additives such as stabilizers, buffers, taste-masking agents, preservatives, fragrances, and coloring agents that are commonly used in pharmacology.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably exhibits an immunostimulatory action.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be one obtained by adding an immunostimulatory action to a pharmaceutical composition for another therapeutic use containing other pharmacological substances.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an immunostimulator.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can reinforce the immune system, particularly the mucosal immune system, by significantly increasing IgA production in the mucosal immune system and increasing the production of secretory components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the purpose of, for example, enhancing the ability to protect against pathogen infection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the age and weight of the administration subject, the administration route, and the number of administrations, and can be varied widely within the discretion of those skilled in the art.
  • the dose of bifidobacteria and / or processed products of the bifidobacteria contained in the immunostimulatory composition in the pharmaceutical composition should be 1 to 1000 mg / kg / day. It is right.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a single dose, or may be administered repeatedly at intervals of 6 to 8 hours.
  • Subjects to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered are mammals including humans, domestic animals, pets, experimental (test) animals and the like.
  • infants with undeveloped immune function mammals whose immune function has declined due to aging or illness, constitutional or environmental immunity Mammals whose ability is likely to decline are preferred as subjects to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used very effectively for continuous use since it is less susceptible to side effects.
  • Bifidobacterium longum OLB 6001 strain (Accession number FERM P-13610), Bifidobacterium bifidum OLB 6377 strain (Accession number NITE BP-30), Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain (Accession number NITE BP-31), Bifidobacterium breve strain (Accession number FERM BP-2824) and Bifidobacterium bifidum MEP170212 (formerly Bifidobacterium bifidum # 1 (Meiko) strain; this strain is owned by Meiji Dairies, Japan)
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C in the anaerobic EG medium prepared above.
  • the anaerobic EG medium was prepared according to the following composition.
  • the cells in the obtained culture were washed twice with cold PBS (-), suspended in a small amount of PBS (-), and suspended in an equal volume of 8% formalin-PBS to fix the cells. . From the fixed cells, formalin was removed by washing with cold PBS (-) on the day of the experiment for measuring the ability to induce IgA production.
  • the bacterial solution was suspended in PBS and the turbidity at 660 mm was 1.6. The bacterial solution concentration was adjusted so that The bacterial solution thus obtained was called a formalin-treated bifidobacterial solution.
  • the collected Peyer's plate is taken out on a petri dish containing RPM 1640 medium (Gibco) containing a small amount of 2% urinary fetal serum, chopped with a scalpel blade, and a plastic syringe handle (Terumo). ) And gradually unraveled.
  • the cell suspension thus obtained was passed through a 150-gauge sterilized stainless steel sieve and further washed twice with RPMI-1640 medium containing 2% urine fetal serum.
  • the cells were resuspended in RPMI-1 640 medium containing an appropriate amount of 2% fetal bovine serum to obtain a lymphocyte group (Peier plate cells) containing T cells and B cells.
  • the obtained lymphocyte group was washed by changing the RPM 1640 medium twice and then confirming that 98% or more were viable cells using trypan blue. on 3072) at 5 X 10 5 per well.
  • this 96-well microphone mouthplate add 100 ⁇ l of anti-CD3 antibody (CEDARLANE, No. CL7202AP, working concentration: 2.5 xg / ml) to each tool in advance and incubate for 2 hours at 37 ° C.
  • Pre-coated with anti-CD3 antibody by washing once with ⁇ 1 PBS and then once with 200 ⁇ FCS ( ⁇ ) RPMI medium was used.
  • a lymphocyte group was cultured in the presence of anti-CD3 antibody for 5 days in the same manner as above except that no formalin-treated bifidobacteria solution was added. The amount of IgA was measured in the same manner.
  • Table 1 shows the IgA concentration in the culture supernatant measured as described above.
  • the cells were cultured overnight in the anaerobic EG medium prepared as described above. Subsequently, the cells in the obtained culture were washed twice with cold PBS ( ⁇ ) and then suspended at 10 mg / ml in PBS ( ⁇ ). This suspension was heat-treated at 75 ° C for 60 minutes, and then applied to an ultrasonic crusher (BRANSON SONIFIE R250, Duty cycle: 60%, Output control: 2 micro tip limit). Got.
  • each of the 12 well plates prepared above was added to the medium of 3 wells so that the cell disruption concentration was 50 to 500 xg / ml, and cultured at 37 ° C for 48 hours.
  • PBS (-) [Dulbecco's Phosphate Buffered Saline from which Ca and Mg ions were removed] was used instead of the disrupted cells.
  • the culture supernatant was collected from the obtained culture, and the concentration of secretory components in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • the ELISA plate tool was coated at 4 ° C with a polyclonal antibody against human secretory component (DAK ⁇ , diluted 1000-fold with PBS (-)), and then 0.01% tween Wash with 20 PBS (-), then add 1% sushi serum albumin (BSA) _PBS (-) for 1 hour at room temperature Incubated and blocked. Next, 50 ⁇ of each culture supernatant obtained above was added to each well of the plate as a sample and incubated at room temperature for 1 hour.
  • DAK ⁇ polyclonal antibody against human secretory component
  • PBSA sushi serum albumin
  • the light intensity was measured. The measurement results are shown as relative values when the secretory component production of the control is 1.
  • Table 3 and Fig. 3 show the measurement results of the secretory component when Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain was added to the medium at 500 ⁇ g / ml in the above measurement. [Table 3]
  • Bifidobacterium bifidum MEP170212 and Bifidobacterium bifidum MEP170222 showed no increase in secretory component production even at a relatively high concentration of 250 ⁇ g / ml. This indicates that Bifidobacterium belonging to Bifidobacterium bifidum does not necessarily have the ability to enhance secretory component production.
  • the ileum and proximal large intestine were excised from BALB mice within 24 hours after delivery and were used for examination. That is, a tissue piece having a width of about 2 to 4 mm was prepared by slicing the ileum and the proximal large intestine. The tissue piece was cut longitudinally in a sheet shape on glass filter paper, and the surface on the muscle plate side was brought into close contact with the glass filter paper.
  • RNA of cultured tissue was extracted using an RNA purification kit (QIAGEN, RNeasy mini kit), and cDNA was prepared using an oligo dT primer (INVITROGEN) as a cage. Furthermore, the cDNA is used as a saddle and PCR primers (5, -AGGCAATGACAACATGGGG-3, (SEQ ID NO: 1), and 5, _ATGTCA GCTTCCTCCTTGG-3 '(SEQ ID NO: 2)) specific to the plgR gene (secretory component gene) The real-time PCR to be used was measured using LightCycler (Roche), and the expression level of plgR gene in cDNA was measured.
  • RNA purification kit QIAGEN, RNeasy mini kit
  • cDNA was prepared using an oligo dT primer (INVITROGEN) as a cage. Furthermore, the cDNA is used as a saddle and PCR primers (5, -AGGCAATGACAACATGGGG-3, (SEQ ID NO: 1), and
  • the plgR gene expression level measured for each sample is the GAPDH gene (PCR primer, 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(SEQ ID NO: 3), and 5'-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3' ( Using the expression level detected by the same method using SEQ ID NO: 4), correction was performed according to the following calculation formula.
  • plgR gene relative expression level plgR gene expression level / GAPDH gene expression level
  • the gene expression level of the plgR gene (secretory component gene) was increased 2.9-fold in the ileum (lower part of the small intestine) and 2.4-fold in the proximal large intestine (the first part of the large intestine).
  • the increase in the large intestine was confirmed to be significant (P ⁇ 0.05) by Mann-Whitney U test. From these results, it was shown that Bifidobacterium bifidum enhances the expression of secretory component genes in the small and large intestines.
  • Example 4 Measurement of expression levels of secreted component genes and IRF-1 gene expression in cultured tissues of small intestine and large intestine organs treated with disrupted bifidobacteria by DNA microarray from BALB mice on embryonic day 18 The ileum and proximal colon were removed and organ-cultured for use.
  • a tissue piece having a width of about 2 to 4 mm was prepared by cutting the ileum and the proximal large intestine into round slices. The tissue piece was cut vertically in a sheet shape on glass filter paper, and the surface on the muscle plate side was brought into close contact with the glass filter paper.
  • crushed bacterial cells derived from B. bifidum OLB 6378 prepared according to "1.
  • GeneChip Expression 3 -Amplincation CDNA was synthesized using Reagent One-ycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix) and GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit (Affymetrix), and then purified using GeneChip Cleanup Module (Affymetrix) GeneChip Expression 3-Amplification Reagent IVT labeling Kit (Affymet rix) was used for in vitro transcription reaction. After cRNA was purified using GeneChip Cleanup Module (Affymetrix), the cRNA was fragmented with a fragmentation buffer (Affimetrix) to obtain a fragmented cRNA. Fragmented cRNA was used for analysis by DNA Ar ray system (Affymetrix).
  • a mouse genome MG U74Av2 set (Affymetri X) containing about 36000 kinds of mouse genes was used. Variations between experiments were corrected using the ratio of gene expression to internal control. The effect of treatment with B. bifidum OLB 6378 on the expression level of each gene was expressed as a ratio to the expression level of each gene in the control experiment (PBS (-) treatment).
  • Example 3 As shown in Table 6, when the cell disruption of Bifidobacterium bifidum OLB 637 strain 8 prepared according to Example 2 was added at a cell disruption concentration of 500 / g / ml, The results of Example 3 showed a 2.0-fold increase in secretory component gene (plgR gene) expression in the intestine (lower part of the small intestine) and 6.1-fold in the proximal large intestine (the first part of the large intestine) Almost matched.
  • plgR gene secretory component gene
  • Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain disrupted cells increased IRF-1 gene expression by 1.5 times in the ileum and 4.0 times in the proximal large intestine (the first part of the large intestine) compared to the control. It was seen.
  • Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain and Bifidobacterium bifidum JCM 1255 T strain was measured and compared.
  • Bifidobacterium bifidum JCM 1255 T strain was obtained as a comparative strain from the Independent Administrative Law, Bioresource Center, Microbial Materials Development Office (JCM) (2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, Japan).
  • Bifidobacterium bifidum OLB 6378 strain and Bifidobacterium bifidum JCM 1255 T strain were cultured overnight according to the procedure of Example 2, and then washed twice with cold PBS (-) and suspended in PBS (-).
  • the immunostimulatory composition of the present invention can particularly enhance the function of the mucosal immune system by promoting the production of secretory components and highly promoting the production of IgA. Therefore, the immunostimulating composition of the present invention is useful for providing such an immune function enhancing action to foods and drinks and pharmaceutical compositions.
  • foods and drinks and pharmaceutical compositions containing the immunostimulatory composition of the present invention are suitable for use in patients with low immune functions, such as infants, the elderly and the sick.
  • the immunostimulatory composition of the present invention can be produced using the dead cells of the bifidobacteria of the present invention, it is also used by adding to products having biological standards such as infant formula. It can be used for various products regardless of product form.
  • sequences of SEQ ID Nos: 1 to 4 are primers.

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Abstract

　本発明は、分泌成分産生誘導能と高いIgA産生誘導能とを備えたビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌、例えばBifidobacterium bifidum OLB 6377株もしくはBifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体、またはその処理物を、単独でまたは複数組み合わせて含有する、粘膜組織においてIgAならびに分泌成分の産生を促進するのに有用な、免疫賦活用組成物に関する。

Description

明 細 書
免疫賦活用組成物
技術分野
[0001] 本発明はビフイドバタテリゥム.ビフィダム（Bifidobacterium bifidum)に属するビフィズ ス菌および/または該ビフィズス菌の処理物を含有してなることを特徴とする免疫賦 活用組成物、ならびにそれを含む免疫賦活に有用な飲食品および医薬組成物に関 する。
背景技術
[0002] 気管支、消化管、泌尿生殖器系などの粘膜面には、細菌、ウィルスなどの微生物 や食物タンパクをはじめとする多くの外来抗原に対し、生体を防御するための分泌型 IgAを主体とする強力な粘膜免疫機構が存在する。分泌型 IgAは、血清中の IgAとは 異なり、 J鎖を含んだ二量体 IgA (dimeric IgA: 2IgA'J)と分泌成分（SC: secretory com ponent,または secretory piece)とが結合した形 (2IgA' J ' SC)で存在しており、唾液、 涙、鼻汁、乳汁、さらに気管支や腸管などからの分泌液中に多く含まれている。その ような粘膜面におけるリンパ組織を粘膜関連リンパ組織とよび、 IgA産生誘導におい て中心的な役割を演じている。粘膜免疫では、腸管の代表的な粘膜関連リンパ組織 であるパイエル板 (Peyer's patch)などで抗原刺激を受けた活性化 B細胞力 全身の 血液循環を経由しふたたび腸管のみならず外分泌腺や気管支'泌尿生殖器系の粘 膜面に分布し、 IgA産生細胞である形質細胞に分化して二量体 IgAを産生する。さら にそのようにして産生された二量体 IgAは、粘膜上皮細胞で産生される分泌成分と結 合して分泌型 IgAとなり、粘膜内から管腔や生体外へ分泌される。分泌成分は、二量 体 IgAを管腔や生体外へ分泌するために必須の成分であることが知られている。
[0003] そこで、気管支、消化管、泌尿生殖器系などの粘膜にぉレ、て二量体 IgAの産生と分 泌成分の産生を誘導し成立させる食品成分あるいは組成物は、分泌型 IgAの産生量 あるいは粘膜から管腔や生体外への分泌型 IgAの分泌量を増加させ生体防御能を 増強することが期待できる。また、粘膜免疫によるそのような生体防御能の増強は、と りわけ病原体の体内への侵入防止や食物アレルギーの発症予防等において有用で ある。
[0004] 分泌型 IgAの産生を亢進する物質として、例えば本発明者らはフラタトオリゴ糖およ びその組成物（特許文献 1)を見出している。このフラタトオリゴ糖は、分泌成分の産 生に与える影響について報告されている数少ない食品成分の 1つである。一方、ビフ ィズス菌ビフイドバタテリゥム'ロンガムゃビフイドバタテリゥム 'ブレーべは、パイエル板 細胞において IgA産生を誘導することが従来から知られている（特許文献 2)。また本 発明者らは、成人の糞便より分離した Bifidobacterium longum OLB 6001株が IgA産 生誘導能をもつことも過去に見出している（非特許文献 1)。このビフィズス菌 Bifidoba cterium longum OLB 6001株は本発明者らのグループによりビフイドバタテリゥム.ロン ガム No.7 (受託番号 FERM P-13610)として報告されているものと同一である（特許文 献 3)。しかし、それらのビフィズス菌をも上回る、より高い免疫賦活効果を有する免疫 賦活用組成物のさらなる登場がなおも望まれている。
特許文献 1 :特開 2003— 201239号公報
特許文献 2：特公平 7— 106142号公報
特許文献 3：特開平 7— 69907号公報
非特午文献 1： Takahashi T.， NaKagawa Ε·， Nara Τ·, Yajima Τ. and Kuwata T. Biosci Biotechnol Biochem 62(1), (1998) p.10-15
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、免疫賦活用組成物、ならびに免疫賦活に有用な飲食品および医薬組 成物を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ビフイドバタテリゥム 'ビ フィダム（Bifidobacterium bifidum)に属するビフィズス菌株の中から、分泌成分の産 生と腸管粘膜系における二量体 IgA産生の両方を促進することができる、免疫賦活に おいて有用な菌株を複数取得することに成功して、本発明を完成させた。すなわち 本発明は以下を包含する。
[0007] [1] 腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも 1.2倍に増加させる分泌成 分産生誘導能を有するビフイドバタテリゥム.ビフィダム（Bifidobacterium bifidum)に属 するビフィズス菌および/または該ビフィズス菌の処理物を含有することを特徴とする 、免疫賦活用組成物。
[0008] [2] 前記ビフィズス菌が、抗 CD3抗体存在下でのパイエル板細胞 5 X 105個当たりの I gA産生量を少なくとも 10 x g/mlに増加させる IgA産生誘導能をさらに有することを特 徴とする、上記 [1]に記載の免疫賦活用組成物。
[0009] [3] 前記ビフィズス菌が、 Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-
30)または Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP- 31)である、上 記 [1]または [2]に記載の免疫賦活用組成物。
[0010] [4] 前記ビフィズス菌の処理物力 ビフィズス菌の懸濁物、培養物、培養上清、発酵 物、加熱処理物、破砕物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物および希釈物からなる群よ り選択される少なくとも 1つである、上記 [1]〜[3]に記載の免疫賦活用組成物。
[0011] [5] 上記 [1]〜[4]に記載の免疫賦活用組成物を含む飲食品。
[0012] [6] 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健 機能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料力 なる群から選択される、上記 [5
]に記載の飲食品。
[0013] [7] 上記 [1]〜[4]に記載の免疫賦活用組成物を含む、医薬組成物。
[0014] [8] 免疫賦活用の飲食品または医薬組成物を製造するための、 Bifidobacterium bifi dum OLB 6377株（受託番号 ΝΠΈ BP-30)または Bifidobacterium bifidum OLB 6378 株（受託番号 NITE BP-31)の使用。
[0015] [9] 下記 (a)または (b)のビフィズス菌。
[0016] (a) Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30)
(b) Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP- 31)
発明の効果
[0017] 本発明の免疫賦活用組成物は、上皮細胞における分泌成分の産生を促進すること ができ、また、従来免疫賦活作用が報告されているビフィズス菌（ビフイドバタテリゥム 'ロンガムゃビフイドバタテリゥム 'ブレーべなど）と比べてパイエル板細胞における IgA 産生をかなり強力に誘導することができる。このため本発明の免疫賦活用組成物は、 特に粘膜免疫の賦活において非常に有用である。さらに本発明の飲食品および医 薬組成物は、食品として人類が長年摂取してきたビフィズス菌に由来する免疫賦活 用組成物を有効成分として含むことから、副作用を生じる恐れが少ない。本発明の Bi fidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30)および Bifidobacterium b ifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31)を用いれば、分泌成分の産生を促進す ること力 Sでき、かつ従来のビフィズス菌と比べて数倍も強力に IgA産生を誘導できる免 疫賦活用組成物を、製造することができる。
[0018] 本明細書は、本願の優先権の主張の基礎となる特願 2005— 026631号および特 願 2005— 256835号に記載された内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]マウスパイエル板由来のリンパ細胞群を抗 CD3抗体存在下で各種ビフィズス菌 と共に培養した場合の IgA産生誘導能を示す。 n=3、値は平均値土標準偏差で表し た。
[図 2]Bifidobacterium bifidum OLB 6377株の破砕物が HT-29からの分泌成分産生に 与える効果を示す。試料は 50-500 μ g/mlになるように培地に加え 48時間培養した。 * pく 0.05対対照群、スチューデント t-検定。 n=3。値は対照を 1としたときの相対値とし 、平均値土標準偏差で表した。
[図 3]Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の破砕物が HT-29細胞からの分泌成分産 生に与える効果を示す。試料は 500 μ g/mlになるように培地に加え 48時間培養した。
* pく 0.05対対照群、スチューデント t-検定。 n=3。値は対照を 1としたときの相対値と し、平均値土標準偏差で表した。
[図 ^Bifidobacterium bifidum MEP170212および Bifidobacterium bifidum MEP170222 の破砕物が HT-29細胞からの分泌成分産生に与える効果を示す。試料は 250 μ g/ml または 500 μ g/mlになるように培地にカ卩ぇ 48時間培養した。スチューデント t-検定によ りいずれの群間においても 5%水準で有意差なし。 n=3。値は対照を 1としたときの相 対値とし、平均値 ±標準偏差で表した。
[図 5]Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物が、小腸および大腸におけ る分泌成分遺伝子の発現量に及ぼす効果を示す。バーは平均値土 SD (標準偏差） で示す相対値を表す。
[図 6]Bifidobacterium bifidum OLB 6378株が HT-29細胞からの分泌成分産生に与え る効果を分泌成分濃度 (ng/ml)で示す。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0021] 1.使用するビフィズス菌およびそのスクリーニング
本発明では、分泌成分産生誘導能と高い IgA産生誘導能とを備えた、ビフイドバタ テリゥム.ビフィダム（Bifidobacterium bifidum)に属するビフィズス菌を用いて、免疫賦 活用組成物を製造する。
[0022] 本発明で使用するビフィズス菌が属する「ビフイドバタテリゥム'ビフィダム（Bifidobact erium bifidum)」は、ビフイドバクテリア属の 1菌種である。本発明においてビフイドバタ テリゥム'ビフィダムに分類されるビフィズス菌は、通常の分類学上の基準に従って同 定することができるが、近年頻繁に用いられる分子生物学的な手法、例えば、ビフィ ドバクテリゥム'ビフィダムに特異的な DNAプローブを用いる方法（腸内フローラシン ポジゥム 8「腸内フローラの分子生態学的検出同定」 )や、標準菌株との DNAホモロジ 一により、同定することもできる。
[0023] 本発明において「分泌成分産生誘導能」とは、粘膜上皮細胞（例えば、限定される ものではないが、腸管上皮細胞）からの分泌成分の分泌を促進する能力を言う。この 分泌成分産生誘導能は、例えば、ビフィズス菌またはビフィズス菌処理物と接触させ た粘膜上皮細胞から分泌される分泌成分量を、ビフィズス菌等を使用しなレ、対照実 験群と比較した場合の、分泌成分濃度の増加率または分泌成分量の相対値によつ て示すことができる。より具体的には、本発明のビフィズス菌が有する「分泌成分産生 誘導能」は、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも 1.2倍、好ましくは 1. 4倍以上、一般的には 1.2〜10倍、通常は 1.2〜3倍に増加させる能力に相当する。
[0024] 本発明で用いるビフィズス菌は、ビフイドバタテリゥム.ビフィダムに属するビフィズス 菌の中で、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも 1.2倍に増加させるこ とができる菌を選択したものであることが好ましい。分泌成分産生量は、例えば後述 の実施例に記載のようにして in vitroで測定することができる。 [0025] このようなビフィズス菌の選択は、限定するものではなレ、が、例えば本願明細書の 実施例に記載したアツセィ法に基づいて行うことができる。簡単に述べれば、まず、ビ フイドバタテリゥム'ビフィダムに属するビフィズス菌を、グルコースをラタトースに変更 して調製した嫌気 EG培地において培養し、得られた培養物中の菌体を洗浄し、次い で加熱処理と超音波破砕を行って菌体破砕物を得る。この菌体破砕物を、ヒト腸管 上皮細胞由来細胞系（例えば、 HT-29細胞）を播種した培地に添加し、好ましくは 37 °Cで 48時間にわたり培養した後、培養上清中の分泌成分濃度を測定する。あるいは 菌体破砕物の代わりに、培養菌体の PBS (-)中懸濁液を上記培地に直接添加してもよ レ、。さらに、菌体破砕物の代わりに PBS (-) [すなわち、 Caおよび Mgイオンを除去した Dulbecco's Phosphate Buffered Saline]を用いること以外は同様の実験操作によって 対照実験を行い、培養上清中の分泌成分濃度を測定する。分泌成分濃度は ELISA 法で測定することができる。次に、実験群で得られた分泌成分濃度の測定値を、対 照実験群における分泌成分濃度の測定値を 1としたときの相対値に換算する。こうし て得られた相対値を、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を増加させるレベルと みなすことができる。すなわち、この相対値が 1.2以上を示すビフィズス菌を選択すれ ばよレ、。例えば、あるビフィズス菌株を用いて上記アツセィを行って得られた相対値 力 S1.5である場合には、そのビフィズス菌株は、腸管上皮細胞からの分泌成分産生量 を 1.5倍に増加させる能力を有するものとみなすことができ、本発明のビフィズス菌とし て選択されうる。なお、このアツセィ法の培養系には形質細胞（IgA産生細胞）が含ま れないため、このアツセィ系では分泌成分は IgAと結合せず単独で培養上清中に分 泌されている。
[0026] 本発明で用いるビフィズス菌の分泌成分産生誘導能はまた、腸における分泌成分 遺伝子の発現量を増加させる効果によっても裏付けられる。本発明で用いるビフィズ ス菌は、好ましくは、分泌成分遺伝子の発現量を少なくとも 2.0倍に増加させることが できる。本発明のビフィズス菌による分泌成分遺伝子の発現量増加は、具体的には、 zjヽ月昜又は大月易における、分泌、成分道伝子 5ある plgR逾伝子 olymeric immunoglobu lin receptor gene； GeneiD: 18703； Shimada S. et al" J Immunol. 1999;1り 3(10):536 3)から発現された mRNA (例えばァクセッション番号 BC013556 [国際塩基配列データ ベース])のパーセンテージ (全 mRNA量に対する）の増加として確認することができる 。 plgR遺伝子由来の mRNA量は、例えば、小腸 (例えば回腸、空腸など）又は大腸（ 例えば近位大腸など）の組織から抽出した全 RNAを铸型としてオリゴ dTプライマーを 用いる逆転写 PCRにより cDNAを調製し、得られた cDNAを錡型として、 plgR遺伝子特 異的なプライマー対を用いてリアルタイム PCRを行うことにより、検出された増幅産物 の量から決定することができる。 plgR遺伝子の発現量測定に供する腸組織は、測定 条件を均一化するために器官培養したものであってよい。リアルタイム PCRの内部標 準として、 GAPDH遺伝子、 /3ァクチン遺伝子などを利用することも好ましい。それら の遺伝子は、市販のハイブリダィゼーシヨンプローブ（A卯 lied Biosystems社、 Stratag ene社など）として入手することもでき、それらは内部標準として好適に使用することが できる。
[0027] なお、上記のような粘膜上皮細胞からの分泌成分産生量の増強レベルを判定する ことにより、高い免疫賦活効果を含む有利な機能性を有するビフィズス菌をスタリー二 ングするようなビフィズス菌の選抜方法もまた、本発明に包含される。
[0028] 本発明で用いるビフィズス菌はまた、上記のような分泌成分遺伝子の発現量増加と ともに、腸におけるインターフェロン調節因子 1遺伝子（IRF-1遺伝子）の発現量も増 カロさせることができるものであることが好ましい。本発明で用いるビフィズス菌は、好ま しくは、腸組織における IRF-1遺伝子の発現量を少なくとも 1.5倍に増加させることが できる。本発明のビフィズス菌による IRF-1遺伝子の発現量増加は、具体的には、小 腸又は大腸における、 IRF-1遺伝子（interferon regulatory factor 1 ; GeneID:16362) 力 発現された mRNA (例えばァクセッション番号 NM008390 [国際塩基配列データべ 一ス])のパーセンテージ（全 mRNA量に対する）の増加として確認することができる。 I RF-1遺伝子由来の mRNA量は、例えば、小腸 (例えば回腸、空腸など）又は大腸 (例 えば近位大腸など）の組織から抽出した全 RNAを錡型としてオリゴ dTプライマーを用 レ、る逆転写 PCRにより cDNAを調製し、得られた cDNAを錡型として、 IRF-1遺伝子特 異的なプライマー対を用いてリアルタイム PCRを行うことにより、検出された増幅産物 の量から決定することができる。さらに、 IRF-1遺伝子由来の mRNA量の変化を全 RN Aを铸型として調製した cRNAを用いた DNAマイクロアレイによって解析することも可能 である。 IRF-1遺伝子の発現量測定に供する腸組織は、測定条件を均一化するため に器官培養したものであってよい。本発明に係るビフィズス菌またはその処理物を投 与した腸組織においては、このような IRF-1遺伝子の発現量増加が、細胞内シグナル 伝達経路を介して分泌成分の産生量を増加させるものと考えられる。し力 本発明は 、このような理論によって拘束されるものではない。
[0029] 一方、本発明において「IgA産生誘導能」とは、粘膜関連リンパ組織（限定するもの ではないが、例えば腸管粘膜）に存在する形質細胞からの IgAの分泌を促進する能 力を言う。この IgA産生誘導能は、例えば、ビフィズス菌またはビフィズス菌処理物と 接触させた粘膜関連リンパ組織にぉレ、て分泌される IgA量を、ビフィズス菌等を使用 しない対照実験群と比較した場合の、 IgA濃度の増加率によって示すことができる。 あるいはこの IgA産生誘導能は、ある特定のアツセィ系において粘膜関連リンパ組織 に由来する IgA産生細胞から産生される IgA濃度で示してもよい。本発明のビフィズス 菌は、 IgA産生誘導能が従来報告されているビフィズス菌と比べて、高い IgA産生誘 導能を有する。より具体的には、本発明のビフィズス菌が有する「高い IgA産生誘導 肯 」とは、 in vitro実験系において、抗 CD3抗体存在下でのパイエル板細胞 5 X 105個 当たりの IgA産生量を、少なくとも 10 /i g/ml、ー般的には10 /1 §/1111〜100 /1 §/1111、通常 は 10 μ g/ml〜30 μ g/mlのレベルまで増加させる能力に相当する。
[0030] 本発明で用いるビフィズス菌は、ビフイドバタテリゥム.ビフィダムに属するビフィズス 菌の中で、例えば下記アツセィ系において、抗 CD3抗体存在下でのパイエル板細胞 5 X 105個当たりの IgA産生量が少なくとも 10 /i g/mlとなる菌を選択したものであること が好ましい。
[0031] ビフィズス菌の選択のための IgA産生量に基づくアツセィは、限定するものではない が、例えば本願明細書の実施例に記載に基づいて、以下のようにして行うことができ る。簡単に述べれば、まず、ビフイドバタテリゥム'ビフィダムに属するビフィズス菌を、 グノレコースをラタトースに変更して調製した嫌気 EG培地にぉレ、て培養し、得られた培 養物中の菌体を洗浄した後、例えば 4%_ホルマリン- PBSなどにより菌体を固定する。 この固定菌体を、ホルマリン除去などを必要に応じて行ってから、 660 nmでの濁度が 1.6となるように菌液濃度を調整する。一方、マウスから採取したパイエル板を、培地（ 例えば、 2%ゥシ胎児血清含有 RPMト 1640培地）中でほぐし、 150ゲージの滅菌ステ ンレス鋼ふるいを通過させ、洗浄した後に培地に再懸濁して、 T細胞および B細胞を 含むリンパ細胞群を調製する。本アツセィではこのリンパ細胞群をパイエル板細胞と して用いる。そこで次にこのリンパ細胞群を、予め抗 CD3抗体でコーティング済みの プレートに 1ゥエル当たり 5 X 105個にて播種し、そこに上記菌液 (濁度 = 1.6) 5 μ ΐを添 加し、炭酸ガスインキュベーター内で 37°Cで 5日間培養する。培養物からリンパ細胞 を除去して培養上清を採取し、培養上清中の IgA量を測定する。この培養上清中の Ig A量を、抗 CD3抗体存在下でのパイエル板細胞 5 X 105個当たりの IgA産生量とみなす こと力 Sできる。すなわちこの培養上清中の IgA量が 10 a g/ml以上であることが示された ビフィズス菌を、選択すればよレ、。また、ビフィズス菌液を添カ卩しないこと以外は上記 と同様の対照実験を行って培養上清中の IgA量を測定し、この対照実験群の IgA量を 1として、実験群の培養上清中の IgA量を相対値に換算することもできる。なお本アツ セィ法において測定される IgAは、大部分が、パイエル板細胞において抗 CD3抗体 存在下で分化した形質細胞（IgA産生細胞）から細胞外に分泌された二量体 IgAであ ると考えられる。
本発明で用いるビフィズス菌の IgA産生誘導能はまた、従来から高い IgA産生誘導 能が報告されているビフィズス菌株の Bifidobacterium longum OLB 6001株（受託番 号 FERM P-13610)または Bifidobacterium breve株（受託番号 FERM BP-2824)の Ig A産生誘導能を基準として、規定することもできる。これらは、独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中 央第 6)に寄託されている菌株である。例えば、上記の IgA産生量に基づくアツセィ法 において、実験群のビフィズス菌の代わりに Bifidobacterium longum OLB 6001株また は Bifidobacterium breve株（受託番号 FERM BP-2824)を用いること以外は同様の操 作により対照実験を行レ、、この対照実験群における培養上清中の IgA量を 1として実 験群の培養上清中の IgA量を相対値に換算することにより、その相対値で示される、 当該ビフィズス菌が抗 CD3抗体存在下でパイエル板細胞における IgA産生を促進す る能力として、本発明のビフィズス菌の IgA産生誘導能を示すことができる。例えば、 上記アツセィの結果、 Bifidobacterium longum OLB 6001株における培養上清中の Ig A量を 1とした場合のビフイドバタテリゥム'ビフィダムに属するあるビフィズス菌株の IgA 量の相対値が 3であるならば、そのビフィズス菌株は、 Bifidobacterium longum OLB 6 001株と比較して、抗 CD3抗体存在下でパイエル板細胞における IgA産生量を 3倍に 増加させることができる IgA産生誘導能を有する。本発明で用いるビフィズス菌の IgA 産生誘導能は、例えば Bifidobacterium longum OLB 6001株と比較して、抗 CD3抗体 存在下でのパイエル板細胞における IgA産生量を 2〜10倍、好ましくは 2.4〜5倍に増 カロさせることができる IgA産生誘導能を有する。
[0033] 本発明では、使用するビフィズス菌の分泌成分産生誘導能および IgA産生誘導能 について、上記のようなアツセィ法を用いて確認することもできる。
[0034] 本発明において特に好適に使用できるビフィズス菌株は、本発明者らが乳児の糞 便より独自に分離したビフィズス菌 Bifidobacterium bifidum OLB 6377株および Bifido bacterium bifidum OLB 6378株である。これらの菌株については、菌種特異的 DNA- プローブを用いて検討することにより、いずれもビフイドバタテリゥム'ビフィダムに属す る菌株であることが同定されている。これら菌株は、 2004年 10月 26日付（原寄託日 )で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千 葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8)に、 Bifidobacterium bifidum OLB 6377株につい ては受託番号 NITE P-30として、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378株については受 託番号 NITE P-31として寄託された。これらの菌株は 2006年 1月 18日付で原寄託 よりブダペスト条約に基づく寄託に移管され、 Bifidobacterium bifidum OLB 6377株に ついては受託番号が NITE BP-30に、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378株について は受託番号が NITE BP-31に変更された。これらの菌株はまた、実施例に詳細に記 載されている通り、上記のアツセィによって、分泌成分産生誘導能を有し、かつ、従 来のビフィズス菌と比べて 2〜5倍高レ、IgA産生誘導能とを有することが確認されてレヽ る。なおこれらの菌株より得られる変異株なども、分泌成分産生誘導能と高い IgA産 生誘導能を有する限り、本発明において好適に使用することができる。
[0035] 本発明のビフィズス菌を培養するためには、ビフィズス菌の培養に通常用いられる 培地を使用することができる。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄 養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能であるが、システィンや シスチンあるいはメチォニン等の含硫アミノ酸を添加せしめるとなお良好な生育が得 られる。炭素源としてはラタトース、グノレコース、スクロース、フラクトース、ガラクトース 、廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としてはカゼインの加水 分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含 有物が使用できる。ほかに増殖促進剤として肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が 用いられる。
[0036] 本発明のビフィズス菌の培養は嫌気条件下で行えばよい。嫌気培養には炭素ガス を予め通気した培地中で培養する方法や、ァネロパックやガスパック等、脱酸素剤を 封入した嫌気ジャーなどの公知の手法を適用することができる。培養温度は一般に 3 5〜40°Cが好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でも良い。培養開 始時の培地の pHは 5.0〜8.0に維持することが好ましい。免疫賦活用組成物の製造に 用いる培養物を得るための培養時間は、通常 10〜20時間が適当である。
[0037] 2 ^ mm ^
本発明では、上記のような本発明のビフィズス菌を含有する組成物を、免疫賦活用 組成物として用いることができる。また、本発明のビフィズス菌に追加して、あるいはそ れに代えて、本発明のビフィズス菌の処理物を含有する組成物を、免疫賦活用組成 物として用いてもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、腸管上皮細胞などの粘膜上 皮細胞からの分泌成分の産生を誘導 (促進）し、かつ、ノ ィエル板細胞をはじめとす る粘膜関連リンパ組織における IgA産生を高レベルに誘導 (促進）する。
[0038] 本発明の免疫賦活用組成物は、適量を添加することにより、例えば病原体の感染 抑制等の免疫賦活作用を、飲食品や医薬組成物に付与することができる。この免疫 賦活用組成物は、限定するものではないが、液体状、ゲル状、粉末状、顆粒状、固 形状、カプセル状、又はタブレット状等の任意の形態であってよい。
[0039] 本発明の免疫賦活用組成物に用いる本発明のビフィズス菌は、生菌体であっても 死菌体であってもよぐ湿潤菌であっても乾燥菌であってもよレ、。なお本明細書にお いて用語「ビフィズス菌」は、ビフィズス菌の菌株と菌体のいずれをも意味する。
[0040] 本発明においてビフィズス菌の「処理物」としては、限定するものではなレ、が、例え ばビフィズス菌の懸濁物（懸濁液）、培養物（菌体、培養上清および培地成分を含む )、培養上清 (培養物から固形分を除去したもの）、発酵物 (生乳、脱脂粉乳または豆 乳などを、ビフィズス菌発酵させたもの；ヨーグルトなど）、加熱処理物、滅菌処理物（ 例えば、放射線殺菌したもの）、破砕物（例えば、超音波破砕物）、濃縮物、ペースト 化物、乾燥物（例えば、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物など） 液状物、および希釈物が挙げられる。
[0041] 本発明においてビフィズス菌の「処理物」はまた、培養物または発酵物を濃縮して 濃縮物としたものでもよぐその濃縮物をさらに乾燥して菌体濃度を乾燥物 lgあたり 1 o1Q個以上としたものでもよい。この濃縮物の乾燥は、通常の手法、例えば真空乾燥、 噴霧乾燥、または凍結乾燥等により行うことができる。
[0042] 本発明のビフィズス菌の処理物に含まれる最高菌体数は特に限定されないが、通 常、濃縮物で約 4 X 101Q個/ g、乾燥物で約 5 X 10"個/ g程度である。
[0043] 本発明のビフィズス菌は、死菌体もまたパイエル板細胞からの IgA産生を顕著に誘 導できることから（実施例参照）、ビフイドバタテリゥム'ビフィダムのビフィズス菌の細胞 壁に IgAの産生誘導を活性化する成分が含まれるものと考えられた。ただし本発明は 、このような理論によって拘束されるものではない。
[0044] ところで、消化管内へ分泌された分泌成分は、単独で感染性大腸菌や毒素原性ク ロストリジゥム菌体に結合しこれら病原菌の感染を抑制すると考えられている (J. Med. Biol. 1995, 42: 3-9 ; J. Med. Microbiol. 1998, 47: 879-888)。従って本発明の免疫 賦活用組成物は、分泌成分の産生を促進することにより、感染性大腸菌や毒素原性 クロストリジゥム菌などの感染性病原体の感染のリスクを低減する効果を有する。
[0045] 一方で、腸管粘膜上皮細胞から生体外 (腸管腔内）への分泌型 IgAの産生には、腸 管粘膜における形質細胞からの IgA産生と腸管上皮細胞における分泌成分の産生 の両方が重要な役割を果たすことが知られている。実際、分泌成分の遺伝子を欠損 させた実験動物では、本来腸管腔に分泌されるべき IgAが血清中に蓄積する (J Exp Med 1999; 190: 915-22)。分泌成分の発現には環境からの刺激が関与することも示 唆されており、栄養失調による分泌成分の発現低下が報告されている（Lab Invest 19 98; 78: 1255-66) 本発明の免疫賦活用組成物は、分泌成分産生誘導能を示し、か つ高い IgA産生誘導能を有することから、例えば簡便な経口投与によって、分泌型 Ig Aの産生を促進することができると考えられる。
[0046] 本発明は、本願発明に係る免疫賦活用組成物を被験体に投与 (好ましくは経口投 与）することにより、被験体の免疫力を向上させる方法にも関する。この方法では、投 与を受けた被験体において、好ましくは、分泌成分の産生と IgAの産生の両方が促進 され、その結果、分泌型 IgAの産生が促進される。この方法において免疫賦活用組成 物を投与する被験体は、後述の医薬組成物の投与対象と同じである。好適な被験体 の例としては、妊産婦、授乳婦、乳幼児、高齢者、免疫機能の低下した患者などが挙 げられる。本願の免疫賦活用組成物の投与量は、後述の医薬組成物の投与量に従 うことができる。
[0047] 3. , ffiffl 成, 含 する *。
本発明は、分泌成分産生誘導能および高い IgA産生誘導能を有するビフイドバクテ リウム.ビフィダムに属するビフィズス菌および Zまたはそのビフィズス菌の処理物を 含有する免疫賦活用組成物を添加した、飲食品にも関する。本明細書において「飲 食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品および機能性食品を包含する。
[0048] 本発明の免疫賦活用組成物を含む飲食品は、特に限定されない。例えば本発明 の免疫賦活用組成物を含む飲料として、発酵乳 (ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳 飲料 (コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料 (緑茶、紅茶およびウーロン茶 など）、果物 ·野菜系飲料 (オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンな どの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料 (ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲 料および清涼飲料等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等について は、既存の参考書、例えば「最新'ソフトドリンクス」 (2003) (株式会社光琳)等を参考 にすることができる。
[0049] また本発明の免疫賦活用組成物を含む食品は、特に限定されず、生鮮食品であつ てもよいし、加工食品であってもよレ、。例えば、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、ケー キ、キャンディ、パスタ、うどん、かまぼこ、ハム、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、豆 腐、スープ、パン、魚の切り身、加工肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示するこ とができる。本発明において特に好適な食品としては、本発明のビフィズス菌を生き たまま腸まで届けることが可能な発酵乳や乳酸菌飲料が挙げられる。 [0050] 本発明の免疫賦活用組成物を含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好ま しい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し 、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ [特定保健用食品]を含む)および栄養機 能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サブ リメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの )および美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。 本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食 品規格に基づく健康強調表示（Health claim)が適用される健康食品を包含する。
[0051] 本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦 '授 乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。本発明の 免疫賦活用組成物は、副作用の恐れがほとんどなく広範な病原体等に対して比較 的非特異的な免疫応答を全身的に惹起できる腸管免疫を増強可能であるため、免 疫機能の発達が未熟な乳幼児のための調製粉乳または液体調製乳における使用（ 例えば、通常の乳幼児用調製乳の原料に添加すればよい)や、授乳婦用粉乳等の 妊婦用または授乳婦用食品ならびに免疫機能の低下した高齢者や病者のための高 齢者用食品および病者用食品における使用は特に好適である。
[0052] 本発明の好適な機能性食品としては、さらに、免疫機能の発達が未熟な乳幼児の ための乳幼児用サプリメント、ならびに免疫機能の増強や回復を目的とする、妊産婦 •授乳婦用サプリメント、高齢者用サプリメントおよび病者用サプリメントが挙げられる
[0053] 本発明の免疫賦活用組成物を含有する機能性食品の好ましい例として、 日本国法 令に基づいて規定される保健機能食品が挙げられる。保健機能食品制度は、内外 の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみな らず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられた。この制度の下、保 健機能食品は、特定保健用食品 (個別許可型)と栄養機能食品 (規格基準型)の 2種 類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ [特定保健用食品]等の新たな類型も含ま れる。
[0054] 本発明の機能性食品は、免疫賦活に有用であることが好ましい。本発明の機能性 食品は、免疫機能の向上、好ましくは腸管免疫 (粘膜免疫）の機能の向上を示す指 標（例えば、 IgA産生量の増加、分泌成分の産生量の増加、分泌型 IgA量の増加、リ ンパ球数の増加など）によって、免疫賦活に有用であることが示されるものでもよい。 本発明の機能性食品は、免疫賦活以外の用途を第一目的とするものでもよい。本発 明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品または条件付きトクホ [特定保健用食 品])は、免疫賦活効果を有する旨あるいは免疫賦活と関連の深い指標をもたらす旨 (分泌成分の産生量の増加など）について、記載または表示したものであってよい。 免疫賦活効果を有する旨の記載または表示は、保健機能食品制度において定めら れた規定に基づレ、て表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能性食品に おいては、「低下した粘膜免疫機能を改善する」「感染防御能を高める」「風邪を引き に《する」「身体の抵抗力を高める」などの記載が考えられる。
[0055] 本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤 、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジヱル剤などの製剤の形状で あってもよいし、通常の飲食品の形状 (例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など)であって あよい。
[0056] 本発明の免疫賦活用組成物の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じ て様々であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮し て、当業者が適宜定めることができる。し力 通常は、添加される免疫賦活用組成物 中のビフィズス菌および/またはそのビフィズス菌の処理物の総量力 S、 0.001〜100質 量％、特に 0.1〜100質量％となるような免疫賦活用組成物の配合量が適当である。
[0057] 本発明の免疫賦活用組成物は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によ つて、飲食品に含有させればよい。例えば、本発明の免疫賦活用組成物を、液体状 、ゲル状、固体状、粉末状または顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合してもよ レ、。あるいは本発明の免疫賦活用組成物を、飲食品の原料中に直接混合又は溶解 してもよレ、。本発明の免疫賦活用組成物は、飲食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付 けてもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、飲食品中に均一に分散させてもよいし 、偏在させてもよい。本発明の免疫賦活用組成物を入れたカプセルなどを調剤しても よい。本発明の免疫賦活用組成物を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包 み込んでもよい。また本発明の免疫賦活用組成物に適切な賦形剤等を加えた後、錠 剤などの形状に成形してもよい。本発明の免疫賦活用組成物を含有させた飲食品は さらに加工してもよぐそのような加工品も本発明の範囲に包含される。
[0058] 本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加 物を使用してもよレ、。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナト リウム等)、着色料 (クチナシ色素、赤 102等）、香料 (オレンジ香料等)、甘味料 (ステ ビア、アステルパーム等）、保存料 (酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロ ィチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDT Aニナトリウム、ビタミン C等）、 pH調整剤（タエン酸等）、化学調味料 (イノシン酸ナトリ ゥム等）、増粘剤 (キサンタンガム等）、膨張剤 (炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸力 ルシゥム)等、結着剤 (ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤 (カルシウム強化剤、ビタ ミン A等）、賦形剤（水溶性デキストリン等）等が挙げられる。さらに、ォタネニンジンェ キス、ェゾゥコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添カロ してもよい。
[0059] 4. ¾ ^舌 ffl gfefeを含 する医- 5¾^Ι
本発明は、分泌成分産生誘導能および高い IgA産生誘導能を有するビフイドバクテ リウム ·ビフィダムに属するビフィズス菌および/またはそのビフィズス菌の処理物を 含有する免疫賦活用組成物を有効成分として含有する、医薬組成物にも関する。
[0060] 本発明の医薬組成物には、医薬製剤上許容される担体又は添加物を配合してもよ レ、。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラ 一ゲン、ポリビニルアルコール、ポリビエルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、ァ ルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスタ ーチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、 グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステ ァリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清ァノレブミン、マンニトール、ソルビトール、ラ タトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リボゾームなどの人工 細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜又は 組み合わせて選択される。本発明の医薬組成物は、さらに他の薬理成分を含有して いてもよい。
[0061] 本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる力 特に経 口的に投与することが好ましい。経口的に投与される本発明の医薬組成物は、錠剤 、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジヱル剤、あるいは液剤、懸濁 剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であってよい。液体製剤として用いる場合に は、本発明の医薬組成物を使用する際に再溶解させることを意図した乾燥物として 供給してもよい。
[0062] 上記剤形のうち経口用固形製剤は、薬学上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑 沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口用液体製剤は、薬 学上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添 加剤を含有してもよい。
[0063] 本発明の医薬組成物は、免疫賦活作用を発揮することが好ましい。本発明の医薬 組成物は、他の薬理物質を含む別の治療用途のための医薬組成物に、免疫賦活作 用を追加したものであってもよい。あるいは本発明の医薬組成物は、好ましくは免疫 賦活剤である。
[0064] 本発明の医薬組成物は、粘膜免疫系における IgA産生量を格段に増加させ、かつ 分泌成分の産生量を増加させて、免疫系、特に粘膜免疫系を強化することができる 。本発明の医薬組成物は、例えば、病原体の感染に対する防御能を高めることを目 的として使用すること力 Sできる。
[0065] 本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢および体重、投与経路、投与 回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、経 口的に投与する場合には、医薬組成物中の免疫賦活用組成物に含まれるビフィズス 菌および/またはそのビフィズス菌の処理物の投与量は、 l〜1000mg/kg/dayが適 当である。本発明の医薬組成物は、単回投与でもよいが、 6〜8時間の間隔で反復的 に投与してもよい。
[0066] 本発明の医薬組成物を投与する対象は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験 (試験)動物 等を含む哺乳動物である。特に、免疫機能が未発達な乳幼児期の哺乳動物、加齢 または病気などにより免疫機能の低下した哺乳動物、体質的または環境的に免疫機 能が低下しやすい哺乳動物が、本発明の医薬組成物を投与する対象として好ましい 。本発明の医薬組成物は、副作用の心配が少ないことから、継続的に利用する上で 非常に有用に用いることができる。
[0067] 本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はその全体を参照に より本明細書中に組み入れるものとする。 実施例
[0068] 以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の技術的範囲はこれらにより 限定されるものではない。
[0069] [実施例 1]ビフィズス菌の IgA産生誘導能の測定
1.ビフィズス萌の調製
Bifidobacterium longum OLB 6001株（受託番号 FERM P- 13610)、 Bifidobacteriu m bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP- 30)、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378 株（受託番号 NITE BP-31) , Bifidobacterium breve株（受託番号 FERM BP-2824)お よび Bifidobacterium bifidum MEP170212 (以前の名称： Bifidobacterium bifidum #1(明 冶)株;本菌株は明治乳業株式会社 (日本)が保有している）を、それぞれ、グルコース をラタトースに変更して調製した嫌気 EG培地で 37°Cにて一夜培養した。なお嫌気 EG 培地は以下の組成に従つて調製した。
[0070] 嫌気 EG培地の組成
40.0 g (1リットル当たり）
肉エキス 2.6 g
プロテオーゼペプトン 10.0 g
酵母エキス 5.0 g
リン酸一水素ナトリウム · ' ·4.0 g
ラタトース 1.5 g
溶性デンプン 0.5 g
L—シスチン 0.2 g
L—システィン塩酸塩' · · · 0.5 g
消泡剤（シリコン） 0.2 g ポリソノレべート 80 0.5 g
カンテン 15.0 g
H 7.7
得られた培養物中の菌体を冷 PBS (-)で 2回洗浄した後、少量の PBS (-)に懸濁し、等 量の 8%_ホルマリン- PBSに懸濁して菌体を固定した。この固定した菌体から、 IgA産生 誘導能の測定実験を行う当日に冷 PBS (-)で洗浄することによりホルマリンを除去した 後、菌液を PBSに懸濁して 660匪での濁度が 1.6となるように菌液濃度を調整した。こ うして得られた菌液をホルマリン処理済ビフィズス菌液と呼ぶこととした。
[0071] 2.ビフィズス菌のパイエル板細胞からの IgA産牛誘導能の測定
8週齢の BALB/Cマウス (メス）を炭酸ガス気流下に 50秒間さらすことにより殺し、無 菌的に切り出された小腸からパイエル板を採取した。このパイエル板を少量の 2%ゥ シ胎児血清を含む RPMI-1640培地（Gibco)中に取り出し、 Suzukiらの方法（スライド法 ； Bifidobacteria Microflora, 9: 87-98， 1990)を一部改変してパイエル板細胞を調製し た。すなわち、採取したパイエル板を少量の 2%ゥシ胎児血清を含む RPMト 1640培 地（Gibco社）を入れたシャーレ上に取り出し、解剖用のメスの刃で切り刻み、プラスチ ックシリンジの柄（テルモ社）を用いて徐々に押しほぐした。こうして得られた細胞懸濁 液を 150ゲージの滅菌ステンレス鋼ふるいを通過させ、さらに 2%ゥシ胎児血清を含む RPMI-1640培地にて 2回洗浄した。細胞を適当量の 2%ゥシ胎児血清を含む RPMI-1 640培地に再懸濁し、 T細胞および B細胞を含むリンパ細胞群 (パイエル板細胞）を得 た。
[0072] 得られたリンパ細胞群は RPMト 1640培地を 2回交換して洗浄した後、トリパンブルー を用いて 98%以上が生細胞であることを確認しつつ、 96ウェルマイク口プレート（Falc on 3072)に 1ゥエル当たり 5 X 105個にて播種した。なおこの 96ウェルマイク口プレート は、各ゥヱルに予め抗 CD3抗体（CEDARLANE, No.CL7202AP、使用濃度： 2.5 x g/ ml)を 100 μ 1ずつ入れて、 37°Cで 2時間保温し、その後 200 μ 1 PBSで 1回、次いで 200 μ ΐ FCS (-) RPMI培地で 1回洗うことにより、予め抗 CD3抗体でコーティングしておいた ものを用いた。
[0073] さらに、リンパ細胞群を播種した 96ウェルマイク口プレートに、上記「1.ビフィズス菌 の調製」に従って調製した 5菌株由来のホルマリン処理済ビフィズス菌液 (濁度 = 1.0 ) 5 /i lを、それぞれ、 3つのゥエルに添加し、炭酸ガスインキュベーター内で 37°Cで 5 日間培養した。培養後の菌液から 1400 rpm、 10分の遠心分離によりリンパ細胞群を 除いた培養上清を IgA量測定用試料とし、測定まで- 80°Cに保存した。次いでその培 養上清試料中の IgA量を、 Mouse IgA ELISA Quantitation Kit (B ethyl laboratories社 )を用いて、説明書に記載された方法に従って測定した。
[0074] 一方、対照実験として、ホルマリン処理済ビフィズス菌液を添加しないこと以外は上 記と同様にして、抗 CD3抗体の共存下でリンパ細胞群を 5日間培養し、その培養上清 中の IgA量を同様に測定した。
[0075] 以上によって測定された培養上清中の IgA濃度を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000021_0001
[0076] 表 1に基づき、図 1には結果をグラフで示した。
[0077] 図 1のグラフ左側に示されるように、抗 CD3抗体の共存下で上記リンパ球細胞群 (パ イエル板細胞）を 5日間培養したところ、培養上清中に IgAが分泌された。このことは、 抗 CD3抗体の共存下で培養したパイエル板細胞において、 IgA産生細胞（形質細胞 )が分化してくることを確認するものである。
[0078] 表 1および図 1のグラフ右側に示すように、本アツセィ系を用いることにより、 Bifidoba cterium bifidum OLB 6377株および Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の IgA産生 誘導能は、 IgA産生誘導能を有することが過去に報告されている Bifidobacterium long urn OLB 6001株（受託番号 FERM P-13610)および Bifidobacterium breve株（受託番 号 FERM BP-2824)と比較して、 2〜5倍大きいことが示された。
[0079] [実施例 2]ビフィズス菌の分泌成分産生誘導能の測定 I
1.ビフィズス菌破砕物の調製
Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、 Bifido bacterium bifidum MEP170212 (以前の名称： Bifidobacterium bifidum #1(明治)株；本 菌株は明治乳業株式会社（日本)が保有している）および Bifidobacterium bifidum ME P170222 (以前の名称： Bifidobacterium bifidum #2(明治)株；本菌株は明治乳業株式 会社 (日本)が保有している）のそれぞれを、実施例 1と同様にして、グルコースをラクト ースに変更して調製した嫌気 EG培地において一夜培養した。次いで、得られた培養 物中の菌体を冷 PBS (-)で 2回洗浄してから、 PBS (-)中に 10 mg/mlにて懸濁した。この 懸濁物を 75°Cで 60分間かけて加熱処理した後、超音波破砕機（BRANSON SONIFIE R250、 Duty cycle: 60%、 Output control: 2 micro tip limit)に力けて、菌体破砕物を 得た。
[0080] 2.ビフィズス菌破砕物による HT-29細胞からの分泌成分産生誘導能の測定
ヒト腸管上皮細胞由来である HT-29細胞を 12ゥエルプレートに 3〜6 X 105個/ゥェ ル程度になるように播種し、 10%ゥシ胎児血清を含む McCoy's 5A培地（invitrogen社 製） 1.0 mlをカ卩えた。翌日、上記「1.ビフィズス菌破砕物の調製」に従って調製した 4 菌株のビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、 Bifidobacterium bifidum MEP170212および Bifidobacterium bifidum M EP170222)由来の菌体破砕物を、上記で調製した 12ゥヱルプレートのそれぞれ 3つ のゥエルの培地に、菌体破砕物濃度 50〜500 x g/mlになるように添加し、 37°Cで 48時 間培養した。対照実験には菌体破砕物の代わりに PBS (-) [Caおよび Mgイオンを除去 した Dulbecco's Phosphate Buffered Saline]を用いた。得られた培養物から培養上清 を採取し、培養上清中の分泌成分濃度を ELISA法で測定した。このため、まず ELISA プレートのゥヱルを、ヒト分泌成分に対するポリクローナル抗体（DAK〇社、 PBS (-)に て 1000倍希釈して使用）を用いて 4°Cでー晚コーティングした後、 0.01% tween 20加 P BS (-)で洗浄し、次いで 1%ゥシ血清アルブミン (BSA)_ PBS (-)を加えて室温にて 1時間 インキュベートしブロッキングした。次にこのプレートの各ゥエルに、上記で得られた各 培養上清の 50 μ ΐをサンプルとして加え、室温で一時間インキュベートした。各ゥエル を 0.01% tween 20加 PBS (-)で洗浄後、ホースラディッシュペルォキシダーゼ標識した 抗ヒト分泌成分抗体 (DAKO社、 1% BSA- PBS (-)にて 1000倍希釈)を添加し、室温で 3 0分間インキュベートした。次いで各ゥヱルを 0.01% tween 20加 PBS (-)で洗浄後、オル トフェニレンジァミン/過酸化水素水溶液 100 μ 1を各ゥエルに入れ、 30分間反応させ た。反応後、 2ΝΗ SO 20 μ ΐを添カ卩して反応を停止させたのち、測定波長 490匪で吸
2 4
光度を測定した。測定結果は対照の分泌成分産生量を 1としたときの相対値で示した
。各群間の有意
差検定は、スチューデント t -検定により、危険率 5%以下で有意差の有無を判定した。
[0081] 上記測定にぉレ、て Bifidobacterium bifidum OLB 6377株の菌体破砕物を、 50 μ g/m 1、 100 μ g/ml、 200 μ g/ml、 500 μ g/mlと量を変化させて培地に添加した場合の、分泌 成分の測定結果を表 2および図 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000023_0001
[0082] この結果、菌体破砕物を 50 β g/mlで添加した場合でも、すでに対照と比べて約 1.4 倍の分泌成分産生量の増加が見られた。そして菌体破砕物の用量を増加させても 分泌成分産生量の増加は同程度であった（図 2)。
[0083] なおこの結果は、本発明のビフィズス菌力 75°Cで 60分間加熱処理を行って不活 性化した菌体の破砕物でも分泌成分産生の促進効果があることも示した。
[0084] また上記測定において Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を 500 μ g/mlにて培地に添加した場合の分泌成分の測定結果を、表 3および図 3に示す。 [表 3]
Figure imgf000024_0001
[0085] このように Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を 500 μ g/mlにて添 カロした場合、対照と比べて約 2.5倍の分泌成分産生量の増加が見られた。
[0086] さらに、上記測定において Bifidobacterium bifidum MEP170212および Bifidobacteri um bifidum MEP170222の菌体破砕物を、 250 μ g/mlおよび 500 μ g/mlにて培地に添 加した場合の分泌成分の測定結果を、表 4および図 4に示す。
[表 4]
Figure imgf000024_0002
[0087] 図 4に示されるように、 Bifidobacterium bifidum MEP170212および Bifidobacterium bi fidum MEP170222では、 250 μ g/mlという比較的高濃度でも分泌成分産生量の増加 は認められなかった。このことは、 Bifidobacterium bifidumに属するビフィズス菌が必 ずしも分泌成分産生を増強する能力を有するわけではないことを示している。
[0088] [実施例 3]ビフィズス菌破砕物で処理した小腸および大腸器官培養組織における分 泌成分遺伝子発現量の測定
出産された後 24時間以内の BALBんマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器 官培養したものを検討に用いた。すなわち、回腸および近位大腸を輪切りにして幅 約 2〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開 き、筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを 48ゥヱルプレート に入れ、 100 U/mlペニシリン (萬有製薬）、 0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、 0.05 mg/mlゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES)、および 10%ゥシ胎児血清入り の RPMI培地（日水製薬） 0.5mlを加えた。
[0089] 続いて、上記実施例 2の「1.ビフィズス菌破砕物の調製」にしたがって調製した B. b ifidum OLB 6378株由来の菌体破砕物を、上記で調製した 48ゥヱルプレートのそれぞ れ 3つのゥエルの培地に、菌体破砕物濃度 500 z g/mlになるように添加し、 37°Cで 18 時間培養した (n=3)。対照実験には菌体破砕物の代わりに PBS (-)を用いた (n=3)。
[0090] 培養完了後、 RNA精製キット（QIAGEN、 RNeasy mini kit)を用いて培養組織力 総 RNAを抽出し、それを铸型としてオリゴ dTプライマー（INVITROGEN)により cDNAを調 製した。さらにその cDNAを铸型とし、 plgR遺伝子（分泌成分遺伝子）に特異的な PCR プライマー（5，-AGGCAATGACAACATGGGG-3，（配列番号 1)、および 5，_ATGTCA GCTTCCTCCTTGG-3' (配列番号 2) )を用いるリアルタイム PCRを、 LightCycler (Ro che社）を用いて行レ、、 cDNA中の plgR遺伝子発現量を測定した。各試料について測 定した plgR遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子の 1つである GAPDH遺伝子（P CRプライマー、 5'- TGAACGGGAAGCTCACTGG- 3' (配列番号 3)、および 5'-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3' (配列番号 4)を用いて同様の方法で検出）の発現量 を利用して、以下の算出式に従って補正した。
[0091] plgR遺伝子の相対発現量 = plgR遺伝子発現量 / GAPDH遺伝子発現量
以上のようにして算出された plgR遺伝子相対発現量に基づき、複数の実験サンプ ルから plgR遺伝子の相対発現量の平均値を算出した結果を表 5および図 5に示す。
[表 5] 対照 B. bif i dum 0LB6378破碎物 f§00 u_£/inl)_ 回腸 ϋ . 0 0 1 1 0 . 0 0 3 1
近位大腸 0 . 0 0 4 2 0 . 0 1 0 2
[0092] 図 5中、白のバーが、対照実験での plgR遺伝子の相対発現量、黒のバーが、 Bifido bacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を添加した場合の plgR遺伝子の相対 発現量を示す。各バーには標準偏差も示す。 [0093] 表 5および図 5に示されるように、実施例 2に従って調製した Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を菌体破砕物濃度 500 / g/mlにて添加した場合、対照と 比べて回腸 (小腸の下部）で 2. 9倍、近位大腸 (大腸の始めの部分）で 2. 4倍の plgR 遺伝子（分泌成分遺伝子）の遺伝子発現量の増加が見られた。大腸における増加は Mann-Whitneyの U検定により有意（P < 0.05)な差が確認された。これらのことから、 Bi fidobacterium bifidumの菌体破砕物力 小腸および大腸において分泌成分遺伝子の 発現を増強することが示された。
[0094] [実施例 4]ビフィズス菌破砕物で処理した小腸および大腸器官培養組織における分 泌成分遺伝子発現量、および IRF-1遺伝子発現量の DNAマイクロアレイによる測定 胎生 18日目の BALBんマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器官培養したもの を検討に用いた。上記実施例 3と同様に、回腸および近位大腸を輪切りにして幅約 2 〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開き、 筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを 48ゥエルプレートに入 れ、 100 U/mlペニシリン（萬有製薬）、 0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、 0.05 mg/mlゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES) ,および 10%ゥシ胎児血清入りの DM EM培地（Gibco) 0.5mlを加えた。
[0095] 続いて、上記実施例 2の「1.ビフィズス菌破砕物の調製」にしたがって調製した B. b ifidum OLB 6378株由来の菌体破砕物を、上記で調製した 48ゥヱルプレートのそれぞ れ 3つのゥエルの培地に、菌体破砕物濃度 500 /i g/mlになるように添加し、 37°Cで 18 時間培養した。対照実験には菌体破砕物の代わりに PBS (-)を用いた (n=3)。
[0096] 培養完了後、 RNA精製キット（QIAGEN、 RNeasy mini kit)を用いて培養組織力 総 RNAを抽出し、 3つのゥエルの総 RNAをひとつにまとめて以下の測定に使用した。総 R ΙΑ 11=型とし飞 Geneし hip One-し ycle "t arget Labeling ana Control Reagentsキット、 Affymetrix社）を用いて断片化 cRNAを合成した。すなわち、上記キットに含まれる Gen eChip Expression 3 -Amplincation Reagent One—し ycle cDNA Synthesis Kit (Affyme trix社）、および GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit (Affymetrix社）を用い て cDNAを合成した。次に、 GeneChip Cleanup Module (Affymetrix社）を用いて cDNA 精製し、 GeneChip Expression 3 - Amplification Reagent IVT labeling Kit (Affymet rix社)を用いて In vitro転写反応を行った。 GeneChip Cleanup Module (Affymetrix社) を用いて cRNAを精製した後、 cRNAを断片化バッファー（Fragmentation buffer; Affim etrix社）によって断片化処理し、断片化 cRNAを得た。断片化 cRNAを用いて DNA Ar rayシステム（Affymetrix社）による分析を行った。ここで用いた DNAアレイのプローブ としては、約 36000種のマウス遺伝子を含むマウスゲノム MG U74Av2セット（Affymetri X社)を使用した。実験間の変動は遺伝子発現対内部コントロールの比を用いて補 正した。各遺伝子の発現量に対する B. bifidum OLB 6378株での処理の効果を、対 照実験 (PBS (-)処理）における各遺伝子の発現量に対する比として表した。
[0097] その結果、小腸および大腸器官培養組織における分泌成分遺伝子 (plgR遺伝子） の発現量増加、および細胞内シグナル伝達因子である IRF-1遺伝子の発現量増加 が確認された（表 6)。
[表 6] 照 B. bifidum 破碎物 〔500 g/ml )
(plgR ;ia伝子
回腸 1 . 0 2 . 0
近位大腸 I 0 6 . I
(IRF-1遺伝子? g現量）
回腸 1 . 0 1 . 5
近位大腸 1 - 0 4 . 0
[0098] 表 6に示されるように、実施例 2に従って調製した Bifidobacterium bifidum OLB 637 8株の菌体破砕物を菌体破砕物濃度 500 / g/mlにて添加した場合、対照と比べて回 腸 (小腸の下部）で 2. 0倍、近位大腸 (大腸の始めの部分)で 6. 1倍の分泌成分遺 伝子 (plgR遺伝子)発現量の増加が見られ、実施例 3の結果とほぼ一致した。さらに、 Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物により、対照と比べて回腸で 1. 5 倍、近位大腸 (大腸の始めの部分）で 4. 0倍の IRF-1遺伝子発現量の増加が見られ た。
[0099] IRF-1は分泌成分遺伝子の転写調節因子の 1つであることが示されている（Blanch et al. J Immunol 1999， 162: 1232-1235)。したがって、 B.bifidum OLB6378株を用レ、 た処理による分泌成分遺伝子発現の誘導は、細胞内シグナル伝達経路を介して増 強されることが示された。
[0100] [実施例 5]ビフィズス菌の分泌成分産生誘導能の測定 II
基本的には実施例 2の方法に従って、ビフィズス菌 Bifidobacterium bifidum OLB 63 78株と Bifidobacterium bifidum JCM 1255T株の分泌成分産生誘導能を測定し、比較 した。なお Bifidobacterium bifidum JCM 1255T株は、比較用の株として、独立行政法 人 理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室 (JCM) (日本国埼玉 県和光市広沢 2-1)より入手した。
[0101] Bifidobacterium bifidum OLB 6378株と Bifidobacterium bifidum JCM 1255T株は、実 施例 2の手順に従って一夜培養した後、冷 PBS (-)で 2回洗浄してから PBS (-)中に懸 濁し、それを、実施例 2の手順に従って調製した HT-29細胞を播いた培地（10%ゥシ 胎児血清を含む McCo s 5A培地（invitrogen社製））に菌体濃度 500 μ g/mlとなる量 で添加して、 37°Cで 72時間培養した（n=2)。得られた培養物から 48時間目および 72 時間目に培養上清を採取し、実施例 2に記載の手順に従ってそれぞれの培養上清 中の分泌成分濃度を ELISA法で測定した。
[0102] なお対照実験では、菌体の PBS (-)中懸濁物の代わりに PBS (-)を上記培地に添カロし た（下記表 7中、 PBS (-))。さらなる対照実験としては、上記培地に菌体の PBS (-)中懸 濁物を添加せず、また代わりの物質も何も添加せずに培養した（下記表 7中、培地の み)。
[0103] この結果を表 7および図 6に示す。表 7に示す分泌成分濃度は n=2の平均値である [表 7] 分泌成分濃度 (ng/ml)
48時間目 72時間目
培地のみ 0 . 3 1 0 . 5 5
PBS (-) 0 . 3 1 0 . 7
B. bifidum JCM 1255T 0 . 3 5 0 . 5 7
B. bifidum OLB 6378 0 . 6 1 1 . 0 7 [0104] 表 7および図 6に示すように、 HT-29細胞は無刺激でも分泌成分を産生した。さらに 、 Bifidobacterium, bifidum OLB 6378株は、 Bifidobacterium bifidum JCM 1255T株と 比較しても顕著に多い量の分泌成分を産生誘導することができた。
産業上の利用可能性
[0105] 本発明の免疫賦活用組成物は、分泌成分の産生を促進し、かつ IgA産生を高度に 促進することにより、とりわけ粘膜免疫系の機能を高めることができる。従って本発明 の免疫賦活用組成物は、そのような免疫機能増強作用を飲食品や医薬組成物に付 与する上で有用である。また本発明の免疫賦活用組成物を含む飲食品および医薬 組成物は、免疫機能の低い患者、例えば乳幼児や高齢者、病者などにおいて用い るのに適している。また本発明の免疫賦活用組成物は、本発明のビフィズス菌の死 菌体を使用して製造することができるので、育児用調製粉乳など生物学的規格を有 する製品にも添加して使用することができ、製品形態などによらず様々な製品に利用 可能である。
配列表フリーテキスト
[0106] 配列番号 1〜4の配列はプライマーである。

Claims

請求の範囲
[1] 腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも 1.2倍に増加させる分泌成分産 生誘導能を有するビフイドバタテリゥム'ビフィダム（Bifidobacterium bifidum)に属する ビフィズス菌および Zまたは該ビフィズス菌の処理物を含有することを特徴とする、免 疫賦活用組成物。
[2] 前記ビフィズス菌が、抗 CD3抗体存在下でのパイエル板細胞 5 X 105個当たりの IgA産 生量を少なくとも 10 / g/mlに増加させる IgA産生誘導能をさらに有することを特徴とす る、請求項 1に記載の免疫賦活用組成物。
[3] 前記ビフィズス菌が、 Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30) または Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31)である、請求項
1または 2に記載の免疫賦活用組成物。
[4] 前記ビフィズス菌の処理物が、ビフィズス菌の懸濁物、培養物、培養上清、発酵物、 加熱処理物、破砕物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物および希釈物からなる群より選 択される少なくとも 1つである、請求項 1〜3のいずれ力 1項記載の免疫賦活用組成 物。
[5] 請求項:!〜 4のいずれか 1項記載の免疫賦活用組成物を含む飲食品。
[6] 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能 食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料からなる群から選択される、請求項 5記 載の飲食品。
[7] 請求項:!〜 4のいずれか 1項記載の免疫賦活用組成物を含む、医薬組成物。
[8] 免疫賦活用の飲食品または医薬組成物を製造するための、 Bifidobacterium bifidum
OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30)または Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（ 受託番号 NITE BP-31)の使用。
[9] 下記 (a)または (b)のビフィズス菌。
(a) Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30)
(b) Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31)
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